Summary
Ici, nous décrivons un protocole en utilisant la mini-himar1 marin mutagenèse de transposon médiation pour générer une bibliothèque de mutants d'insertion à haute densité à l'écran, isoler et d'identifier de nouveaux régulateurs d'alginate dans le prototype Pseudomonas aeruginosa souche PAO1.
Abstract
Pseudomonas aeruginosa est une bactérie à Gram négatif de l'environnement avec des capacités métaboliques polyvalents. P. aeruginosa est une bactérie pathogène opportuniste qui établit des infections pulmonaires chroniques chez les patients atteints de fibrose kystique (FK). La surproduction d'un polysaccharide capsulaire appelé alginate, également connu sous le nom mucoidy, favorise la formation de biofilms mucoïdes qui sont plus résistants que les cellules planctoniques antibiotique et à la chimiothérapie défenses de l'hôte. En outre, la conversion de la non mucoïde au phénotype mucoïde est un marqueur clinique pour le début de l'infection chronique à CF. Surproduction alginate par P. aeruginosa est un processus endergonic qui impose lourdement énergie cellulaire. Par conséquent, la production d'alginate est très réglementé dans P. aeruginosa. Afin de mieux comprendre la régulation de l'alginate, nous décrivons un protocole à l'aide du mini-transposon himar1 mutagenèse pour l'identification de nouveau régulateur d'alginates dans une souche PAO1 prototype. La procédure se compose de deux étapes de base. Tout d'abord, nous avons transféré la mini-himar1 transposon (PFA) de l'hôte E. coli dans SM10/λpir destinataire P. aeruginosa PAO1 par conjugaison biparentale pour créer une bibliothèque de mutants d'insertion à haute densité, qui ont été sélectionnés sur des plaques de gélose Pseudomonas d'isolation additionné de gentamycine. En second lieu, nous avons criblé et isolé les colonies mucoïdes pour mapper le site d'insertion par PCR inverse en utilisant des amorces d'ADN pointant vers l'extérieur à partir de la cassette de la gentamycine et de séquençage de l'ADN. En utilisant ce protocole, nous avons identifié deux nouveaux régulateurs d'alginate, MUCE (PA4033) et kinB (PA5484), à souche PAO1 avec un type sauvage Muca codant pour le facteur anti-sigma Muca pour le régulateur de l'alginate de maître ALGU (ALGT, σ 22) . Ce protocole de mutagenèse à haut débit peut être modifié pour l'identification d'autres gènes liés à la virulence causant le changement dans la colomorphologie ny.
Introduction
La capacité de la opportuniste, agent pathogène Gram négatif Pseudomonas aeruginosa à la surproduction de l'alginate est un facteur majeur dans sa capacité à établir un film biologique. La surproduction d'alginate est un phénotype souvent dénommé mucoidy. L'isolement des colonies mucoïdes de crachats de personnes atteintes de fibrose kystique (FK) est indicative d'une infection chronique, et est directement associée à une baisse générale de la santé du patient 1. Actuellement, il est entendu que la régulation de la production et de l'alginate dans P. aeruginosa se produit principalement à deux opérons. Le premier est l'opéron de biosynthèse de l'alginate, qui contient 12 gènes (ALGD - alg8 - alg44 - algK - Alge - algG - Algx - algL - ALGI - algJ - algF - algA) qui sont responsables de la synthèse et de l'exportation du polymère d'alginate dans le périplasme de la environme extracellulairent 2-5. La deuxième opéron est un groupe de gènes en commençant par le facteur sigma alternatif ALGU / T et en continuant avec Muca, mucB, et mucD. ALGU / T est un régulateur positif, tandis que mucAB-D sont classés en tant que régulateurs négatifs de la production d'alginate 6-8. En outre, les régulateurs de la transcription, tels que ALGB, AlgQ, ALGr, et rpoN, ainsi que post-transcriptionnel et la modification post-traductionnelle par le contrôle de la répression catabolique, l'activité kinase (KinB) et la protéolyse intramembranaire, se sont également avérés être impliqués dans l'alginate réglementation 9-14.
