Summary
Aqui nós descrevemos um protocolo com o marinheiro mutagênese mini-himar1 mediada por transposon para gerar uma biblioteca de mutantes de inserção de alta densidade para a tela, isolar e identificar novos reguladores de alginato no protótipo PAO1 cepa Pseudomonas aeruginosa.
Abstract
Pseudomonas aeruginosa é uma bactéria Gram-negativa, do meio ambiente com as capacidades metabólicas versáteis. P aeruginosa é uma bactéria patogênica oportunista que estabelece infecções pulmonares crônicas em pacientes com fibrose cística (FC). O excesso de produção de um polissacarídeo capsular chamado alginato, também conhecido como mucoidy, promove a formação de biofilmes mucóides que são mais resistentes que as células planctônicas a quimioterapia antibiótico e as defesas do hospedeiro. Além disso, a conversão do nonmucoid para fenótipo mucóide é um marcador clínico para o início da infecção crónica em CF. Superprodução alginato por P. aeruginosa é um processo endergonic que tributa pesadamente energia celular. Portanto, a produção de alginato é altamente regulado em P. aeruginosa. Para compreender melhor regulação alginato, nós descrevemos um protocolo utilizando a mutagénese de transposões mini-himar1 para a identificação de novos regulador alginatos em um PAO1 cepa protótipo. O processo consiste em duas etapas principais. Em primeiro lugar, nós transferimos o transposon mini-himar1 (PFAC) do host E. coli SM10/λpir em destinatário P. aeruginosa PAO1 por conjugação entre parentes para criar uma biblioteca de mutantes de inserção de alta densidade, que foram seleccionados em placas de agar de isolamento Pseudomonas suplementado com gentamicina. Em segundo lugar, nós analisamos e isoladas as colónias mucóides para mapear o local de inserção por meio de PCR inversa utilizando iniciadores de ADN que apontam para fora a partir da cassete de gentamicina e sequenciação de ADN. Usando este protocolo, foram identificados dois reguladores novas alginato, Muce (PA4033) e kinB (PA5484), em PAO1 tensão com um tipo selvagem Muca que codifica o fator anti-sigma MUCA para o alginato regulador mestre Algu (ALGT, σ 22) . Este protocolo de mutagénese de alto rendimento podem ser modificados para a identificação de outros genes de virulência causando alterações no colomorfologia ny.
Introduction
A capacidade do oportunista, patógeno Gram-negativa Pseudomonas aeruginosa a produzir alginato é um fator importante na sua capacidade de estabelecer um biofilme. A superprodução de alginato é um fenótipo muitas vezes referida como mucoidy. O isolamento das colônias mucóides de amostras de escarro de indivíduos que sofrem de fibrose cística (FC) é indicativo de uma infecção crônica, e está diretamente associado a um declínio geral na saúde do paciente 1. Atualmente, entende-se que a regulamentação e produção de alginato em P. aeruginosa ocorre principalmente em dois operões. O primeiro é o operon biossintética alginato, que contém 12 genes (algD - alg8 - alg44 - algK - Alge - algG - algX - algL - ALGI - algJ - algF - alga) que são responsáveis pela síntese e exportação do polímero alginato através periplasma para o Environme extracelularnt 2-5. A segunda operon é um conjunto de genes que começa com o fator sigma alternativo Algu / T e continuando com Muca, mucB e mucD. Algu / T é um regulador positivo, enquanto mucAB-D são classificados como reguladores negativos da produção de alginato de 6-8. Além disso, reguladores de transcrição, tais como ALGB, AlgQ, AlgR, e RPON, bem como pós-transcricional e modificação pós-tradução pela repressão catabólica de controlo, a actividade da cinase (KinB) e proteólise intramembrane, têm também sido mostrado para ser envolvido em alginato regulação 9-14.
