여기서 우리는, 화면 고밀도 삽입 돌연변이 체 라이브러리를 생성하기위한 미니 himar1 마리너 트랜스포존-매개 돌연변이 유발을 사용하여 프로토콜을 설명 분리 및 프로토 타입 녹농균 스트레인 PAO1 참신한 알긴산 레귤레이터를 식별한다.
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이 논문에서
요약
초록
녹농균은 다양한 대사 기능이있는 그람 음성, 환경 세균이다. P. 녹농균은 낭포 성 섬유증 (CF) 환자에서 만성 폐 감염을 확립 기회 세균성 병원체이다. 또한 mucoidy로 알려진 알긴산이라는 캡슐 다당류의 생산 과잉은 항생제 화학 요법과 호스트 방어에 플랑크톤 세포보다 더 많은 저항 점액 바이오 필름의 형성을 촉진한다. 또한, 점액 표현형 nonmucoid의 변환은 CF 만성 감염의 발병에 대한 임상 마커입니다. P.에 의해 알긴산 과잉 생산 녹농균은 크게 세포 에너지를 세금을 에너지 흡수성 과정이다. 따라서, 알긴산 생산은 매우 P.에서 규제 녹농균. 더 알긴산 규제를 이해하기 위해, 우리는 신규 알긴산 레귤레이터의 식별을위한 미니 himar1 트랜스포존 돌연변이 유발을 사용하여 프로토콜을 설명프로토 타입의 변형 PAO1에서의. 이 절차는 두 가지 기본 단계로 구성됩니다. 첫째, 우리는 호스트 E.에서 미니 himar1의 트랜스포존 (pFAC)을 전송 받는 사람 P.에 대장균 SM10/λpir 겐타 마이신으로 보충 슈도모나스 분리 아가 플레이트상에서 선택 하였다 고밀도 삽입 돌연변이 체 라이브러리를 생성하기 biparental 공액 통해 녹농균 PAO1. 둘째, 우리는 검사 및 겐타 마이신 카세트 및 DNA 염기 서열에서 바깥쪽으로 가리키는 DNA 프라이머를 사용하여 PCR 역을 통해 삽입 사이트를 매핑하는 점액 식민지입니다. 이 프로토콜을 사용하여, 우리는 (22 σ AlgT) 야생형 mucA 마스터 알긴산 레귤레이터에게도 누군가의 안티 - 시그마 인자 MucA을 인코딩 변형 PAO1 두 소설 알긴산 조절기, MUCE (PA4033) 및 kinB (PA5484)를 확인했습니다 . 이것은 높은 처리량 돌연변이 유발 프로토콜은 깔깔 변화를 일으키는 다른 병원성 관련 유전자의 식별을 위해 수정 될 수있다뉴욕의 형태.
서론
알긴산 염을 과잉 생산하는 기회, 그람 음성 병원균 녹농균의 능력은 생물막을 확립하는 기능의 주요 요인이다. 알긴산의 과잉 생산은 종종 mucoidy 언급 표현형이다. 낭포 성 섬유증 (CF)로 고통받는 개인의 가래에서 점액 콜로니의 절연은 만성 감염 나타낸다 직접 환자의 건강 하나의 전체적인 감소와 연관된다. 현재는 것이 이해된다 P.있는 알긴산의 규제 및 생산 녹농균은 주로 두 오페론에서 발생한다. 에서 알긴산 고분자의 합성 및 수출에 대한 책임이 있습니다 (조류 - alg8 - alg44 - algK - ALGE - algG - algX - algL - algI - algJ - - algF algD) 첫 번째는 12 유전자를 포함하는 알긴산 생합성 오페론이다 세포 environme에 페리 플라 즘NT 2-5. 두 번째 오페론은 대체 시그마 인자에게도 누군가 / T로 시작 mucA, mucB 및 MUCD 계속 유전자의 클러스터입니다. mucAB-D는 알긴산 생산 ....
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프로토콜
1. 균주의 제조 및 Biparental 활용
- E.에게 접종 37 ℃에서 하룻밤 진탕 배양기에서 겐타 마이신과 장소의 15 ㎍ / ㎖로 보충 루리아 국물 (LB) 5 ㎖의 대장균 SM10/λpir/pFAC
- P.에게 접종 녹농균 변형 LB 5 ㎖의 PAO1, 그리고 흔들리는 인큐베이터에있는 장소 하룻밤 42 ℃에서
- OD 하룻밤 문화 (600)를 측정하고 PAO1와 E 같은 양을 혼합 콜라이 pFAC은 최종 부피는 1-1.4 ML 사이 그러한된다.
- 5 분 6,000 XG에 원심 분리기의 혼합물.
- 한편, 활용을 위해 LB 플레이트를 건조 : 10 ~ 15 분 동안 37 ° C에서 인큐베이터에 열려있는 판을 둡니다.
- 세포 혼합물로부터 상층 액 50 μL를 제외한 나머지를 모두 제거합니다.
- 하나의 컴팩트 한 방울에 건조 LB 판에 뜨는 피펫의 나머지 50 μL의 세포 펠렛을 Resuspend.
- 조심스럽게 (IMPO 건조 흄 후드에서 플레이트를 배치RTANT 참고) 접시에 걸쳐 세포가이 크게 활용의 효율성을 감소 할 수 있도록하지 마십시오. <....
