Flexibel Koloskopi i möss för att utvärdera hur allvarligt kolit och kolorektal tumörer med en validerad Endoskopisk Scoring System

Summary

Under de senaste åren har en ny generation endoskop vuxit fram som viktiga diagnostiska forskningshjälpmedel för utvärdering murina kolit och kolorektala tumörer. Vi presenterar häri ett detaljerat protokoll för endoskopisk utvärdering av inflammation och kolorektala tumörer i möss, såväl som ett nytt bedömningssystem som använder decimal identifierare för att dokumentera den endoskopisk svårighetsgrad av kolit och kolorektala tumörer.

Abstract

Användningen av modern endoskopi för forskningsändamål har väsentligt underlättat vår förståelse av gastrointestinala sjukdomar. I synnerhet har experiment endoskopi varit mycket användbart för studier som kräver upprepade bedömningar i ett enda laboratorium djur, som de utvärderar mekanismer för kronisk inflammatorisk tarmsjukdom och utvecklingen av kolorektal cancer. Men de metoder som används i studierna är mycket variabla. Minst tre endoskopiska poängsystem har publicerats för mus kolit och publicerade protokoll för bedömning av kolorektala tumörer misslyckas med att ta itu med förekomsten av samtidig kolon inflammation. Denna studie utvecklar och validerar en reproducerbar endoskopisk poängsystem som integrerar utvärdering av både inflammation och tumörer samtidigt. Detta nya poängsystem har tre huvudkomponenter: 1) bedömning av hur omfattande och svåra för kolorektal inflammation (baserat på perianala fynd, öppenhet för wall, slemhinneblödningar, och fokala lesioner), 2) kvantitativ inspelning av tumörlesioner (grid karta och stapeldiagram), och 3) numerisk sortering av kliniska fall genom sin patologiska och forsknings relevans utifrån decimal enheter med tilldelade kategorier av observerade skador och endoskopiska komplikationer (decimal kännetecken). Videon och manuskript som presenteras här var beredda, efter IACUC-godkända protokoll, att låta utredarna att göra mål sina egna experimentella möss med hjälp av en väl validerad och mycket reproducerbar endoskopisk metod, med möjlighet systemet att skilja distalt från proximala endoskopisk kolit (D-PECS ).

Introduction

Murin endoskopi har utförts som ett användbart forskningsverktyg för över ett decennium ^1-3. Hittills har de flesta studier som använder mus endoskopi används stela endoskop, även om vissa har också använt flexibel sigmoidoskopi. Murina endoskopi ger omedelbara resultat och en mer objektiv bedömning av omfattningen av tarm normalitet, svårighetsgraden av inflammation och tumörprogression jämfört med indirekta åtgärder, såsom viktnedgång, diarré, och histologi (vilket är optimalt när lesioner är ojämna), medan ger insikter om den allmänna hälsan i tjocktarmen. Framför allt gör endoskopi för upprepad bedömning av laboratoriedjurmodeller med tiden, till skillnad från traditionell histologisk undersökning som kräver att djur som ska avlivas och kolon som ska skördas för analys ^1. Trots dessa fördelar, har användningen av murina endoskopiska tekniken inte varit utbredd och begränsas av bristen på standardiserade protokoll för implementatipå och poängsättning av patologiska fynd. Genomförs korrekt, mus endoskopi är mycket lovande för att ytterligare underlätta vår förståelse och karakterisering av djurmodeller av flera kroniska gastrointestinala sjukdomstillstånd, inklusive inflammatoriska tarmsjukdomar, kolit och kolorektala tumörer.

Nyttan av murina endoskopisk teknik hänger på sin reproducerbarhet och objektivitet, vilket kräver att det finns standardiserade metoder för inspektion och en enhetlig, icke-redundant, och tillförlitligt poängsystem för intestinala patologier. Minst tre beskrivande scoring system för endoskopisk utvärdering av kolit ^4-6, såväl som för kolontumörer ^4,7,8 i möss har publicerats. Dessa rapporterade metoder och poängsystem inte är direkt jämförbara mellan studierna. I många fall finns det ingen klar definition av de kriterier som används för klassificering av organskador, och när kriterier anges, varierar de kraftigt. DessutomDet finns inga rapporterade poängsystem som integrerar bedömningen av både kolit och tumörer, två av de vanligaste kolon sjukdomar som kan förekomma samtidigt och har interaktiva effekter på resultatet, i ett enda mätverktyg. Slutligen, de endoskopiska poängsystem som existerar för kolit har ofta inflammatoriska kategorier med begränsat diskriminering (dvs.. Smala scoring alternativ över korta heltal skalor, ofta 1-4) för att korrekt representera sjukdomsutveckling scenarier och möjliggör användning av parametrisk statistisk analys.

I detta dokument beskriver vi användningen av en flexibelt endoskop för att bedöma allvarlighetsgraden av murin kolit och colon-tumörer och beskriva ett standardiserat protokoll för att använda denna teknik i anatomisk bedömning av området kring anus, ändtarm och distal kolon. Vi illustrerar effektiv felsökning under endoskopi för att minimera trauma och bildartefakter, och vi beskriver ett reproducerbart poängsystembaserat på validerade publicerade kliniska parametrar. Poängsystemet integrerar utvärdering av såväl tarminflammation och tumörer med hjälp av en hög grad av diskriminering med 12 möjliga grader av inflammation, tumörmappning och rita alternativ och ett nytt decimalenhetssystemet (dvs decimal kännetecken) för att belysa resultaten med särskild diagnostiskt värde ( dvs tumörutveckling, komplikationer under endoskopi, etc.). Användningen av decimal identifierare möjliggör snabb spårning av relevanta uppgifter för vidare analys nedströms. Slutligen, vi utför reliabilitet och validitet testning av poängsystemet i flera musmodeller av kolit och kolit-associerad cancer (dextransulfat natrium (DSS) inducerad-kolit, Clostridium difficile infektion, och azoximetan / DSS-inducerad koloncancer).

