Summary
Qui si descrive un protocollo con il mini-himar1 mariner trasposone-mediata mutagenesi per generare una libreria mutante inserimento ad alta densità per schermo, isolare ed identificare i regolatori alginato romanzo nel prototipo Pseudomonas aeruginosa ceppo PAO1.
Abstract
Pseudomonas aeruginosa è un batterio Gram-negativo, batterio ambientale con versatili capacità metaboliche. P. aeruginosa è un batterio patogeno opportunista che stabilisce le infezioni polmonari croniche in pazienti con fibrosi cistica (CF). La sovrapproduzione di un polisaccaride capsulare chiamato alginato, noto anche come mucoidy, promuove la formazione di biofilm mucoide che sono più resistenti rispetto alle cellule planctoniche alla chemioterapia antibiotica e difese dell'ospite. Inoltre, la conversione dal nonmucoid al fenotipo mucoide è un marcatore clinico per l'insorgenza di infezione cronica in CF. Sovrapproduzione alginato di P. aeruginosa è un processo ergoniche che tassa pesantemente energia cellulare. Di conseguenza, la produzione di alginato è altamente regolamentato in P. aeruginosa. Per capire meglio regolamentazione alginato, si descrive un protocollo utilizzando il mini-himar1 trasposone mutagenesi per l'identificazione di regolatore alginato romanzos in un ceppo PAO1 prototipo. La procedura si compone di due fasi fondamentali. In primo luogo, abbiamo trasferito il trasposone mini-himar1 (pFAC) dall'host E. coli SM10/λpir in destinatario P. aeruginosa PAO1 via coniugazione biparental per creare una libreria di mutante inserimento ad alta densità, che sono stati selezionati su piastre di isolamento di Pseudomonas agar addizionato con gentamicina. In secondo luogo, abbiamo proiettato e isolate colonie mucoidi per mappare il sito di inserimento attraverso inversa PCR usando primer DNA puntano verso l'esterno dal cassetto gentamicina e sequenziamento del DNA. Usando questo protocollo, abbiamo identificato due nuovi regolatori di alginato, MUCE (PA4033) e kinB (PA5484), in ceppo PAO1 con una wild-type Muca che codifica per il fattore anti-sigma Muca per il regolatore di alginato maestro AlgU (ALGT, σ 22) . Questo protocollo mutagenesi ad alta produttività può essere modificato per l'identificazione di altri geni di virulenza legate causando variazione colony morfologia.
Introduction
La capacità del opportunistica, patogeno Gram-negativo Pseudomonas aeruginosa produrre in eccesso alginato è un fattore importante nella sua capacità di stabilire un biofilm. La sovrapproduzione di alginato è un fenotipo spesso indicato come mucoidy. L'isolamento di colonie mucoidi dal espettorati di individui affetti da fibrosi cistica (CF) è indicativo di una infezione cronica, ed è direttamente associata ad un declino generale della salute del paziente 1. Attualmente, resta inteso che la regolazione e la produzione di alginato in P. aeruginosa si verifica principalmente a due operoni. Il primo è l'operone biosintetica alginato, che contiene 12 geni (algD - alg8 - alg44 - algK - Alge - algG - algX - algL - Algi - algJ - algF - Alga), che sono responsabili per la sintesi e l'esportazione del polimero alginato di tutti periplasma al environme extracellularent 2-5. Il secondo operone è un cluster di geni che inizia con il fattore sigma alternativo algU / T e continuando con muca, mucB, e mucD. AlgU / T è un regolatore positivo, mentre mucAB-D sono classificati come regolatori negativi della produzione alginato 6-8. Inoltre, regolatori trascrizionali, come ALGB, AlgQ, ALGR, e RpoN, così come post-trascrizionale e modificazione post-traslazionale dal controllo repressione da cataboliti, l'attività chinasi (KinB) e proteolisi intramembrane, hanno anche dimostrato di essere coinvolti in alginato regolamentazione 9-14.