Le vecteur de transposon mini-himar1 appelé PFA a été créé à l'origine dans le laboratoire du Dr Mekalanos à Harvard Medical School 15. Le plasmide PFA est constitué d'un élément transposable flanqué de deux répétitions inversées de 27 pb et une cassette de résistance à la gentamycine dans le milieu (aacC1: 534 pb), un gène codant pour la hyperactive transposase mariner 16, et un codage de β-lactamase de gène (bla) (figure 1). L'information de séquence pour les éléments transposables du PFA est disponible au numéro d'accession GenBank: DQ366300 13. Dans PFA, il existe un site de clonage multiple (MCS) derrière le gène aacC1 qui est utilisé pour l'identification du site d'insertion chromosomique en utilisant une PCR inverse. Un avantage majeur à l'utilisation du transposon mini-himar1 a pas de facteurs de l'hôte spécifiques sont nécessaires pour la transposition (mutagenèse). En outre, il existe une grande abondance de sites d'insertion de dinucléotides TA trouvés dans le génome de P. aeruginosa. Par exemple, AT sites d'insertion dinucléotide se produit 94 404 et 100 229 fois dans le PAO1 (6264404 bps, numéro d'accession GenBank NC_002516.2) et PA14 (6537648 bps; numéro d'accès GenBank NC_008463) génomes, respectivement. En raison de l'abondance de dinucléotide TA dans le génome, d'un mini-himar1 mini-himar1 peut insérer dans tout gène non essentiel dans le génome de P. aeruginosa. Ceci permet d'obtenir environ 18 sites d'insertion par TA cadre ouvert de lecture dans le génome de PAO1.
Ici, nous décrivons un protocole utilisant des mini-transposon himar1 médiation mutagenèse pour identifier de nouveaux régulateurs de mucoidy dans P. aeruginosa. Plus précisément, nous biparentally conjugué du vecteur PFA contenant un transposon mini-himar1 de E. coli SM10/λpir dans le non mucoïde prototrophique souche PAO1. Après que le transposon est intégré dans le génome, la souche réceptrice est mise en culture sur gélose Pseudomonas isolement (PIA) contenant du triclosan qui inhibe la croissance de E. coli. Ainsi, une banque de mutants d'
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Protocol
Une. Préparation des souches bactériennes et biparentale Conjugaison
- Inoculer E. coli SM10/λpir/pFAC dans 5 ml de bouillon de Luria (LB) additionné de 15 pg / ml de gentamicine et le placer dans un incubateur à agitation pendant une nuit à 37 ° C.
- Inoculer P. aeruginosa souche PAO1 dans 5 ml de LB, et placer dans un incubateur à agitation pendant une nuit à 42 ° C.
- Mesurer la DO 600 de cultures de la nuit et mélanger des quantités égales de PAO1 et E. coli PFA telle que le volume final est entre 1 à 1,4 ml.
- mélange Centrifuger à 6000 g pendant 5 min.
- Pendant ce temps, sécher des plaques LB pour la conjugaison: laisser les plaques ouvertes dans l'incubateur à 37 ° C pendant 10-15 min.
- Retirez tous mais 50 pi de surnageant de mélange de cellules.
- Reprendre le culot cellulaire dans les 50 pi restants de surnageant et pipette sur une plaque LB sec dans une gouttelette compact.
- Placez délicatement la plaque dans une hotte à sécher (IMPORemarque rtant: Ne laissez pas les cellules réparties sur la plaque, ce diminuera de façon significative l'efficacité de la conjugaison).
- Une fois la goutte est sec, retourner la plaque LB et incuber à 37 ° C pendant 4-6 heures.
