Summary
这里我们描述了使用微型himar1水手转座子介导的诱变以产生高密度的插入突变体文库，以屏幕的协议，分离和鉴定中的原型的铜绿假单胞菌菌株PAO1新颖藻稳压器。
Abstract
铜绿假单胞菌是一种革兰氏阴性，环境细菌具有多功能的代谢能力。P.绿脓杆菌是一种条件致病菌细菌确立患者的囊性纤维化（CF）的慢性肺部感染。荚膜多糖称为藻酸盐，也被称为mucoidy的生产过剩，促进粘液的生物膜是比浮游细胞对抗生素的化疗和宿主防御更能抵抗的形成。此外，从nonmucoid到粘液表型的转化是一个临床标记的发作的慢性感染的CF。海藻酸钠生产过剩由P.绿脓杆菌是一种吸能的过程，大量征税细胞能量。因此，海藻酸钠生产是高度管制的P。铜绿假单胞菌 。为了更好地理解海藻酸钠调控，我们描述了一个协议，使用mini-himar1转座子诱变的新型海藻酸调节器的识别S IN一个原型株PAO1。该过程包括两个基本步骤。首先，我们从主机E.转让迷你himar1转座子（PFAC） 大肠杆菌 SM10/λpir到受体P。通过双亲结合来创建一个高密度的插入突变体库，并于辅以庆大霉素假单胞菌分离琼脂平板上选择的铜绿假单胞菌 PAO1。其次，我们筛选和分离出的粘液状菌落，通过反向PCR用DNA引物从盒式庆大霉素和DNA测序指着向外绘制的插入位点。使用此协议，我们已经确定了两个新海藻酸钠监管，MUCE（PA4033）和kinB（PA5484），在PAO1菌株与野生型mucA编码抗σ因子MucA对主海藻酸钠调节AlgU（ALGT，σ22） 。这种高通量诱变协议可以修改为其他毒力相关基因的鉴定引起的变化在结肠NY形态。
Introduction
机会主义，革兰氏阴性病原体绿脓杆菌的生产过剩海藻酸钠的能力是其建立了生物膜能力的主要因素。藻酸盐的过量产生是一个表型通常被称为mucoidy。粘液状菌落从患有囊性纤维化（CF）个人痰隔离指示一种慢性感染，并直接与病人的健康1整体下降有关。目前，应当理解的是藻酸盐中P的调节和生产假单胞菌主要发生在两个操纵子。首先是海藻酸钠生物合成操纵子，其中包含12个基因（ALGD - alg8 - alg44 - algK - 代数 - algG - algX - algL - ALGI - algJ - algF - 藻类 ），负责海藻酸盐聚合物的合成及出口对面在周质的细胞外环境为NT 2-5。第二个操纵子是基因的集群开头的替代σ因子algU /吨 ，与mucA，mucB和MUCD继续。 AlgU / T是正的调节器，而mucAB-D被划分为藻酸盐生产6-8的负调节因子。此外，转录调节子，如ALGB，AlgQ，ALGR和RpoN，以及转录后和翻译后修饰通过降解物阻遏控制，激酶活性（KinB）和膜内蛋白水解作用，也被证明是参与海藻酸钠调控9-14。
被称为PFAC迷你himar1转座子载体最初是在Mekalanos博士的实验室在哈佛医学院15创建的。该PFAC质粒组成由27个基点2反向重复序列和庆大霉素抗性盒在中间（aacC1：534 bp）的两侧转座元件，编码hyperact的基因的ive 水手转座16，和一个基因编码的β-内酰胺酶（BLA）（ 图1）。可在GenBank登录号为PFAC的转座子序列信息：DQ366300 13。在PFAC，有一个多克隆位点（MCS），其用于使用反向PCR的染色体插入位点的鉴定aacC1基因的后面。使用迷你himar1转座子的一个主要优点是所需的换位（诱变）没有具体的宿主因素。此外，还有高丰度的整个P的基因组中发现了TA二核苷酸插入位点铜绿假单胞菌 。例如，TA二核苷酸插入位点发生94404和100229倍，在PAO1（6264404基点，GenBank登录号NC_002516.2）和PA14（6537648基点; GenBank登记接入号码NC_008463）基因组中，分别为。因为TA二核苷酸的基因组中，微型himar1丰度的himar1座子可以插入到P的基因组中的任何非必需基因铜绿假单胞菌 。这提供了每在PAO1基因组开放阅读框约18 TA的插入位点。
在这里，我们描述了一个协议，使用mini-himar1转座子介导的诱变识别mucoidy在体育新监管铜绿假单胞菌 。更具体地说，我们biparentally缀含有微型himar1座子来自大肠杆菌的PFAC矢量大肠杆菌 SM10/λpir到nonmucoid原养型菌株PAO1。后转座子整合在基因组中，受体菌株进行培养的假单胞菌分离琼脂（PIA）的含有三氯生，其抑制大肠杆菌的生长大肠杆菌 。因此，突变体的文库
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Protocol
1。细菌菌株的制备与双亲共轭
- E.接种大肠杆菌 SM10/λpir/pFAC在5ml的Luria肉汤（LB）中在37℃下补充有庆大霉素和地方的15微克/毫升在振荡孵化过夜
- 接种P.假单胞菌菌株PAO1于5ml的LB，并将其放置在摇床过夜，42°C
