Summary
כאן אנו מתארים פרוטוקול באמצעות mutagenesis בתיווך transposon ספן מיני himar1 ליצירת ספריית מוטציה הכנסה בצפיפות גבוהה למסך, לבודד ולזהות רגולטורים אלגינט רומן בPAO1 מתח Pseudomonas aeruginosa אב הטיפוס.
Abstract
Pseudomonas aeruginosa הוא חיידק גראם שלילי, סביבתי עם יכולות מטבוליות צדדי. פ aeruginosa הוא פתוגן חיידקים אופורטוניסטי הקובע דלקות ריאה כרוניות בחולי סיסטיק פיברוזיס (CF). ייצור יתר של פוליסכריד קופסית נקרא אלגינט, הידוע גם mucoidy, מקדם את הקמתה של biofilms רירני שהם עמידים יותר מאשר תאי פלנקטון לכימותרפיה אנטיביוטיקה והגנה מארחת. בנוסף, ההמרה מnonmucoid לפנוטיפ רירני היא סמן קליני לתחילתה של דלקת כרונית בCF. ייצור יתר אלגינט על ידי פ ' aeruginosa הוא תהליך endergonic מיסי אנרגיה בתאים כבד. לכן, ייצור אלגינט מוסדר מאוד בפ aeruginosa. כדי להבין טוב יותר רגולציה אלגינט, אנו מתארים פרוטוקול באמצעות mutagenesis transposon מיני himar1 לזיהוי רגולטור אלגינט רומןים בPAO1 זן אב טיפוס. ההליך מורכב משני שלבים בסיסיים. ראשית, העברנו את transposon מיני himar1 (pFAC) מהמארח א coli SM10/λpir לנמען P. aeruginosa PAO1 באמצעות נטיית biparental ליצור ספריית מוטציה הכנסה בצפיפות גבוהה, אשר נבחרו על צלחות אגר בידוד Pseudomonas בתוספת gentamycin. שנית, אנו הוקרנו ובודדנו את מושבות רירני למפה אתר ההחדרה באמצעות PCR ההפוך באמצעות פריימרים DNA מצביעים החוצה מקלטת gentamycin ורצפי DNA. באמצעות פרוטוקול זה, זיהינו שני רגולטורים רומן אלגינט, mucE (PA4033) וkinB (PA5484), בPAO1 מתח עם mucA פראי מסוג קידוד הגורם אנטי סיגמא MucA לרגולטור אלגינט מאסטר AlgU (AlgT, σ 22) . פרוטוקול mutagenesis תפוקה גבוהה זה יכול להיות שונה לזיהוי גנים הקשורים לאלימות אחרים הגורם לשינוי בקולומורפולוגיה ניו יורק.
Introduction
היכולת של האופורטוניסטי, הפתוגן גראם השלילי Pseudomonas aeruginosa לoverproduce אלגינט היא גורם מרכזי ביכולתה להקים biofilm. ייצור יתר של אלגינט הוא הפנוטיפ המכונה לעתים קרובות כmucoidy. הבידוד של מושבות רירני מספוטה של אנשים לוקים בסיסטיק פיברוזיס (CF) הוא מעיד על זיהום כרוני, והיא קשור באופן ישיר עם ירידה כללית בבריאותו של החולה 1. נכון לעכשיו, הוא הבין כי הרגולציה וייצור של אלגינט בפ aeruginosa מתרחש בעיקר בשני operons. הראשון הוא אופרון biosynthetic אלגינט, המכיל 12 גנים (algD - alg8 - alg44 - algK - alge - algG - algX - algL - algI - algJ - algF - אצה) שאחראים לסינתזה והיצוא של פולימר אלגינט פני periplasm לenvironme תאיNT 2-5. אופרון השני הוא אשכול גנים החל עם גורם סיגמא האלטרנטיבי algU / T וממשיך בmucA, mucB, וmucD. AlgU / T הוא רגולטור חיובי, בעוד mucAB-D מסווגים כרגולטורים שליליים של ייצור אלגינט 6-8. בנוסף, רגולטורים תעתיק, כגון AlgB, AlgQ, AlgR, וRpoN, כמו גם לאחר תעתיק ושינוי שלאחר translational על ידי שליטת catabolite דיכוי, פעילות קינאז (KinB) וproteolysis intramembrane, יש גם הוכחו להיות מעורבים באלגינט הרגולציה 9-14.
