Summary
Här beskriver vi ett protokoll med hjälp av mini-himar1 mariner transposon mutagenes för att generera en hög densitet insättning mutant bibliotek till skärmen, isolera och identifiera nya alginat tillsynsmyndigheter i prototypiska Pseudomonas aeruginosa stam PAO1.
Abstract
Pseudomonas aeruginosa är en gramnegativ, miljö-bakterie med mångsidiga metaboliska kapacitet. P. aeruginosa är en opportunistisk bakteriell patogen som etablerar kroniska lunginfektioner hos patienter med cystisk fibros (CF). Överproduktionen av en kapsulär polysackarid kallas alginat, även känd som mucoidy, främjar bildningen av mukoida biofilmer som är mer motståndskraftiga än planktonceller till antibiotikum kemoterapi och värdförsvar. Dessutom är omvandlingen från nonmucoid till slemmig fenotyp en klinisk markör för uppkomsten av kronisk infektion i CF. Alginat överproduktion av P. aeruginosa är en endergonic process som starkt beskattar cellernas energi. Därför är alginat produktionen starkt reglerad i P. aeruginosa. För att bättre förstå alginat lagstiftning, beskriver vi ett protokoll med hjälp av mini-himar1 transposonmutagenes för identifiering av nya alginat regulatorar i en prototypisk stam PAO1. Förfarandet består av två grundläggande steg. Först överförde vi mini-himar1 transposon (pFAC) från värd E. coli SM10/λpir in mottagaren P. aeruginosa PAO1 via biparental konjugation för att skapa en hög densitet insättning mutant bibliotek, som valdes ut på Pseudomonas isolering agarplattor kompletterade med gentamycin. För det andra, vi avskärmade och isolerade de mukoida kolonierna att kartinsticksstället genom omvänd PCR med hjälp av DNA-primers som pekar utåt från gentamycin kassetten och DNA-sekvensering. Med användning av detta protokoll har vi identifierat två nya alginat regulatorer, mucE (PA4033) och kinB (PA5484), i stammen PAO1 med en vildtyp Muca kodar för anti-sigmafaktor Muca för master alginat regulator AlgU (AlgT, σ 22) . Denna high-throughput mutagenes protokoll kan modifieras för att identifiera andra virulens-relaterade gener som orsakar förändringar i colony morfologi.
Introduction
Förmågan hos den opportunistiska, gramnegativa patogenen Pseudomonas aeruginosa att överproducera alginat är en viktig faktor för dess förmåga att etablera en biofilm. Överproduktionen av alginat är en fenotyp ofta kallad mucoidy. Isoleringen av mukoida kolonier från sputa av individer som lider av cystisk fibros (CF) är ett tecken på en kronisk infektion, och är direkt förknippad med en allmän nedgång i patientens hälsa 1. För närvarande är det underförstått att regleringen och produktion av alginat i P. aeruginosa sker främst på två operon. Den första är den alginat-biosyntetiska operonet, som innehåller 12 gener (algD - alg8 - alg44 - algK - alge - algG - algX - algL - ALGI - algJ - algF - alg) som är ansvarig för syntesen och export av alginatet Polymeren tvärs periplasman med den extracellulära environmennt 2-5. Den andra operon är ett kluster av gener som börjar med alternativa sigmafaktorn algU / T och fortsätter med Muca, mucB och mucD. AlgU / T är en positiv regulator, medan mucAB-D klassificeras som negativa regulatorer av alginat produktion 6-8. Dessutom transkriptionsregulatorer, såsom AlgB, AlgQ, AlgR och RpoN, samt post-transkriptionell och post-translationell modifiering av katabolitrepression kontroll, kinasaktivitet (KinB) och intramembrane proteolys har också visat sig vara inblandade i alginat reglering 9-14.