Il trasposone vettore mini-himar1 noto come pFAC è stato originariamente creato nel laboratorio Dr. Mekalanos 'presso la Harvard Medical School 15. Il plasmide pFAC consiste di un elemento trasponibile fiancheggiato da due ripetizioni invertite di 27 bps e una cassetta gentamicina resistenza nel mezzo (aacC1: 534 bp), un gene che codifica la hyperactive transposase mariner 16, e un gene codificante β-lattamasi (bla) (Figura 1). Informazioni di sequenza per l'elemento trasponibile di pFAC è disponibile al numero di accesso GenBank: DQ366300 13. In pFAC, c'è un sito di clonazione multipla (MCS) dietro il gene aacC1 che viene utilizzato per l'identificazione del sito di inserzione cromosomico mediante PCR inversa. Uno dei principali vantaggi con l'utilizzo del trasposone mini-himar1 è alcuna fattori dell'ospite specifici sono necessari per il recepimento (mutagenesi). Inoltre, vi è grande abbondanza dei TA dinucleotidici siti di inserzione trovati in tutto il genoma del P. aeruginosa. Ad esempio, TA siti di inserzione dinucleotide si verifica 94.404 e 100.229 volte in PAO1 (6.264.404 bps, GenBank numero di accesso NC_002516.2) e PA14 (6.537.648 bps, il numero di accesso GenBank NC_008463) genomi, rispettivamente. A causa della abbondanza di TA dinucleotide nel genoma, mini-himar1 mini-himar1 può inserire in qualsiasi gene non essenziale all'interno del genoma di P. aeruginosa. Questo fornisce circa 18 TA siti di inserzione per fase di lettura aperta nel genoma PAO1.
Qui, descriviamo un protocollo con mini-himar1 trasposone-mediata mutagenesi per identificare nuovi regolatori di mucoidy in P. aeruginosa. Più specificamente, si biparentally coniugato il vettore pFAC contenente un trasposone mini-himar1 da E. coli SM10/λpir nel nonmucoid prototrofici ceppo PAO1. Dopo il trasposone è integrato nel genoma, il ceppo ricevente è in coltura su agar isolamento Pseudomonas (PIA) contenente triclosan che inibisce la crescita di E. coli. Così, una libreria di mutanti di
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Protocol
1. Preparazione di ceppi batterici e biparental Coniugazione
- Seminare E. coli SM10/λpir/pFAC in 5 ml di Luria Broth (LB), completata con 15 mg / ml di gentamicina e posto in un incubatore agitazione durante la notte a 37 ° C.
- Seminare P. aeruginosa ceppo PAO1 in 5 ml di LB, e posto in un incubatore agitazione per una notte a 42 ° C.
- Misurare OD 600 di culture durante la notte e mescolare quantità uguali di PAO1 ed E. coli pFAC tale che il volume finale è compreso tra 1-1,4 ml.
- Miscela centrifugare a 6000 xg per 5 min.
- Nel frattempo, asciugare piastre LB per la coniugazione: lasciare aperte le piastre in termostato a 37 ° C per 10-15 minuti.
- Rimuovere tutti ma 50 ml di surnatante dalla miscela di cellule.
- Risospendere il pellet di cellule nei rimanenti 50 ml di surnatante e pipetta su una piastra LB secco in una gocciolina compatto.
- Posizionare con cautela la piastra in una cappa aspirante a secco (IMPONella documentazione, Nota: Non lasciare che le cellule si sviluppa su piastra, questo diminuiranno in modo significativo l'efficienza del coniugazione).
- Una volta che la goccia è asciutto, capovolgere la piastra LB e incubare a 37 ° C per 4-6 ore.
- Mentre la miscela cella è in incubazione, preparare grandi (150 OD x 15 mm), piastre PIA con 300 mg / ml di gentamicina. Prima dell'uso, rimuovere l'umidità residua ponendo in un incubatore a 37 ° C per 15-20 min.
- Dopo l'incubazione della miscela di cellule è completa, raccogliere le cellule utilizzando un'ansa sterile inoculazione e in una provetta contenente 1 ml di LB e vortice, o pipetta, fino a completa dissoluzione.
- Stendere le cellule in modo uniforme sulle grandi tavole PIA contengono 300 mg / ml di gentamicina. (IMPORTANTE: Per questo passaggio, è meglio aggiungere crescenti volumi della miscela di cellule per separare le piastre (ad es Tavola 1: 10 ml, Piatto 2: 50 microlitri, Tavola 3: 100 ml, Tavola 4: 500 microlitri, ecc) .
- Incubare una notte a 37° C.
2. Rilevazione e isolamento delle colonie mucoidi
- Rimuovere le piastre da incubatrice ed esaminare per le colonie mucoidi.
- Isolare una singola colonia mucoide e strisciare per l'isolamento su piccoli piatti (100 OD x 10 mm) con PIA e 300 pg / ml di gentamicina.
- Incubare una notte a 37 ° C.
- Ripetere passo 2.2 sulla precedente cultura durante la notte.
- Ripetere i passaggi 2,2-2,4 altre due volte per determinare la stabilità dell'isolato mucoide.
- Al termine del passo isolare finale, inoculare 4,5 ml di LB con una singola colonia mucoide e incubare in shaker notte a 37 ° C.
