Summary
Aquí se describe un protocolo utilizando el navegante mutagénesis-mini Himar1 transposón mediada para generar una biblioteca de mutantes de inserción de alta densidad de la pantalla, aislar e identificar nuevos reguladores de alginato en el prototípico cepa PAO1 Pseudomonas aeruginosa.
Abstract
Pseudomonas aeruginosa es una bacteria Gram-negativa, del medio ambiente con capacidades metabólicas versátiles. P. aeruginosa es una bacteria patógena oportunista que produce infecciones pulmonares crónicas en pacientes con fibrosis quística (FQ). La sobreproducción de un polisacárido capsular llamado alginato, también conocido como mucoidy, promueve la formación de biopelículas mucoides que son más resistentes que las células planctónicas a la quimioterapia antibiótico y las defensas del huésped. Además, la conversión de la nonmucoid a fenotipo mucoide es un marcador clínico para el inicio de la infección crónica en la FQ. Sobreproducción de alginato por P. aeruginosa es un proceso que en gran medida endergónica impuestos sobre la energía celular. Por lo tanto, la producción de alginato está muy regulada en P. aeruginosa. Para entender mejor la regulación de alginato, se describe un protocolo usando el transposón de mutagénesis de mini-Himar1 para la identificación de nuevos regulador de alginatos en una cepa PAO1 prototípico. El procedimiento consta de dos pasos básicos. En primer lugar, hemos transferido el transposón mini-Himar1 (PFA) del huésped E. coli SM10/λpir en receptor P. aeruginosa PAO1 a través de la conjugación biparental para crear una biblioteca de mutantes de inserción de alta densidad, los cuales fueron seleccionados en placas de agar de Pseudomonas aislamiento suplementado con gentamicina. En segundo lugar, hemos examinado y aislaron las colonias mucoides para asignar el lugar de la inserción a través de PCR inversa usando cebadores de ADN que apuntan hacia el exterior desde el casete de gentamicina y la secuenciación del ADN. El uso de este protocolo, se han identificado dos nuevos reguladores de alginato, Muce (PA4033) y kinB (PA5484), en PAO1 cepa con una de tipo salvaje mucA codifica el factor anti-sigma MUCA para el maestro de alginato regulador AlgU (ALGT, σ 22) . Este protocolo de mutagénesis de alto rendimiento puede ser modificado para la identificación de otros genes relacionados con la virulencia que causa el cambio en Colomorfología ny.
Introduction
La capacidad de la oportunista, patógenos Gram-negativa Pseudomonas aeruginosa para sobreproducir alginato es un factor importante en su capacidad para establecer un biofilm. La sobreproducción de alginato es un fenotipo a menudo referido como mucoidy. El aislamiento de colonias mucosas de los esputos de los individuos que sufren de fibrosis quística (FQ) es indicativo de una infección crónica y se asocia directamente con una disminución general de la salud del paciente 1. En la actualidad, se entiende que la regulación y la producción de alginato en P. aeruginosa se produce principalmente en dos operones. El primero es el operón biosintético de alginato, que contiene 12 genes (algD - Alg8 - Alg44 - algK - Alge - AlgG - Algx - algL - Algi - algJ - algF - alga) que son responsables de la síntesis y la exportación del polímero de alginato través el periplasma para el med extracelularnt 2-5. El segundo operón es un grupo de genes a partir de la alternativa sigma factor AlgU / T y continuando con mucA, mucB y MUCD. AlgU / T es un regulador positivo, mientras que MUCAB-D se clasifican como reguladores negativos de la producción de alginato 6-8. Además, los reguladores transcripcionales, tales como ALGB, AlgQ, ALGR, y RpoN, así como post-transcripcional y post-translacional modificación por el control de la represión catabólica, la actividad quinasa (KinB) y intramembrane proteólisis, también se han demostrado estar involucrados en alginato regulación 9-14.