וקטור transposon מיני himar1 המכונה pFAC נוצר במקור במעבדה של ד"ר Mekalanos בבית הספר לרפואה של אוניברסיטת הרווארד 15. פלסמיד pFAC מורכב מאלמנט transposable המוקף שתי חזרות הפוכות של 27 bps וקלטת gentamycin התנגדות באמצע (aacC1: 534 נ"ב), גן מקודד hyperactive transposase ספן 16, וβ-lactamase גן קידוד (בלה) (איור 1). מידע רצף עבור אלמנט transposable של pFAC זמין במספר הצטרפות GenBank: 13 DQ366300. בpFAC, יש אתר שיבוט מרובה (MCS) מאחורי גן aacC1 המשמש לזיהוי של אתר ההכנסה כרומוזומליות באמצעות PCR ההפוך. אחד יתרונות גדולים בשימוש בtransposon מיני himar1 אין גורמי מארח ספציפיים נדרשים לטרנספוזיציה (mutagenesis). בנוסף, יש שפע גבוה של החדרת אתרי dinucleotide ת"א נמצאים בכל הגנום של פ aeruginosa. לדוגמא, אתרי החדרת dinucleotide ת"א מתרחש 94,404 ו100,229 פעמים בPAO1 (6,264,404 bps, מספר הצטרפות GenBank NC_002516.2) וPA14 (6,537,648 bps; מספר גישת GenBank NC_008463) הגנום, בהתאמה. בגלל השפע של dinucleotide ת"א בגנום, מיני himar1 himar1 יכול להכניס לתוך כל גן חיוני בתוך הגנום של פ aeruginosa. זה מספק כ 18 אתרי החדרה ת"א לכל מסגרת קריאה פתוחה בגנום PAO1.
כאן אנו מתארים פרוטוקול באמצעות mutagenesis בתיווך transposon מיני himar1 לזהות רגולטורים רומן של mucoidy בפ aeruginosa. באופן ספציפי יותר, אנו biparentally מצומדת וקטור pFAC מכיל transposon מיני himar1 מE. coli SM10/λpir לPAO1 מתח prototrophic nonmucoid. לאחר transposon משולב בגנום, מתח הנמען הוא תרבית על אגר בידוד Pseudomonas טריקלוזן (PIA) המכיל אשר מעכב את הצמיחה של E. coli. לפיכך, ספרייה של מוטציות של
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. הכנה של זני חיידקים וBiparental נטיה
- לחסן E. coli SM10/λpir/pFAC ב 5 מיליליטר של מרק לוריא (LB) בתוספת 15 מיקרוגרם / מיליליטר של gentamycin ומקום בחממה רועדת הלילה בשעה 37 ° C.
- לחסן פ PAO1 aeruginosa המתח ב 5 מיליליטר של LB, ומקום בחממה רועדת הלילה בשעה 42 ° C.
- מדוד OD 600 של תרבויות לילה ולערבב כמויות שווה של PAO1 וא coli pFAC כך שהנפח הסופי הוא בין 1-1.4 מיליליטר.
- תערובת צנטריפוגה ב 6,000 XG במשך 5 דקות.
- בינתיים, ייבוש צלחות LB לנטייה: להשאיר צלחות פתוחות באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס למשך 10-15 דקות.
- הסר את כל אבל 50 μl של supernatant מתערובת תא.
- Resuspend התא גלולה ב μl 50 הנותר של supernatant וטפטף על צלחת LB יבשה בטיפה אחת קומפקטית.
- למקם את הצלחת בזהירות במנדף לייבוש (impoהערה RTANT: אל תתנו לתאים משתרעים על פני הצלחת, זה יהיה להקטין באופן משמעותי את היעילות של נטיה).
- ברגע שרביב הוא יבש, להפוך את צלחת LB ו לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 4-6 שעות.