O vetor de transposon mini-himar1 conhecido como PFAC foi originalmente criado em laboratório Dr. Mekalanos 'na Harvard Medical School 15. O plasmídeo PFAC consiste de um elemento transponível flanqueado por duas repetições invertidas de 27 pb e uma cassete de resistência à gentamicina no meio (aacC1: 534 pb), um gene que codifica para a hyperactive transposase marinheiro 16, e um gene que codifica a β-lactamase (bla) (Figura 1). A informação da sequência para o elemento transponível de PFAC está disponível com o número de acesso do GenBank: DQ366300 13. Em PFAC, há um local de clonagem múltipla (MCS) atrás do gene aacC1 que é utilizado para a identificação do local de inserção cromossómico utilizando PCR inversa. Uma grande vantagem com o uso do transposon mini-himar1 há fatores do hospedeiro específicas são necessárias para a transposição (mutagênese). Além disso, existe uma grande abundância de sítios de inserção dinucleotidicos TA encontrados em todo o genoma de P. aeruginosa. Por exemplo, locais de inserção dinucleotide TA ocorre 94.404 e 100.229 vezes no PAO1 (6.264.404 bps, GenBank número de acesso NC_002516.2) e PA14 (6.537.648 bps; número de acesso GenBank NC_008463) genomas, respectivamente. Devido à abundância de TA dinucleotide no genoma, mini-himar1 mini-himar1 pode inserir qualquer gene não essencial no genoma de P. aeruginosa. Isto fornece cerca de 18 locais de inserção TA por quadro de leitura aberta no genoma PAO1.
Aqui, nós descrevemos um protocolo usando a mutagênese mediada por transposon mini-himar1 para identificar novos reguladores de mucoidy em P. aeruginosa. Mais especificamente, o vector biparentally conjugado PFAC contendo um transposão mini-himar1 de E. coli SM10/λpir no PAO1 tensão prototrófico nonmucoid. Após o transposão está integrado no genoma, a estirpe receptora é cultivado em Pseudomonas isolamento de agar (AIP) contendo triclosan, que inibe o crescimento de E. coli. Assim, uma biblioteca de mutantes de
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Protocol
1. Preparação de Estirpes Bacterianas e biparentais Conjugação
- Inocular E. coli SM10/λpir/pFAC em 5 ml de caldo de Luria (LB) suplementado com 15 ug / ml de gentamicina e colocar num incubador com agitação durante a noite a 37 ° C.
- Inocular P. aeruginosa PAO1 tensão em 5 ml de LB, e coloque em uma incubadora de agitação durante a noite a 42 ° C.
- Meça OD 600 de culturas durante a noite e misture quantidades iguais de PAO1 e E. coli PFAC de tal modo que o volume final é entre 1-1,4 ml.
- Centrifuga-se a mistura de 6000 g durante 5 min.
- Por outro lado, secar as placas de LB para conjugação: deixar abertas as placas na incubadora a 37 ° C durante 10-15 min.
- Remova todos, mas 50 ul de sobrenadante de mistura de células.
- Ressuspender o sedimento de células nos restantes 50 ul de sobrenadante e pipeta para uma placa de LB seco em uma gotícula compacto.
- Com cuidado, coloque a placa em um exaustor para secar (IMPONota RTANT: Não deixe que as células se espalham sobre a placa, isso vai diminuir significativamente a eficiência da conjugação).
- Uma vez que a gotícula é seco, inverter a placa LB e incubar a 37 ° C durante 4-6 horas.
- Enquanto a mistura de células é a incubação, preparar grandes placas PIA (150 x 15 mm OD) com 300 ug / ml de gentamicina. Antes da utilização, remover a humidade residual por colocar numa incubadora a 37 ° C durante 15-20 min.
- Após a incubação da mistura de células está concluída, a colheita das células utilizando uma ansa de inoculação estéril e de um tubo de microcentrífuga contendo 1 ml de LB e vórtice, ou pipeta, para misturar completamente.
- Espalhe as células uniformemente sobre as grandes placas PIA contém 300 mg / ml de gentamicina. (IMPORTANTE: Para este passo, é melhor adicionar volumes crescentes de a mistura de células para separar as placas (por exemplo, placa de 1: 10 ul, Placa 2: 50 ul, Placa 3: 100 ul, Placa 4: 500 ul, etc) .