- Bien que le mélange de cellules est en incubation, préparer de grandes (150 mm x 15 mm) des plaques de PIA avec 300 pg / ml de gentamicine. Avant toute utilisation, enlever toute humidité résiduelle en plaçant dans un incubateur à 37 ° C pendant 15-20 min.
- Après l'incubation du mélange de cellules est terminée, recueillir les cellules à l'aide d'une anse d'inoculation stérile et dans un tube à centrifuger contenant 1 ml de LB et vortex, ou d'une pipette, pour bien mélanger.
- Répartir les cellules uniformément sur les grandes plaques PIA contiennent 300 pg / ml de gentamicine. (IMPORTANT: Pour cette étape, il est préférable d'ajouter des volumes croissants de mélange de cellules pour séparer les plaques (par exemple Planche 1: 10 pi, Planche 2: 50 pi, Planche 3: 100 pi, Planche 4: 500 pi, etc) .
- Incuber une nuit à 37° C.
2. La détection et l'isolement des colonies mucoïdes
- Retirer les plaques de l'incubateur et examiner les colonies mucoïdes.
- Isoler une seule colonie mucoïde et par épuisement sur les petites plaques (100 mm x 10 mm) avec PIA et 300 pg / ml de gentamicine.
- Incuber pendant une nuit à 37 ° C.
- Répétez l'étape 2.2 de la culture de la nuit précédente.
- Répétez les étapes 02.02 à 02.04 deux fois de plus pour déterminer la stabilité de l'isolat mucoïde.
- Après l'étape finale de l'isolat, inoculer 4,5 ml de LB avec une seule colonie mucoïde et incuber pendant une nuit dans un agitateur à 37 ° C.
- Le lendemain, l'étiquette 3 microtubes pour chaque mutant mucoïde.
- Préparer deux 1,25 ml aliquotes de culture d'une nuit dans 2 tubes pour l'extraction de l'ADN génomique et l'identification du site d'insertion du transposon (voir protocole n ° 3).
- En outre, archiver chaque mutant mucoïde par pipetage 1 ml de culture durant la nuit dans un CRÉDITScryovial ely-marqué contenant un volume égal de 10% de lait écrémé. Conserver à -86 ° C.
3. ADNg digestion de restriction et ligature
- Extraire à partir de l'ADNg de la mucoïde mutant en utilisant n'importe quel procédé préféré (par exemple. Phénol-chloroforme, colonne de centrifugation, etc.)
- Déterminer la concentration de l'ADNg, de digérer un total de 2 pg à 1 microlitre de l'endonucléase de restriction Sal I, 0,5 ul d'albumine de sérum bovin, 5 ul de Sali enzyme tampon (100 mM de NaCl, 50 mM Tris-HCl, 10 mM de MgCl2 , 1 mM de dithiothréitol (DTT), pH 7,9 à température ambiante), et le volume approprié de dH 2 O pour obtenir un volume total de 50 ul.
- Digérer l'ADN pendant une nuit à 37 ° C. (IMPORTANT:. Selon l'efficacité de l'enzyme de restriction, il peut être nécessaire d'ajouter un 1 pi supplémentaires pour le résumé du jour au lendemain et incuber à 37 ° C pendant 1-2 heures C'est en plus de la digestion pendant la nuit.)
- Purifier le digeADN STED utilisant n'importe quelle méthode préférée (par exemple agarose de purification de gel, les colonnes de spin) et élue avec 25 pi de tampon.
- Ligaturer l'ADN digéré par mélange de 11 ul d'ADN purifié avec une concentration préférée de ~ 10 à 20 ng / pl, 1,5 pl de tampon de ligature (330 mM de Tris-acétate pH 7,5, 660 mM d'acétate de potassium, l'acétate de magnésium 100 mM, 5 mM DTT), 1,5 ul de 100 mM d'ATP et 1 ul d'ADN ligase.
- Faire incuber le mélange pendant 15 min à température ambiante, et ensuite inactiver l'enzyme par incubation pendant 15 min à 70 ° C. (Remarque: l'incubation du mélange à température ambiante pendant plus peut augmenter le succès de la ligation).