- בעוד תערובת התא היא דוגרת, להכין צלחות פיא (150 OD x 15 מ"מ) גדולות עם 300 מיקרוגרם / מיליליטר של gentamycin. לפני השימוש, הסר את כל לחות שיורית על ידי הצבת באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס למשך 15-20 דקות.
- לאחר הדגירה של תערובת התא היא מלאה, לאסוף את התאים באמצעות לולאת חיסון סטרילי ובצינור microcentrifuge המכיל 1 מיליליטר LB ומערבולת, או פיפטה, לערבב ביסודיות.
- מורחים את התאים באופן שווה על גבי צלחות PIA הגדולות מכילות 300 מיקרוגרם / מיליליטר gentamycin. (חשוב: לצעד זה, עדיף להוסיף כמויות הולך וגדל של תערובת התאים להפריד צלחות (למשל פלייט 1: 10 μl, 2 פלייט: 50 μl, צלחת 3: 100 μl, צלחת 4: 500 μl, וכו ') .
- דגירה הלילה בשעה 37° C.
2. זיהוי ובידוד של מושבות רירני
- הסר את הצלחות מן החממה ולבחון למושבות רירני.
- לבודד מושבה רירני יחידה ופס לבידוד על צלחות קטנות (100 OD x 10 מ"מ) עם PIA ו300 / מיליליטר מיקרוגרם של gentamycin.
- דגירה הלילה בשעה 37 ° C.
- חזור על שלב 2.2 על תרבות הלילה הקודמת.
- חזור על שלבים 2.2-2.4 עוד פעמיים כדי לקבוע את היציבות של בודד רירני.
- לאחר שלב בודד סופי, לחסן 4.5 מיליליטר של LB עם מושבה רירני יחידה ודגירה שבייקרה לילה בשעה 37 ° C.
- למחרת, תווית 3 microcentrifuge צינורות עבור כל מוטציה רירני.
- הכן שני 1.25 aliquots מיליליטר של תרבות הלילה ל -2 צינורות להפקת DNA גנומי וזיהוי של אתר הכנסת transposon (ראה פרוטוקול 3).
- בנוסף, בארכיון בכל מוטציה רירני ידי pipetting 1 מיליליטר תרבות הלילה לתוך appropriatcryovial איליי שכותרת המכילה נפח שווה של 10% חלב דל שומן. חנות ב -86 ° C.
3. הגבלת gDNA עיכול וקשירה
- לחלץ gDNA ממוטצית רירני באמצעות כל שיטה מועדפת (לדוגמא. פנול, כלורופורם, טור ספין, וכו ').
- קבע את הריכוז של gDNA, לעכל כולל של 2 מיקרוגרם עם 1 μl של endonuclease ההגבלה סאלי, 0.5 μl של אלבומין בסרום שור, 5 μl של חיץ אנזים סאלי (100 mM NaCl, 50 מ"מ טריס-HCl, 10 מ"מ MgCl 2 , 1 מ"מ Dithiothrietol (DTT), pH 7.9 בטמפרטורת חדר), והנפח המתאים של DH 2 O להשיג בנפח כולל של 50 μl.
- לעכל דנ"א לילה בשעה 37 ° C. (חשוב:. בהתאם ליעילות של אנזים ההגבלה, ייתכן שיהיה צורך להוסיף μl 1 נוסף כדי לעכל הלילה ולדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 1-2 שעות זאת בנוסף לתקציר בלילה.)
- לטהר את DIGEה-DNA STED באמצעות כל שיטה מועדפת (לדוגמא טיהור agarose ג'ל, עמודות ספין) וelute עם 25 μl של חיץ.
- ולקשור את ה-DNA מתעכל על ידי ערבוב 11 μl של DNA מטוהר עם ריכוז המועדף על ~ 10-20 ng / μl, 1.5 μl של קשירת חוצץ (330 pH מ"מ טריס-אצטט 7.5, 660 אצטט mM אשלגן, מגנזיום 100 אצטט מ"מ, 5 מ"מ DTT), 1.5 μl של 100 מ"מ ATP ואנזים דנ"א μl 1.