- 测量外径600过夜培养和混合PAO1和E等量大肠杆菌 PFAC使得最终体积为1-1.4毫升之间。
- 离心混合物以6,000×g离心5分钟。
- 与此同时，干燥的LB平板的结合：离开板的孵化器开放在37℃10-15分钟。
- 删除所有，但50微升上清液从细胞混合物。
- 悬浮在剩余的50微升上清液和吸管的细胞沉淀到干LB平板在一个紧凑的液滴。
- 小心地将板在通风橱中晾干（IMPORTANT注意：不要让细胞分布在盘子里，这将显著降低共轭的效率）。
- 一旦液滴干燥，颠倒LB平板上并在37℃下进行4-6小时。
- 而细胞混合物孵化，准备大（外径150×15毫米），PIA板与庆大霉素的300微克/毫升。在使用之前，通过放置在培养箱中在37℃下15-20分钟除去残留的水分。
- 后的细胞混合物的温育结束后，用无菌接种环收集细胞并在含有1ml LB和涡流，或吸管微量离心管中，以彻底混合。
- 地摊细胞均匀涂于大的PIA板含有300微克/毫升的庆大霉素。 （重要提示：对于此步骤，最好是增加细胞混合物的体积增加来分隔板（ 如板1：10微升，板2：50微升，板3：100微升，标牌4：500微升， 等 ） 。
- 孵育过夜，在37°C。
2。检测和粘液殖民地的隔离
- 从孵化器中取出板并检查粘液菌落。
- 分离出单个菌落粘液和条纹隔离在中小板（100外径×10毫米），PIA和庆大霉素的300微克/毫升。
- 孵育过夜，在37°C。
- 上一过夜培养重复步骤2.2。
- 重复步骤2.2-2.4两次，以确定粘液分离的稳定性。
- 经过最后的分离步骤，接种4.5毫升LB与单个粘液菌落孵育摇床中过夜，在37°C。
- 第二天，标签3的离心管中的每个粘液突变体。
- 准备过夜培养两个1.25毫升分装成2管基因组DNA的提取和鉴定转座子插入位点（见协议3）。
- 此外，吹打1毫升过夜培养成一个适用情况选择归档的每个粘液突变含10％脱脂牛奶等量伊利标记的离心管。贮存于-86°C。
3。基因组DNA酶切和结扎
- 使用任何惯用的方法（ 例如 ，酚-氯仿，旋转柱等 ）的粘液突变体中提取基因组DNA。
- 确定基因组DNA的浓度，消化共2微克与1微升的限制性内切酶SalI位，0.5微升的牛血清白蛋白，5微升SalI位酶缓冲液（100mM的NaCl，50mM的Tris-盐酸，10mM的MgCl 2的，1mM的二硫苏糖醇（DTT），pH值为7.9，在室温下）和DH 2 O的适当体积达到50μl的总体积。
- 过夜消化的DNA在37°C （要点：根据不同的限制性内切酶的效率，它可能需要额外的1微升加至过夜消化和孵育在37℃下1-2小时，这是除了过夜消化。）
- 净化DIGESTED的DNA使用任何首选方法（ 如琼脂糖凝胶纯化，离心柱）和洗脱与25微升缓冲。
- 通过将11微升纯化的DNA用的〜10-20纳克/微升的优选浓度，1.5微升连接缓冲液中（330毫摩尔Tris-乙酸盐pH为7.5，660 mM的醋酸钾，100mM的醋酸镁，5mM的结扎消化的DNA DTT），1.5微升100毫摩尔ATP和1μlDNA连接酶。
- 为15分钟，在室温下温育该混合物，然后通过在70℃下温育15分钟，使酶失活（注：在室温下温育该混合物不再可能增加连接的成功）。
4。反向PCR（反向PCR）及序列分析
- 使用下列的正向和反向引物和热循环条件对连接产物进行反向PCR：
- 正向引物（Gm3OUT）：GGGCATACGGGAAGAAGTGA
- 反向引物（Gm5OUT）：GACTGCCCTGCTGCGTAACA
热循环康迪系统蒸发散：
1。 94℃1分钟;
2。 94℃1分钟;
3。 58℃持续2分钟。
4。 72℃2分钟。
5。 72°C为8分钟。
6。 10°C保温。
重复步骤2-4为34个周期。
（注：扩增反向PCR产品可以保存在4°C） - 进行琼脂糖凝胶电泳，以确认成功的反向PCR扩增。
- 对反向PCR产物使用Gm3OUT和Gm5OUT引物进行测序。插入位点和himar1的取向被映射出来。
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Representative Results
如图1所示 ，微型himar1水手转座子载体，PFAC，包含两个27碱基的反向重复序列与TA的插入位点侧翼的aacC1庆大霉素抗性盒，其σ70依赖型启动子和多克隆位点（MCS）。此外，PFAC载体含有编码基因的高活性himar1转座，β-内酰胺酶（BLA），和TRA传递操纵子。电讯局长插入位点允许一个有效的融入P的基因组铜绿假单胞菌菌株。在识别和选择粘液突变体的精度是确定参与海藻酸钠调控基因位点的整体成功的关键。的粘液和nonmucoid菌株的例子示于图1。
