Summary
Her beskriver vi en protokol ved hjælp af mini-himar1 mariner transposon-medieret mutagenese for at generere et high-density indsættelse mutantbibliotek til skærm, isolere og identificere nye alginat lovgivere i det prototypiske Pseudomonas aeruginosa stamme PAO1.
Abstract
Pseudomonas aeruginosa er en Gram-negativ, miljømæssig bakterie med alsidige metaboliske kapacitet. P. aeruginosa er en opportunistisk bakteriel patogen, der etablerer kroniske pulmonare infektioner hos patienter med cystisk fibrose (CF). Overproduktion af et kapselpolysaccharid kaldet alginat, også kendt som mucoidy, fremmer dannelsen af slimet biofilm, der er mere modstandsdygtig end planktoniske celler til antibiotisk kemoterapi og værtsforsvar. Derudover konvertering fra nonmucoid til mucoid fænotype er en klinisk markør for indtræden af kronisk infektion i CF. Alginat overproduktion af P. aeruginosa er en endergonic proces, som i høj grad skatter cellulær energi. Derfor er alginat produktion stærkt reguleret i P. aeruginosa. For bedre at forstå alginat regulering beskriver vi en protokol ved hjælp af mini-himar1 transposon mutagenese til identifikation af nye alginat regulators i en prototypisk stamme PAO1. Proceduren består af to grundlæggende skridt. Først overførte vi mini-himar1 transposonen (pFAC) fra vært E. coli SM10/λpir i recipient P. aeruginosa PAO1 via biparental konjugation til at skabe et high-density indsættelse mutantbibliotek, som blev udvalgt på Pseudomonas isolation agarplader suppleret med gentamycin. For det andet, vi screenet og isolerede mucoide kolonier at kortlægge insertionsstedet gennem omvendt PCR ved hjælp af DNA-primere, der peger udad fra gentamycin kassette og DNA-sekventering. Ved hjælp af denne protokol, har vi identificeret to nye alginat regulatorer, mucE (PA4033) og kinB (PA5484) i stammen PAO1 med en vildtype Muca koder anti-sigma faktor Muca til master alginat regulator AlgU (ALGT, σ 22) . Denne high-throughput mutagenese protokol kan modificeres til identifikation af andre virulens-gener, der forårsager ændringer i colony morfologi.
Introduction
Evne opportunistisk, Gram-negative patogener Pseudomonas aeruginosa at overproducere alginat er en vigtig faktor i sin evne til at etablere en biofilm. Overproduktion af alginat er en fænotype, der ofte omtales som mucoidy. Isoleringen af mucoide kolonier fra sputa af personer ramt af cystisk fibrose (CF) er tegn på en kronisk infektion, og er direkte forbundet med et samlet fald i patientens helbred 1. I øjeblikket er det underforstået, at regulering og produktion af alginat i P. aeruginosa forekommer primært på to operoner. Den første er den alginat biosyntetiske operon, der indeholder 12 gener (algD - alg8 - alg44 - algK - Alge - algG - algX - algL - ALGI - algJ - algF - Alga), som er ansvarlige for syntesen og eksport af alginat polymer tværs periplasmaet til det ekstracellulære environment 2-5. Den anden operon er en klynge af gener, der begynder med den alternative sigma faktor algU / T og fortsatte med Muca, mucB og mucD. AlgU / T er en positiv regulator, mens mucAB-D er klassificeret som negative regulatorer af alginat produktion 6-8. Derudover har også vist, transkriptionelle regulatorer, såsom ALGB, AlgQ, AlgR og RpoN, samt post-transkriptionel og post-translationel modifikation af katabolitrepression kontrol kinaseaktivitet (KinB) og intramembrane proteolyse for at være involveret i alginat regel 9-14.