Protocol

1. Inställning av endoskopi System

1. Konfigurera endoskopi systemet innan anesthetizing mössen, enligt tillverkarens instruktioner. Använd en video ureteroskop avsedd för människor för detta protokoll (Figur 1). Den yttre diametern av införingsröret är 9,9 Fr (3,3 mm), är dess distala ände 8,5 Fr (2,8 mm) och innerdiametern hos instrumente kanalen är 6 Fr (1,2 mm).
2. Även om användningen av endoskop som inte har kopplats till smittspridning [9], sterilisera endoskopet och objektivet med 70% etanol ¹⁰ eller med lämpliga metoder vid arbete med sporbildande mikroorganismer. Förbered bakteriostatisk sterilt smörjmedel och icke-repande torka vävnader för att mätta endoskopets spets.
3. Fäst en 3 ml spruta full med luft (eller en lämplig CO ₂ gasblandning) till den övre delen av instrumentkanalen.
4. Slå på strömmen och ställa in vitbalansen i normalt vitt ljus,liksom smalt band imaging (NBI) läget, när så är tillämpligt. Sedan 2001 har NBI tillhandahålls diagnostiska fördelar eftersom det betonar fina blodkärl strukturer på slemhinnor med ulcerös och tumör lesioner, som har karakteristiska onormal vaskularisering ^11. NBI-filterläge begränsar våglängd fångade ljuset till 390-445 nm och 530-550 nm, som lyfter fram strukturer med hemoglobin.
5. Skriv bedömningen poängform (figur 2) för att spela in dina resultat. Bekanta dig med förväntade normala och NBI bilder (Figur 3A) och definitionen och kvaliteter av varje kriterium före tentamen (se avsnitt 6.1).
6. Bered en färgämnesbaserad lösning på fosfatbuffrad koksaltlösning (PBS) under chromoendoscopy, om så önskas. I chromoendoscopy, är testet utförs med hjälp av ett färgämne som kontrastmedel för att markera slemhinneförändringar. Använd metylenblått (0,1-1%) och indigokarmin (0,1%) lösningar (figur 3B). Obsatt metylenblått är en oxidations-reduktionsmedel som kan producera oxiderande radikaler, indirekt tvärbindning av aminosyrarester, och DNA-nedbrytning ^12, som skulle kunna störa provanalys.

2. Allmän anestesi av musen

1. Välj det anestetiska medlet och administreringssättet. Konsultera en veterinär från ett djur resurs anläggning eller Institutional Animal Care och användning kommittén (IACUC) om eventuell inblandning av läkemedel med immunsystemet och mål forskning. Vissa läkemedel kan påverka cytokinprofil uttryck hos djur, inklusive gnagare ^13. Använd injicerbara tribromoethanol för terminal förfaranden eller isofluran för överlevnad endoskopi, tillsammans med lämpliga kontroller.
2. För induktion, administrera 4-5% isofluran i 100% syre med en hastighet av 0,2 till 0,5 l / min, använda från 0,5 till 2% för underhåll. Detta protokoll är inte lämpligt för alla djur. Rådgör med din anläggning veterinärför instruktioner och utbildning. Följa relevanta IACUC rekommendationer för att uppnå högsta standard för djurens välbefinnande. Se till att musen, om helt bedövad.
3. "Strap" sövd musen till en stödyta tabell i en rygg eller ventrala position med hjälp av laboratorie tejp. Se upp för den anatomiska orienteringen på endoskop skärmen. Säkra sina nedre extremiteter och svans. Ett band av tejp kan också placeras över bröstet för att förhindra rörelse bort från respiratorn, men undvika att begränsa bröstkorg ventilatoriska rörelser.

3. Detaljerad endoskopisk undersökning

1. Leta efter perianala skador innan du sätter endoskopet in i ändtarmen, sedan avancera räckvidden genom anus.
2. Coat endoskopet med sterila kirurgiska glidmedel. Var noga med att inte belägga ytan av CCD (Charge Coupled Device) sensor.
3. Sätt endoskopet och starta inspelningen. Inspelade videor är användbara för meticulous utvärdering av endoskopi vid behov efter undersökningen. Försök att utföra endoskopi på minsta möjliga tid för att minimera tarm / mucosal irritation.
4. Applicera luft med hjälp av en spruta för att sakta avskilda tarmväggarna. Beroende på storleken av musen, använda 1-2 ml luft. Undvik överdriven luft inblåsning, det kan leda till andnöd och död sövda mus.
5. Advance endoskopet framåt när du rensa vägen med luft eller mild rotation av räckvidden. Inte avancera endoskopet om du inte ser den intestinala lumen. Perforeringar eller rektala / kolon revor kan uppstå i detta skede, särskilt i unga möss (<8-10 veckor gamla). Ta bilder som behövs.
6. Eftersom omfattningen förskott, bedöma om det finns spontana blödningar (definierat som naturligt förekommande mucosal blödning inte förknippade med traumatisk endoskopi). Spontan blödning kan observeras såsom endoskopet in i ändtarmen och tjocktarmen.
7. SomSess insynen i kolon väggen. Öppenhet definieras som förmågan att visualisera intramural blodkärlen i tjocktarmen och att de andra omgivande inälvor (Figur 4). Gentle rörelse av omfattningen (back-framåt, medurs, moturs) kommer att bidra till att avgöra om blodkärl kan ses i samband med andra inälvor. Mesenteriska fettvävnad kan också ses. Notera om ändtarmen inuti bukhålan verkar mindre transparent än kolon väggen i bukhålan.
8. Inspektera för att bestämma typ och antal fokala lesioner (ödematösa områden, erosioner, sår, tumörmassor). Detta kommer att spelas in i poängformuläret med hjälp av kolon inflammation poäng och decimal identifierare som har utvecklats.
9. När området där tjocktarmen böjs kaudalt i proximala kolon nås, dra tillbaka endoskopet långsamt och leta efter förekomst av kontakt blödning (som uppstår på grund av mucosal sprödhet efterendoskop är avancerad eller tas bort). Det är inte nödvändigt att skrapa kolon ytan avsiktligt. Friska kolorektal slemhinnan blöder inte efter lämplig endoskopisk undersökning.

