Summary
यहाँ हम स्क्रीन करने के लिए एक उच्च घनत्व प्रविष्टि उत्परिवर्ती पुस्तकालय पैदा करने के लिए मिनी himar1 नाविक transposon की मध्यस्थता mutagenesis का उपयोग कर एक प्रोटोकॉल का वर्णन अलग और prototypic Pseudomonas aeruginosa तनाव PAO1 में उपन्यास alginate नियामकों की पहचान.
Abstract
Pseudomonas aeruginosa बहुमुखी चयापचय क्षमताओं के साथ एक ग्राम नकारात्मक, पर्यावरण जीवाणु है. पी. aeruginosa सिस्टिक फाइब्रोसिस (CF) के साथ रोगियों में पुरानी फेफड़े के संक्रमण स्थापित करता है जो एक अवसरवादी जीवाणु रोगज़नक़ है. भी mucoidy के रूप में जाना alginate नामक सम्पुटी polysaccharide, के overproduction, एंटीबायोटिक कीमोथेरेपी और मेजबान गढ़ को planktonic कोशिकाओं की तुलना में अधिक प्रतिरोधी रहे हैं जो mucoid biofilms के गठन को बढ़ावा देता है. इसके अतिरिक्त, mucoid फेनोटाइप को nonmucoid से रूपांतरण CF में पुराने संक्रमण की शुरुआत के लिए एक नैदानिक मार्कर है. पी. द्वारा Alginate overproduction aeruginosa भारी सेलुलर ऊर्जा करों जो एक endergonic प्रक्रिया है. इसलिए, alginate उत्पादन अत्यधिक पी. में नियंत्रित किया जाता है aeruginosa. बेहतर alginate विनियमन समझने के लिए, हम उपन्यास alginate नियामक की पहचान के लिए मिनी himar1 transposon mutagenesis का उपयोग कर एक प्रोटोकॉल का वर्णनएक prototypic तनाव PAO1 में है. प्रक्रिया दो मूल चरण होते हैं. सबसे पहले, हम मेजबान ई. से मिनी himar1 transposon (pFAC) का तबादला प्राप्तकर्ता पी. में कोली SM10/λpir gentamycin के साथ पूरक स्यूडोमोनास अलगाव अगर प्लेटों पर चयन किया गया था, जो एक उच्च घनत्व प्रविष्टि उत्परिवर्ती पुस्तकालय बनाने के लिए biparental विकार के माध्यम से aeruginosa PAO1. दूसरे, हम जांच की और gentamycin कैसेट और डीएनए अनुक्रमण से बाहर की ओर इशारा करते हुए डीएनए प्राइमरों का उपयोग उलटा पीसीआर के माध्यम से प्रविष्टि साइट मैप करने mucoid कालोनियों को अलग किया. इस प्रोटोकॉल का उपयोग करना, हम (22 σ AlgT,) एक जंगली प्रकार mucA मास्टर alginate नियामक AlgU के लिए विरोधी सिग्मा कारक MucA एन्कोडिंग के साथ तनाव PAO1 में दो उपन्यास alginate नियामकों, mucE (PA4033) और kinB (PA5484), की पहचान की है . इस उच्च throughput mutagenesis के प्रोटोकॉल रंग में परिवर्तन के कारण अन्य डाह से संबंधित जीन की पहचान के लिए संशोधित किया जा सकता हैNY आकारिकी.