Mini-himar1 transposon vektor kaldet pFAC blev oprindeligt skabt i Dr. Mekalanos 'laboratorium på Harvard Medical School 15. Den pFAC plasmid består af et transposerbart element flankeret af to inverterede gentagelser af 27 bps og en gentamycin modstand kassette i midten (aacC1: 534 bp), et gen kodende for hyperactive mariner transposasen 16, og et gen, der koder for β-lactamase (bla) (figur 1). Sekvens oplysninger til flytbare element af pFAC er tilgængelig på GenBank accession number: DQ366300 13.. I pFAC er der et multipelt kloningssted bag aacC1 gen, der anvendes til identifikation af kromosomale insertionssted hjælp invers PCR (MCS). En stor fordel med hjælp af mini-himar1 transposonen er ingen specifikke værtsfaktorer er nødvendige for gennemførelse (mutagenese). Desuden er der stor overflod af TA dinukleotiddimererne indsættelsessteder findes i hele genomet af P. aeruginosa. For eksempel TA dinukleotid indsættelsessteder opstår 94.404 og 100.229 gange i PAO1 (6.264.404 bps, Genbank-nummer NC_002516.2) og PA14 (6.537.648 bps, GenBank adgangsnummer NC_008463) genomer, hhv. På grund af den overflod af TA dinukleotid i genomet, mini-himar1 mini-himar1 transposon indsætte i nogen ikke-essentielt gen i genomet af P. aeruginosa. Dette giver ca 18 TA indsættelse steder pr åbne læseramme i PAO1 genom.
Her beskriver vi en protokol ved hjælp af mini-himar1 transposon-medieret mutagenese at identificere nye regulatorer af mucoidy i P. aeruginosa. Mere specifikt, vi biparentally konjugeret den pFAC vektor indeholdende et mini-himar1 transposon fra E. coli SM10/λpir i nonmucoid prototrof stamme PAO1. Efter transposonet er integreret i genomet, modtagerstammen dyrkes Pseudomonas isolation agar (PIA), som indeholder triclosan, der inhiberer væksten af E. coli. Således er et bibliotek af mutanter af
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1.. Udarbejdelse af Bakteriestammer biparental Conjugation
- Podes E. coli SM10/λpir/pFAC i 5 ml Luria Broth (LB) suppleret med 15 ug / ml gentamycin og sted i en ryste-inkubator natten over ved 37 ° C.
- Podes P. aeruginosa stamme PAO1 i 5 ml LB, og sted i en rysteinkubator natten over ved 42 ° C.
- Måle OD600 af overnattende kulturer og bland lige store mængder af PAO1 og E. coli pFAC, således at det endelige volumen er mellem 1 til 1,4 ml.
- Centrifuger blandingen ved 6000 xg i 5 min.
- I mellemtiden tør LB-plader til konjugering: pladerne henstår åbne i inkubator ved 37 ° C i 10-15 min.
- Fjern alle men 50 pi supernatant fra celle blanding.
- Resuspender cellepelleten i de resterende 50 ul af supernatanten og pipette på en tør LB-plade i en kompakt dråbe.
- Placer forsigtigt pladen i et stinkskab for at tørre (IMPORTANT Bemærk: Lad ikke celler spredt over pladen, vil det betydeligt mindske effektiviteten af konjugation).
- Når dråben er tør vendes LB-plade og inkuberes ved 37 ° C i 4-6 timer.
- Mens Celleblandingen inkubering tilberedes store (150 OD x 15 mm) PIA plader med 300 ug / ml gentamycin. Før brug, fjerne enhver resterende fugt ved at placere i en inkubator ved 37 ° C i 15-20 min.
- Efter inkubering af cellen blandingen er færdig, indsamle cellerne ved hjælp af en steril inokulation løkke og i et mikrocentrifugerør indeholdende 1 ml LB og vortex eller pipette for at blande grundigt.
- Spred cellerne jævnt på de store PIA pladerne indeholder 300 mg / ml gentamycin. (VIGTIGT: Til dette trin, er det bedst at tilføje stigende mængder celleblandingen at adskille plader (f.eks Plate 1: 10 ul, Plate 2: 50 ul, Plate 3: 100 ul, Plate 4: 500 ul, osv.) .
- Inkuberes natten over ved 37° C.
2. Påvisning og Isolering af mucoide kolonier
- Fjern pladerne fra inkubatoren og undersøge for mucoide kolonier.
- Isolere en enkelt slimet koloni og streak for isolation på små plader (100 OD x 10 mm) med PIA og 300 pg / ml gentamycin.
- Inkuberes natten over ved 37 ° C.
- Gentag trin 2.2 på forrige overnight kultur.
- Gentag trin 2,2-2,4 to eller flere gange for at bestemme stabiliteten af mucoid isolat.