4. Biopsi

1. När det behövs biopsier, sätt in biopsitänger genom endoskopet kanal som är dedicerad för instrumentering. Övervaka utvecklingen av pincetten på endoskopet skärmen för att förhindra tarmperforation.
2. Öppna biopsi koppar av tången till omkring en 60 till 80 ° kupa-till-kopp vinkel och rikta dem till området av intresse. Alltför öppnats pincett eller tryck kan greppa extra skikt av tarmvävnad, vilket resulterar i en biopsi-inducerad perforering av friska transparenta tarmväggarna. Om perforering inträffar, avliva djuret under anestesi efter dina IACUC rekommendationer. Perforeringar leda endotoxemi och bukhinneinflammation.
3. Stäng biopsi koppar, och dra ut dem samtidigt som pincetten stängda.
4. Remove provet från tången genom att spola vävnaden med en lösning som är skonsam mot vävnaden och pincett. RNA senare och PBS är vanliga arbetsmetoder lösningar, om det behövs, använder nålen för att få bort provet. Undvik att urholka de forcep koppar eller skär.

5. Återhämtning från Anesthesia

1. Efter avslutad undersökning, ger en varm miljö till musen tills den återhämtat sig. Använd antingen ett elektriskt ljus, eller en varm pad inställd på 37 ° C. Undvik överhettning, perifer vasodilatation äventyrar djurens återhämtning. Övervaka musen noga tills fullständig återhämtning.

6. Integrerat Endoskopisk Scoring System för kolorektal hälsa med decimal Identifierare

1. Använd poängform (figur 2) och parameterdefinitionerna nedan (Endoskopisk Bedömning av Murina kolorektal Inflammation och Tumörer använda en Decimal-vägd Scoring System: Parameter Definitioner och protokoll) förexempel och tillval "Distal-Proximal Endoskopisk kolit scoring system" (D-PECS) som riktlinjer för nonbiased bedömning och detaljerad journalföring.
2. Betyg de fyra parametrarna för kolorektal inflammation beskrivs på poängsystem formen (Figur 2). Noggrant utvärdera området kring anus, intestinal öppenhet, typ av intestinal blödning (om det finns), och förekomst och mängd av fokala lesioner (erosiv, ulcerös, och / eller tumör).
3. Vid bedömning av tumörer för forskningsändamål, undersöka kvantitet, plats och storlek, och beskriva dem med hjälp av kolon kartan och stapeldiagram i poängformuläret. Den numeriska summan av poängen som erhållits och antalet lesioner (i förekommande fall) kommer att avgöra bakgrunden kolon inflammation, den dominerande typen av skada, och antalet skador.

Representative Results

Protokollet och bilder som presenteras i denna studie var beredda med en Olympus URF-V flexibla endoskop ¹⁴ och NBI ^11,15. Videobilder räddades i MPEG-2 format och bilder i JPG, TIF, PNG, eller DICOM-format med maximalt 1280 x 1024 bildpunkter, överföras till vanliga USB flash bärbara minnen. NBI förbättrar den visuella kontrasten av hemoglobininnehållande vävnader. Normalt ljus och NBI avbildning är viktiga egenskaper för att illustrera den normala anatomin i kolorektal slemhinnan och skillnaderna mellan normal och onormal vaskularisering under sår och tumörutveckling (fig. 3A och 6A). Bilder med metylenblått som kontrastmedel under chromoendoscopy visar dess fördelar för närbilder, avslöjar antennen normala bikakestruktur utseende kolon kryptor (se nära upp i figur 3B).

Hittills har vi genomfört över 500 murina endoskopier fölvinge detta protokoll, med ca 10% vilket motsvarar upprepad undersökning. Generellt kräver proceduren 10-15 minuter att genomföra, delas lika mellan administrering av anestesi, endoskopi, och återhämtning från anestesi. Granskningen omfattar från anus till mjälten fotled i distala kolon. Vi har också framgångsrikt genomfört obduktion endoskopiska undersökningar av den proximala kolon, blindtarmen och ileum i vissa fall, efter obduktion dissektion av vävnaderna omedelbart före skörd vävnader för histologi (Figur 6B). I ett fall, konstaterade vi också och bekräftade misstänkt gastrisk dilatation i en mus påverkas med svår duodenal striktur och impaktion grund av tarm sammanväxningar. Den onormala utskriften iakttogs transmurally från den mest kraniala aspekten av ett milt inflammerad distal kolon, obduktion undersökning visade den utspänd mage var sida vid sida till tjocktarmen.

Vi har utvecklat en effektiv och tillförlitlig decimal vägda scoring system för att förbättra standardiserad tillämpning av murina endoskopi över publicerade forskningsstudier. Tre poängsystem har tidigare anställd och tjänade som grund för utvecklingen av vårt decimalvägda systemet ^4-6. Även om dessa system möjliggör kategorisering av olika kriterier och nivåer av lesioner svårighetsgrad, de saknar lämpliga kriterier definitioner, av vilka några är svåra från endoskopiska bilder för att utvärdera. I vissa fall tvetydiga parametrar som ingår i de poängsystem har tvivel relevans för endoskopisk undersökning på möss. En sammanfattning av elva publicerade parametrarna ^4-6 och deras endoskopiska fördelar, begränsningar och fysiologiska relevansen är presenterade i Tabell 1.