Introduction
alginate overproduce को अवसरवादी, ग्राम नकारात्मक रोगज़नक़ Pseudomonas aeruginosa की क्षमता एक biofilm स्थापित करने की अपनी क्षमता में एक प्रमुख कारक है. alginate के overproduction अक्सर के रूप में mucoidy में संदर्भित एक phenotype है. सिस्टिक फाइब्रोसिस (CF) से पीड़ित व्यक्तियों के sputa से mucoid कालोनियों के अलगाव के एक पुराने संक्रमण का संकेत है, और सीधे मरीज के स्वास्थ्य 1 में एक समग्र गिरावट के साथ जुड़ा हुआ है. वर्तमान में, यह समझा जाता है कि पी. में alginate के नियमन और उत्पादन aeruginosa मुख्य रूप से दो operons पर होता है. भर alginate बहुलक संश्लेषण और निर्यात के लिए जिम्मेदार हैं कि (ALGA - alg8 - alg44 - algK - ALGE - algG - algX - algL - algi - algJ - - algF algD) पहले 12 जीन होता है जो alginate biosynthetic operon, है बाह्य environme को periplasmNT 2-5. दूसरी operon वैकल्पिक सिग्मा कारक algU / टी के साथ शुरुआत और mucA, mucB, और mucD के साथ जारी रखने के जीन का एक समूह है. MucAB डी alginate उत्पादन 6-8 की नकारात्मक नियामकों के रूप में वर्गीकृत किया जाता है, जबकि AlgU / टी, एक सकारात्मक नियामक है. इसके अतिरिक्त, ट्रांसक्रिप्शनल ऐसे AlgB, AlgQ, AlgR, और RpoN के रूप में नियामकों,, साथ ही बाद transcriptional और कैटाबोलाइट दमन नियंत्रण, kinase गतिविधि (KinB) और intramembrane proteolysis द्वारा बाद translational संशोधन, भी alginate में शामिल होने के लिए दिखाया गया है विनियमन 9-14.
pFAC के रूप में जाना मिनी himar1 transposon वेक्टर मूल हार्वर्ड मेडिकल स्कूल के 15 में डॉ. Mekalanos 'प्रयोगशाला में बनाया गया था. pFAC प्लाज्मिड दो 27 बीपीएस का उलटा दोहराता है और बीच में एक gentamycin प्रतिरोध कैसेट (aacC1: 534 बीपी) से घिरे एक transposable तत्व होते हैं, hyperact एक जीन एन्कोडिंगनाविक Transposase 16, और एक जीन एन्कोडिंग β-lactamase (bla) (चित्रा 1) ive. DQ366300 13: pFAC की transposable तत्व के लिए अनुक्रम जानकारी परिग्रहण संख्या में उपलब्ध है. PFAC में, उलटा पीसीआर का उपयोग गुणसूत्र प्रविष्टि साइट की पहचान के लिए प्रयोग किया जाता है जो aacC1 जीन के पीछे एक कई क्लोनिंग साइट (एमसीएस) है. मिनी himar1 transposon उपयोग करने के साथ एक प्रमुख लाभ कोई विशिष्ट मेजबान कारकों स्थानांतरण (mutagenesis) के लिए आवश्यक हैं है. इसके अतिरिक्त, पी. के जीनोम भर में पाया टीए डाईन्यूक्लियोटाइड प्रविष्टि साइटों के उच्च बहुतायत है aeruginosa. क्रमशः, जीनोम, उदाहरण के लिए, टीए डाईन्यूक्लियोटाइड प्रविष्टि साइटों PAO1 में 94,404 और 100,229 बार होता है (6,264,404 बीपीएस, परिग्रहण संख्या NC_002516.2) और PA14 (GenBank पहुंच नंबर NC_008463 6,537,648 बीपीएस). क्योंकि जीनोम, मिनी himar1 में प्रादेशिक सेना डाईन्यूक्लियोटाइड की बहुतायत के himar1 transposon पी. के जीनोम के भीतर किसी भी अनावश्यक जीन में सम्मिलित कर सकते हैं aeruginosa. इस PAO1 जीनोम में खुला पढ़ने फ्रेम प्रति लगभग 18 टीए प्रविष्टि साइटों प्रदान करता है.
