FIBS habilitado Noninvasive Metabolic Profiling

Resumo

Uma descrição de como calibrar transferência Förster Resonance Energy sensores biológicos integrados (FIBS) no perfil metabólico situ é apresentado. Os FIBS pode ser utilizado para medir os níveis intracelulares de metabolitos de forma não invasiva, contribuindo para o desenvolvimento de modelos metabólicas e elevado rendimento de rastreio de condições de bioprocessamento.

Resumo

Na era da biologia computacional, novos sistemas experimentais de alto rendimento são necessárias para preencher e refinar os modelos para que possam ser validadas para fins preditivos. Idealmente esses sistemas seria baixo volume, o que impede análises de amostragem e destrutivas, quando os dados do curso do tempo devem ser obtidos. O que é necessário é uma ferramenta de monitoramento em situ que pode relatar as informações necessárias em tempo real e de forma não invasiva. Uma opção interessante é a utilização de fluorescência, em sensores biológicos in vivo como repórteres de concentrações intracelulares baseados em proteína. Uma classe especial de in vivo biossensores que tem encontrado aplicações em metabolito quantificação baseia-se na transferência de energia de ressonância de Förster (FRET) entre duas proteínas fluorescentes ligadas por um domínio de ligação ao ligando. FRET sensores biológicos integrados (FIBS) são constitutivamente produzido dentro da linha celular, eles têm tempos de resposta rápidos e sua cha espectralcas mudar de acordo com a concentração de metabolito no interior da célula. Neste papel, o método para a construção de ovário de hamster chinês (CHO), linhas celulares que expressam constitutivamente um FIBS para glicose e glutamina e calibrar os FIBS in vivo em cultura de células em lotes a fim de permitir futura quantificação da concentração intracelular do metabolito é descrito. Os dados de batelada alimentada CHO culturas celulares demonstra que os FIBS foi capaz, em cada caso, para detectar a alteração resultante na concentração intracelular. Usando o sinal de fluorescência a partir das FIBS e a curva de calibração construída anteriormente, a concentração intracelular foi determinada com precisão, como confirmado por um ensaio enzimático independente.

Introdução

Monitoramento metabolito tem diversas aplicações em bioprocessing, incluindo o desenvolvimento de processos, mídia e design de alimentação e engenharia metabólica. Vários métodos estão disponíveis para as medições de concentração através da utilização de ^um enzimática, química ^2, ou ensaios de ligação ^3. Uma opção interessante é a utilização de fluorescência, em sensores biológicos in vivo como repórteres da concentração intracelular de metabolitos essenciais à base de proteínas. Em ensaios de ultra-baixo volume, a fluorescência é uma ferramenta conveniente como miniaturização realmente melhora a taxa de ^4,5

Protocolo

1. Celular Linha Revival e Manutenção

1. Reviver as células CHO em 9 ml de meio CD-CHO suplementado com 8 mM de L-glutamina e 10 ml / L de suplemento de 100x hipoxantina / timidina (meio de crescimento completo).
2. Centrifugar a 100 xg durante 5 min.
3. Ressuspender as células em 10 ml de meio de crescimento completo fresco.
4. Retirar uma amostra de 1 ml e determinar a concentração de células viáveis ​​por microscopia de luz, utilizando o método de exclusão do corante azul tripano num hemocitómetro.
5. Iniciar uma cultura com uma densidade de sementeira de 3 x 10 ⁵ células / ml em 125 ml de frascos de agitação.

Resultados

Uma visão geral da metodologia é apresentada na Figura 2. No trabalho aqui apresentado, as células CHO foram transfectadas com o vector de linhas de células estáveis ​​foram seleccionadas FIBS e a uma pressão de antibiótico de 400 ug / ml de zeocina. Por conseguinte, foram criadas duas linhas de células estáveis ​​que expressam constitutivamente separados os sensores de glicose e glutamina. Figura 1 representa as configurações dos dois biossensores utilizados neste estudo. O sensor de g.......

Discussão

Os FIBS activar in vivo e in situ, a quantificação de moléculas-chave, neste caso nutrientes limitantes do crescimento, eliminando incertezas decorrentes de têmpera e métodos de extracção. Os resultados sugerem que existe uma boa correlação entre o sinal FIBS e as concentrações intracelulares na gama de 1-5 mM de glicose e 0,3-2 mM de glutamina. No lote CHO cultura de células, estas concentrações são encontradas nas fases de declínio exponencial, estacionárias, e no início. As fases exponencial e estacionária s.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
CHO-S Cells	Life Tecnologies	11619-012	A linha celular varia de acordo com os objetivos do estudo
vetor pCDNA4/TO	Life Tecnologies
TransIT-PRO Reagente de Transfecção	Mirus Bio	MIR 5700	As transfecções podem ser realizadas usando qualquer método adequado para a linha celular em estudo
Meio Zeocin	Invivogen
CD-CHO	Life Technologies	10743-011	O meio de crescimento celular depende das células em estudo
100x HT Suplemento	Life Technologies	11067-030
L-Glutamina 200 mM (100x), Liquid	Life Technologies	25030032
Leitor de placas InfinitePRO 200	Tecan	FLx800TBI	Qualquer leitor de placas de fluorescência de 96 poços que possa acessar os comprimentos de onda necessários pode ser substituído
Filtros para leitor de placas	Tecan	30000463
Kit de Purificação de Plasmídeos Maxiprep	Qiagen	12163	Qualquer kit adequado pode ser substituído pelo
kit de ensaio de glicose/glicose oxidase Amplex Red	Invitrogen	A22189	Qualquer kit adequado pode ser substituído por
EnzyChrom  Kit de Ensaio de Glutamina	BioAssay Systems	EOAC-100	Qualquer kit adequado pode ser substituído
Hemocitômetro Neubauer Melhorado	Incubadora Fisher Scientific	MNK-420-010N
	Nuaire	NU-5510E