El vector transposón mini-Himar1 conocida como Comisión PFA fue creado originalmente en el laboratorio del Dr. Mekalanos 'en Harvard Medical School 15. El plásmido PFA consta de un elemento transponible flanqueado por dos repeticiones invertidas de 27 pb y un casete de gentamicina de resistencia en el medio (aacC1: 534 pb), un gen que codifica la hyperactive transposasa Mariner 16, y una codificación de β-lactamasa gen (bla) (Figura 1). Secuencia de la información para el elemento de transposición de la Comisión PFA está disponible en el número de acceso de GenBank: DQ366300 13. En la Comisión PFA, hay un sitio de clonación múltiple (MCS) detrás del gen aacC1 que se utiliza para la identificación del sitio de inserción cromosómica utilizando PCR inversa. Una gran ventaja con el uso del transposón mini-Himar1 es que no se requieren factores del huésped específicos de transposición (mutagénesis). Además, hay una alta abundancia de los sitios de inserción de dinucleótidos TA se encuentran en todo el genoma de P. aeruginosa. Por ejemplo, AT sitios de inserción dinucleótido produce 94.404 y 100.229 veces en el PAO1 (6.264.404 bps, número de acceso GenBank NC_002516.2) y PA14 (6.537.648 bps; número de acceso GenBank NC_008463) genomas, respectivamente. Debido a la abundancia de TA dinucleótido en el genoma, mini-Himar1 mini-Himar1 puede insertar en cualquier gen no esencial dentro del genoma de P. aeruginosa. Esto proporciona aproximadamente 18 sitios de inserción de asistencia técnica al marco de lectura abierto en el genoma PAO1.
Aquí se describe un protocolo utilizando mini-Himar1 transposón mutagénesis mediada por identificar nuevos reguladores de mucoidy en P. aeruginosa. Más específicamente, biparental conjugamos el vector de la Comisión PFA contiene un transposón mini-Himar1 de E. coli SM10/λpir en el nonmucoid cepa PAO1 prototrophic. Después de que el transposón se integra en el genoma, la cepa receptora se cultiva en Pseudomonas aislamiento agar (PIA) que contiene triclosán que inhibe el crecimiento de E. coli. Por lo tanto, una biblioteca de mutantes de
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Protocol
1. Preparación de cepas bacterianas y biparental Conjugación
- Inocular E. coli SM10/λpir/pFAC en 5 ml de caldo Luria (LB) suplementado con 15 g / ml de gentamicina y colocar en una incubadora de agitación durante la noche a 37 ° C.
- Inocular P. aeruginosa cepa PAO1 en 5 ml de LB, y colóquelo en un incubador con agitación durante la noche a 42 ° C.
- Mida OD 600 de cultivos de una noche y mezclar cantidades iguales de PAO1 y E. coli Pfac de tal manera que el volumen final es de entre 1-1,4 ml.
- Mezcla Centrifugar a 6000 xg durante 5 min.
- Mientras tanto, secar placas de LB para la conjugación: deje los platos abiertos en una incubadora a 37 ° C durante 10-15 min.
- Retire todos menos 50 l de sobrenadante de la mezcla de células.
- Resuspender el sedimento celular en los 50 l restantes de sobrenadante y la pipeta sobre una placa de LB seco en una gotita compacto.
- Coloque con cuidado la placa bajo una campana extractora que se seque (IMPONota rtante: No permita que las células se distribuyen en la placa, esto disminuirá significativamente la eficacia de la conjugación).
- Una vez que la gotita está seco, invertir la placa de LB y se incuba a 37 ° C durante 4-6 horas.
- Mientras que la mezcla de células se está incubando, preparar grandes (150 mm DE x 15 mm) Placas de PIA con 300 g / ml de gentamicina. Antes de su uso, eliminar la humedad residual mediante la colocación en una incubadora a 37 ° C durante 15-20 min.
- Después de la incubación de la mezcla de células es completa, recoger las células usando un asa de inoculación estéril y en un tubo de microcentrífuga que contiene 1 ml de LB y vórtice, o una pipeta, para mezclar a fondo.
- Separe las células uniformemente sobre las planchas de PIA contienen 300 g / ml de gentamicina. (IMPORTANTE: Para este paso, lo mejor es añadir volúmenes crecientes de la mezcla de células para separar las placas (por ejemplo, la placa 1: 10 l, de la Plata 2: 50 l, de la Plata 3: 100 l, de la Plata 4: 500 l, etc) .
- Incubar durante la noche a 37° C.
2. Detección y aislamiento de colonias mucosas
- Retire las placas de la incubadora y examinar las colonias mucoides.
- Aislar una sola colonia mucoide y consecutivas para el aislamiento en placas pequeñas (OD 100 x 10 mm) con PIA y 300 g / ml de gentamicina.
- Incubar toda la noche a 37 ° C.
- Repita el paso 2.2 en el cultivo de la noche anterior.
- Repita los pasos 2.2 hasta 2.4 dos veces más para determinar la estabilidad de la cepa mucoide.
- Después de la etapa final de aislamiento, inocular 4,5 ml de LB con una sola colonia mucoide e incubar en agitador durante la noche a 37 ° C.