यहाँ, हम पी. में mucoidy के उपन्यास नियामकों की पहचान करने के लिए मिनी himar1 transposon की मध्यस्थता mutagenesis का उपयोग कर एक प्रोटोकॉल का वर्णन aeruginosa. अधिक विशेष रूप से, हम biparentally ई. से एक मिनी himar1 transposon युक्त pFAC वेक्टर संयुग्मित nonmucoid prototrophic तनाव PAO1 में कोली SM10/λpir. Transposon जीनोम में एकीकृत है, के बाद प्राप्तकर्ता तनाव स्यूडोमोनास अलगाव अगर ई. के विकास को रोकता है जो (पीआईए) युक्त triclosan पर सुसंस्कृत है कोलाई. इस प्रकार, के म्यूटेंट का एक पुस्तकालय
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Protocol
1. जीवाणु उपभेदों की तैयारी और Biparental संयुग्मन
- ई. टीका लगाना 37 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात एक मिलाते इनक्यूबेटर में gentamycin और जगह की 15 माइक्रोग्राम / एमएल के साथ पूरक Luria शोरबा (पौंड) के 5 मिलीलीटर में कोली SM10/λpir/pFAC
- पी. टीका लगाना aeruginosa तनाव लेग के 5 मिलीलीटर में PAO1, और एक मिलाते इनक्यूबेटर में जगह रातोंरात 42 डिग्री सेल्सियस पर
- आयुध डिपो रातोंरात संस्कृतियों के 600 उपाय और PAO1 और ई. के बराबर राशि का मिश्रण कोली pFAC अंतिम मात्रा 1-1.4 मिलीलीटर के बीच इस तरह है कि.
- 5 मिनट के लिए 6000 XG पर अपकेंद्रित्र मिश्रण.
- इस बीच, विकार के लिए लेग प्लेटों सूखी: 10-15 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में खुला प्लेटें छोड़ दें.
- सेल मिश्रण से सतह पर तैरनेवाला के 50 μl लेकिन सभी निकालें.
- एक कॉम्पैक्ट छोटी बूंद में एक सूखी लेग थाली पर सतह पर तैरनेवाला और पिपेट की शेष 50 μl में सेल गोली Resuspend.
- सावधानी (जन्मदिन सुखाने के लिए एक धूआं हुड में थाली प्लेसRTANT नोट:) थाली में फैला कोशिकाओं, यह काफी विकार की दक्षता में कमी होगी मत देना.
- छोटी बूंद सूखी है एक बार, लेग थाली पलटना और 4-6 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं.
- सेल मिश्रण incubating है, वहीं gentamycin की 300 माइक्रोग्राम / मिलीलीटर के साथ बड़े (150 आयुध डिपो x 15 मिमी) पीआईए प्लेटें तैयार करते हैं. उपयोग करने से पहले, 15-20 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर एक मशीन में रखकर किसी भी अवशिष्ट नमी को हटा दें.
- सेल मिश्रण की ऊष्मायन के बाद पूरा हो, एक बाँझ टीका पाश का उपयोग कोशिकाओं को इकट्ठा करने और 1 मिलीलीटर लेग और भंवर, या पिपेट युक्त एक microcentrifuge ट्यूब में, मिश्रण अच्छी तरह से करने के लिए.
- बड़े पिया प्लेटें 300 माइक्रोग्राम / एमएल gentamycin होते हैं पर समान रूप से कोशिकाओं बिखरा हुआ है. (महत्वपूर्ण: आदि), 500 μl: 10 μl, थाली 2: 50 μl, प्लेट 3: 100 μl, प्लेट 4 इस कदम के लिए, यह जैसे प्लेट 1 (प्लेटों को अलग करने के लिए सेल मिश्रण की बढ़ती मात्रा को जोड़ने के लिए सबसे अच्छा है .
- 37 पर रातोंरात सेतेडिग्री सेल्सियस
2. जांच और mucoid कालोनियों का अलगाव
- इनक्यूबेटर से प्लेटें निकालें और mucoid कालोनियों के लिए जांच करते हैं.