Mini-himar1 transposonvektor kallas pFAC skapades ursprungligen i Dr Mekalanos lab vid Harvard Medical School 15. Den pFAC plasmid består av ett transposabelt element som flankeras av två inverterade upprepningar om 27 bps och en gentamycin motstånd kassett i mitten (aacC1: 534 bp), en gen som kodar för hyperactive mariner-transposas 16, och en gen som kodar för β-laktamas (bla) (Figur 1). Sekvensinformation för det transponerbara elementet i pFAC är tillgänglig vid GenBank accessionsnummer: DQ366300 13. I pFAC finns ett multipelt kloningsställe (MCS) bakom aacC1 genen som används för identifiering av insättningsstället kromosomala användning av omvänd PCR. En stor fördel med att använda mini himar1 transposon är inga specifika värdfaktorer krävs för införlivande (mutagenes). Dessutom finns det stor förekomst av TA dinukleotid insertionsställen som finns i hela genomet hos P. aeruginosa. Till exempel, TA dinukleotid insticksställen inträffar 94.404 och 100.229 gånger i PAO1 (6.264.404 bps, GenBank tillträdesnummer NC_002516.2) och PA14 (6.537.648 bps, GenBank åtkomstnummer NC_008463) genom, respektive. På grund av överflödet av TA dinukleotid i genomet, mini-himar1 mini-himar1 transposon infoga i varje icke-essentiell gen i genomet av P. aeruginosa. Detta ger cirka 18 TA ingsplatser per öppen läsram i PAO1 genomet.
Här beskriver vi ett protokoll med användning av mini-himar1 transposon mutagenes för att identifiera nya regulatorer av mucoidy i P. aeruginosa. Mer specifikt vi biparentally konjugeras den pFAC vektor som innehåller en mini-himar1 transposon från E. coli SM10/λpir i nonmucoid prototrofa stammen PAO1. Efter transposonen integreras i genomet, är den mottagande stammen odlade på Pseudomonas Isolation Agar (PIA) som innehåller triklosan som hämmar tillväxten av E. coli. Sålunda kan ett bibliotek av mutanter av
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Beredning av bakteriestammar och Biparental konjugation
- Ympa E. coli SM10/λpir/pFAC i 5 ml Luria Broth (LB) supplementerad med 15 pg / ml gentamycin och placera det i en skakinkubator över natten vid 37 ° C.
- Inokulera P. aeruginosa stam PAO1 i 5 ml LB, och lägg i en skakande inkubator över natten vid 42 ° C.
- Mät OD 600 av natten kulturer och blanda lika delar PAO1 och E. coli pFAC så att den slutliga volymen är mellan 1 till 1,4 ml.
- Centrifugera blandningen vid 6000 xg under 5 minuter.
- Under tiden, torka LB plattor för konjugering: låt plattorna öppnas i inkubator vid 37 ° C i 10-15 min.
- Ta bort alla utom 50 pl supernatant från cellblandningen.
- Resuspendera cellpelleten i de återstående 50 ul av supernatanten och pipett på en torr LB-platta i en kompakt droppe.
- Placera försiktigt plattan i ett dragskåp för att torka (IMPORTANT OBS: Låt inte celler spridda över plattan, kommer detta avsevärt minskar effektiviteten i konjugation).
- När droppen är torr, invertera LB-platta och inkubera vid 37 ° C under 4-6 timmar.
- Medan cellblandningen inkubera, förbereda stora (150 ytterdiameter x 15 mm) PIA-plattor med 300 | ig / ml gentamycin. Innan användning, avlägsnande av eventuellt kvarvarande fukt genom att placera i en inkubator vid 37 ° C under 15-20 min.
- Efter inkubation av cellblandningen är fullständig, samla upp cellerna med en steril inokulering slinga och i ett mikrocentrifugrör innehållande 1 ml LB och vortexa eller pipett för att blanda noggrant.
- Sprid cellerna jämnt på de stora PIA plattorna innehåller 300 mikrogram / ml gentamycin. (OBS: För detta steg, är det bäst att lägga ökande volymer av cellblandningen för att separera plattorna (t.ex. Plate 1: 10 ^ il, Plate 2: 50 | il, Plate 3: 100 ^ il, Plate 4: 500 ^ il, etc.) .
- Inkubera över natten vid 37° C.
2. Upptäckt och isolering av slemmig kolonier
- Ta bort plattorna från inkubatorn och undersöka för mukoida kolonier.
- Isolera en slemmig koloni och strimma för isolering på små plattor (100 OD x 10 mm) med PIA och 300 pg / ml gentamycin.
- Inkubera över natten vid 37 ° C.
- Upprepa steg 2.2 på föregående natten kultur.