- Al día siguiente, la etiqueta 3 tubos de microcentrífuga para cada mutante mucoide.
- Preparar dos alícuotas de 1,25 ml de cultivo de una noche en 2 tubos para la extracción de ADN genómico y la identificación del sitio de inserción del transposón (véase el Protocolo 3).
- Además, archivar cada mutante mucoide con la pipeta 1 ml de cultivo durante la noche en una CRÉDITOScriovial Ely marcado que contiene un volumen igual de leche descremada 10%. Almacenar a -86 ° C.
3. ADNg digestión de restricción y la ligadura
- Extracto de ADNg de la mutante mucoide usando cualquier método preferido (fenol-cloroformo, por ejemplo, la columna. Espín, etc.)
- Determinar la concentración de la ADNg, digerir un total de 2 g con 1 l de la endonucleasa de restricción SalI, 0,5 l de albúmina de suero bovino, 5 l de tampón de enzima SalI (NaCl 100 mM, Tris-HCl 50, 10 mM de MgCl 2 , 1 mM de ditiotreitol (DTT), pH 7,9 a temperatura ambiente), y el volumen apropiado de dH2O para conseguir un volumen total de 50 l.
- Digerir el ADN durante la noche a 37 ° C. (IMPORTANTE:. Dependiendo de la eficiencia de la enzima de restricción, puede ser necesario añadir un adicional de 1 l para la noche a la mañana digest y se incuba a 37 ° C durante 1-2 horas Esto es además de la noche a la mañana digest.)
- Se purifica el digeSTED ADN usando cualquier método preferido (por ejemplo, purificación en gel de agarosa, columnas de centrifugado) y se eluye con 25 l de tampón.
- Se liga el ADN digerido mediante la mezcla de 11 l de ADN purificado con una concentración preferida de ~ 10-20 ng / l, 1,5 l de tampón de ligadura (330 mM de Tris-acetato, pH 7,5, 660 mM de acetato de potasio, acetato de magnesio 100 mM, 5 mM TDT), 1,5 l de ATP 100 mM y 1 l de ADN ligasa.
- Incubar la mezcla durante 15 min a temperatura ambiente, y después inactivar la enzima por incubación durante 15 min a 70 ° C. (Nota: la incubación de la mezcla a temperatura ambiente durante más tiempo puede aumentar el éxito de la ligadura).
4. PCR inversa (iPCR) y Análisis de Secuencia
- Realice iPCR el producto de ligación utilizando la siguiente adelante y atrás primers y ciclos térmicos condiciones:
-Forward Primer (Gm3OUT): GGGCATACGGGAAGAAGTGA
-Reverse Primer (Gm5OUT): GACTGCCCTGCTGCGTAACA
Termociclador Condiciones:
1. 94 ° C durante 1 min.
2. 94 ° C durante 1 min.
3. 58 ° C durante 2 min.
4. 72 ° C durante 2 min.
5. 72 ° C durante 8 min.
6. 10 ° C espera.
Repita los pasos 2-4 para 34 ciclos.
(NOTA: Los productos de Amplified iPCR pueden almacenarse a 4 ° C) - Realice la electroforesis en gel de agarosa para confirmar la amplificación exitosa iPCR.
- Lleve a cabo la secuenciación del producto iPCR utilizando los cebadores Gm3OUT y Gm5OUT. El sitio de inserción y la orientación de Himar1 se asignan a cabo.
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Representative Results
Como se ilustra en la Figura 1, el vector de transposón mariner-Mini Himar1, PFA, contiene dos repeticiones invertidas de 27 pb con sitios de inserción de AT que flanquean el casete de resistencia a gentamicina aacC1, con su promotor σ 70-dependientes, y un sitio de clonación múltiple (MCS). Además, el vector de la Comisión PFA contiene genes que codifican la transposasa altamente activo Himar1, β-lactamasa (bla), y el operón de transferencia de TRA. Los sitios de inserción TA permiten una integración eficiente en el genoma de P. aeruginosa cepas. La exactitud en la identificación y selección de mutantes mucoides es crítico para el éxito general en la determinación de los loci de genes implicados en la regulación de alginato. Ejemplos de cepas mucoides y nonmucoid se muestran en la Figura 1.