4. PCR inverse (iPCR) et Analyse de séquence
- Effectuer iPCR sur le produit de ligature en utilisant le texte suivant amorces sens et antisens et conditions thermocycler:
Primer-Forward (Gm3OUT): GGGCATACGGGAAGAAGTGA
Primer inversée (Gm5OUT): GACTGCCCTGCTGCGTAACA
Thermocycleur Conditions:
Une. 94 ° C pendant 1 min.
2. 94 ° C pendant 1 min.
3. 58 ° C pendant 2 min.
4. 72 ° C pendant 2 min.
5. 72 ° C pendant 8 min.
6. 10 ° C en attente.
Répétez les étapes 2-4 pour 34 cycles.
(REMARQUE: Les produits amplifiés PCR inverse peuvent être stockés à 4 ° C) - Effectuer l'électrophorèse sur gel d'agarose pour confirmer la réussite amplification iPCR.
- Effectuer le séquençage du produit iPCR utilisant les amorces Gm3OUT et Gm5OUT. Le site d'insertion et l'orientation de himar1 sont tracées.
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Representative Results
Comme illustré sur la figure 1, le vecteur marin transposon mini-himar1, PFA, contient deux répétitions inversées de 27 pb avec des sites d'insertion TA flanquant la cassette de résistance aacC1 de gentamycine, avec son σ promoteur 70-dépendante, et un site de clonage multiple (MCS). En outre, le vecteur contient des gènes codant pour des PFA la transposase hautement actif de himar1, β-lactamase (bla), et l'opéron de transfert TRA. Les sites d'insertion de TA pour permettre une intégration efficace dans le génome de P. souches aeruginosa. Précision dans l'identification et la sélection de mutants mucoïdes est critique pour le succès global dans la détermination de loci de gènes impliqués dans la régulation de l'alginate. Exemples d'isolats glaireuses et non mucoïde sont présentés dans la figure 1.
Pour identifier plus précisément les mutants mucoïdes, les conjugaisons remplis doivent être étalées sur plusieurs grandes plaques (150 mm). La CEoutes les mélanges doivent être remises en suspension dans du PBS stérile et étalés par étalement sur les plaques PIA, plus la gentamycine (300 pg / ml). Dilutions de mélange de cellules dans du PBS seront répartis sur les plaques dans le but d'avoir entre 1000-3000 colonies / plaque. Basé sur le protocole ci-dessus, chaque conjugaison devrait produire une banque de ~ 20 000 mutants sur 15-20 grandes plaques. Le temps d'incubation optimal pour les plaques à 37 ° C est comprise entre 24 à 36 heures. En raison de la surproduction de l'alginate, la colonie mucoïde doit être claire ou de couleur blanche et ont une apparence crémeuse ou visqueux. Si les colonies mucoïdes ne peuvent être repérés, puis incuber pendant 24-36 heures supplémentaires à température ambiante. Les mutants mucoïdes sont mieux isolés en passant trois fois sur une plaque régulière PIA gentamicine. Pendant ce temps, vous pouvez déterminer la stabilité du phénotype mucoïde. La colonie mucoïde purifié sera utilisé pour l'extraction de l'ADN génomique et l'identification des gènes par I-PCR. produits IPCR peuvent être visualisées en utilisant un gel d'agarose electrophoresis (Figure 2). En cas de succès, il devrait y avoir un seul amplicon à la taille appropriée. PAO1 ADN génomique qui a subi une digestion de restriction et la ligature peut être utilisé comme témoin négatif. Comme le montre la figure 2, il ya une absence de iPCR amplicon dans PAO1, mais nous détectons un seul amplicon de 1400 pb ~ ~ et 1000 pb PAO1-VE2 et PAO1-VE13, respectivement. La taille de ces amplicons correspond à l'insertion du transposon mariner himar1 dans la région du promoteur du PA4033 (MUCE) dans PAO1-VE2 et interne dans PA5484 (kinB) dans PAO1-VE13. Le séquençage d'ADN des amplicons PCR inverse doit être effectuée avec l'amorce GM5OUT. Lorsque vous utilisez l'outil de recherche d'alignement local de base (BLAST) pour analyser la séquence cible, la répétition inversée sur l'extrémité 5 'de la PFA et AT dinucléotide marquer l'emplacement et l'orientation de l'insertion de himar1 dans le génome de P. aeruginosa (Figure 2 g>).