- Incubar durante a noite a 37° C.
2. Detecção e isolamento de colónias mucóides
- Remover placas da incubadora e examinar para colônias mucóides.
- Isolar uma única colônia de muco e estrias para isolamento em pequenas placas (100 OD x 10 mm) com PIA e 300 mg / ml de gentamicina.
- Incubar durante a noite a 37 ° C.
- Repetir a etapa 2.2 em cultura durante a noite anterior.
- Repita os passos de 2,2-2,4, mais duas vezes, para determinar a estabilidade do isolado mucóide.
- Após o passo final de isolamento, o inocular 4,5 ml de LB com uma única colónia mucóide e incubar no agitador durante a noite a 37 ° C.
- No dia seguinte, etiqueta 3 microtubos para cada mutante mucóide.
- Prepare dois 1,25 ml alíquotas de cultura durante a noite em dois tubos para extração de DNA genômico e identificação do local de inserção do transposon (ver protocolo 3).
- Adicionalmente, arquivar cada mutante mucóide pipetando 1 ml da cultura durante a noite em um DOTAÇÕEScriotubo ely-marcado contendo um volume igual de 10% de leite desnatado. Guarde-o em -86 ° C.
3. gDNA Restrição Digestão e ligadura
- Extrair ADNg do mutante mucóide usando qualquer método preferido (fenol-clorofórmio, a coluna de centrifugação, por exemplo., Etc.)
- Determinar a concentração do ADNg, digerir com um total de 2 mg com 1 ul da endonuclease de restrição Sall, 0,5 ul de albumina de soro de bovino, 5 uL de tampão de enzima Sall (100 mM de NaCl, 50 mM Tris-HCl, 10 mM de MgCl2 , ditiotreitol 1 mM (DTT), pH 7,9 à temperatura ambiente), e o volume adequado de dH2O para obter um volume total de 50 ul.
- Digerir o ADN durante a noite a 37 ° C. (IMPORTANTE:. Dependendo da eficiência do enzima de restrição, pode ser necessário adicionar um adicional de 1 ml para a digestão durante a noite e incubar a 37 ° C durante 1-2 hr Isto é em adição à digestão durante a noite.)
- Purifica-se o DigeADN STED usando qualquer método preferido (por exemplo, purificação em gel de agarose, coluna de spin) e elui-se com 25 mL de tampão.
- Ligar o DNA digerido, misturando 11 ul de ADN purificado com uma concentração preferida de ~ 10-20 ng / mL, 1,5 mL de ligadura Buffer (330 mM de Tris-acetato, pH 7,5, 660 mM acetato de potássio, 100 mM de acetato de magnésio, 5 mM DTT), 1,5 ul de ATP 100 mM e 1 uL de ligase de ADN.
- Incubar a mistura durante 15 minutos à temperatura ambiente, e, em seguida, desactivar a enzima por incubação durante 15 min a 70 ° C. (Nota: A incubação da mistura à temperatura ambiente durante mais longa pode aumentar o sucesso da ligação).
4. PCR Inverso (IPCR) e Análise de Sequência
- Realizar IPCR no produto de ligação com a seguinte iniciadores directos e inversos e termociclagem condições:
-Forward Primer (Gm3OUT): GGGCATACGGGAAGAAGTGA
-Reverse Primer (Gm5OUT): GACTGCCCTGCTGCGTAACA
Termociclador Condições:
1. 94 ° C durante 1 min.
2. 94 ° C durante 1 min.
3. 58 ° C durante 2 min.
4. 72 ° C durante 2 min.
5. 72 ° C durante 8 min.
6. 10 ° C preensão.
Repita os passos 2-4 para 34 ciclos.
(NOTA: Os produtos amplificados IPCR pode ser armazenado a 4 ° C.) - Realizar a electroforese em gel de agarose para confirmar a amplificação de IPCR bem sucedida.