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결과
도 1에 도시 된 바와 같이, 미니 himar1 마리너 트랜스포존 벡터 pFAC는 TA 삽입 위치가 σ 70-의존성 프로모터 및 다중 클로닝 부위 (MCS)와 aacC1의 겐타 마이신 내성 카세트를 플 랭킹 두 27 bp의 반전이 반복을 포함한다. 또한, pFAC 벡터는 높은 활성 himar1의 트랜스 포사, β-락타 마제 (BLA) 및 육 차원 속의 전송 오페론을 코딩하는 유전자를 포함하고 있습니다. TA 삽입 사이트는 P.의 게놈에 효율적으로 통합 할 수 녹농균의 변종. 식별 및 점액 돌연변이를 선택하는 정확도는 알긴산 규제와 관련된 유전자의 궤적을 결정하는 전반적인 성공에 중요합니다. 뮤코 이드 및 nonmucoid 균주의 예는도 1에 나타낸다.
더 정확하게 점액 돌연변이를 확인하.......
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토론
또한이 방법은 이러한 변경과 다른 슈도모나스 종에서 사용할 수 있음을주의하는 것이 중요하다 : P.보기 부화 의 fluorescens와 P. 30 ° C에서 푸티하고, P. 42 ° C에서 stutzeri, P. stuzeri은 겐타 마이신 150 ㎍ / mL의 보충 LB 플레이트에서 배양되어야한다 단계 1.11, P.에 stutzeri 세포는 LB 500 ㎕를 대신 1 ㎖로 전송해야한다. 또한이 프로토콜에 대한 두 가지 중요한 단계가 있습니다. 첫째,받는 사람의 부담은 적절한 온도에서 배양해야한다. 예를 들어, PAO1 재조합 (15)의 주파수를 증가시키기 위해 42 ° C에서 배양해야한다. 수신자 부담이 올바른 온도에서 배양하지 않을 경우 경우 돌연변이 체 라이브러리의 효율이 크게 감소 하였다. 둘째, iPCR을 높게 재현성이지만, gDNA를 완전히 원형 공유 클로즈 DNA가 DNA 라이 게이션을 통해 이루어.......
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공개 사항
저자 훙 웨이 D. 유 최고 과학 책임자 Progenesis 기술의 공동 설립자, LLC입니다.
감사의 글
이 작품은 바이오 메디컬 연구 우수 웨스트 버지니아 아이디어 네트워크에 미국 항공 우주국 웨스트 버지니아 공간 부여 컨소시엄 (NASA WVSGC), 낭포 성 섬유증 재단 (CFF-YU11G0)와 NIH P20RR016477 및 P20GM103434에 의해 지원되었다. 우리는이 작업과 기술 지원을 Vonya M. Eisinger 감사합니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| Luria Broth | Difco | 240230 | via Fisher Scientific |
| Pseudomonas Fisher | Scientific | ||
| Small Plates (100 O.D. x 10 mm) | 를 통한 Fisher Scientific | 08-757-13 | |
| Large Plates (150 O.D. x 15 mm) | Fisher Scientific | 08-757-14 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | BP229-4 | |
| 벤치탑 쉐이킹 인큐베이터 | New Brunswick Scientific | Innova 4080 | 200rpm에서 쉐이크 |
| 캐비닛 인큐베이터 | VWR | 1540 | |
| SmartSpec Plus 분광광도계 | Bio-Rad | 170-2525 | 또는 선호하는 방법/공급업체 |
| 분할 가능한 접종 루프 | Fisher Scientific | 22-363-597 | |
| 1.5ml 마이크로 원심분리기 튜브 | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| 2.0ml 극저온 바이알 | Corning | 430659 via Fisher Scientific | |
| 15ml 튜브 | Fisher Scientific | 05-539-12 | |
| 탈지 우유 | Difco | DF0032-17-3 | Fisher Scientific |
| DNeasy 혈액 및 조직 (250) | Qiagen | 69506 | 또는 선호 방법/공급업체 |
| QIAquick PCR Purification Kit (250) | Qiagen | 28106 | 또는 선호 방법/공급업체 |
| QIAprep Spin Miniprep Kit (250) | Qiagen | 27106 | 또는 선호하는 방법/공급업체 |
| FastLink II DNA 결찰 키트 | Epicentre Technologies | LK6201H | via Fisher Scientific |
| Accu block Digital Dry Bath | Fisher Scientific | Labnet | NC0205808 |
| 제한 엔도뉴클레아제 | New England BioLabs | R0138L | |
| EasyStart Micro 50 | Molecular BioProducts | 6020 | via Fisher Scientific |
| Taq DNA Polymerase | New England BioLabs | M0267L | |
| iCycler, Thermocycler | Bio-Rad | 170-8740 | |
| LE 아가로스 | Fisher Scientific을 통한 | Genemate | 3120-500 |
| 황산 겐타마이신 Fisher | Scientific | BP918-1 | |
| 2.0ml 극저온 바이알 | Corning | 430659 | Fisher Scientific을 통해 |
참고문헌
- Govan, J. R., Deretic, V. Microbial pathogenesis in cystic fibrosis: mucoid Pseudomonas aeruginosa and Burkholderia cepacia. Microbiol. Rev. 60, 539-574 (1996).
- Chitnis, C. E., Ohman, D. E. ....
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재인쇄 및 허가