为了更准确地识别粘液突变体，已完成的动词应该是镀上的多个大板块（150毫米）。该CELL混合物应重新悬浮于无菌PBS中，并通过扩散到PIA板加庆大霉素（300微克/毫升）接种。在PBS中的细胞混合物的稀释液将1,000-3,000菌落/板之间具有的目标被铺展在平板上。根据上述协议，每个共轭应该产生的〜20,000突变银行超过15-20大板。最佳培养时间为板在37°C为24-36小时之间。由于海藻酸钠的生产过剩，粘液菌落应该是透明或白色的颜色和有奶油或粘糊糊的外观。如果粘液状菌落不能被识别，然后孵育额外的24-36小时，在室温下进行。粘液的突变体，最好是由有规律PIA板经过三次庆大霉素隔离。在此期间，您可以决定粘液样表型的稳定性。纯化的粘液状菌落，将用于基因组DNA的提取和鉴定的基因通过反向PCR。反向PCR产物可以使用琼脂糖凝胶EL的可视化ectrophoresis（ 图2）。如果成功的话，应该有一个单一的扩增子在适当的大小。 PAO1基因组DNA已经历限制性消化和连接，可作为阴性对照。如示于图2中，有一个不存在反向PCR扩增子在PAO1的，但是我们发现的〜1400碱基对的单个扩增子和〜1,000 bp的PAO1-VE2和PAO1-VE13，分别。这些扩增子的大小对应于himar1水手转座子插入到PA4033（MUCE）的启动子区域中PAO1-VE2和内部在PA5484（kinB）在PAO1-VE13。的反向PCR扩增子的DNA序列应进行与GM5OUT底漆。当使用基本局部比对搜索工具（BLAST）来分析的靶序列上的PFAC和TA二核苷酸的5'末端的反向重复标记himar1插入在P的基因组中的位点和取向假单胞菌 （ 图2 g>的）。
图1。微型himar1水手转座子载体，PFAC和粘液突变体的表示的概略图。质粒PFAC包含两个反向重复用于选择himar1水手转座子元件和庆大霉素抗性盒（aacC1），将编码过动himar1转座子的基因和一个有条件的复制。迷你himar1水手转座子可引起高密度插入P.绿脓杆菌因为基板（TA二核苷酸）的丰度。 TA二核苷酸中的2 P的基因组的数量假单胞菌菌株，PAO1和PA14以红色显示。红色箭头表示使用该程序确定的粘液突变体。om/files/ftp_upload/51346/51346fig1highres.jpg“目标=”_blank“>请点击这里查看该图的放大版本。
图2。 PAO1（阴性对照），PAO1-VE2（1396个基点），而PAO1-VE13（999：使用正向Gm3OUT和反向Gm5OUT引物和1 kb梯度反向PCR扩增代表反向PCR和测序结果的 ）1％琼脂糖凝胶电泳基点）。从三个菌株P的基因组DNA 假单胞菌萃取，用SalⅠ消化的限制酶接着自我连接。作为文本B）中描述的闭合环状DNA被用作反向PCR的模板使用PAO1基因组参考序列比较分析确定himar1马林的精确位置呃转座子插入在PAO1-VE2和PAO1-VE13。标记为红色的顺序表示在PFAC反向重复的5'末端。 TA的插入位点下划线。 BLAST搜索这两个序列将映射PAO1的基因组内的转座子himar1的确切位置和方向。
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Discussion
要注意，这种方法可以在其他假单胞菌属与这些改变使用是很重要的：孵化P.荧光假单胞菌和P.恶臭在30°C和P。施氏假单胞菌在42℃; P。 stuzeri应培养于补充有150微克/毫升庆大霉素的LB平板上，在步骤1.11，P。斯氏假单胞菌细胞应被转移到500微升的LB代替1毫升。此外，还有对本协议的两个关键步骤。首先，受体菌株应在适当的温度下进行培养。例如，PAO1，应在42℃下培养，以增加重组15的频率。该突变体库的效率，如果收款人应变，如果不能培养在适当的温度被显著降低。第二，iPCR中是高度重现性的，但基因组DNA必须被完全消化，以确保一个圆形共价闭合的DNA可通过DNA连接进行。我F这是正确完成后，反向PCR产物将显示为一条带在琼脂糖凝胶上。如果多个频段被确定，它们表明存在多个插入的突变体。我们发现，反向PCR的结果与我们的Southern杂交结果（〜100％）密切相关。因此，反向PCR可以代替Southern印迹分析对每突变体插入次数的使用。
在PFAC迷你himar1水手转座子没有转录终止子，它是通过一个σ70依赖型启动子驱动的庆大霉素盒的表达调控。我们观察到，himar1插入的位置和方向已经在一个特定的基因的调节不同的影响。当集成在一个基因的中间基因被灭活。这样的一个例子是感官激酶基因kinB（PA5484），它导致转换到在PAO1（PAO1-VE13）11 mucoidy的失活。此外，它也可以ü对调节该基因的表达，如果在相同的方向插入基因的编码区的上游。这样的一个例子是PAO1-VE2，其中himar1驱动MUCE（PA4033）13的表达。本协议的限制是，只有调节基因是不重要的增长可以被识别。此外，使用这种方法确定的粘液突变可能不是自然发生的。
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Disclosures