- Upprepa steg 2,2-2,4 två gånger till för att bestämma stabiliteten hos den mukoida isolatet.
- Efter det slutliga isolatet steget inokulera 4,5 ml LB med en enda slemmig koloni och inkuberas i skakare över natten vid 37 ° C.
- Nästa dag, etikett 3 mikrocentrifugrör för varje slemmig mutant.
- Bered två 1,25 ml alikvoter av natten kultur i 2 rör för genomiskt DNA-extraktion och identifiering av transposoninfogning webbplats (se protokoll 3).
- Dessutom arkiverar varje mukoid mutant genom att pipettera 1 ml övernattskultur i ett FALLely märkt cryovial innehållande en lika volym av 10% skummjölk. Förvara vid -86 ° C.
3. gDNA restriktionsklyvning och ligering
- Utdrag gDNA från slemmig mutant med valfri metod (fenol-kloroform, spinnkolonn, etc. t.ex..).
- Bestäm koncentrationen av gDNA, smälta totalt 2 | ig med ett pl av restriktionsendonukleaset Sall, 0,5 pl av bovint serumalbumin, 5 | il av Sall-enzymbuffert (100 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl2 , 1 mM Dithiothrietol (DTT), pH 7,9 vid rumstemperatur), och den lämpliga volymen av dH 2 O för att uppnå en total volym av 50 | il.
- Digerera DNA över natten vid 37 ° C. (VIKTIGT:. Beroende på effektiviteten av restriktionsenzymet, kan det vara nödvändigt att lägga till ytterligare en fil till den natten digest och inkubera vid 37 ° C under 1-2 timmar är detta utöver den natten digest.)
- Rena den Digested-DNA med användning av någon metod som föredras (t.ex. agarosgelrening, spinnkolonner) och eluera med 25 ^ il buffert.
- Ligera omsatta DNA genom att blanda 11 | il av renad DNA med en föredragen koncentration av ca 10 till 20 ng / | il, 1,5 | il ligeringsbuffert (330 mM Tris-acetat, pH 7,5, 660 mM kaliumacetat, 100 mM magnesiumacetat, 5 mM DTT), 1,5 ^ il av 100 mM ATP och 1 | il DNA-ligas.
- Inkubera blandningen i 15 min vid rumstemperatur och därefter inaktivera enzymet genom inkubation under 15 min vid 70 ° C. (Notera: inkubering av blandningen vid rumstemperatur under längre kan öka framgången för ligering).
4. Inverse PCR (iPCR) och sekvensanalys
- Utför iPCR på ligeringsprodukt med följande framåt och bakåt primers och termocykling villkor:
-Forward Primer (Gm3OUT): GGGCATACGGGAAGAAGTGA
-Reverse Primer (Gm5OUT): GACTGCCCTGCTGCGTAACA
Thermocycler Conditioner:
1. 94 ° C under 1 min.
2. 94 ° C under 1 min.
3. 58 ° C under 2 min.
4. 72 ° C under 2 min.
5. 72 ° C under 8 min.
6. 10 ° C håll.
Upprepa steg 2-4 för 34 cykler.
(OBS! Amplified iPCR produkter kan förvaras vid 4 ° C.) - Utför agarosgelelektrofores för att bekräfta lyckad iPCR amplifiering.
- Utför sekvense på iPCR produkten med Gm3OUT och Gm5OUT primrar. Insättningsstället och orientering himar1 kartläggs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Såsom illustreras i figur 1, den mini-himar1 mariner transposon vector, pFAC innehåller två 27 bp inverterade upprepningar med TA insättningsställen flankerar aacC1 gentamycin motstånd kassett, med dess σ 70-beroende promotorn och ett multipelt kloningsställe (MCS). Dessutom innehåller pFAC vektor gener som kodar för den högaktiva himar1 transposas, β-laktamas (bla) och tra överföring operonet. TA insättningsställen möjliggör en effektiv integration in i genomet hos P. aeruginosa-stammar. Noggrannhet i att identifiera och välja slemmig mutanter är avgörande för den totala framgången i att bestämma gen loci involverade med alginat reglering. Exempel på slemmig och nonmucoid isolat visas i figur 1.
