Summary
Her beskriver vi en protokoll ved hjelp av mini-himar1 mariner transposon-mediert mutagenese for å generere en høy tetthet innsetting mutant bibliotek til skjermen, isolere og identifisere nye alginat regulatorer i prototypic Pseudomonas aeruginosa belastning PAO1.
Abstract
Pseudomonas aeruginosa er en gram-negativ, miljø-bakterie med allsidige metabolske funksjoner. P. aeruginosa er en opportunistisk bakteriell patogen som etablerer kroniske lungeinfeksjoner hos pasienter med cystisk fibrose (CF). Den overproduksjon av et kapsulært polysakkarid kalt alginat, også kjent som mukoiditet, fremmer dannelsen av slimaktig biofilmer som er mer motstandsdyktig enn planktoniske celler til antibiotikum kjemoterapi og vertens forsvar. I tillegg er konvertering fra ikke-mukoid til slimaktig fenotype en klinisk markør for utbruddet av kronisk infeksjon i CF. Alginat overproduksjon av P. aeruginosa er en endergonic prosess som tungt skatter cellulær energi. Derfor er alginat produksjon sterkt regulert i P. aeruginosa. For bedre å forstå alginat regulering, beskriver vi en protokoll ved hjelp av mini-himar1 transposon mutagenese for identifisering av romanen alginat regulators i en prototypic belastning PAO1. Fremgangsmåten består av to grunnleggende trinn. Først, vi overførte mini-himar1 transposon (pFAC) fra verts E. coli SM10/λpir til mottaker P. aeruginosa PAO1 via biparental konjugering å skape en høy tetthet innsetting mutant bibliotek, som ble valgt på Pseudomonas isolasjon agar plater supplert med gentamycin. Dernest, vi skjermet og isolert de slimaktig koloniene å kartlegge innstikkstedet gjennom invers PCR ved hjelp av DNA-primere som peker utover fra gentamycin kassett og DNA-sekvensering. Ved hjelp av denne protokollen, har vi identifisert to nye alginat regulatorer, mucE (PA4033) og kinB (PA5484), i belastning PAO1 med en villtype muca koding av anti-sigma faktor muca for master alginat regulator AlgU (AlgT, σ 22) . Denne high-throughput mutagenese Protokollen kan modifiseres for identifisering av andre virulens-relaterte gener som forårsaker endring i coloNY morfologi.
Introduction
Muligheten av opportunistiske, gram-negative patogene Pseudomonas aeruginosa for å overprodusere alginat er en viktig faktor i sin evne til å etablere en biofilm. Overproduksjon av alginat er en fenotype ofte referert til som mukoiditet. Isolasjon av slimaktig kolonier fra sputa av personer rammet av cystisk fibrose (CF) er et tegn på en kronisk infeksjon, og er direkte forbundet med en samlet nedgang i pasientens helse en. Foreløpig er det enighet om at regulering og produksjon av alginat i P. aeruginosa oppstår hovedsakelig på to operoner. Den første er den alginat biosyntetiske operon, som inneholder 12 gener (algD - alg8 - alg44 - algK - Alge - algG - algX - algL - ALGI - algJ - algF - alge) som er ansvarlig for syntese og eksport av alginat polymer tvers periplasma til ekstracellulære environment 2-5. Den andre operon er en klynge av gener som begynner med den alternative sigma faktoren algU / T og fortsetter med muca, mucB, og mucD. AlgU / T er en positiv regulator, mens MucAB-D er klassifisert som negative regulatorer av alginat produksjon 6-8. I tillegg transcriptional regulator, slik som AlgB, AlgQ, AlgR og RpoN, samt post-transkripsjonelle og post-translasjonell modifikasjon av catabolite undertrykkelse kontroll, kinaseaktivitet (KinB) og intramembrane proteolyse, har også vist seg å være involvert i alginat regulering 9-14.