Eftersom den föreslagna murina kolon endoskopi poängsystem kommer att användas för forskningsändamål, var nödvändigt dess användbarhet för att utföra statistisk slutledning. För att säkerställa att det poängsystem hadehög konstruktion giltighet, först utvecklade vi en konceptuell ram för att identifiera relevanta parametrar, grupperade dessa parametrar till färre kriterier (n = 3), och bedömde deras colinearity och korrelation med faktisk närvaro av inflammation och läkning (Figur 7). Därefter tillade vi perianala fynd använda diskreta heltal för att representera ordning svårighetsgrad, och integrerat begreppet tumörinduktion och utveckling med hjälp av decimal identifierare. Dessutom har vi lagt till "strikturer" som en annan parameter som inte tidigare ansetts / rapporteras i murina tarm endoskopi. Den resulterande utsignalen betygsättning producera hög validitet och är lämpliga för parametrisk statistisk analys. Slutligen har vi lagt kartläggning och numeriska plottingfunktioner för detaljerad övervakning sjukdom.

För att bedöma konvergerande giltigheten av vårt system för bedömning, var poängen som erhållits från tre publicerade parametrar för 36 mus koloskopier jämfört mot poängen obtained av samma person blint använder tre tidigare poängsystem ^4-6. Varje jämförelse visade god positiv korrelation, vilket indikerar hög konvergent validitet för vårt integrerade poängsystem (Pearson p <0,0001, figur 8). Analysen stöder införandet av perianala fynd som en del av de kliniska kriterierna för att bedöma kolorektal hälsa, eftersom det var vanligt förekommande i fall av allvarlig kolit och förbättrad data dispersion (P = 0,0351 mellan poängen 0 och 1, P = 0,0086 mellan poängen 2 och 3, Figur 8B). När det integrerade poängsystem (efter att ha lagt perianala fynd) jämfördes med de andra tillgängliga system, var det uppenbart att 2 av de 3 andra system har stor inferential begränsning på grund av anhopning av fall till en av de fyra möjliga heltal kategorier, en stor indikation på metod felklassificering bias (figur 8C) ^16. Med decimal identifierare, har vår nya poängsystem den lägsta sannolikheten för klustertrering datapunkter i heltal kategorier.

Figur 1. Instrument. Flexibelt endoskop, video styrsystem, ljuskälla, videobandspelare, och inhalationsanestesi maskin som används i denna studie. Klicka här för att visa en större bild .

Figur 2. Decimal poängsystem formulär för bedömning av kolit och kolorektala tumörer hos möss. Systemet har en kärna inflammatorisk komponent av fyra icke-sam-linjära parametrar, grafik för tumor information och decimal enheter till noterbara skador eller komplikationer. Se detaljerade kriterier och exempel i avsnitt nedan (Endoskopisk Bedömning av Murina kolorektal Inflammation och Tumörer använda en Decimal-vägd Scoring System). Klicka här för att visa en större bild .

Figur 3. Kopplade bilder av normal slemhinna i normal endoskopisk ljusläge, NBI-läge, och med chromoendoscopy. Arborization av blodkärl är normalt mindre vanlig i ändtarmen. Klicka här för att visa en större bild .

fo: innehåll-width = "5in" fo: src = "/ files/ftp_upload/50843/50843fig4highres.jpg" src = "/ files/ftp_upload/50843/50843fig4.jpg" width = "500px" />
Figur 4. Tvärsnitt av tarmslingor för att illustrera principen om endoskopisk insyn i tarmväggen hos möss. Endoskopisk visualisering av väggmålning tarm fartyg och mesenteriska fett, och det av mesenteriala fartyg och fett från intilliggande friska inälvor, är möjlig genom väggen av en frisk kolon. Inflammation och förtjockning av tarmväggen i peritoneal avsnitt i distala kolon förhindrar visualisering av intramural och transmurala strukturer från andra inälvor, även om andra tarmsegment är friska. Klicka här för att visa en större bild .

3/50843fig5highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/50843/50843fig5.jpg "width =" 500px "/>
Figur 5. Felsökning. Åtgärda dålig sikt orsakad av tarminnehåll, suddiga bilder och peristaltiska rörelser. Klicka här för att visa en större bild .

Figur 6. Kopplade bilder (vanlig ljus kontra smalband imaging, NBI) av sjuka kolorektal slemhinna och andra proximala tarmsegment. NBI hjälper till att identifiera ulcerös och tumör lesioner. Vissa sår visas brunaktig med NBI, andra, täckta med fibrinös material verkar tjock och vit. AOM / DSS tumörer är bättre karakteriserade med NBI, speciellt under tidiga skeden när de inteskjuter in i lumen. Asterisker (*) markerar endoskopisk artefakt (mucosal korrugering) i kolon fylld med PBS, som inte observerats i alla andra bilder där kolon utspänd med luft. Klicka här för att visa en större bild .

Figur 7. Teoretisk korrelation och co-linjäritet mellan svårighetsgraden av tarminflammation och förmågan att visuellt urskilja och betygs olika publicerade kriterier för kolon inflammation (se tabell 1). Klicka här för att visa en större bild .

Figur 8. Jämförelse av resultat mellan vårt poängsystem och tidigare publicerade poängsystem data från parade blinda analyser av 36 mus video endoskopier. A) Jämförelse av System A (5 parametrar) till de inflammatoriska parametrar, utom perianala lesioner (3 parametrar). B.) Vikten av att inkludera perianala rön i poängsystem;. perianal undersökning genomgående gav ytterligare statistiskt signifikant information i fall av måttlig / svår kolit i möss C) Utförande av poängsystem efter inklusive perianala resultat i jämförelse med tidigare rapporterade system (36 mus video endoskopier var gjorde med varje metod). Lägg märke till att systemen B och C har en stor begränsning på grund av anhopning av fall i en av sina fyra kategorier som leder till misclassification bias (System B-och C-kluster fall i nonequivalent kategorier). Genom att lägga till decimal identifierare, sänkte vi också risken för klustring i heltal kategorier, samtidigt som spårning av nu meningsfulla numeriska poängen. Klicka här för att visa en större bild .

Tabell 1. Kliniska parametrar som publiceras som endoskopiska kriterier för att bedöma tarminflammation hos möss. Klicka här för att visa en större bild .