För att mer exakt identifiera slemmig mutanter, bör de ifyllda konjugationer beläggas på flera stora plattor (150 mm). Cella blandningarna bör återsuspenderades i steril PBS och ströks ut genom att sprida ut de PIA plattorna plus gentamycin (300 ng / ml). Spädningar av cellblandning i PBS kommer att spridas på plattorna med målet att ha mellan 1000-3000 kolonier / platta. På grundval av protokollet ovan, bör varje konjugering producera en bank av ~ 20.000 mutanter över 15-20 stora plåtar. Optimala inkubationstiden för plattorna vid 37 ° C är mellan 24 till 36 timmar. På grund av överproduktionen av alginat, bör den slemmig kolonin vara klar eller vit till färgen och ha krämig eller slemmiga utseende. Om mukoida kolonier inte kan urskiljas, sedan inkubera under ytterligare 24 till 36 timmar vid rumstemperatur. De slemmig mutanter är bäst isoleras genom att tre gånger på en vanlig PIA platta med gentamycin. Under denna tid kan du avgöra stabiliteten i slemmig fenotypen. Den renade mukoida koloni kommer att användas för genom-DNA-extraktion och identifiering av de gener genom iPCR. iPCR produkter kan visualiseras med hjälp av agarosgel-electrophoresis (Figur 2). Om det lyckas, bör det finnas ett enda amplicon vid lämplig storlek. PAO1 genomiskt DNA som har genomgått en restriktionsdigerering och ligering kan användas som en negativ kontroll. Såsom illustreras i figur 2, finns det en avsaknad av iPCR amplikon i PAO1 emellertid vi detektera ett enda amplikon om ~ 1400 bp och ~ 1000 bp PAO1-VE2 och PAO1-VE13, respektive. Storleken på dessa amplikoner motsvarar insättningen av himar1 mariner transposon in i promotorregionen av PA4033 (mucE) i PAO1-VE2 och internt i PA5484 (kinB) i PAO1-VE13. DNA-sekvensering av de iPCR amplikoner bör utföras med GM5OUT primer. När du använder Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) analysera målsekvensen, den inverterade upprepning på 5 'änden av pFAC och TA dinukleotid markera platsen och orienteringen av himar1 insättning i genomet hos P. aeruginosa (Figur 2 g>).
Figur 1. Skiss av mini himar1 mariner transposon vector, pFAC, och en representation av mukoida mutanter. Plasmid pFAC innehåller en himar1 mariner transposon element med två inverterade upprepningar och gentamycin motstånd kassett (aacC1) för selektion, en gen som kodar för den hyperaktiva himar1 transposas , och en villkorlig replikon. Mini-himar1 mariner transposon kan orsaka hög densitet införande i P. aeruginosa på grund av överflödet av substrat (TA dinukleotid). Antalet TA dinukleotider i genom av två s. aeruginosa-stammar, PAO1 och PA14 visas i rött. De röda pilarna visar de slemmig mutanter som identifieras med hjälp av denna procedur.om/files/ftp_upload/51346/51346fig1highres.jpg "target =" _blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. . Representativa iPCR och sekvenseringsresultat A) 1% agarosgelelektrofores av iPCR amplifiering med användning av de framåt Gm3OUT och back Gm5OUT primrar och en 1 kB stege: PAO1 (negativ kontroll), PAO1-VE2 (1396 bp), och PAO1-VE13 (999 bp). Det genomiska DNA från tre stammar av P. aeruginosa extraherades och digererades med Sall-restriktionsenzymer följt av självligering. Den slutna cirkulära DNA: t användes som mallar för iPCR såsom beskrivits i texten. B) Jämförande sekvensanalys med användning av PAO1 referens genomet bestämmer den exakta placeringen av den himar1 marinER transposoninfogning i PAO1-VE2 och PAO1-VE13. Sekvensen märkta i rött indikerar 5'-änden av inverterad upprepning i pFAC. Insättningsstället för TA underströks. En BLAST-sökning av dessa två sekvenser kommer att kartlägga den exakta platsen och orienteringen av himar1 transposonen i genomet av PAO1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det är viktigt att notera att denna metod kan användas i andra Pseudomonas-arter med dessa ändringar: inkubera P. fluorescens och P. putida vid 30 ° C, och P. stutzeri vid 42 ° C; P. stuzeri bör odlas på LB-plattor med tillsats av 150 | ig / ml gentamycin; på steg 1,11, P. stutzeri celler bör överföras till 500 l av LB istället för 1 ml. Dessutom finns det två viktiga steg för detta protokoll. För det första bör den mottagande stammen odlas vid den lämpliga temperaturen. Till exempel bör PAO1 inkuberas vid 42 ° C för att öka frekvensen av rekombination 15. Verkningsgraden hos mutantbibliotek reducerades signifikant, om mottagaren stammen om inte odling vid rätt temperatur. För det andra är iPCR mycket reproducerbar, men gDNA måste vara helt spjälkad för att säkerställa att en cirkulär kovalent slutna DNA kan framställas genom DNA-ligering. Jagf detta görs på rätt sätt, kommer det iPCR produkten visas som ett band på en agarosgel. Om flera band identifieras, de visar att det finns flera införanden i mutant. Vi fann att iPCR resultat var starkt korrelerade med våra Southern blot-resultaten (~ 100%). Därför kan iPCR användas i stället för Southern blot-analys för det antal infogningar per mutant.