- Efter den endelige isolat trin pode 4,5 ml LB med en enkelt mucoid koloni og inkuberes i shaker natten over ved 37 ° C.
- Næste dag, etiket 3 mikrocentrifugerør for hver mucoid mutant.
- Forbered to 1,25 ml portioner af natten kultur i 2 rør til genomisk DNA-ekstraktion og identifikation af transposonindsættelse webstedet (se protokol 3).
- Derudover arkivere hver mucoid mutant ved at pipettere 1 ml natten over kultur i et BEVILLINGEely-mærket kryoglas indeholdende et lige volumen af 10% skummetmælk. Opbevares ved -86 ° C.
3. gDNA restriktionsspaltning og ligering
- Uddrag gDNA fra mucoid mutant ved hjælp af en foretrukken metode (f.eks. Phenol-chloroform, spinkolonne osv.).
- Bestem koncentrationen af gDNA, fordøje alt 2 ug med 1 pi af restriktionsendonuclease Sall, 0,5 pi bovint serumalbumin, 5 pi Sall-buffer (100 mM NaCI, 50 mM Tris-HCI, 10 mM MgCl2 , 1 mM Dithiothrietol (DTT), pH 7,9 ved stuetemperatur), og det passende volumen af dH2O at opnå et samlet volumen på 50 ul.
- Fordøje DNA natten over ved 37 ° C. (VIGTIGT:. Afhængigt af effektiviteten af restriktionsenzymet, kan det være nødvendigt at tilføje yderligere 1 ul til overnight fordøje og inkuberes ved 37 ° C i 1-2 hr Dette er i tillæg til den overnight Digest.)
- Rense Digeplace-DNA ved hjælp af en foretrukken metode (f.eks agarosegeloprensning, spin-søjler), og elueres med 25 pi buffer.
- Ligere fordøjede DNA ved at blande 11 pi af oprenset DNA med en foretrukken koncentration på ~ 10-20 ng / ul, 1,5 pi Ligation Buffer (330 mM Tris-acetat, pH 7,5, 660 mM kaliumacetat, 100 mM magnesiumacetat, 5 mM DTT), 1,5 pi 100 mM ATP og 1 pi DNA-ligase.
- Inkuber blandingen i 15 minutter ved stuetemperatur, og derefter inaktivere enzymet ved inkubering i 15 minutter ved 70 ° C. (Bemærk: inkubering af blandingen ved stuetemperatur i længere tid kan forøge succesen af ligering).
4.. Inverse PCR (IPCR) og Sekvensanalyse
- Udfør IPCR om ligeringsprodukt hjælp af følgende frem og bak primere og termocykling betingelser:
-Forward Primer (Gm3OUT): GGGCATACGGGAAGAAGTGA
Reverse Primer (Gm5OUT): GACTGCCCTGCTGCGTAACA
Thermocycler Conditioner:
1.. 94 ° C i 1 min.
2. 94 ° C i 1 min.
3. 58 ° C i 2 min.
4.. 72 ° C i 2 min.
5.. 72 ° C i 8 min.
6.. 10 ° C hold.
Gentag trin 2-4 for 34 cyklusser.
(BEMÆRK: Amplified IPCR produkter kan opbevares ved 4 ° C) - Udfør agarosegelelektroforese for at bekræfte vellykket IPCR amplifikation.
- Udfør sekventering på IPCR produktet ved hjælp af Gm3OUT og Gm5OUT primere. Indsættelsen stedet og orientering af himar1 er kortlagt ud.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Som illustreret i figur 1, mini-himar1 mariner transposon vektor pFAC indeholder to 27 bp omvendte gentagelser med TA indsættelsessteder flankerer aacC1 gentamycin modstand kassette med sin σ 70-promotor og et multipelt kloningssted (MCS). Derudover pFAC vektoren indeholder gener, der koder den meget aktive himar1 transposasen, β-lactamase (bla) og tra overførsel operonen. TA indsættelsessteder mulighed for en effektiv integration i genomet af P. aeruginosa stammer. Nøjagtighed i at finde og udvælge mucoide mutanter er afgørende for den samlede succes i fastlæggelsen genloci involveret med alginat regulering. Eksempler på slimet og nonmucoid isolater er vist i figur 1.