Endoskopisk BEDÖMNINGENnt av murina kolorektal inflammation och tumörer med en Decimal vägda Scoring System: Parameter Definitioner och protokoll

Vår integrerade endoskopisk poängsystem för kolorektal hälsa har tre huvudkomponenter: 1) bedömning av hur omfattande och svåra för kolorektal inflammation, med fyra parametrar och 12 möjliga sifferbetyg, 2) inspelning av läge, storlek och antal tumör lesioner, och 3 ) decimal enheter med tilldelade typer av primära eller dominerande lesioner och endoskopiska komplikationer för att belysa resultaten av särskild betydelse för forskare, här kallad "decimal identifierare". Placeringen och storleken av tumörer spelas in på en virtuell kolon karta, och antalet tumörer i varje procent av utsprång (obstruktion) i lumen registreras i ett diagram. Dessa två diagram ger tumör information som kan integreras i tre dimensioner. De decimala enheter för lesion kategorier varierar 0,0-0,9. Om numlet lesioner för en särskild kategori är relevanta, andra och tredje decimaler kan användas för att indikera antalet lesioner. Till exempel, om tre lesioner observeras, lägga 0,003 skulle tillåta forskare att veta att det fanns tre organskador, om det finns 12 lesioner, då 0,012 skulle användas. Detta tracking system är av särskild fördel om upprepade endoskopiska undersökningar förväntas. Detaljerade definitioner av de kriterier inflammation och svårighets kvaliteter ges nedan.

A. Bedömning av kolorektal infammation med fyra kliniska parametrar - definition av endoskopiska kriterier

1. Perianala fynd: Bedöm denna aspekt innan du börjar avgränsning för att undvika förväxling med post-endoskopi blödning. Vård av området kring anus är en proxy för hälsa i tjocktarmen, hud, och djuret attityd i allmänhet, och ingår som en del av endoskopisk undersökning eftersom vissa skador kan inte och should inte undersökas noggrant med blotta ögat. Iakttag biosäkerhetsågärder som är lämpligt. Observera att hälso grooming vanor av mössen kan ta bort blod / utsläpp, men kommer inte att ta bort hudförändringar från området kring anus. Poängberäkning:

0. Normal. Inget blod, diarré, sprickor, fistlar eller utsläpp observerats.
1. Klumpar av avföring eller diarré observerats.
2. Proppar / klumpar av blodiga flytningar, lös avföring (diarré), pus eller mindre sår observerats.
3. Granulationsvävnad eller organskador som observerats som involverar de flesta av de omgivande hud och tyder på att djuret har markerat irritation eller inflammation i området kring anus, ändtarmsframfall.

2. Insyn i tjocktarmen: definieras som förmågan att visualisera blodkärl eller Utåtriktad organ genom kolon väggen som kolon-endoskopet försiktigt flyttas. Observera att ändtarmen är naturligtvis mindre öppet på grund av muskelskikten end för att det är i bukhålan där mindre kontrast existerar. Detta är en av de fysiologiskt mest omfattande parametrar eftersom den återspeglar det allmänna inflammatoriskt tillstånd eller hälsa murina kolon. Observera att det är möjligt att ha en icke-inflammerad kolon med slemhinnor erosioner / sår i tidiga stadier av infektion eller toxiska effekter på epitelet. Tänk på att fysiologisk isoton lösning bör användas för att spola under endoskopi, som hypotona lösningar, såsom vatten, orsaka förändringar med blekning och kontraktion av slemhinnan hos möss om användning under längre perioder (se asterisker i Figur 6).

0. Normal. Stora och små blodkärlen i tjocktarmen och de omgivande inälvor syns tydligt. Flytta endoskopet något (och tillbaka, klocka / moturs). Kan också observeras Vit mesenterial fett eller mörkt innehåll av andra inälvor.
1. Små fartyg är delvis osynliga men stora fartyg är synliga.
2. Liten vessels är osynliga och stora fartyg är inte klart. Slemhinnan visas inte tjocknat.
3. Skenbar förtjockning av tarmväggen och / eller slemhinnor ödem / generaliserad. Blodkärl är inte synliga. Få utspänd / åderbråck fartyg kan synas i vissa fall.

3. Slemhinneblödningar: Deri kontakt blödning från spontana blödningar. Rutinstandard endoskopiska förfaranden friska möss bör inte framkalla blödning. Om det finns inflammation kan den ökade mukosal vaskularitet och vävnads skörhet leder till mukosal erosion och blödning. Det finns inget behov att avsikt skrapa kolon för att bedöma denna parameter.

0. Normal, ingen blödning.
1. Gemensam kontakt blödning. Denna traumatisk blödning definieras som kontakt blödning, det bör bedömas först efter att dra tillbaka endoskopet.
2. Ej tillämplig. Avsikt inte tilldelats tvinga examinator att avgöra nature för blödning.
3. Spontan blödning, som definieras som en icke-traumatisk och naturligt förekommande blödning som kan observeras såsom endoskopet kommer in i tjocktarmen. Ibland inducerar luft inblåsning spontana blödningar under svår kolit.

4. Fokala lesioner: För att tillgodose den ojämna, oförutsägbara kolorektala sjukdomar, ger detta integrerade poängsystem omdöme för förekomst av fokala lesioner (främst ulcerös i naturen) genom strängheten av inflammationen. Eftersom tjocktarmen är en kort, rak tubulär segmentet i möss, ansågs det onödigt att beskriva placeringen av lesioner. Istället är antalet lesioner registreras och läggs till den totala poängen användning av systemet enligt decimal identifierare. Men om det behövs vikt vid lokalisering av lesioner, har vi ett alternativ som heter "Distal-Proximal Endoskopisk kolit Scoring System" (D-PECS) som beskrivs nedan i avsnitt F. Ytterligare strömlinjeformade applikationer kan varahärstammar från vårt decimal poängsystem. Eftersom tumörer sällan existera utan att framkalla någon form av inflammation i kolorektal regionen i möss, har vi inkluderat tumörer i avsnittet decimal identifierare för att unikt möjliggöra studier av tumörer i samband med tarmhälsa (se nedan).