- छोटी प्लेट पिया और gentamycin की 300 माइक्रोग्राम / मिलीलीटर के साथ (100 आयुध डिपो x 10 मिमी) पर अलगाव के लिए एक एकल mucoid कॉलोनी और लकीर अलग.
- 37 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात सेते
- पिछले रातोंरात संस्कृति पर 2.2 कदम दोहराएँ.
- दोहराएँ mucoid अलग की स्थिरता को निर्धारित करने के लिए 2.2-2.4 दो बार दोहराएँ.
- अंतिम अलग कदम के बाद, एक भी mucoid कॉलोनी साथ लेग की 4.5 मिलीलीटर टीका लगाना और 37 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात प्रकार के बरतन में सेते
- अगले दिन, प्रत्येक mucoid उत्परिवर्ती के लिए लेबल 3 microcentrifuge ट्यूबों.
- जीनोमिक डीएनए निष्कर्षण और transposon प्रविष्टि साइट की पहचान के लिए 2 ट्यूब (प्रोटोकॉल 3 देखें) में रातोंरात संस्कृति के दो 1.25 मिलीलीटर aliquots तैयार करें.
- इसके अतिरिक्त, एक appropriat में 1 मिलीलीटर रातोंरात संस्कृति pipetting द्वारा प्रत्येक mucoid उत्परिवर्ती को संग्रह10% दूध स्किम के एक बराबर मात्रा युक्त इली लेबल cryovial. -86 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर
3. gDNA प्रतिबंध पाचन और ligation
- किसी भी पसंदीदा तरीका है (उदाहरण. फिनोल के क्लोरोफॉर्म, स्पिन स्तंभ, आदि) का उपयोग कर mucoid उत्परिवर्ती से gDNA निकालें.
- GDNA की एकाग्रता का निर्धारण, प्रतिबंध endonuclease साली की 2 ग्राम के साथ 1 μl की कुल पचा, गोजातीय सीरम albumin, साली एंजाइम बफर (100 मिमी NaCl, 50 मिमी Tris-एचसीएल, 10 मिमी 2 MgCl के 5 μl के 0.5 μl , 1 मिमी Dithiothrietol (डीटीटी), कमरे के तापमान पर पीएच 7.9), और 50 μl की कुल मात्रा को प्राप्त करने के लिए DH 2 हे की उचित मात्रा.
- 37 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात डीएनए पचाने (महत्वपूर्ण:. प्रतिबंध एंजाइम की दक्षता पर निर्भर करता है, यह रातोंरात डाइजेस्ट करने के लिए एक अतिरिक्त 1 μl जोड़ने और 1-2 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते करने के लिए आवश्यक हो सकता है यह रातोंरात डाइजेस्ट के अतिरिक्त है.)
- DIGE शुद्धकिसी भी पसंदीदा तरीका (जैसे agarose जेल शुद्धि, स्पिन स्तंभों) और बफर के 25 μl के साथ elute का उपयोग STED डीएनए.
- ~ 10-20 एनजी / μl की एक पसंदीदा एकाग्रता, ligation बफर के 1.5 μl (330 मिमी Tris-एसीटेट 7.5 पीएच, 660 मिमी पोटेशियम एसीटेट, 100 मिमी मैग्नीशियम एसीटेट, 5 मिमी के साथ शुद्ध डीएनए के 11 μl मिश्रण से पचा डीएनए ligate डीटीटी), 100 मिमी एटीपी के 1.5 μl और 1 μl डीएनए ligase.
- कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए मिश्रण को सेते हैं, और फिर 70 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए incubating द्वारा एंजाइम को निष्क्रिय (नोट: लंबे समय तक के लिए कमरे के तापमान पर मिश्रण incubating बंधाव की सफलता को बढ़ा सकता है).