Mini-himar1 mariner transposon i pFAC saknar transkriptionsterminator, och den regleras via en σ 70-beroende promotorn som driver uttrycket av gentamycin kassetten. Vi observerade att positionen och orienteringen av himar1 insättnings hade varierande effekter på regleringen av en viss gen. Gener inaktiverades när den integreras i mitten av en gen. Ett exempel på detta är inaktiveringen av den sensoriska kinasgenen kinB (PA5484) som orsakar en omvandling till mucoidy i PAO1 (PAO1-VE13) 11. Dessutom kan det också up-reglera expressionen av den gen, om det sitter uppströms om den kodande regionen i samma orientering som den gen. Ett exempel på detta är PAO1-VE2 där himar1 driver uttrycket av mucE (PA4033) 13. Begränsningen med detta protokoll är att endast reglerande gener som är oväsentliga för tillväxt kan identifieras. Dessutom kan dessa slemmig mutanter identifieras med den här metoden inte förekommer naturligt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författaren Hongwei D. Yu är forskningschef och en av grundarna till Progenesis Technologies, LLC.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av National Aeronautics and Space Administration West Virginia Space Grant Consortium (NASA WVSGC), cystisk fibros Foundation (CFF-YU11G0) och NIH P20RR016477 och P20GM103434 till West Virginia IDEA Nätverk för biomedicinsk forskning Excellence. Vi tackar Vonya M. Eisinger för teknisk hjälp med detta arbete.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Luria Broth | Difco | 240230 | via Fisher Scientific |
| Pseudomonas isolation agar | Difco | 292710 | via Fisher Scientific |
| Small Plates (100 O.D. x 10 mm) | Fisher Scientific | 08-757-13 | |
| Large Plates (150 O.D. x 15 mm) | Fisher Scientific | 08-757-14 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | BP229-4 | |
| Benchtop Shaking Incubator | New Brunswick Scientific | Innova 4080 | shake at 200 rpm |
| Cabinet Incubator | VWR | 1540 | |
| Benchtop Microcentrifuge | Sorvall | 75-003-287 | via Fisher Scientific |
| SmartSpec Plus Spectrophotometer | Bio-Rad | 170-2525 | or preferred method/vendor |
| Diposable Inoculation Loops | Fisher Scientific | 22-363-597 | |
| 1.5 ml Microcentrifuge Tubes | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| 2.0 ml Cryogenic Vials | Corning | 430659 | via Fisher Scientific |
| 15 ml Tubes | Fisher Scientific | 05-539-12 | |
| Skim Milk | Difco | DF0032-17-3 | via Fisher Scientific |
| DNeasy Blood and Tissue (250) | Qiagen | 69506 | or preferred method/vendor |
| QIAquick PCR Purification Kit (250) | Qiagen | 28106 | or preferred method/vendor |
| QIAprep Spin Miniprep Kit (250) | Qiagen | 27106 | or preferred method/vendor |
| FastLink II DNA Ligation Kit | Epicentre Technologies | LK6201H | via Fisher Scientific |
| Accu block Digital Dry Bath | Labnet | NC0205808 | via Fisher Scientific |
| Sal1, restriction endonuclease | New England BioLabs | R0138L | |
| EasyStart Micro 50 | Molecular BioProducts | 6020 | via Fisher Scientific |
| Taq DNA Polymerase | New England BioLabs | M0267L | |
| iCycler, Thermocycler | Bio-Rad | 170-8740 | |
| LE agarose | Genemate | 3120-500 | via Fisher Scientific |
| Gentamycin Sulfate | Fisher Scientific | BP918-1 | |
| 2.0 ml Cryogenic Vials | Corning | 430659 | via Fisher Scientific |
References
- Govan, J. R., Deretic, V. Microbial pathogenesis in cystic fibrosis: mucoid Pseudomonas aeruginosa and Burkholderia cepacia. Microbiol. Rev. 60, 539-574 (1996).