- דגירה את התערובת ל15 דקות בטמפרטורת חדר, ולאחר מכן להשבית את האנזים על ידי דוגרים ל15 דקות ב 70 ° C. (הערה: דוגרים את התערובת בטמפרטורת חדר למשך זמן ארוך יותר עשוי להגדיל את ההצלחה של קשירה).
4. PCR ההפוך (iPCR) ורצף ניתוח
- בצע iPCR על מוצר קשירה באמצעות הפעולות הבאות קדימה לאחור פריימרים וthermocycling תנאים:
קדימה פריימר (Gm3OUT): GGGCATACGGGAAGAAGTGA
-ההפוך פריימר (Gm5OUT): GACTGCCCTGCTGCGTAACA
Thermocycler קונדיtions:
1. C ° 94 דקות 1.
2. C ° 94 דקות 1.
3. C ° 58 למשך 2 דקות.
4. C ° 72 למשך 2 דקות.
5. C ° 72 במשך 8 דקות.
6. אחיזת C ° 10.
חזור על השלבים 2-4 ל34 מחזורים.
(הערה: ניתן לאחסן מוצרי Amplified iPCR ב 4 ° C.) - בצע ג'ל אלקטרופורזה agarose כדי לאשר הגברה iPCR מוצלחת.
- לבצע רצף על מוצר iPCR באמצעות פריימרים Gm3OUT וGm5OUT. אתר ההכנסה ואת הכיוון של himar1 ממופים החוצה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
כפי שמודגם באיור 1, וקטור transposon ספן מיני himar1, pFAC, מכיל שתי חזרות הפוכות 27 נ"ב עם אתרי החדרת ת"א איגוף קלטת התנגדות gentamycin aacC1, עם האמרגן שלה σ 70 תלוי, ואתר מרובה שיבוט (MCS). בנוסף, וקטור pFAC מכיל גנים המקודדים את transposase הפעיל מאוד himar1, β-lactamase (בלה), ואופרון העברת טרה. אתרי החדרת ת"א לאפשר אינטגרציה יעילה לתוך הגנום של פ זני aeruginosa. דיוק בזיהוי ובחירת מוטנטים רירני הוא קריטי להצלחה הכוללת בקביעת לוקוסי גן מעורב עם הרגולציה אלגינט. דוגמאות מבודדת רירני וnonmucoid מוצגות באיור 1.
כדי לזהות באופן מדויק יותר מוטציות רירני, צריכים להיות מצופים הפעלים השלימו על צלחות מרובות גדולות (150 מ"מ). Ceתערובות ll צריכה להיות מושעות בPBS סטרילי ומצופות על ידי הפצה לצלחות PIA בתוספת gentamycin (300 מיקרוגרם / מיליליטר). דילולים של תערובת תאים בPBS יתפרסו על הצלחות במטרה שיש בין 1,000-3,000 מושבות / צלחת. בהתבסס על הפרוטוקול לעיל, כל נטיה צריכה לייצר בנק של ~ 20,000 מוטציות מעל 15-20 צלחות גדולות. זמן דגירה אופטימלי לצלחות ב 37 ° C הוא בין 24-36 שעה. בשל ייצור יתר של אלגינט, המושבה רירני צריכה להיות ברורה או בצבע לבן ויש לי הופעת שמנת או חלקלקה. אם לא ניתן להבחין במושבות רירני, אז דגירה של 24-36 שעות נוספות בטמפרטורת חדר. מוטציות רירני מבודדות הטוב ביותר על ידי עובר שלוש פעמים על צלחת PIA קבועה עם gentamycin. במהלך הזמן הזה, אתה יכול לקבוע את היציבות של פנוטיפ רירני. המושבה רירני מטוהרת תשמש להפקת הדנ"א הגנומי וזיהוי של גנים על ידי iPCR. ניתן דמיינו מוצרי iPCR באמצעות agarose ג'ל אלectrophoresis (איור 2). אם יצליח, צריך להיות שיש amplicon אחד בגודל המתאים. הדנ"א הגנומי PAO1 שעבר עיכול הגבלה וקשירה יכול לשמש כביקורת שלילית. כפי שמודגם באיור 2, קיים היעדר amplicon iPCR בPAO1, עם זאת אנו מזהים amplicon יחיד של ~ 1,400 BP ו ~ 1,000 BP בPAO1-VE2 וPAO1-VE13, בהתאמה. הגודל של amplicons אלו מקביל לכניסה של transposon ספן himar1 לאזור המקדם של PA4033 (mucE) בPAO1-VE2 והפנימי בPA5484 (kinB) בPAO1-VE13. רצף ה-DNA של amplicons iPCR צריכה להתבצע עם פריימר GM5OUT. בעת השימוש המקומי יישור כלי חיפוש הבסיסי (תפציץ) לנתח את רצף היעד, חוזר ההפוך בסופו של הדבר '5 של dinucleotide pFAC ות"א לסמן את האתר ואת הכיוון של הכניסה himar1 בגנום של פ aeruginosa (איור 2 g>).