Den mini-himar1 transposon vektor kjent som pFAC ble opprinnelig opprettet i Dr. Mekalanos 'lab ved Harvard Medical School 15. Den pFAC plasmidet består av et transportabelt element som flankert av to inverterte gjentagelser av 27 bp og en gentamycin motstand kassett i midten (aacC1: 534 bp), et gen som koder for hyperactive mariner transposase 16, og et gen som koder for β-laktamase (bla) (figur 1). Sekvensinformasjon for den transposable element av pFAC er tilgjengelig på GenBank sjonsnummer: DQ366300 13. I pFAC, er det et multippel kloningssete (MCS) bak aacC1-genet som anvendes for identifisering av det kromosomale innføringsstedet ved hjelp av invers PCR. En stor fordel med å bruke mini-himar1 transposon er ingen spesifikke vertsfaktorer er nødvendig for innarbeiding (mutagenese). I tillegg er høy mengde av TA-dinukleotid innstikk finnes i hele genomet av P. aeruginosa. For eksempel, TA dinucleotide innstikk oppstår 94404 og 100229 ganger i PAO1 (6264404 bps, GenBank tiltredelse nummer NC_002516.2) og PA14 (6537648 bps, GenBank tilgang nummer NC_008463) genomer, henholdsvis. På grunn av overflod av TA dinucleotide i genomet, mini-himar1 mini-himar1 transposon sette inn noen unødvendige gen innenfor genomet til P. aeruginosa. Dette gir ca 18 TA innstikk pr åpen leseramme i PAO1 genomet.
Her beskriver vi en protokoll ved hjelp av mini-himar1 transposon-mediert mutagenese å identifisere nye regulatorer av mukoiditet i P. aeruginosa. Mer spesifikt, vi biparentally konjugert den pFAC vektor som inneholder en mini-himar1 transposon fra E. coli SM10/λpir inn i ikke-mukoid proto belastning PAO1. Etter at transposon er integrert i genomet, er belastningen mottaker dyrket på Pseudomonas isolasjon agar (PIA) som inneholder triclosan som hemmer veksten av E. coli. Således, et bibliotek av mutanter av
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
En. Utarbeidelse av bakteriestammer og Biparental Bøyning
- Vaksinere E. coli SM10/λpir/pFAC i 5 ml Luria-buljong (LB) supplert med 15 ug / ml gentamycin, og plasser i en ristende inkubator over natten ved 37 ° C.
- Vaksinere P. aeruginosa belastning PAO1 i 5 ml LB, og plasser i en risteinkubator over natten ved 42 ° C.
- Mål OD 600 overnattings kulturer og blande like mengder PAO1 og E. coli pFAC slik at det endelige volum er mellom 1 til 1,4 ml.
- Sentrifuger blandingen ved 6000 xg i 5 min.
- I mellomtiden, tørk LB-plater for konjugering: la platene er åpne i inkubator ved 37 ° C i 10-15 min.
- Fjern alle unntatt 50 pl supernatant fra celleblanding.
- Resuspender cellepelleten i de resterende 50 pl av supernatanten og pipette på en tørr LB-plate i en kompakt dråpene.
- Sett platen forsiktig i en avtrekkshette for å tørke (IMPORTANT Merk: Ikke la celler spredt over platen, vil dette i betydelig grad redusere effektiviteten av konjugering).
- Når dråpen er tørr snus LB-plate og inkuberes ved 37 ° C i 4-6 timer.
- Mens celleblandingen inkubering, å tilberede store (150 OD x 15 mm) PIA-plater med 300 ug / ml gentamycin. Før bruk fjerne eventuell restfuktighet ved å plassere i en inkubator ved 37 ° C i 15-20 min.
- Etter inkubering av celleblandingen er fullstendig, samle cellene ved bruk av en steril sløyfe og inokulering i et mikrosentrifugerør inneholdende 1 ml LB og vortex eller pipette, for å blandes godt.
- Spre cellene jevnt på de store PIA platene inneholder 300 mikrogram / ml gentamycin. (Viktig: I dette trinnet, er det best å legge økende volumer av celleblandingen for å skille platene (f.eks Plate 1: 10 ul, Plate 2: 50 ul, Plate 3: 100 ul, Plate 4: 500 pl, etc.) .
- Inkuber over natten ved 37° C.
2. Påvisning og isolering av slimaktig koloniene
- Fjern platene fra inkubator og undersøke for slimaktig kolonier.
- Isolere en enkelt slimaktig koloni og strek for isolasjon på små plater (100 OD x 10 mm) med PIA og 300 mikrogram / ml gentamycin.
- Inkuber over natten ved 37 ° C.
- Gjenta trinn 2.2 på forrige natten kultur.
- Gjenta trinn 2.2 til 2.4 to ganger til for å bestemme stabiliteten av mukoid isolatet.