- Il giorno dopo, etichetta 3 tubi microcentrifuga per ogni mutante mucoide.
- Preparare due 1,25 ml aliquote di cultura durante la notte in 2 tubi per l'estrazione del DNA genomico e identificazione del sito di inserzione del trasposone (vedi protocollo 3).
- Inoltre, archiviare ogni mutante mucoid pipettando 1 ml di coltura durante la notte in un NECESSARIOely esageratamente marcato contenenti un volume uguale di latte scremato 10%. Conservare a -86 ° C.
3. gDNA restrizione Digestione e legatura
- Estrarre gDNA dal mutante mucoide utilizzando qualsiasi metodo preferito (ad es. Fenolo-cloroformio, colonnine, ecc).
- Determinare la concentrazione della gDNA, digerire un totale di 2 mg con 1 ml di endonucleasi di restrizione SalI, 0,5 ml di albumina di siero bovino, 5 microlitri di tampone SalI enzima (100 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl 2 , 1 Dithiothrietol mM (DTT), pH 7,9 a temperatura ambiente), e il volume appropriato di dH 2 O per ottenere un volume totale di 50 microlitri.
- Digerire il DNA notte a 37 ° C. (IMPORTANTE:. Funzione dell'efficienza dell'enzima di restrizione, può essere necessario aggiungere un ulteriore 1 microlitri al pernottamento digest e incubare a 37 ° C per 1-2 ore Questo è in aggiunta al pernottamento digest.)
- Purificare il DigeDNA STED utilizzando qualsiasi metodo preferito (ad esempio agarosio purificazione gel, colonne di rotazione) ed eluire con 25 microlitri di tampone.
- Legare il DNA digerito miscelando 11 ml di DNA purificato con una concentrazione preferita di ~ 10-20 ng / ml, 1,5 ml di tampone di ligazione (330 mM Tris-acetato pH 7,5, 660 mM acetato di potassio, 100 mM di acetato di magnesio, 5 mM DTT), 1,5 ml di 100 mM ATP e 1 ml DNA ligasi.
- Incubare la miscela per 15 minuti a temperatura ambiente, e quindi inattivare l'enzima incubando per 15 min a 70 ° C. (Nota: L'incubazione la miscela a temperatura ambiente per più può aumentare il successo della legatura).
4. PCR inversa (IPCR) e analisi di sequenza
- Eseguire IPCR sul prodotto legatura utilizzando il seguente forward e reverse primer e le condizioni di ciclo termico:
-Forward Primer (Gm3OUT): GGGCATACGGGAAGAAGTGA
-Reverse Primer (Gm5OUT): GACTGCCCTGCTGCGTAACA
Thermocycler Condizioni:
1. 94 ° C per 1 min.
2. 94 ° C per 1 min.
3. 58 ° C per 2 min.
4. 72 ° C per 2 min.
5. 72 ° C per 8 min.
6. 10 ° C attesa.
Ripetere i passaggi 2-4 per 34 cicli.
(NOTA: prodotti Amplified IPCR possono essere conservati a 4 ° C.) - Eseguire gel elettroforesi per confermare il successo di amplificazione IPCR.
- Eseguire il sequenziamento del prodotto IPCR utilizzando i primer Gm3OUT e Gm5OUT. Il sito di inserzione e l'orientamento di himar1 vengono mappate.
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Representative Results
Come illustrato nella Figura 1, il mini-himar1 mariner trasposone vettore, pFAC, contiene due ripetizioni invertite 27 bp con siti di inserzione TA fiancheggianti la cassetta resistenza aacC1 gentamicina, con il suo promotore σ 70-dipendente, e un sito di clonazione multipla (MCS). Inoltre, il vettore pFAC contiene i geni che codificano la transposase altamente attiva himar1, β-lattamasi (bla), e l'operone trasferimento tra. I siti di inserzione TA consentono una efficace integrazione nel genoma di P. ceppi aeruginosa. Accuratezza nella individuazione e selezione dei mutanti muco è fondamentale per il successo complessivo nella determinazione loci genici coinvolti con regolazione alginato. Esempi di isolati muco e nonmucoid sono mostrati in Figura 1.