איור 1. תרשים סכמטי של וקטור מיני himar1 transposon הספן, pFAC, וייצוג של מוטציות רירני. פלסמיד pFAC מכיל רכיב himar1 ספן transposon עם שתי חזרות הפוכות, וקלטת gentamycin התנגדות (aacC1) לבחירה, גן מקודד transposase himar1 היפראקטיבי , וreplicon על תנאי. Transposon ספן מיני himar1 יכול לגרום להחדרה בצפיפות גבוהה בפ aeruginosa בגלל השפע של מצע (dinucleotide ת"א). מספר dinucleotides ת"א בגנומים של שני פ זני aeruginosa, PAO1 וPA14 מוצגים באדום. החיצים האדומים מציינים את מוטציות רירני זוהו באמצעות הליך זה.om/files/ftp_upload/51346/51346fig1highres.jpg "target =" _blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2. . IPCR ותוצאות רצף נציג) ג'ל אלקטרופורזה agarose 1% מהגברת iPCR באמצעות primers קדימה Gm3OUT והיפוך Gm5OUT וסולם 1 kB: PAO1 (בקרה שלילית), PAO1-VE2 (1396 נ"ב), וPAO1-VE13 (999 נ"ב). הדנ"א הגנומי משלושה זנים של פ aeruginosa הופק ומתעכל עם אנזימי הגבלת סאלי ואחרי קשירה עצמית. DNA המעגלי סגור שמשמש כתבניות לiPCR כפי שמתואר בטקסט. ב ') ניתוח השוואתי באמצעות רצף הגנום התייחסות PAO1 קובע את המיקום המדויק של marin himar1הכניסה transposon er בPAO1-VE2 וPAO1-VE13. הרצף שהכותרת באדום מציין סוף '5 של חוזר הפוכים בpFAC. אתר ההחדרה של ת"א היה בקו תחתון. חיפוש פיצוץ של שני רצפים אלה למפות את המיקום וכיוון המדויקים של transposon himar1 בתוך הגנום של PAO1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
חשוב לציין כי בשיטה זו ניתן להשתמש במינים Pseudomonas אחרים עם השינויים הבאים: דגירה פ fluorescens ו פ putida ב30 מעלות צלזיוס, ופ stutzeri על 42 מעלות צלזיוס; פ stuzeri צריך להיות מתורבת על צלחות LB בתוספת 150 מיקרוגרם / מ"ל של gentamycin; על צעד 1.11, פ תאי stutzeri צריכים להיות מועברים לתוך 500 μl של LB במקום 1 מיליליטר. בנוסף, יש שני שלבים קריטיים לפרוטוקול זה. ראשית, מתח הנמען צריך להיות מתורבת בטמפרטורה המתאימה. לדוגמא, PAO1 יש טופח על 42 ° C כדי להגדיל את התדירות של רקומבינציה 15. היעילות של ספריית המוטציה צומצמה באופן משמעותי אם מתח הנמען אם לא בתרבית בטמפרטורה הנכונה. שנית, iPCR הוא לשעתקו מאוד, אבל gDNA חייב להיות מתעכל לגמרי לעשות להבטיח כי ה-DNA קוולנטית הסגור מעגלי יכולה להתבצע באמצעות קשירת ה-DNA. אניו זה נעשה בצורה נכונה, מוצר iPCR יופיע כלהקה אחת על ג'ל agarose. אם להקות מרובות מזוהות, הם מצביעים על כך שיש הוספות רבות במוטציה. מצאנו כי תוצאות iPCR היו מתואמות חזק עם התוצאות שלנו כתם דרום (~ 100%). לכן, iPCR ניתן להשתמש במקום של ניתוח כתם דרום למספר הוספות למוטציה.