- Chitnis, C. E., Ohman, D. E. Genetic analysis of the alginate biosynthetic gene cluster of Pseudomonas aeruginosa shows evidence of an operonic structure. Mol. Microbiol. 8, 583-593 (1993).
- Franklin, M. J., et al. Pseudomonas aeruginosa AlgG is a polymer level alginate C5-mannuronan epimerase. J. Bacteriol. 176, 1821-1830 (1994).
- Franklin, M. J., Ohman, D. E. Mutant analysis and cellular localization of the AlgI, AlgJ, and AlgF proteins required for O acetylation of alginate in Pseudomonas aeruginosa. J. Bacteriol. 184, 3000-3007 (2002).
- Deretic, V., Gill, J. F., Chakrabarty, A. M. Gene algD coding for GDPmannose dehydrogenase is transcriptionally activated in mucoid Pseudomonas aeruginosa. J. Bacteriol. 169, 351-358 (1987).
- Mathee, K., McPherson, C. J., Ohman, D. E. Posttranslational control of the algT (algU)-encoded sigma22 for expression of the alginate regulon in Pseudomonas aeruginosa and localization of its antagonist proteins MucA and MucB (AlgN). J. Bacteriol. 179, 3711-3720 (1997).
- Boucher, J. C., Schurr, M. J., Yu, H., Rowen, D. W., Deretic, V. Pseudomonas aeruginosa in cystic fibrosis: role of mucC in the regulation of alginate production and stress sensitivity. Microbiology. 143, 3473-3480 (1997).
- Martin, D. W., Holloway, B. W., Deretic, V. Characterization of a locus determining the mucoid status of Pseudomonas aeruginosa: AlgU shows sequence similarities with a Bacillus sigma factor. J. Bacteriol. 175, 1153-1164 (1993).
- Damron, F. H., Goldberg, J. B. Proteolytic regulation of alginate overproduction in Pseudomonas aeruginosa. Mol. Microbiol. 84 (4), 595-607 (2012).
- Browne, P., Barret, M., O'Gara, F., Morrissey, J. P. Computational prediction of the Crc regulon identifies genus-wide and species-specific targets of catabolite repression control in Pseudomonas bacteria. BMC Microbiol. 10, 300 (2010).
- Damron, F. H., Qiu, D., Yu, H. D. The Pseudomonas aeruginosa sensor kinase KinB negatively controls alginate production through AlgW-dependent MucA proteolysis. J. Bacteriol. 191, 2285-2295 (2009).
- Damron, F. H., et al. Analysis of the Pseudomonas aeruginosa regulon controlled by the sensor kinase KinB and sigma factor RpoN. J. Bacteriol. 194, 1317-1330 (2012).
- Qiu, D., Eisinger, V. M., Rowen, D. W., Yu, H. D. Regulated proteolysis controls mucoid conversion in Pseudomonas aeruginosa. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 8107-8112 (2007).
- Schurr, M. J. Which bacterial biofilm exopolysaccharide is preferred, Psl or alginate. J. Bacteriol. 195, 1623-1626 (2013).
- Wong, S. M., Mekalanos, J. J. Genetic footprinting with mariner-based transposition in Pseudomonas aeruginosa. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 10191-10196 (2000).
- Lampe, D. J., Akerley, B. J., Rubin, E. J., Mekalanos, J. J., Robertson, H. M. Hyperactive transposase mutants of the Himar1 mariner transposon. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96, 11428-11433 (1999).