Figure 1. Schéma de vecteur de mini-himar1 marin transposon, PFA, et une représentation de mutants mucoïdes. Plasmide PFA contient un élément himar1 de marin de transposon avec deux répétitions inversées, et une cassette de résistance à la gentamycine (de aacC1) pour la sélection, un gène codant pour la himar1 transposase hyperactive , et un réplicon conditionnel. Le marin transposon mini-himar1 peut provoquer l'insertion à haute densité en P. aeruginosa raison de l'abondance de substrat (TA dinucléotide). Le nombre de dinucléotides TA dans les deux génomes de P. souches aeruginosa, PAO1 et PA14 sont indiquées en rouge. Les flèches rouges indiquent les mutants mucoïdes identifiés à l'aide de cette procédure.om/files/ftp_upload/51346/51346fig1highres.jpg "target =" _blank "> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2. . Représentant iPCR et les résultats de séquençage A) 1% d'agarose électrophorèse sur gel d'amplification iPCR utilisant les amorces Forward Gm3OUT et n º Gm5OUT et une échelle 1 ko: PAO1 (contrôle négatif), PAO1-VE2 (1396 pb), et PAO1-VE13 (999 pb). L'ADN génomique provenant de trois souches de P. aeruginosa a été extrait et digéré par les enzymes de restriction Sal I, suivie par une auto-ligation. L'ADN circulaire fermé a été utilisé en tant que modèles pour la I-PCR comme décrit dans le texte. B) analyse de la séquence comparative en utilisant le génome de référence de PAO1 détermine l'emplacement précis de la marin de himar1er insertion du transposon dans PAO1-VE2 et PAO1-VE13. La séquence marquée dans rouge indique l'extrémité 5 'de répétition inversée en PFA. Le site d'insertion de l'assistance technique a été soulignée. Une recherche BLAST de ces deux séquences permettra de cartographier l'emplacement et l'orientation exactes du transposon himar1 dans le génome de PAO1.
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Discussion
Il est important de noter que ce procédé peut être utilisé dans d'autres espèces de Pseudomonas avec ces altérations: incuber P. fluorescens et P. putida à 30 ° C, et P. stutzeri à 42 ° C; P. stuzeri doit être mis en culture sur des plaques LB supplémenté avec 150 ug / ml de gentamycine, à l'étape 1.11, P. stutzeri cellules doivent être transférés dans 500 pl de LB au lieu de 1 ml. En outre, il ya deux étapes essentielles de ce protocole. Tout d'abord, la souche réceptrice doit être mis en culture à la température appropriée. Par exemple, PAO1 doit être incubé à 42 ° C pour augmenter la fréquence de recombinaison 15. L'efficacité de la banque de mutants a été réduite de manière significative si la souche réceptrice si elle n'est pas en culture à la température correcte. Deuxièmement, I-PCR est très reproductible, mais l'ADNg doit être complètement digéré pour faire en sorte qu'un ADN circulaire fermé de manière covalente peut se faire par ligature de l'ADN. Jef cela est fait correctement, le produit iPCR apparaîtra comme une bande sur un gel d'agarose. Si plusieurs bandes sont identifiées, elles indiquent qu'il existe des insertions multiples dans le mutant. Nous avons constaté que les résultats IPCR étaient fortement corrélées avec les résultats de nos Southern blot (~ 100%). Par conséquent, iPCR peut être utilisé à la place de l'analyse par transfert de Southern pour le nombre d'insertions par mutant.