Transposon ספן מיני himar1 בpFAC אין שליחות קטלנית תעתיק, וזה מוסדר באמצעות אמרגן 70 תלוי σ נהיגה הביטוי לקלטת gentamycin. הבחנו כי העמדה והכיוון של החדרת himar1 היו שונה השפעות על הרגולציה של גן מסוים. גנים היו מובטלים כאשר משולב באמצע גן. דוגמא לכך היא איון של kinB גן קינאז החושי (PA5484) אשר גורם להמרה לmucoidy בPAO1 (PAO1-VE13) 11. בנוסף, גם זה יכול up-להסדיר את הביטוי של הגן, אם הוכנס במעלה הזרם של אזור הקידוד באותו הכיוון כמו הגן. דוגמא לכך היא PAO1-VE2, שם himar1 מניע את הביטוי של mucE (PA4033) 13. המגבלה של פרוטוקול זה היא שרק גנים רגולטורים כי הם חיוניים לצמיחה יכולים להיות מזוהות. בנוסף, אלה מוטציות רירני זוהו באמצעות שיטה זו לא יכולה להתרחש באופן טבעי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחבר Hongwei ד יו הוא קצין המדע הראשי ומייסדים של Progenesis טכנולוגיות, LLC.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי הקרן הלאומית לאווירונאוטיקה וחלל מנהל מערב וירג'יניה שטח גרנט Consortium (נאס"א WVSGC), קרן סיסטיק פיברוזיס (CFF-YU11G0) ו-NIH P20RR016477 וP20GM103434 לרשת רעיון המערב וירג'יניה ביו רפואית מצוינות מחקר. אנו מודים Vonya מ 'אייזינגר לסיוע הטכני בעבודה זו.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Luria Broth | Difco | 240230 | via Fisher Scientific |
| Pseudomonas isolation agar | Difco | 292710 | via Fisher Scientific |
| Small Plates (100 O.D. x 10 mm) | Fisher Scientific | 08-757-13 | |
| Large Plates (150 O.D. x 15 mm) | Fisher Scientific | 08-757-14 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | BP229-4 | |
| Benchtop Shaking Incubator | New Brunswick Scientific | Innova 4080 | shake at 200 rpm |
| Cabinet Incubator | VWR | 1540 | |
| Benchtop Microcentrifuge | Sorvall | 75-003-287 | via Fisher Scientific |
| SmartSpec Plus Spectrophotometer | Bio-Rad | 170-2525 | or preferred method/vendor |
| Diposable Inoculation Loops | Fisher Scientific | 22-363-597 | |
| 1.5 ml Microcentrifuge Tubes | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| 2.0 ml Cryogenic Vials | Corning | 430659 | via Fisher Scientific |
| 15 ml Tubes | Fisher Scientific | 05-539-12 | |
| Skim Milk | Difco | DF0032-17-3 | via Fisher Scientific |
| DNeasy Blood and Tissue (250) | Qiagen | 69506 | or preferred method/vendor |
| QIAquick PCR Purification Kit (250) | Qiagen | 28106 | or preferred method/vendor |
| QIAprep Spin Miniprep Kit (250) | Qiagen | 27106 | or preferred method/vendor |
| FastLink II DNA Ligation Kit | Epicentre Technologies | LK6201H | via Fisher Scientific |
| Accu block Digital Dry Bath | Labnet | NC0205808 | via Fisher Scientific |
| Sal1, restriction endonuclease | New England BioLabs | R0138L | |
| EasyStart Micro 50 | Molecular BioProducts | 6020 | via Fisher Scientific |
| Taq DNA Polymerase | New England BioLabs | M0267L | |
| iCycler, Thermocycler | Bio-Rad | 170-8740 | |
| LE agarose | Genemate | 3120-500 | via Fisher Scientific |
| Gentamycin Sulfate | Fisher Scientific | BP918-1 | |
| 2.0 ml Cryogenic Vials | Corning | 430659 | via Fisher Scientific |
References
- Govan, J. R., Deretic, V. Microbial pathogenesis in cystic fibrosis: mucoid Pseudomonas aeruginosa and Burkholderia cepacia. Microbiol. Rev. 60, 539-574 (1996).