笔者宏伟D.羽的首席科学官兼联合创始人Progenesis科技有限责任公司。
Acknowledgments
这项工作是由美国国家航空和航天局西弗吉尼亚州的太空格兰特联盟（NASA WVSGC），囊性纤维化基金会（CFF-YU11G0）和美国国立卫生研究院P20RR016477和P20GM103434到西弗吉尼亚理念营销网络的生物医学研究的卓越支持。我们感谢Vonya M.艾辛格对这项工作的技术援助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Luria Broth | Difco | 240230 | via Fisher Scientific |
| Pseudomonas isolation agar | Difco | 292710 | via Fisher Scientific |
| Small Plates (100 O.D. x 10 mm) | Fisher Scientific | 08-757-13 | |
| Large Plates (150 O.D. x 15 mm) | Fisher Scientific | 08-757-14 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | BP229-4 | |
| Benchtop Shaking Incubator | New Brunswick Scientific | Innova 4080 | shake at 200 rpm |
| Cabinet Incubator | VWR | 1540 | |
| Benchtop Microcentrifuge | Sorvall | 75-003-287 | via Fisher Scientific |
| SmartSpec Plus Spectrophotometer | Bio-Rad | 170-2525 | or preferred method/vendor |
| Diposable Inoculation Loops | Fisher Scientific | 22-363-597 | |
| 1.5 ml Microcentrifuge Tubes | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| 2.0 ml Cryogenic Vials | Corning | 430659 | via Fisher Scientific |
| 15 ml Tubes | Fisher Scientific | 05-539-12 | |
| Skim Milk | Difco | DF0032-17-3 | via Fisher Scientific |
| DNeasy Blood and Tissue (250) | Qiagen | 69506 | or preferred method/vendor |
| QIAquick PCR Purification Kit (250) | Qiagen | 28106 | or preferred method/vendor |
| QIAprep Spin Miniprep Kit (250) | Qiagen | 27106 | or preferred method/vendor |
| FastLink II DNA Ligation Kit | Epicentre Technologies | LK6201H | via Fisher Scientific |
| Accu block Digital Dry Bath | Labnet | NC0205808 | via Fisher Scientific |
| Sal1, restriction endonuclease | New England BioLabs | R0138L | |
| EasyStart Micro 50 | Molecular BioProducts | 6020 | via Fisher Scientific |
| Taq DNA Polymerase | New England BioLabs | M0267L | |
| iCycler, Thermocycler | Bio-Rad | 170-8740 | |
| LE agarose | Genemate | 3120-500 | via Fisher Scientific |
| Gentamycin Sulfate | Fisher Scientific | BP918-1 | |
| 2.0 ml Cryogenic Vials | Corning | 430659 | via Fisher Scientific |
References
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