4. उलटा पीसीआर (iPCR) और अनुक्रम विश्लेषण
- आगे निम्न और प्राइमरों रिवर्स और शर्तों thermocycling का उपयोग बंधाव उत्पाद पर iPCR कार्य करें:
फॉरवर्ड प्राइमर (Gm3OUT): GGGCATACGGGAAGAAGTGA
रिवर्स प्राइमर (Gm5OUT): GACTGCCCTGCTGCGTAACA
Thermocycler Condiमाहौल:
1. 1 मिनट के लिए 94 डिग्री सेल्सियस.
2. 1 मिनट के लिए 94 डिग्री सेल्सियस.
3. 2 मिनट के लिए 58 डिग्री सेल्सियस.
4. 2 मिनट के लिए 72 डिग्री सेल्सियस.
5. 8 मिनट के लिए 72 डिग्री सेल्सियस.
6. 10 डिग्री सेल्सियस पकड़.
दोहराएँ 34 चक्र के लिए चरण 2-4.
(नोट: प्रवर्धित iPCR उत्पादों 4 डिग्री सेल्सियस पर भंडारित किया जा सकता है) - सफल iPCR प्रवर्धन की पुष्टि करने के लिए agarose जेल वैद्युतकणसंचलन प्रदर्शन करना.
- Gm3OUT और Gm5OUT प्राइमरों का उपयोग iPCR उत्पाद पर अनुक्रमण प्रदर्शन. प्रविष्टि साइट और himar1 के उन्मुखीकरण बाहर मैप कर रहे हैं.
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Representative Results
चित्रा 1 में सचित्र, मिनी himar1 नाविक transposon वेक्टर, pFAC, टीए प्रविष्टि साइटों इसकी σ 70 निर्भर प्रमोटर, और एक कई क्लोनिंग साइट (एमसीएस) के साथ, aacC1 gentamycin प्रतिरोध कैसेट flanking साथ दो 27 बीपी उल्टे दोहराता होता है. इसके अतिरिक्त, pFAC वेक्टर अत्यधिक सक्रिय himar1 Transposase, β-lactamase (bla), और टीआरए स्थानांतरण operon जीन एन्कोडिंग होता है. प्रादेशिक सेना प्रविष्टि साइटों पी. के जीनोम में एक कुशल एकीकरण के लिए अनुमति aeruginosa उपभेदों. पहचान और mucoid म्यूटेंट के चयन में शुद्धता alginate विनियमन के साथ शामिल जीन loci का निर्धारण करने में समग्र सफलता के लिए महत्वपूर्ण है. Mucoid और nonmucoid आइसोलेट्स के उदाहरण चित्र 1 में दिखाया गया है.
अधिक सही mucoid म्यूटेंट की पहचान करने के लिए, पूरा conjugations कई बड़ी प्लेट (150 मिमी) पर चढ़ाया जाना चाहिए. CEडालूँगा मिश्रण बाँझ पीबीएस में resuspended और पिया प्लेटें प्लस gentamycin (300 माइक्रोग्राम / एमएल) पर फैल द्वारा चढ़ाया जाना चाहिए. पीबीएस में सेल मिश्रण के dilutions / प्लेट 1,000-3,000 कालोनियों के बीच होने के लक्ष्य के साथ प्लेटों पर फैल जाएगा. ऊपर प्रोटोकॉल के आधार पर, प्रत्येक संयुग्मन 15-20 बड़े प्लेटों पर ~ 20,000 म्यूटेंट के एक बैंक का उत्पादन करना चाहिए. 37 डिग्री सेल्सियस पर प्लेटों के लिए इष्टतम ऊष्मायन समय 24-36 घंटे के बीच है. कारण alginate के overproduction करने के