- Chitnis, C. E., Ohman, D. E. Genetic analysis of the alginate biosynthetic gene cluster of Pseudomonas aeruginosa shows evidence of an operonic structure. Mol. Microbiol. 8, 583-593 (1993).
- Franklin, M. J., et al. Pseudomonas aeruginosa AlgG is a polymer level alginate C5-mannuronan epimerase. J. Bacteriol. 176, 1821-1830 (1994).
- Franklin, M. J., Ohman, D. E. Mutant analysis and cellular localization of the AlgI, AlgJ, and AlgF proteins required for O acetylation of alginate in Pseudomonas aeruginosa. J. Bacteriol. 184, 3000-3007 (2002).
- Deretic, V., Gill, J. F., Chakrabarty, A. M. Gene algD coding for GDPmannose dehydrogenase is transcriptionally activated in mucoid Pseudomonas aeruginosa. J. Bacteriol. 169, 351-358 (1987).
- Mathee, K., McPherson, C. J., Ohman, D. E. Posttranslational control of the algT (algU)-encoded sigma22 for expression of the alginate regulon in Pseudomonas aeruginosa and localization of its antagonist proteins MucA and MucB (AlgN). J. Bacteriol. 179, 3711-3720 (1997).
- Boucher, J. C., Schurr, M. J., Yu, H., Rowen, D. W., Deretic, V. Pseudomonas aeruginosa in cystic fibrosis: role of mucC in the regulation of alginate production and stress sensitivity. Microbiology. 143, 3473-3480 (1997).
- Martin, D. W., Holloway, B. W., Deretic, V. Characterization of a locus determining the mucoid status of Pseudomonas aeruginosa: AlgU shows sequence similarities with a Bacillus sigma factor. J. Bacteriol. 175, 1153-1164 (1993).
- Damron, F. H., Goldberg, J. B. Proteolytic regulation of alginate overproduction in Pseudomonas aeruginosa. Mol. Microbiol. 84 (4), 595-607 (2012).
- Browne, P., Barret, M., O'Gara, F., Morrissey, J. P. Computational prediction of the Crc regulon identifies genus-wide and species-specific targets of catabolite repression control in Pseudomonas bacteria. BMC Microbiol. 10, 300 (2010).
- Damron, F. H., Qiu, D., Yu, H. D. The Pseudomonas aeruginosa sensor kinase KinB negatively controls alginate production through AlgW-dependent MucA proteolysis. J. Bacteriol. 191, 2285-2295 (2009).
- Damron, F. H., et al. Analysis of the Pseudomonas aeruginosa regulon controlled by the sensor kinase KinB and sigma factor RpoN. J. Bacteriol. 194, 1317-1330 (2012).
- Qiu, D., Eisinger, V. M., Rowen, D. W., Yu, H. D. Regulated proteolysis controls mucoid conversion in Pseudomonas aeruginosa. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 8107-8112 (2007).
- Schurr, M. J. Which bacterial biofilm exopolysaccharide is preferred, Psl or alginate. J. Bacteriol. 195, 1623-1626 (2013).
- Wong, S. M., Mekalanos, J. J. Genetic footprinting with mariner-based transposition in Pseudomonas aeruginosa. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 10191-10196 (2000).
- Lampe, D. J., Akerley, B. J., Rubin, E. J., Mekalanos, J. J., Robertson, H. M. Hyperactive transposase mutants of the Himar1 mariner transposon. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96, 11428-11433 (1999).