Para identificar con mayor precisión los mutantes mucoides, las conjugaciones completados deben sembraron en placas múltiples de gran tamaño (150 mm). La cemezclas ll deben resuspendieron en PBS estéril y se sembraron mediante la difusión sobre las placas PIA más gentamicina (300 mg / ml). Las diluciones de la mezcla de células en PBS se repartirán en las placas con el objetivo de que entre 1.000-3.000 colonias / placa. Basado en el protocolo anterior, cada conjugación debe producir un banco de ~ 20.000 mutantes más de 15 a 20 platos grandes. Tiempo de incubación óptimo para las placas a 37 ° C es entre 24-36 horas. Debido a la sobreproducción de alginato, la colonia mucoide debe ser transparente o de color blanco y tienen aspecto cremoso o viscosa. Si colonias mucoides no se pueden discernir, a continuación, se incuba durante un 24-36 h adicionales a temperatura ambiente. Los mutantes mucoides están mejor aislados mediante el paso tres veces en un plato regular de PIA con gentamicina. Durante este tiempo, se puede determinar la estabilidad del fenotipo mucoide. La colonia mucoide purificada se utiliza para la extracción de ADN genómico y la identificación de los genes por iPCR. productos iPCR se pueden visualizar usando gel de agarosa ELectrophoresis (Figura 2). Si tiene éxito, debería haber un solo amplicón en el tamaño apropiado. PAO1 de ADN genómico que se ha sometido a digestión de restricción y la ligadura se puede utilizar como un control negativo. Como se ilustra en la Figura 2, hay una ausencia de iPCR amplicón en PAO1, sin embargo detectamos un único amplicón de ~ 1400 pb y ~ 1000 pb en PAO1-VE2 y PAO1-VE13, respectivamente. El tamaño de estos amplicones corresponde a la inserción del transposón mariner Himar1 en la región promotora de PA4033 (Muce) en PAO1-VE2 y internamente en PA5484 (kinB) en PAO1-VE13. La secuenciación del ADN de los amplicones iPCR debe llevarse a cabo con el cebador GM5OUT. Cuando se utiliza la herramienta de búsqueda de alineamiento local básico (BLAST) para analizar la secuencia diana, la repetición invertida en el extremo 5 'de la Comisión PFA y TA dinucleótido marcar el sitio y la orientación de la inserción Himar1 en el genoma de P. aeruginosa (Figura 2 g>).
Figura 1. Diagrama esquemático de mini-Himar1 vector de transposón mariner, PFA, y una representación de mutantes mucoides. Plásmido PFA contiene un elemento Himar1 mariner transposón con dos repeticiones invertidas, y un casete de resistencia a gentamicina (aacC1) para la selección, un gen que codifica la transposasa hiperactiva Himar1 , y un replicón condicional. El marinero transposón mini-Himar1 puede causar la inserción de alta densidad de P. aeruginosa debido a la abundancia de sustrato (TA dinucleótido). El número de dinucleótidos TA en los genomas de dos P. aeruginosa cepas, PAO1 y PA14 se muestran en rojo. Las flechas rojas indican los mutantes mucoides identificados mediante este procedimiento.om/files/ftp_upload/51346/51346fig1highres.jpg "target =" _blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. . Representante iPCR y resultados de la secuenciación A) 1% electroforesis en gel de agarosa de la amplificación iPCR utilizando los primers Forward Gm3OUT y Gm5OUT inversa y una escalera de 1 kB: PAO1 (control negativo), PAO1-VE2 (1396 pb) y PAO1-VE13 (999 pb). El ADN genómico de tres cepas de P. aeruginosa se extrajo y se digirió con enzimas de restricción SalI, seguido por la auto-ligación. El ADN circular cerrado se utilizó como plantillas para iPCR como se describe en el texto. B) Análisis comparativo de secuencias usando el genoma de referencia PAO1 determina la ubicación precisa de la Marin Himar1inserción del transposón er en PAO1-VE2 y PAO1-VE13. La secuencia marcada en rojo indica el extremo 5 'de repetición invertida en PFA. Se insistió en la zona de inserción del TA. Una búsqueda BLAST de estas dos secuencias se mapa la ubicación exacta y la orientación del transposón Himar1 dentro del genoma de PAO1.