- Etter endelig isolat trinn, inokulere 4,5 ml av LB med et enkelt mukoid koloni og inkuber i shaker over natten ved 37 ° C.
- Neste dag, etikett 3 mikrosentrifugerør for hver slimaktig mutant.
- Forbered to 1,25 ml deler av natten kultur inn to rør for genomisk DNA-ekstraksjon og identifikasjon av transposon innstikkstedet (se protokoll 3).
- I tillegg arkivere hver slimaktig mutant ved å pipettere 1 ml over natten kultur inn i en appropriatEly merkede cryovial inneholdende et like stort volum av 10% skummet melk. Oppbevares ved -86 ° C.
Tre. gDNA Restriction Fordøyelse og hemorroider
- Ekstraher gDNA fra mucoid mutant ved hjelp av en hvilken som helst foretrukket metode (f.eks. Fenol-kloroform, spinn kolonne, etc.).
- Bestem konsentrasjonen av gDNA, smakskonsentrat i alt 2 pg med 1 pl av den restriksjonsendonuklease Sall, 0,5 pl av bovint serumalbumin, 5 pl av SalI enzym buffer (100 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl 2 , 1 mM ditiotreitol (DTT), pH 7,9 ved romtemperatur), og det aktuelle volum av dH 2 O for å oppnå et totalt volum på 50 pl.
- Fordøye DNA natten ved 37 ° C. (Viktig. Avhengig av effektiviteten av restriksjonsenzym, kan det være nødvendig å tilsette en ytterligere 1 mL til over natten fordøye og inkuber ved 37 ° C i 1 til 2 timer Det er i tillegg til de over natten digest.)
- Rense digeSTED DNA ved hjelp av en foretrukket metode (f.eks agarosegel rensing, spin kolonner) og elueres med 25 mL buffer.
- Å ligere det fordøyde DNA ved å blande 11 ul av renset DNA med en foretrukket konsentrasjon på ~ 10 til 20 ng / mL, 1,5 pl av Ligation buffer (330 mM Tris-acetat pH 7,5, 660 mM kaliumacetat, 100 mM magnesium-acetat, 5 mM DTT), 1,5 pl av 100 mM ATP og 1 pl DNA-ligase.
- Inkuber blandingen i 15 min ved romtemperatur, og deretter inaktivere enzymet ved inkubering i 15 min ved 70 ° C. (Merk: inkubering av blandingen ved romtemperatur i lengre tid kan øke suksessen av ligering).
4. Inverse PCR (IPCR) og sekvensanalyse
- Utfør IPCR på ligation produktet ved hjelp av følgende forover og bakover primere og termosykling vilkår:
-Forward Primer (Gm3OUT): GGGCATACGGGAAGAAGTGA
-Reverse Primer (Gm5OUT): GACTGCCCTGCTGCGTAACA
Termocycler Condisjoner:
En. 94 ° C i 1 min.
2. 94 ° C i 1 min.
Tre. 58 ° C i 2 min.
4. 72 ° C i 2 min.
5. 72 ° C i 8 min.
6. 10 ° C hold.
Gjenta trinn 2-4 for 34 sykluser.
(MERK: Amplified IPCR produkter kan lagres ved 4 ° C.) - Utfør agarosegelelektroforese for å bekrefte vellykket IPCR forsterkning.
- Utfør sekvense på IPCR produktet ved hjelp av Gm3OUT og Gm5OUT primere. Innstikkstedet og retningen på himar1 er kartlagt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Som illustrert i figur 1, er mini-himar1 mariner transposon vektor, pFAC, inneholder to 27 bp inverterte repetisjoner med TA innstikk flankerer aacC1 gentamycin motstand kassett, med sin σ 70-avhengige promotor, og en multippel kloningssete (MCS). I tillegg inneholder pFAC vektoren gener som koder for den høyaktiv himar1 transposase, β-laktamase (bla), og tra overførings operon. TA innstikk tillate en effektiv integrering i genomet av P. aeruginosa-stammer. Nøyaktighet i å identifisere og velge slimaktig mutanter er avgjørende for den samlede suksess i å bestemme genloci involvert med alginat regulering. Eksempler på slimaktig og ikke-mukoid isolatene er vist i figur 1..