Per identificare in modo più accurato mutanti mucoidi, le coniugazioni compilate devono essere placcato su più piatti di grandi dimensioni (150 mm). Il cemiscele ll dovrebbero essere risospese in PBS sterile e piastrate diffondendo sulle piastre PIA più gentamicina (300 ug / ml). Diluizioni di miscela di cellule in PBS saranno distribuiti sulle piastre con l'obiettivo di avere tra 1.000-3.000 colonie / piastra. Sulla base del protocollo di cui sopra, ogni coniugazione dovrebbe produrre una banca di ~ 20.000 mutanti oltre 15-20 grandi tavole. Tempo di incubazione ottimale per le piastre a 37 ° C è compresa tra 24-36 ore. A causa della sovrapproduzione di alginato, la colonia mucoide deve essere trasparente o di colore bianco e hanno l'aspetto cremoso o viscido. Se le colonie mucoidi non possono essere individuate, poi incubare per un ulteriore 24-36 ore a temperatura ambiente. I mutanti mucoidi sono più isolati passando per tre volte su un piatto regolare PIA con gentamicina. Durante questo tempo, è possibile determinare la stabilità del fenotipo mucoide. La colonia mucoide purificato sarà utilizzata per l'estrazione di DNA genomico e identificazione dei geni da IPCR. prodotti IPCR possono essere visualizzati utilizzando gel di agarosio electrophoresis (Figura 2). In caso di successo, ci dovrebbe essere una sola amplicone alla dimensione appropriata. PAO1 DNA genomico che ha subito restrizione digestione e ligazione può essere utilizzato come controllo negativo. Come illustrato nella figura 2, vi è una mancanza di IPCR amplicone in PAO1, tuttavia rileviamo un singolo amplicone di ~ 1400 bp e ~ 1000 bp in PAO1-VE2 e PAO1-VE13, rispettivamente. La dimensione di questi ampliconi corrisponde l'inserimento del marinaio trasposone himar1 nella regione del promotore del PA4033 (MUCE) in PAO1-VE2 e internamente PA5484 (kinB) in PAO1-VE13. Sequenziamento del DNA dei ampliconi IPCR deve essere effettuata con il primer GM5OUT. Quando si utilizza il Local Alignment Search Tool base (BLAST) per analizzare la sequenza bersaglio, la ripetizione invertita sulla estremità 5 'di pFAC e TA dinucleotide contrassegnare il sito e l'orientamento del himar1 inserimento nel genoma di P. aeruginosa (Figura 2 g>).
Figura 1. Schema di mini-himar1 marinaio trasposone vettore, pFAC, e una rappresentazione di mutanti mucoidi. Plasmide pFAC contiene un elemento himar1 marinaio trasposone con due ripetizioni invertite, e una cassetta di resistenza gentamicina (aacC1) per la selezione, un gene che codifica per il himar1 trasposasi iperattivo , e un replicone condizionale. Il marinaio trasposone mini-himar1 può causare l'inserimento ad alta densità di P. aeruginosa causa dell'abbondanza di substrato (TA dinucleotide). Il numero di dinucleotidi TA nel genoma di due P. ceppi aeruginosa, PAO1 e PA14 sono mostrati in rosso. Le frecce rosse indicano i mutanti mucoidi identificati utilizzando questa procedura.om/files/ftp_upload/51346/51346fig1highres.jpg "target =" _blank "> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2. . Rappresentante IPCR e risultati di sequenziamento A) 1% agarosio elettroforesi su gel di IPCR amplificazione con i primer Forward Gm3OUT e Reverse Gm5OUT e 1 kB scala: PAO1 (controllo negativo), PAO1-VE2 (1396 bp), e PAO1-VE13 (999 bp). Il DNA genomico da tre ceppi di P. aeruginosa è stato estratto e digerito con enzimi di restrizione SalI seguita da auto-ligazione. Il DNA circolare chiuso è stato usato come template per IPCR come descritto nel testo. B) analisi di sequenza comparativa utilizzando il genoma di riferimento PAO1 determina la posizione precisa del marin himar1er inserimento trasposone in PAO1-VE2 e PAO1-VE13. La sequenza marcata in rosso indica la fine del 5 'di ripetizione invertita in pFAC. Il sito di inserzione del TA è stata sottolineata. Una ricerca BLAST di queste due sequenze mapperà l'esatta posizione e l'orientamento del trasposone himar1 all'interno del genoma di PAO1.