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Discussion
Es importante señalar que este método se puede utilizar en otras especies de Pseudomonas con estas alteraciones: incubar P. y P. fluorescens putida a 30 ° C, y P. stutzeri a 42 ° C; P. stuzeri debe cultivarse en placas de LB suplementadas con 150 g / ml de gentamicina; en el paso 1,11, p células stutzeri deben transferirse en 500 l de LB en lugar de 1 ml. Además, hay dos pasos críticos para este protocolo. En primer lugar, la cepa receptora debe cultivarse a la temperatura apropiada. Por ejemplo, PAO1 debe ser incubado a 42 ° C para aumentar la frecuencia de recombinación 15. La eficiencia de la biblioteca mutante se redujo de manera significativa si la cepa receptora si no se cultivó a la temperatura correcta. En segundo lugar, iPCR es altamente reproducible, pero el ADNg debe estar completamente digerido para hacer asegurar que un ADN circular cerrado covalentemente puede hacerse a través de ligación de ADN. Yof esto se hace correctamente, el producto iPCR aparecerá como una banda en un gel de agarosa. Si se identifican múltiples bandas, que indican que hay múltiples inserciones en el mutante. Se encontró que los resultados de iPCR fueron fuertemente correlacionados con nuestros resultados de transferencia de Southern (~ 100%). Por lo tanto, iPCR se puede utilizar en lugar del análisis de transferencia de Southern para el número de inserciones por mutante.
El marinero transposón mini-Himar1 en PFA no tiene terminador de la transcripción, y que se regula a través de un promotor σ 70-dependientes de dirigir la expresión de la casete de gentamicina. Se observó que la posición y orientación de la inserción Himar1 tenían diversos efectos sobre la regulación de un gen particular. Los genes se inactivan cuando se integra en el medio de un gen. Un ejemplo de esto es la inactivación del gen de la quinasa sensorial kinB (PA5484) que provoca una conversión a mucoidy en PAO1 (PAO1-VE13) 11. Además, también puede up-regular la expresión del gen, si está insertada aguas arriba de la región codificante en la misma orientación que el gen. Un ejemplo de esto es PAO1-VE2, donde el Himar1 impulsa la expresión de Muce (PA4033) 13. La limitación de este protocolo es que sólo los genes reguladores que no son esenciales para el crecimiento pueden ser identificados. Además, los mutantes mucoides identificados con este método no se pueden producir de forma natural.
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Disclosures
El autor Hongwei D. Yu es el oficial científico jefe y cofundador de progénesis Technologies, LLC.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por la National Aeronautics and Space Administration West Virginia Espacio de Grant Consorcio (NASA WVSGC), Cystic Fibrosis Foundation (CFF-YU11G0) y NIH P20RR016477 y P20GM103434 a la Red IDEA West Virginia para la Investigación Biomédica de Excelencia. Damos las gracias a M. Vonya Eisinger para la asistencia técnica con este trabajo.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Luria Broth | Difco | 240230 | via Fisher Scientific |
| Pseudomonas isolation agar | Difco | 292710 | via Fisher Scientific |
| Small Plates (100 O.D. x 10 mm) | Fisher Scientific | 08-757-13 | |
| Large Plates (150 O.D. x 15 mm) | Fisher Scientific | 08-757-14 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | BP229-4 | |
| Benchtop Shaking Incubator | New Brunswick Scientific | Innova 4080 | shake at 200 rpm |
| Cabinet Incubator | VWR | 1540 | |
| Benchtop Microcentrifuge | Sorvall | 75-003-287 | via Fisher Scientific |
| SmartSpec Plus Spectrophotometer | Bio-Rad | 170-2525 | or preferred method/vendor |
| Diposable Inoculation Loops | Fisher Scientific | 22-363-597 | |
| 1.5 ml Microcentrifuge Tubes | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| 2.0 ml Cryogenic Vials | Corning | 430659 | via Fisher Scientific |
| 15 ml Tubes | Fisher Scientific | 05-539-12 | |
| Skim Milk | Difco | DF0032-17-3 | via Fisher Scientific |
| DNeasy Blood and Tissue (250) | Qiagen | 69506 | or preferred method/vendor |
| QIAquick PCR Purification Kit (250) | Qiagen | 28106 | or preferred method/vendor |
| QIAprep Spin Miniprep Kit (250) | Qiagen | 27106 | or preferred method/vendor |
| FastLink II DNA Ligation Kit | Epicentre Technologies | LK6201H | via Fisher Scientific |
| Accu block Digital Dry Bath | Labnet | NC0205808 | via Fisher Scientific |
| Sal1, restriction endonuclease | New England BioLabs | R0138L | |
| EasyStart Micro 50 | Molecular BioProducts | 6020 | via Fisher Scientific |
| Taq DNA Polymerase | New England BioLabs | M0267L | |
| iCycler, Thermocycler | Bio-Rad | 170-8740 | |
| LE agarose | Genemate | 3120-500 | via Fisher Scientific |
| Gentamycin Sulfate | Fisher Scientific | BP918-1 | |
| 2.0 ml Cryogenic Vials | Corning | 430659 | via Fisher Scientific |
References
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