0. Normal, inga fokala lesioner.
1. Väldefinierade områden av liten platt höjd som omfattas av normal slemhinna observerats. Detta är för att möta lokala ödematösa områden eller potentiella områden av cellinfiltration / spridning, som funnit i mild kolit.
2. Rodnad eller eroderande områden observeras.
3. Sår eller strikturer. Sår identifieras av rodnad och missbildning (oregelbundna kanter med tecken på onormal vaskularisering) på grund av ödematös eller fibrotisk sårläkning. NBI endoskopi är användbart för att skilja upptäckt eller observation av sår. Strikturer redovisas som områden onormalt smala, runda eller oregelbundna och statisk i formen, som inte avtal eller expandera som exförväntade. Ofta förträngningar arealer om onormala mucosal kryptor, eller villi i ileum. I fallet med flexibla endoskop (yttre diameter = 3,3 mm) är noggrann oförmåga att avancera räckvidden in mera proximala delar av kolon har genomgående i samband med onormal strikturer verifierade obduktion.

B. Tumör sjökort för inspelning läge, storlek och antal

1. Virtual kolon map: Den här kartan är en virtuell perspektiv bild av distala kolon och rektum som görs genom att klippa upp i lumen (0 °) och rulla ut den. Den övre och undre delen av diagrammet delas proximal av kolon (fotled), och anus, respektive. Centrumlinjen (180 °) indikerar botten av hålrummet (ventrala aspekten av ett djur), och högra och vänstra halvor av halvcirklar indikera den högra och vänstra väggen av lumen. Kartan kan användas för att beskriva läget och horisontella storleken av tumörer, såvälsom sår.

2. Tumör nummer för varje grad av tumör yrke: Även om kolon kartan ger bara tvådimensionell information är i vilken utsträckning tumörer växer i tarmlumen ett viktigt inslag i tumörer, eftersom utstick kan orsaka tarm stenos eller obstruktion. För att fånga denna information har vi lagt en inspelning diagram för procent utstick i lumen som dokumenterar antalet tumörer i varje procentintervall, vilket gör ett tredimensionellt perspektiv för att bedöma omfattningen av kolontumörer.

C. Decimal identifierare för att göra numeriska värderingar meningsfulla och snabba relevanta fall

Vårt poängsystem använder ett nytt decimal identifierare system för att registrera förekomsten av relevanta skador eller komplikationer. Dessa kännetecken är i beskrivande syfte och är avsedda att underlätta tolkningen av en numerisk poäng och snabba fall av endoskopisk intresse. Men fungerar de också att numeriskt vikt dominerande typer av lesioner, och tillåta generering av datauppsättningar kan bli föremål för parametrisk statistik. Vid användning av utvecklade scoring formen, markera lesioner som är lämpligt, och välj en decimal identifierare som ska läggas till den inflammatoriska poäng.

0. Inga speciella fynd.
1. Perianal fistel, eller överdriven perianal inflammation, ändtarmsframfall.
2. Främst eroderande lesioner med mindre vägg engagemang.
3. Mestadels sårskador, en del täckta med fibrin, blödning, eller stora med oregelbundna former på grund av filmbildande av små sår (antalet sår kan spelas in som 0.301 för en tumör, 0.302 för två tumörer, 0.311 för elva tumörer, osv.).
4. Intestinal förträngning (valfri därför förträngning är en allvarlig inflammatorisk komplikation i kolit, lägga 2 poäng till den totala inflammatoriska poängen).
5. Väldefinierade plack (tjock / icke-transparent vävnad i tarmväggen, t.ex. & #160, en platt låg höjd tumör). Antalet plack kan registreras som beskrivs för lesioner (dvs 0,401, 0.402, ... 0.411, osv.). De kan visas som en platt icke expanderbar yta som kan tyckas sticka ut upp till ca 5-10% som modifierar den perifera utseende intestinala lumen.
6. Utskjutande massa eller tumör lesion. Antalet massorna kan registreras som beskrivs för lesioner (dvs 0,601, 0.602, ... 0.611, osv.). De är klart utbuktande, men kan synas platt men utskjutande> 15% av den uttänjda omkretsen av tarmlumen.
7. Inducerad riva / perforering under endoskopi.
8. Död av djur under endoskopi.
9. Annat: _____________ (t.ex. svår proximal endoskopisk kolit, se Distal-Proximal Endoskopisk kolit Scoring System nedan).

D. Exempel och tillämpningar

Den murina endoskopi poängsystem som presenteras i denna uppsats är specifically för att integrera insamling och analys av data om kolon inflammation och kolorektala tumörer. När det gäller tumörer, kan data analyseras med hjälp av olika statistiska metoder, bland annat ytan under kurvan, median, mode, eller principalkomponentanalys. På individnivå kan det poängsystem hjälpa forskare övervakar kolon hälsa i en enda mus över tiden. Efter summering av de inflammatoriska delpoäng och lägga rätt decimal identifierare för typ och antal lesioner vid behov, kommer den totala poängen tillåta forskare att numeriskt kvantifiera omfattningen av kolon inflammation, den dominerande typen av skada, och antalet skador. Till exempel, en poäng på 12,609 indikerar att den här musen har svår kolorektal inflammation och nio utskjutande tumörmassor, en frisk mus med en vanlig perianal region och kolorektal slemhinna som perforerade under endoskopi skulle få en totalpoäng på 0,7. Decimalidentifieringssystemet kommertillåta forskare att katalogisera och enkelt söka stora databaser av skårade möss. Till exempel kan en forskare in sökkriterier för att identifiera alla poäng som slutar på "0,6" och hämta alla ärenden som har utskjutande tumörer. Fler exempel illustreras i den kompletterande figurer S1-S3.