लिए, mucoid कॉलोनी स्पष्ट या सफेद रंग में हो सकता है और मलाईदार या घिनौना उपस्थिति होनी चाहिए. Mucoid कालोनियों discerned नहीं किया जा सकता है, तो कमरे के तापमान पर एक अतिरिक्त 24-36 घंटे के लिए सेते हैं. mucoid म्यूटेंट सबसे अच्छा gentamycin साथ एक नियमित पिया प्लेट पर तीन बार गुजर द्वारा अलग कर रहे हैं. इस समय के दौरान, आप mucoid phenotype की स्थिरता को निर्धारित कर सकते हैं. शुद्ध mucoid कॉलोनी iPCR द्वारा जीनोमिक डीएनए निष्कर्षण और जीन की पहचान के लिए इस्तेमाल किया जाएगा. iPCR उत्पादों agarose जेल अल का उपयोग कर देखे जा सकते हैंectrophoresis (चित्रा 2). यदि सफल, उचित आकार में एक भी amplicon होना चाहिए. प्रतिबंध पाचन और बंधाव आया है कि PAO1 जीनोमिक डीएनए एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है. चित्रा 2 में सचित्र, PAO1 में iPCR amplicon की अनुपस्थिति हालांकि हम क्रमश: एक एकल ~ 1,400 बीपी के amplicon और PAO1-VE2 और PAO1-VE13 में ~ 1,000 बीपी का पता लगाने, वहाँ है. इन amplicons का आकार PAO1-VE2 में और आंतरिक PAO1-VE13 में PA5484 (kinB) में PA4033 (mucE) के प्रमोटर क्षेत्र में himar1 नाविक transposon की प्रविष्टि से मेल खाती है. IPCR amplicons के डीएनए अनुक्रमण GM5OUT प्राइमर के साथ बाहर किया जाना चाहिए. लक्ष्य अनुक्रम का विश्लेषण करने के लिए बेसिक स्थानीय संरेखण खोज उपकरण (ब्लास्ट) का उपयोग करते हैं, pFAC और टीए डाईन्यूक्लियोटाइड के 5 'अंत पर उल्टे दोहराने पी. के जीनोम में himar1 प्रविष्टि के स्थल और उन्मुखीकरण निशान aeruginosa (चित्रा 2 जी>).
चित्रा 1. मिनी himar1 नाविक transposon वेक्टर, pFAC, और mucoid म्यूटेंट का प्रतिनिधित्व के योजनाबद्ध आरेख. प्लास्मिड pFAC चयन के लिए दो उल्टे दोहराता साथ एक himar1 नाविक transposon तत्व, और एक gentamycin प्रतिरोध कैसेट (aacC1) होता है, अति सक्रिय himar1 Transposase एक जीन एन्कोडिंग , और एक सशर्त replicon. मिनी himar1 नाविक transposon पी. में उच्च घनत्व प्रविष्टि पैदा कर सकता है क्योंकि सब्सट्रेट (टीए डाईन्यूक्लियोटाइड) की बहुतायत के aeruginosa. दो पी. के जीनोम में प्रादेशिक सेना dinucleotides की संख्या aeruginosa उपभेदों, PAO1 और PA14 लाल रंग में दिखाया गया है. लाल तीर इस प्रक्रिया का उपयोग पहचान mucoid म्यूटेंट संकेत मिलता है.om/files/ftp_upload/51346/51346fig1highres.jpg "लक्ष्य =" _blank "> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.