Til mer nøyaktig identifisere slimaktig mutanter, bør de utfylte bøyning bli belagt på flere store plater (150 mm). Cell blandinger bør resuspendert i sterilt PBS og belagt ved å spre ut de PIA plater pluss gentamycin (300 ug / ml). Fortynninger av cellen blandingen i PBS vil bli spredt på platene med mål om å ha mellom 1000-3000 kolonier / plate. Basert på protokollen ovenfor, bør hver konjugering produsere en bank av ~ 20 000 mutanter enn 15-20 store tallerkener. Optimal inkubasjonstid for at platene ved 37 ° C er mellom 24 til 36 timer. På grunn av overproduksjon av alginat, bør mukoid koloni være klart eller hvitt i farge og har kremaktig eller slimete utseende. Hvis slimet kolonier ikke kan skjelnes, og deretter inkuberes i ytterligere 24-36 timer ved romtemperatur. De slimaktig mutanter er best isolert ved å passere tre ganger på en vanlig PIA plate med gentamycin. I løpet av denne tiden, kan du bestemme stabiliteten av slimaktig fenotype. Det rensede mukoid koloni vil bli brukt for genomisk DNA ekstraksjon og identifisering av gener ved IPCR. IPCR produkter kan visualiseres ved hjelp av agarosegel electrophoresis (figur 2). Ved vellykket, bør det være et enkelt fragment på passende størrelse. PAO1 genomisk DNA som har gjennomgått restriksjonsfordøyelse og ligering kan brukes som en negativ kontroll. Som illustrert i figur 2, er det et fravær av IPCR fragment i PAO1, men vi detektere et enkelt fragment på ~ 1400 bp og 1000 bp ~ in PAO1-VE2 og PAO1-VE13, respektivt. Størrelsen på disse amplikonene svarer til innsetting av himar1 mariner transposon inn i promoter-regionen i PA4033 (mucE) i PAO1-VE2 og internt i PA5484 (kinB) i PAO1-VE13. DNA-sekvensering av de IPCR amplicons bør utføres med GM5OUT primer. Når du bruker Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) å analysere målet sekvensen, den omvendte repeat på 5 'enden av pFAC og TA dinucleotide markere stedet og orientering av himar1 innsetting i genomet til P. aeruginosa (Figur 2 g>).
Figur 1. Skjematisk diagram av mini-himar1 mariner transposon vektor, pFAC, og en representasjon av slimaktig mutanter. Plasmid pFAC inneholder en himar1 mariner transposon-element med to inverterte gjentagelser, og en gentamycin motstand kassett (aacC1) for seleksjon, et gen som koder for den hyperaktive himar1 transposase , og en betinget replikon. Den mini-himar1 mariner transposon kan føre til høy tetthet innsetting i P. aeruginosa på grunn av den mengde av substrat (TA-dinukleotid). Antallet TA dinucleotides i genomene til to P. aeruginosa stammer, PAO1 og PA14 er vist i rødt. De røde pilene viser de slimaktig mutanter identifisert ved hjelp av denne prosedyren.om/files/ftp_upload/51346/51346fig1highres.jpg "target =" _blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. . Representant IPCR og sekvense resultater A) 1% agarosegel elektroforese av IPCR forsterkning ved hjelp av Forward Gm3OUT og revers Gm5OUT primere og en 1 kB ladder: PAO1 (negativ kontroll), PAO1-VE2 (1396 bp), og PAO1-VE13 (999 bp). Det genomiske DNA fra tre stammer av P. aeruginosa ble ekstrahert og fordøyd med Sall-restriksjonsenzymer etterfulgt av selv-ligering. Det lukkede sirkulære DNA ble brukt som mal for IPCR som beskrevet i teksten. B) Sammenligningssekvensanalyse ved hjelp av PAO1 referanse-genomet avgjør den nøyaktige plasseringen av himar1 marineh transposon innsetting i PAO1-VE2 og PAO1-VE13. Sekvensen som er merket med rødt indikerer 5'-enden av inverterte gjentakelse i pFAC. Innstikkstedet på TA ble understreket. En BLAST søk av disse to sekvenser skal kartlegge nøyaktig plassering og orientering av himar1 transposon innenfor genomet av PAO1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det er viktig å merke seg at denne metoden kan anvendes i andre Pseudomonas-arter med følgende forandringer: inkuber P. fluorescens og P. putida ved 30 ° C, og P. stutzeri ved 42 ° C; P. stuzeri skal dyrkes på LB-plater supplert med 150 pg / ml gentamycin, på trinnet 1.11, P. stutzeri cellene skal bli overført inn i 500 pl av LB i stedet for 1 ml. I tillegg er det to viktige skritt for denne protokollen. Først bør belastningen mottaker dyrkes ved passende temperatur. For eksempel bør PAO1 inkuberes ved 42 ° C for å øke frekvensen av rekombinasjon 15. Effektiviteten av det mutante biblioteket ble betydelig redusert dersom belastningen mottakeren om ikke dyrket til riktig temperatur. For det andre er IPCR reproduserbar, men gDNA må være fullstendig fordøyet for å gjøre at en sirkulær kovalent lukket DNA kan gjøres gjennom DNA ligering. Jegf dette gjøres riktig, vil den IPCR produkt fremstår som en band på en agarose gel. Hvis flere band er identifisert, viser de at det er flere innføringer i mutanten. Vi fant ut at IPCR resultater ble sterkt korrelert med våre Southern blot resultater (~ 100%). Derfor kan IPCR bli brukt i stedet for Southern blot analyse for antallet innføringer pr mutant.