E. Distal-proximala endoskopisk kolit poängsystem (D-PECS)

Detta är en valfri modifiering av vår decimal identifierare poängsystem för att skilja fall med svår / omfattande proximal kolit. Eftersom de endoskopiska tecken på kolit och kolorektala tumörer i möss tycks utvecklas konsekvent i distala delar av tjocktarmen som vi rekommenderar:

• Gör mål kolon efter de kriterier som beskrivs, med särskild uppmärksamhet på de distala två tredjedelar av tjocktarmen och ignorera den proximala segmentet, om det är till synes friska. Detta undviker förvirring och ökar diskriminerande makt endoskopi för differentieringtiate djur med olika grad av omfattande kolit.
• Om inflammatoriska eller tumör förändringar observeras i den proximala tredje, rekommenderar vi att lägga till en punkt till den totala poängen (1,0) och tilldela decimal identifierare som '0 .9 - Andra, "som skulle märkas som allvarlig proximal endoskopisk kolit. Plotta resultaten i kartnätet och stapeldiagram.
• Övervaka djur som har endoskopiska abnormaliteter i den proximala tredjedelen av kolon. Var särskilt uppmärksam obduktion, eftersom sjukdomen kan vara ovanligt svår eller kan sträcka sig utanför mjälten fotled mot den proximala kolon.
• Om denna rekommendation följdes, spela in detta tillvägagångssätt i "observationer avsnittet" av utvärderingsformuläret, och följa denna trend över experiment. Vänligen citera i din slutliga publikation som utredningen utfördes efter vår "distal-proximal endoskopisk kolit poängsystem" eller D-PECS, som sträcker sig från 0 till 13,9. Observera att denna ändring inte har någon s TATISTISKA effekt på vårt poängsystem om de används i djur utan omfattande / allvarlig proximal kolit.

Kompletterande figurer.

Figur s1. Exempel på endoskopisk bedömning av en mus med kolorektala tumörer. Djur behandlades med AOM och DSS före endoskopi. A) representant bild i normalt och NBI-läge, respektive. B) Poäng formulär fylls med endoskopiska fynd. Observera att även om det finns två relevanta slutsatser forskaren valde att tilldela decimal identifierare 0,6 baserat på klinisk svårighetsgrad och mål forskning. En mängd parametrisk statistisk analys kan utföras med de uppgifter som registrerats i "Karta av tumörer / sår" och "Record av tumör utskjutande" diagram. iles/ftp_upload/50843/50843figs1highres.jpg "target =" _blank "> Klicka här för att visa en större bild.

Figur s2. Exempel på en mus med ett kolon förträngning och en endoskopisk komplikation. Notera förträngning av intestinala lumen och att en nonperforating, mucosal tår inducerades under endoskopi precis distalt om förträngningen platsen. Förträngning och kraftlöshet i inflammerad kolon kan resultera i mukosala tårar. Djuret var under narkos. Observera att poängsystemet har gett oss möjlighet att övervaka och minska behandlingskomplikationer. Klicka här för att visa en större bild .

43/FigureS3.jpg "width =" 500px "/>
Figur s3. Exempel på tidsförloppet för inflammation och endoskopisk poäng i en DSS-behandlad mus. Observera att siffrorna kan vara självförklarande och indikerar att kolon inflammation fortskred (1-5 och 8), och att erosioner utvecklats av dag 8 (decimal 0,2 ) och sår efter dag 11 (decimal 0.3). Klicka här för att visa en större bild .

Discussion

Det finns flera överväganden om ändring och felsökning av endoskopisk teknik i möss. Kritiska aspekter av förfarandet som måste bemästras under användningen av flexibel endoskopi inkluderar justering av luftmängden som behövs för att förhindra utspänd buk och respiratoriska problem med musen, och mindre tekniska aspekterna av utsikt kontroll med samordning av vinkling och momentkontroll . Momentreglering är viktigt för att minimera risken för tarmperforering. När hanteras på rätt sätt, blir murina flexibel endoskopi en mycket säker, snabb procedur som möjliggör direkt visualisering och biopsi provtagning av tarm forskningsområden intresse.

För att lösa granska hinder på grund av avföring (Figur 5), är det viktigt att förstå att fekal pellets brukar observeras även efter fasta eller användning av laxermedel. När nuvarande, kan avföring lätt flyttas proximalt med mjuka luft insufflation. I omkring 11% av fallen är det nödvändigt att också använda en ml PBS lavemang. Innan de genomför lavemang, vara försiktig när man undersöker djur som verkar ha Bukspänning eller som är gravid. För peristaltiska rörelser är det viktigt att vänta några sekunder tills den peristaltiska vågen passerar eftersom luft inblåsning slutar inte peristaltiken.

Hittills har de flesta endoskopiska bedömningssystem används för att utvärdera murin tarmsjukdom är specifika för antingen kolit eller cancer. Med tanke på att dessa två villkor förekommer ofta samtidigt och kan interagera med varandra, ett standardiserat poängsystem som tar hänsyn till både inflammation och tumörbildning skulle i hög grad underlätta tvärvetenskaplig kommunikation, vilket ökar användbarheten av information som vunnits under gastrointestinal forskning av cancerforskare, och vice versa. Eftersom tumörer förekommer sällan utan att framkalla någon form av inflammatorisk förändring i kolorektal regionen in möss, har vi inkluderat tumörer i avsnittet decimal identifierare för vårt poängsystem för att unikt möjliggöra studier av tumörer i samband med tarmhälsa. För att öka kvaliteten och tillförlitligheten av poängsystem och underlätta dess användning i långtidsförsök eller kliniska försök, utvecklade vi också ett standardiserat rapportformulär för att använda tillsammans med det poängsystem (figur 2), som systematiskt lagrar de uppgifter som krävs för att beräkna murina tarminflammation poäng, som bygger på exakta definitioner för varje klassificeringskriterier.