For mere præcist at identificere slimet mutanter, bør de udfyldte bøjninger være belagt på flere store plader (150 mm). CEll blandinger bør resuspenderes i sterilt PBS og udpladet ved spredning på pladerne PIA plus gentamycin (300 ug / ml). Fortyndinger af celleblandingen i PBS vil blive fordelt på pladerne med det mål at have mellem 1.000-3.000 kolonier / plade. Baseret på den ovennævnte protokol, skal hver konjugation producere en bank af ~ 20.000 mutanter i løbet 15-20 store plader. Optimal inkubationstid for pladerne ved 37 ° C er mellem 24-36 timer. På grund af overproduktion af alginat, bør mucoid koloni være klar eller hvid i farven og har cremet eller slimet udseende. Hvis mucoide kolonier ikke kan skelnes, og derefter inkuberes i yderligere 24-36 timer ved stuetemperatur. De slimet mutanter er bedst isoleres ved at passere tre gange på en regelmæssig PIA plade med gentamycin. I løbet af denne tid, kan du bestemme stabiliteten af slimet fænotype. Det oprensede mucoid koloni vil blive anvendt til genomisk DNA-ekstraktion og identifikation af gener af IPCR. IPCR produkter kan visualiseres ved hjælp af agarosegel electrophoresis (figur 2). Hvis det lykkes, bør der være en enkelt amplikon på den rigtige størrelse. PAO1 genomisk DNA, som har undergået restriktionsspaltning og ligering kan anvendes som en negativ kontrol. Som illustreret i figur 2, er der et fravær af IPCR amplikon i PAO1, men vi registrerer en enkelt amplikon af ~ 1.400 bp og ~ 1.000 bp PAO1-VE2 og PAO1-VE13 hhv. Størrelsen af disse amplikationsprodukter svarer til indsættelse af himar1 søulk transposon i promotor regionen PA4033 (mucE) i PAO1-VE2 og internt i PA5484 (kinB) i PAO1-VE13. DNA-sekventering af IPCR amplikoner bør udføres med GM5OUT primeren. Når du bruger Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) at analysere målsekvensen, den omvendte gentagelse på 5 'enden af pFAC og TA dinucleotid markere stedet og orientering af himar1 indsættelse i genomet af P. aeruginosa (figur 2 g>).
Figur 1. Skematisk diagram af mini-himar1 mariner transposon vektor pFAC, og en repræsentation af mucoide mutanter. Plasmid pFAC indeholder en himar1 mariner transposonelement med to omvendte gentagelser, og en gentamycin modstand kassette (aacC1) for udvælgelse, et gen, der koder for den hyperaktive himar1 transposasen samt en betinget replikon. Mini-himar1 mariner transposonen kan forårsage high-density indsættelse i P. aeruginosa grund af den overflod af substrat (TA-dinukleotid). Antallet af TA-dinukleotider i genomer af to P. aeruginosa stammer PAO1 og PA14 er vist i rødt. De røde pile angiver de slimet mutanter identificeret ved hjælp af denne procedure.om/files/ftp_upload/51346/51346fig1highres.jpg "target =" _blank "> Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. . Repræsentant IPCR og sekventering resultater A) 1% agarose gelelektroforese af IPCR forstærkning ved hjælp af Forward Gm3OUT og Reverse Gm5OUT primere og en 1 kB ladder: PAO1 (negativ kontrol), PAO1-VE2 (1396 bp), og PAO1-VE13 (999 bp). Det genomiske DNA fra tre stammer af P. aeruginosa blev ekstraheret og fordøjet med Sall-restriktionsenzymer, efterfulgt af selv-ligering. Den lukket cirkulært DNA blev anvendt som skabeloner til IPCR som beskrevet i teksten. B) Sammenlignende sekvensanalyse under anvendelse af PAO1 henvisning genomet bestemmer den nøjagtige placering af himar1 marinis transposonindsættelse i PAO1-VE2 og PAO1-VE13. Sekvensen mærket i rød indikerer 5'-enden af omvendte repetitioner i pFAC. Indsættelsen stedet for TA blev understreget. En BLAST søgning af disse to sekvenser skal kortlægge den nøjagtige placering og orientering af himar1 transposonet i genomet af PAO1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det er vigtigt at bemærke, at denne metode kan bruges i andre Pseudomonas arter med disse ændringer: inkuberes P. fluorescens og P. putida ved 30 ° C, og P. stutzeri ved 42 ° C P. stuzeri bør dyrkes på LB-plader suppleret med 150 ug / ml gentamycin og på trin 1.11, P. stutzeri celler skal overføres i 500 ul LB i stedet for 1 ml. Derudover er der to kritiske trin til denne protokol. For det første bør modtagerstammen dyrkes ved den passende temperatur. For eksempel bør PAO1 inkuberes ved 42 ° C for at øge hyppigheden af rekombination 15. Effektiviteten af mutantbibliotek blev reduceret signifikant, hvis modtagerstammen hvis ikke dyrket ved den korrekte temperatur. Andet IPCR er meget reproducerbar, men gDNA skal fordøjes fuldstændigt at sikre, at en cirkulær covalent lukket DNA kan ske gennem DNA-ligering. Jegf dette gøres korrekt, vil IPCR produktet fremstår som et band på en agarosegel. Hvis der konstateres multiple bånd, de viser, at der er flere insertioner i mutanten. Vi fandt, at IPCR resultater var stærkt korreleret med vores Southern blot-resultater (~ 100%). Derfor kan IPCR anvendes i stedet for Southern blot-analyse for antallet af indsætninger per mutanten.