Den mini-himar1 mariner transposon i pFAC har ingen transkripsjonen terminator, og det er regulert via en σ 70-avhengige promotor kjøring uttrykk for gentamycin kassett. Vi observerte at posisjonen og retningen på himar1 innsetting hadde varierende effekt på regulering av et bestemt gen. Gener ble inaktivert når de integreres i midten av et gen. Et eksempel på dette er den inaktivering av sensoriske kinasegenet kinB (PA5484) som fører til en konvertering til mukoiditet i PAO1 (PAO1-VE13) 11. I tillegg kan det også up-å regulere ekspresjonen av genet, blir satt inn oppstrøms for det kodende område i den samme retning som genet. Et eksempel på dette er PAO1-VE2, hvor himar1 driver ekspresjonen av mucE (PA4033) 13. Begrensningen av denne protokollen er at bare regulatoriske gener som er uviktig for vekst kan identifiseres. I tillegg kan disse slimaktig mutanter identifisert ved hjelp av denne metoden ikke forekommer naturlig.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatteren Hongwei D. Yu er Chief Science Officer og Grunnlegger av Progenesis Technologies, LLC.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av National Aeronautics and Space Administration West Virginia Space Grant Consortium (NASA WVSGC), Cystisk fibrose Foundation (CFF-YU11G0) og NIH P20RR016477 og P20GM103434 til West Virginia ideen Nettverk for Biomedical Research Excellence. Vi takker Vonya M. Eisinger for hjelp i forbindelse med dette arbeidet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Luria Broth | Difco | 240230 | via Fisher Scientific |
| Pseudomonas isolation agar | Difco | 292710 | via Fisher Scientific |
| Small Plates (100 O.D. x 10 mm) | Fisher Scientific | 08-757-13 | |
| Large Plates (150 O.D. x 15 mm) | Fisher Scientific | 08-757-14 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | BP229-4 | |
| Benchtop Shaking Incubator | New Brunswick Scientific | Innova 4080 | shake at 200 rpm |
| Cabinet Incubator | VWR | 1540 | |
| Benchtop Microcentrifuge | Sorvall | 75-003-287 | via Fisher Scientific |
| SmartSpec Plus Spectrophotometer | Bio-Rad | 170-2525 | or preferred method/vendor |
| Diposable Inoculation Loops | Fisher Scientific | 22-363-597 | |
| 1.5 ml Microcentrifuge Tubes | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| 2.0 ml Cryogenic Vials | Corning | 430659 | via Fisher Scientific |
| 15 ml Tubes | Fisher Scientific | 05-539-12 | |
| Skim Milk | Difco | DF0032-17-3 | via Fisher Scientific |
| DNeasy Blood and Tissue (250) | Qiagen | 69506 | or preferred method/vendor |
| QIAquick PCR Purification Kit (250) | Qiagen | 28106 | or preferred method/vendor |
| QIAprep Spin Miniprep Kit (250) | Qiagen | 27106 | or preferred method/vendor |
| FastLink II DNA Ligation Kit | Epicentre Technologies | LK6201H | via Fisher Scientific |
| Accu block Digital Dry Bath | Labnet | NC0205808 | via Fisher Scientific |
| Sal1, restriction endonuclease | New England BioLabs | R0138L | |
| EasyStart Micro 50 | Molecular BioProducts | 6020 | via Fisher Scientific |
| Taq DNA Polymerase | New England BioLabs | M0267L | |
| iCycler, Thermocycler | Bio-Rad | 170-8740 | |
| LE agarose | Genemate | 3120-500 | via Fisher Scientific |
| Gentamycin Sulfate | Fisher Scientific | BP918-1 | |
| 2.0 ml Cryogenic Vials | Corning | 430659 | via Fisher Scientific |
References
- Govan, J. R., Deretic, V. Microbial pathogenesis in cystic fibrosis: mucoid Pseudomonas aeruginosa and Burkholderia cepacia. Microbiol. Rev. 60, 539-574 (1996).