Le mini-transposon mariner himar1 en PFA n'a pas de terminateur de transcription, et il est régulé par un promoteur σ-70 dépendante dirigeant l'expression de la cassette de gentamycine. Nous avons observé que la position et l'orientation de l'insertion de himar1 avaient des effets variables sur la régulation d'un gène particulier. Les gènes ont été inactivés lorsqu'ils sont intégrés dans le milieu d'un gène. Un exemple de ceci est l'inactivation du gène de kinB sensorielle kinase (PA5484) qui provoque une conversion de mucoidy dans PAO1 (PAO1-VE13) 11. En outre, il peut également up-réguler l'expression du gène, si elle est insérée en amont de la région codante dans la même orientation que le gène. Un exemple de ceci est PAO1-VE2, où la himar1 entraîne l'expression de MUCE (PA4033) 13. La limitation de ce protocole est que seuls les gènes de régulation qui ne sont pas essentielles pour la croissance peuvent être identifiés. En outre, ces mutants mucoïdes identifiés à l'aide de cette méthode peuvent ne pas se produire naturellement.
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Disclosures
L'auteur Hongwei D. Yu est le conseiller scientifique en chef et co-fondateur de ProGenesis Technologies, LLC.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par la NASA en Virginie occidentale espace Grant Consortium NASA (National WVSGC), Cystic Fibrosis Foundation (CFF-YU11G0) et NIH P20RR016477 et P20GM103434 au réseau IDeA Virginie-Occidentale pour l'excellence en recherche biomédicale. Nous remercions Vonya M. Eisinger pour l'assistance technique à ces travaux.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Luria Broth | Difco | 240230 | via Fisher Scientific |
| Pseudomonas isolation agar | Difco | 292710 | via Fisher Scientific |
| Small Plates (100 O.D. x 10 mm) | Fisher Scientific | 08-757-13 | |
| Large Plates (150 O.D. x 15 mm) | Fisher Scientific | 08-757-14 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | BP229-4 | |
| Benchtop Shaking Incubator | New Brunswick Scientific | Innova 4080 | shake at 200 rpm |
| Cabinet Incubator | VWR | 1540 | |
| Benchtop Microcentrifuge | Sorvall | 75-003-287 | via Fisher Scientific |
| SmartSpec Plus Spectrophotometer | Bio-Rad | 170-2525 | or preferred method/vendor |
| Diposable Inoculation Loops | Fisher Scientific | 22-363-597 | |
| 1.5 ml Microcentrifuge Tubes | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| 2.0 ml Cryogenic Vials | Corning | 430659 | via Fisher Scientific |
| 15 ml Tubes | Fisher Scientific | 05-539-12 | |
| Skim Milk | Difco | DF0032-17-3 | via Fisher Scientific |
| DNeasy Blood and Tissue (250) | Qiagen | 69506 | or preferred method/vendor |
| QIAquick PCR Purification Kit (250) | Qiagen | 28106 | or preferred method/vendor |
| QIAprep Spin Miniprep Kit (250) | Qiagen | 27106 | or preferred method/vendor |
| FastLink II DNA Ligation Kit | Epicentre Technologies | LK6201H | via Fisher Scientific |
| Accu block Digital Dry Bath | Labnet | NC0205808 | via Fisher Scientific |
| Sal1, restriction endonuclease | New England BioLabs | R0138L | |
| EasyStart Micro 50 | Molecular BioProducts | 6020 | via Fisher Scientific |
| Taq DNA Polymerase | New England BioLabs | M0267L | |
| iCycler, Thermocycler | Bio-Rad | 170-8740 | |
| LE agarose | Genemate | 3120-500 | via Fisher Scientific |
| Gentamycin Sulfate | Fisher Scientific | BP918-1 | |
| 2.0 ml Cryogenic Vials | Corning | 430659 | via Fisher Scientific |
References
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