Mini-himar1 mariner transposon i pFAC har ingen transkriptionsterminator, og den reguleres via σ 70-promotor driver ekspressionen af gentamycin kassetten. Vi observerede, at position og orientering af himar1 indsættelse havde varierende virkninger på reguleringen af et bestemt gen. Generne blev inaktiveret, når de integreres i midten af et gen. Et eksempel på dette er inaktivering af sensoriske kinase genet kinB (PA5484), som forårsager en konvertering til mucoidy i PAO1 (PAO1-VE13) 11.. Derudover kan det også up-regulere ekspressionen af genet, hvis det indsættes opstrøms for den kodende region i den samme retning som genet. Et eksempel på dette er PAO1-VE2, hvor himar1 driver ekspression af mucE (PA4033) 13.. Begrænsningen af denne protokol er, at kun regulatoriske gener, der er essentiel for vækst kan identificeres. Derudover kan disse slimet mutanter identificeret ved hjælp af denne metode ikke forekommer naturligt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatteren Hongwei D. Yu er Chief Science Officer og medstifter af Progenesis Technologies, LLC.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af National Aeronautics and Space Administration West Virginia Space Grant Consortium (NASA WVSGC), cystisk fibrose Foundation (CFF-YU11G0) og NIH P20RR016477 og P20GM103434 til West Virginia IDEA Netværk for Biomedical Research Excellence. Vi takker Vonya M. Eisinger til teknisk bistand med dette arbejde.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Luria Broth | Difco | 240230 | via Fisher Scientific |
| Pseudomonas isolation agar | Difco | 292710 | via Fisher Scientific |
| Small Plates (100 O.D. x 10 mm) | Fisher Scientific | 08-757-13 | |
| Large Plates (150 O.D. x 15 mm) | Fisher Scientific | 08-757-14 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | BP229-4 | |
| Benchtop Shaking Incubator | New Brunswick Scientific | Innova 4080 | shake at 200 rpm |
| Cabinet Incubator | VWR | 1540 | |
| Benchtop Microcentrifuge | Sorvall | 75-003-287 | via Fisher Scientific |
| SmartSpec Plus Spectrophotometer | Bio-Rad | 170-2525 | or preferred method/vendor |
| Diposable Inoculation Loops | Fisher Scientific | 22-363-597 | |
| 1.5 ml Microcentrifuge Tubes | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| 2.0 ml Cryogenic Vials | Corning | 430659 | via Fisher Scientific |
| 15 ml Tubes | Fisher Scientific | 05-539-12 | |
| Skim Milk | Difco | DF0032-17-3 | via Fisher Scientific |
| DNeasy Blood and Tissue (250) | Qiagen | 69506 | or preferred method/vendor |
| QIAquick PCR Purification Kit (250) | Qiagen | 28106 | or preferred method/vendor |
| QIAprep Spin Miniprep Kit (250) | Qiagen | 27106 | or preferred method/vendor |
| FastLink II DNA Ligation Kit | Epicentre Technologies | LK6201H | via Fisher Scientific |
| Accu block Digital Dry Bath | Labnet | NC0205808 | via Fisher Scientific |
| Sal1, restriction endonuclease | New England BioLabs | R0138L | |
| EasyStart Micro 50 | Molecular BioProducts | 6020 | via Fisher Scientific |
| Taq DNA Polymerase | New England BioLabs | M0267L | |
| iCycler, Thermocycler | Bio-Rad | 170-8740 | |
| LE agarose | Genemate | 3120-500 | via Fisher Scientific |
| Gentamycin Sulfate | Fisher Scientific | BP918-1 | |
| 2.0 ml Cryogenic Vials | Corning | 430659 | via Fisher Scientific |
References
- Govan, J. R., Deretic, V. Microbial pathogenesis in cystic fibrosis: mucoid Pseudomonas aeruginosa and Burkholderia cepacia. Microbiol. Rev. 60, 539-574 (1996).