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Discussion
È importante notare che questo metodo può essere utilizzato in altre specie Pseudomonas con queste alterazioni: incubare P. fluorescens e P. putida a 30 ° C, e P. stutzeri a 42 ° C; P. stuzeri deve essere coltivato su piastre LB addizionato con 150 mg / ml di gentamicina, sul passo 1.11, pag cellule stutzeri devono essere trasferiti in 500 ml di LB invece di 1 ml. Inoltre, ci sono due passaggi critici per questo protocollo. In primo luogo, il ceppo ricevente dovrebbe essere coltivato alla temperatura appropriata. Ad esempio, PAO1 devono essere incubate a 42 ° C per aumentare la frequenza di ricombinazione 15. L'efficienza della biblioteca mutante era significativamente ridotto se il ceppo ricevente se non coltura alla giusta temperatura. In secondo luogo, IPCR è altamente riproducibile, ma il gDNA deve essere completamente digerito per rendere sicuri che una DNA covalentemente chiuso circolare può essere effettuato tramite ligazione del DNA. Iof questo è fatto correttamente, il prodotto IPCR apparirà come una banda su gel di agarosio. Se vengono individuati più bande, indicano che vi sono molteplici inserimenti nel mutante. Abbiamo scoperto che i risultati IPCR erano fortemente correlati con i nostri risultati Southern Blot (~ 100%). Pertanto, IPCR può essere utilizzato al posto di analisi Southern blot per il numero di inserimenti al mutante.
La mini-himar1 mariner trasposone pFAC ha terminatore trascrizionale, ed è regolato tramite un promotore σ 70-dipendente guidare l'espressione della cassetta gentamicina. Abbiamo osservato che la posizione e l'orientamento del inserimento himar1 avuto vari effetti sulla regolazione di un gene particolare. I geni sono stati inattivati quando integrato nel mezzo di un gene. Un esempio di questo è l'inattivazione del gene sensoriale chinasi kinB (PA5484) che provoca una conversione mucoidy in PAO1 (PAO1-VE13) 11. Inoltre, può anche up-regolare l'espressione del gene, se inserita a monte della regione codificante nello stesso orientamento come il gene. Un esempio di questo è PAO1-VE2, dove il himar1 guida l'espressione di Muce (PA4033) 13. Il limite di questo protocollo è che solo i geni regolatori che sono non essenziali per la crescita possono essere identificati. Inoltre, questi mutanti mucoidi individuati con questo metodo non si possono verificare in modo naturale.
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Disclosures
L'autore Hongwei D. Yu è il Chief Science Officer e co-fondatore di ProGenesis Technologies, LLC.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato supportato dal Aeronautics and Space Administration West Virginia Spazio di Grant Consorzio Nazionale (NASA WVSGC), Cystic Fibrosis Foundation (CFF-YU11G0) e NIH P20RR016477 e P20GM103434 all'idea Network West Virginia per la Ricerca Biomedica Eccellenza. Ringraziamo Vonya M. Eisinger per l'assistenza tecnica con questo lavoro.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Luria Broth | Difco | 240230 | via Fisher Scientific |
| Pseudomonas isolation agar | Difco | 292710 | via Fisher Scientific |
| Small Plates (100 O.D. x 10 mm) | Fisher Scientific | 08-757-13 | |
| Large Plates (150 O.D. x 15 mm) | Fisher Scientific | 08-757-14 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | BP229-4 | |
| Benchtop Shaking Incubator | New Brunswick Scientific | Innova 4080 | shake at 200 rpm |
| Cabinet Incubator | VWR | 1540 | |
| Benchtop Microcentrifuge | Sorvall | 75-003-287 | via Fisher Scientific |
| SmartSpec Plus Spectrophotometer | Bio-Rad | 170-2525 | or preferred method/vendor |
| Diposable Inoculation Loops | Fisher Scientific | 22-363-597 | |
| 1.5 ml Microcentrifuge Tubes | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| 2.0 ml Cryogenic Vials | Corning | 430659 | via Fisher Scientific |
| 15 ml Tubes | Fisher Scientific | 05-539-12 | |
| Skim Milk | Difco | DF0032-17-3 | via Fisher Scientific |
| DNeasy Blood and Tissue (250) | Qiagen | 69506 | or preferred method/vendor |
| QIAquick PCR Purification Kit (250) | Qiagen | 28106 | or preferred method/vendor |
| QIAprep Spin Miniprep Kit (250) | Qiagen | 27106 | or preferred method/vendor |
| FastLink II DNA Ligation Kit | Epicentre Technologies | LK6201H | via Fisher Scientific |
| Accu block Digital Dry Bath | Labnet | NC0205808 | via Fisher Scientific |
| Sal1, restriction endonuclease | New England BioLabs | R0138L | |
| EasyStart Micro 50 | Molecular BioProducts | 6020 | via Fisher Scientific |
| Taq DNA Polymerase | New England BioLabs | M0267L | |
| iCycler, Thermocycler | Bio-Rad | 170-8740 | |
| LE agarose | Genemate | 3120-500 | via Fisher Scientific |
| Gentamycin Sulfate | Fisher Scientific | BP918-1 | |
| 2.0 ml Cryogenic Vials | Corning | 430659 | via Fisher Scientific |
References
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