चित्रा 2. PAO1 (नकारात्मक नियंत्रण), PAO1-VE2 (1396 बीपी), और PAO1-VE13 (999:. फॉरवर्ड Gm3OUT और रिवर्स Gm5OUT प्राइमरों और एक 1 kB सीढ़ी का उपयोग iPCR प्रवर्धन के प्रतिनिधि iPCR और अनुक्रमण परिणाम एक) 1% agarose जेल वैद्युतकणसंचलन बीपी). पी. के तीन उपभेदों से जीनोमिक डीएनए aeruginosa निकाला और आत्म - बंधाव द्वारा पीछा sali प्रतिबंध एंजाइमों के साथ पचा गया था. पाठ. बी) में वर्णित के रूप में बंद परिपत्र डीएनए iPCR के लिए टेम्पलेट्स के रूप में इस्तेमाल किया गया था PAO1 संदर्भ जीनोम का उपयोग तुलनात्मक अनुक्रम विश्लेषण himar1 मारिन के सटीक स्थान निर्धारित करता हैPAO1-VE2 और PAO1-VE13 में ईआर transposon प्रविष्टि. लाल रंग में लेबल अनुक्रम pFAC में उलटा दोहराने की 5 'अंत का संकेत है. प्रादेशिक सेना की प्रविष्टि साइट को रेखांकित किया गया था. इन दो दृश्यों का एक विस्फोट खोज PAO1 के जीनोम के भीतर himar1 transposon का सही स्थान और अभिविन्यास नक्शा होगा.
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Discussion
यह इस विधि इन परिवर्तनों के साथ अन्य स्यूडोमोनास प्रजातियों में इस्तेमाल किया जा सकता है कि नोट करना महत्वपूर्ण है: पी. सेते fluorescens और पी. 30 डिग्री सेल्सियस पर putida, और पी. 42 डिग्री सेल्सियस पर stutzeri, पी. stuzeri gentamycin की 150 माइक्रोग्राम / एमएल के साथ पूरक लेग प्लेटों पर सभ्य होना चाहिए; कदम 1.11, पी. पर stutzeri कोशिकाओं लेग के 500 μl के बजाय 1 मिलीलीटर में स्थानांतरित किया जाना चाहिए. इसके अतिरिक्त, इस प्रोटोकॉल के लिए दो महत्वपूर्ण कदम उठाए हैं. सबसे पहले, प्राप्तकर्ता तनाव उचित तापमान पर सभ्य होना चाहिए. उदाहरण के लिए, PAO1 पुनर्संयोजन 15 की आवृत्ति को बढ़ाने के लिए 42 डिग्री सेल्सियस पर incubated किया जाना चाहिए. प्राप्तकर्ता तनाव सही तापमान पर सुसंस्कृत यदि नहीं, तो उत्परिवर्ती पुस्तकालय की दक्षता काफी कम हो गया था. दूसरा, iPCR अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य है, लेकिन gDNA पूरी तरह से एक परिपत्र covalently बंद डीएनए डीएनए बंधाव के माध्यम से किया जा सकता है कि यह सुनिश्चित करने के लिए पचा जाना चाहिए. मैंयह सही ढंग से किया जाता है एफ, iPCR उत्पाद एक agarose जेल पर एक बैंड के रूप में दिखाई देगा. कई बैंड की पहचान कर रहे हैं, वे कई सम्मिलन उत्परिवर्ती में कर रहे हैं कि संकेत मिलता है. हम iPCR परिणाम जोरदार हमारे दक्षिणी धब्बा परिणाम (~ 100%) के साथ सहसंबद्ध थे. इसलिए, iPCR उत्परिवर्ती प्रति सम्मिलन की संख्या के लिए दक्षिणी धब्बा विश्लेषण के स्थान पर प्रयोग किया जा सकता है.