Den tidigare tillgång till flera murina endoskopi poängsystem för begränsad giltighet hindrar tolkningen av resultaten över studierna. För att minimera förvirring upplevs av laboratoriepersonal för att avgöra vilken publicerade metod att använda, rekommenderar vi att utföra endoskopisk bedömning med hjälp av kriterier som kan härledas från tvådimensionella bilder (till exempel undvika kriterier that hänvisar till struktur eller konsekvens - av avföring,. Observera att vissa möss inklusive bakteriefri kan ha lös avföring), och som inte är co-linjär (dvs. som fysiologiskt och tidsmässigt drivs av samma inflammatoriska sammanhang) Eftersom kardinala tecken inflammation är sekventiell grund av kronologisk inflammatoriska händelser, rekommenderar vi följande kriterier: 1) tarm öppenhet, först beskrivits av Becker et al ^4, som en återspegling av väggtjocklek, 2) blödning, som en indikator på slemhinnor och blodkärl integritet. , 3) perianala fynd, som en indikator på kolon integritet och hudirritation eller anlag för överdriven inflammation, och 4) fokala lesioner, att gradera svårighetsgraden av inflammatoriska lesioner (som i möss främst ulcerös). Hittills har vi inte sett tumör lesioner i de typiska modeller av 3% DSS-inducerad murin kolit. Den murina endoskopiska poängsystem som beskrivs i detta dokument ger för första gången, så vitt vi veten kvantitativ ordning för utvärdering av förekomst och induktion av tumörartade lesioner i samband med kolon-inflammation.

För första gången har vi också lyfta fram vikten av att inkludera strikturer som en parameter vid mus-endoskopi, eftersom de verkar vara vanligt förekommande i vissa djurmodeller av tarminflammation, t.ex. SAMP / Yit / Fc. Strikturer representerar (semi) periferiområden submukosala kronisk inflammation, med förlust av tarm elasticitet på grund av ökad fibros, som är svåra att bedöma endoskopiskt för nybörjare. Vi har märkt i endoskopiskt definierade striktur drabbade möss, att det finns mer inflammation i segment som är proximal till förträngningen i jämförelse med de distala segmenten (som kan undersökas endoskopiskt), sannolikt på grund av långsammare tarmen. För forskningsändamål, är det lämpligt att följa upp djur histologiskt i slutet av experiment för att bättre karakterisera inflammationmatoriska reaktioner som flankerar kandidat striktur regioner.

Utan ordentlig utbildning och sakkunnig feedback, kan någon poängsystem har variabilitet vid varje given tidpunkt. Det är viktigt att betona att endoskopiska utbildningsförfaranden som genomförts på möss bör övervakas av en utbildad veterinär för vårdpersonal att se till: i) lämplig utbildning av andra forskare och tekniker, och ii) att se till att djur inte är fel diagnos eller oavsiktligt skadas under förfarandet. Rådfråga veterinär som ansvarar för ditt djur forskningsanläggning för expertråd innan du fortsätter att genomföra denna procedur för att säkerställa bästa möjliga praxis och djurens välbefinnande. Det är tillrådligt att rutinmässigt övervaka prestandan hos utbildade endoscopists. Använd bilder som vi har presenteras här som riktlinjer, slumpa ordningen som djur utvärderas, och bedöma varje djur i blindad. Konsultera parameterdefinitioner och protokollkriterier regelbundet och kEEP dem till hands vid endoskopi och poängsättning § 6).

Sammanfattningsvis, som ett team av medicinska och veterinära gastroenterologer, presenterar vi ett standardiserat protokoll och semi-kvantitativ poängsystem för endoskopisk utvärdering av musmodeller av kolit och tumörer. Dessa forskningsverktyg gör det möjligt för forskare att utföra rutinmässiga murina endoskopi, och gör att forskningspersonal på alla nivåer av erfarenhet att skapa reproducerbara och jämförbara mått på tarminflammation och tumörbildning över laboratorier och mellan discipliner. Vi har utvecklat systemet för att producera meningsfulla numeriska poängen med hög validitet, och tillhandahålls funktioner för snabb spårning av vissa iakttagelser, som kan vara anpassningsbar för internt bruk inom enskilda laboratorier. Vi beskriver också en diskriminerande scoring alternativ som tar hänsyn till skillnader i den regionala mottaglighet för sjukdomar i tjocktarmen (se avsnitt E, ̵6; Distal-proximala endoskopisk kolit poängsystem, akronym D-PECS). Datarapportform och vissa siffror kan användas som vägg-affischer för att hjälpa oerfarna forskare (fig. 1, 3, 5, 6). Ett framgångsrikt genomförande av murina endoskopi hänger på att bli bekant med den normala anatomin i mukokutan korsningen i anus, ändtarmen, kolon, och omgivande inälvor, som anatomiska skillnader står för subtila endoskopiska skillnader ^17.

Även idag även de minsta, mest flexibla och finaste endoskopiska tekniker inte kan nå den proximala kolon in vivo, snabbrörliga tekniska framsteg inom området för kapseln och enda fiber endoskopi kan bli tillgängliga för möss i en nära framtid. Den standardiserade protokoll och endoskopisk poängsystem som presenteras i detta dokument utgör värdefulla verktyg för att visualisera och bedöma statusen på murina tarmmiljön i levande djur. Dessa verktyg kommer att underlättalätta jämförbarhet av resultat mellan papper och mellan discipliner, och kommer att ha tillämplighet på nya och framväxande murina endoskopiska tekniker.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Isoflurane, USP	Webster Veterinary
Surgical lubricant	Savage laboratories	surgilube, 0281-0205-45
Phosphate Buffered Saline	Thermo Scientific	SH30256
RNAlater	Ambion	AM7021
Methylene Blue 1% Aqueous Solution	Fisher Science Education	S96393
Flexible digital ureteroscope	Olympus America	URF-V
Video system center	Olympus America	VISERA Pro OTV-S7 Pro
Xenon light source	Olympus America	VISERA Pro CLV-S40 Pro
Video recorder	MediCapture, Inc.	MediCap USB200
Flexible biopsy cup forceps	Olympus America	FBC-3115
Anesthesia machine	Euthanex Corporation	EZ-7000 Classic System