- Chitnis, C. E., Ohman, D. E. Genetic analysis of the alginate biosynthetic gene cluster of Pseudomonas aeruginosa shows evidence of an operonic structure. Mol. Microbiol. 8, 583-593 (1993).
- Franklin, M. J., et al. Pseudomonas aeruginosa AlgG is a polymer level alginate C5-mannuronan epimerase. J. Bacteriol. 176, 1821-1830 (1994).
- Franklin, M. J., Ohman, D. E. Mutant analysis and cellular localization of the AlgI, AlgJ, and AlgF proteins required for O acetylation of alginate in Pseudomonas aeruginosa. J. Bacteriol. 184, 3000-3007 (2002).
- Deretic, V., Gill, J. F., Chakrabarty, A. M. Gene algD coding for GDPmannose dehydrogenase is transcriptionally activated in mucoid Pseudomonas aeruginosa. J. Bacteriol. 169, 351-358 (1987).
- Mathee, K., McPherson, C. J., Ohman, D. E. Posttranslational control of the algT (algU)-encoded sigma22 for expression of the alginate regulon in Pseudomonas aeruginosa and localization of its antagonist proteins MucA and MucB (AlgN). J. Bacteriol. 179, 3711-3720 (1997).
- Boucher, J. C., Schurr, M. J., Yu, H., Rowen, D. W., Deretic, V. Pseudomonas aeruginosa in cystic fibrosis: role of mucC in the regulation of alginate production and stress sensitivity. Microbiology. 143, 3473-3480 (1997).
- Martin, D. W., Holloway, B. W., Deretic, V. Characterization of a locus determining the mucoid status of Pseudomonas aeruginosa: AlgU shows sequence similarities with a Bacillus sigma factor. J. Bacteriol. 175, 1153-1164 (1993).
- Damron, F. H., Goldberg, J. B. Proteolytic regulation of alginate overproduction in Pseudomonas aeruginosa. Mol. Microbiol. 84 (4), 595-607 (2012).
- Browne, P., Barret, M., O'Gara, F., Morrissey, J. P. Computational prediction of the Crc regulon identifies genus-wide and species-specific targets of catabolite repression control in Pseudomonas bacteria. BMC Microbiol. 10, 300 (2010).
- Damron, F. H., Qiu, D., Yu, H. D. The Pseudomonas aeruginosa sensor kinase KinB negatively controls alginate production through AlgW-dependent MucA proteolysis. J. Bacteriol. 191, 2285-2295 (2009).
- Damron, F. H., et al. Analysis of the Pseudomonas aeruginosa regulon controlled by the sensor kinase KinB and sigma factor RpoN. J. Bacteriol. 194, 1317-1330 (2012).
- Qiu, D., Eisinger, V. M., Rowen, D. W., Yu, H. D. Regulated proteolysis controls mucoid conversion in Pseudomonas aeruginosa. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 8107-8112 (2007).
- Schurr, M. J. Which bacterial biofilm exopolysaccharide is preferred, Psl or alginate. J. Bacteriol. 195, 1623-1626 (2013).
- Wong, S. M., Mekalanos, J. J. Genetic footprinting with mariner-based transposition in Pseudomonas aeruginosa. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 10191-10196 (2000).
- Lampe, D. J., Akerley, B. J., Rubin, E. J., Mekalanos, J. J., Robertson, H. M. Hyperactive transposase mutants of the Himar1 mariner transposon. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96, 11428-11433 (1999).