- Chitnis, C. E., Ohman, D. E. Genetic analysis of the alginate biosynthetic gene cluster of Pseudomonas aeruginosa shows evidence of an operonic structure. Mol. Microbiol. 8, 583-593 (1993).
- Franklin, M. J., et al. Pseudomonas aeruginosa AlgG is a polymer level alginate C5-mannuronan epimerase. J. Bacteriol. 176, 1821-1830 (1994).
- Franklin, M. J., Ohman, D. E. Mutant analysis and cellular localization of the AlgI, AlgJ, and AlgF proteins required for O acetylation of alginate in Pseudomonas aeruginosa. J. Bacteriol. 184, 3000-3007 (2002).
- Deretic, V., Gill, J. F., Chakrabarty, A. M. Gene algD coding for GDPmannose dehydrogenase is transcriptionally activated in mucoid Pseudomonas aeruginosa. J. Bacteriol. 169, 351-358 (1987).
- Mathee, K., McPherson, C. J., Ohman, D. E. Posttranslational control of the algT (algU)-encoded sigma22 for expression of the alginate regulon in Pseudomonas aeruginosa and localization of its antagonist proteins MucA and MucB (AlgN). J. Bacteriol. 179, 3711-3720 (1997).
- Boucher, J. C., Schurr, M. J., Yu, H., Rowen, D. W., Deretic, V. Pseudomonas aeruginosa in cystic fibrosis: role of mucC in the regulation of alginate production and stress sensitivity. Microbiology. 143, 3473-3480 (1997).
- Martin, D. W., Holloway, B. W., Deretic, V. Characterization of a locus determining the mucoid status of Pseudomonas aeruginosa: AlgU shows sequence similarities with a Bacillus sigma factor. J. Bacteriol. 175, 1153-1164 (1993).
- Damron, F. H., Goldberg, J. B. Proteolytic regulation of alginate overproduction in Pseudomonas aeruginosa. Mol. Microbiol. 84 (4), 595-607 (2012).
- Browne, P., Barret, M., O'Gara, F., Morrissey, J. P. Computational prediction of the Crc regulon identifies genus-wide and species-specific targets of catabolite repression control in Pseudomonas bacteria. BMC Microbiol. 10, 300 (2010).
- Damron, F. H., Qiu, D., Yu, H. D. The Pseudomonas aeruginosa sensor kinase KinB negatively controls alginate production through AlgW-dependent MucA proteolysis. J. Bacteriol. 191, 2285-2295 (2009).
- Damron, F. H., et al. Analysis of the Pseudomonas aeruginosa regulon controlled by the sensor kinase KinB and sigma factor RpoN. J. Bacteriol. 194, 1317-1330 (2012).
- Qiu, D., Eisinger, V. M., Rowen, D. W., Yu, H. D. Regulated proteolysis controls mucoid conversion in Pseudomonas aeruginosa. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 8107-8112 (2007).
- Schurr, M. J. Which bacterial biofilm exopolysaccharide is preferred, Psl or alginate. J. Bacteriol. 195, 1623-1626 (2013).
- Wong, S. M., Mekalanos, J. J. Genetic footprinting with mariner-based transposition in Pseudomonas aeruginosa. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 10191-10196 (2000).
- Lampe, D. J., Akerley, B. J., Rubin, E. J., Mekalanos, J. J., Robertson, H. M. Hyperactive transposase mutants of the Himar1 mariner transposon. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96, 11428-11433 (1999).