pFAC में मिनी himar1 नाविक transposon कोई ट्रांसक्रिप्शनल टर्मिनेटर है, और यह gentamycin कैसेट की अभिव्यक्ति ड्राइविंग एक σ 70 निर्भर प्रमोटर के माध्यम से नियंत्रित किया जाता है. हम himar1 प्रविष्टि की स्थिति और अभिविन्यास एक विशेष जीन के नियमन पर प्रभाव अलग था कि मनाया. एक जीन के बीच में एकीकृत जब जीन निष्क्रिय किया गया. इस का एक उदाहरण एक रूपांतरण PAO1 (PAO1-VE13) 11 में mucoidy जिससे संवेदी kinase जीन kinB (PA5484) की निष्क्रियता है. इसके अतिरिक्त, यह यू भी कर सकते हैंजीन की अभिव्यक्ति पी विनियमित, जीन के रूप में एक ही ओरिएंटेशन में अपस्ट्रीम कोडिंग क्षेत्र के डाला है. इस का एक उदाहरण himar1 mucE (PA4033) 13 की अभिव्यक्ति ड्राइव जहां PAO1-VE2 है. इस प्रोटोकॉल की सीमा वृद्धि के लिए अनावश्यक हैं कि केवल नियामक जीन की पहचान की जा सकती है. साथ ही, इस विधि का उपयोग पहचान उन mucoid म्यूटेंट स्वाभाविक रूप से घटित नहीं हो सकता है.
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Disclosures
लेखक Hongwei डी. यू मुख्य विज्ञान अधिकारी और Progenesis टेक्नोलॉजीज के सहसंस्थापक, LLC है.
Acknowledgments
इस काम जैव चिकित्सा अनुसंधान उत्कृष्टता के लिए पश्चिम वर्जीनिया आइडिया नेटवर्क के लिए नेशनल एयरोनॉटिक्स एंड स्पेस एडमिनिस्ट्रेशन वेस्ट वर्जीनिया अंतरिक्ष अनुदान कंसोर्टियम (नासा WVSGC), सिस्टिक फाइब्रोसिस फाउंडेशन (CFF-YU11G0) और एनआईएच P20RR016477 और P20GM103434 द्वारा समर्थित किया गया. हम इस काम के साथ तकनीकी सहायता के लिए Vonya एम. Eisinger धन्यवाद.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Luria Broth | Difco | 240230 | via Fisher Scientific |
| Pseudomonas isolation agar | Difco | 292710 | via Fisher Scientific |
| Small Plates (100 O.D. x 10 mm) | Fisher Scientific | 08-757-13 | |
| Large Plates (150 O.D. x 15 mm) | Fisher Scientific | 08-757-14 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | BP229-4 | |
| Benchtop Shaking Incubator | New Brunswick Scientific | Innova 4080 | shake at 200 rpm |
| Cabinet Incubator | VWR | 1540 | |
| Benchtop Microcentrifuge | Sorvall | 75-003-287 | via Fisher Scientific |
| SmartSpec Plus Spectrophotometer | Bio-Rad | 170-2525 | or preferred method/vendor |
| Diposable Inoculation Loops | Fisher Scientific | 22-363-597 | |
| 1.5 ml Microcentrifuge Tubes | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| 2.0 ml Cryogenic Vials | Corning | 430659 | via Fisher Scientific |
| 15 ml Tubes | Fisher Scientific | 05-539-12 | |
| Skim Milk | Difco | DF0032-17-3 | via Fisher Scientific |
| DNeasy Blood and Tissue (250) | Qiagen | 69506 | or preferred method/vendor |
| QIAquick PCR Purification Kit (250) | Qiagen | 28106 | or preferred method/vendor |
| QIAprep Spin Miniprep Kit (250) | Qiagen | 27106 | or preferred method/vendor |
| FastLink II DNA Ligation Kit | Epicentre Technologies | LK6201H | via Fisher Scientific |
| Accu block Digital Dry Bath | Labnet | NC0205808 | via Fisher Scientific |
| Sal1, restriction endonuclease | New England BioLabs | R0138L | |
| EasyStart Micro 50 | Molecular BioProducts | 6020 | via Fisher Scientific |
| Taq DNA Polymerase | New England BioLabs | M0267L | |
| iCycler, Thermocycler | Bio-Rad | 170-8740 | |
| LE agarose | Genemate | 3120-500 | via Fisher Scientific |
| Gentamycin Sulfate | Fisher Scientific | BP918-1 | |
| 2.0 ml Cryogenic Vials | Corning | 430659 | via Fisher Scientific |
References
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