- Realizar a sequenciação do produto de IPCR utilizando os iniciadores Gm3OUT e Gm5OUT. O local de inserção e orientação de himar1 são mapeados.
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Representative Results
Tal como ilustrado na Figura 1, o vector de mariner transposão mini-himar1, PFAC, contém duas repetições invertidas com 27 pb que flanqueia os locais de inserção de TA a cassete de resistência à gentamicina aacC1, com o seu promotor σ 70-dependente, e um local de clonagem múltipla (MCS). Além disso, o vector contém os genes que codificam PFAC transposase altamente activa himar1, β-lactamase (bla), e o operão transferência tra. Os locais de inserção TA para permitir uma integração eficiente no genoma de P. estirpes aeruginosa. Precisão na identificação e seleção de mutantes mucoides é fundamental para o sucesso global na determinação loci de genes envolvidos com a regulação de alginato. Exemplos de isolados mucóides e nonmucoid são mostrados na Figura 1.
Para identificar com mais precisão os mutantes mucóides, as conjugações concluídas devem ser colocadas em várias placas de grandes dimensões (150 mm). O cell misturas devem ser ressuspensas em PBS estéril e banhado pelo espalhamento sobre as placas de PIA mais gentamicina (300 ug / ml). As diluições de mistura de células em PBS será espalhada sobre as placas com o objectivo de que entre 1.000-3.000 colónias / placa. Com base no protocolo acima, cada conjugação deve produzir um banco de ~ 20000 mutantes sobre 15-20 placas maiores. O tempo de incubação óptimo para as placas a 37 ° C é entre 24-36 horas. Devido ao excesso de produção de alginato, a colônia de muco deve ser transparente ou de cor branca e tem aspecto cremoso ou viscoso. Se colónias mucóides não pode ser discernida, depois incubar durante um adicional de 24-36 h à temperatura ambiente. Os mutantes mucoides são mais isolado, passando três vezes em uma placa PIA regular com gentamicina. Durante este tempo, você pode determinar a estabilidade do fenótipo mucóide. A colónia mucóide purificada irá ser utilizado para a extracção de ADN genómico e identificação dos genes de IPCR. IPCR produtos podem ser visualizados utilizando gel de agarose a electrophoresis (Figura 2). Se for bem sucedido, não deve haver um único fragmento amplificado com o tamanho apropriado. ADN genómico PAO1 que tenha sido submetido a digestão de restrição e de ligação pode ser usado como um controlo negativo. Tal como ilustrado na Figura 2, há uma ausência de IPCR amplicão em PAO1, no entanto, detectar um único fragmento amplificado de ~ 1400 pb e 1000 pb na ~ PAO1-VE2 e PAO1-VE13, respectivamente. O tamanho desses produtos de amplificação corresponde à inserção do transposão mariner himar1 para a região do promotor de PA4033 (Muce) em PAO1-VE2 e internamente em PA5484 (kinB) em PAO1-VE13. A sequenciação de ADN dos produtos de amplificação de IPCR deve ser levada a cabo com o iniciador GM5OUT. Ao utilizar o local básico Alignment Search Tool (BLAST), para analisar a sequência alvo, a repetição invertida na extremidade 5 'do dinucleótido PFAC TA e marcar o local e orientação da inserção himar1 no genoma de P. aeruginosa (Figura 2 g>).
Figura 1. Diagrama esquemático do mini-himar1 vetor mariner transposon, PFAC, e uma representação de mutantes mucóides. Plasmídeo PFAC contém um elemento mariner himar1 transposon com duas repetições invertidas, e uma cassete de resistência a gentamicina (aacC1) para a seleção, um gene que codifica a transposase himar1 hiperativo , e um replicão condicional. O marinheiro transposon mini-himar1 pode causar a inserção de alta densidade em P. aeruginosa, devido à abundância de substrato (TA dinucleótido). O número de dinucleótidos TA nos genomas de dois P. cepas aeruginosa, PAO1 e PA14 são mostrados em vermelho. As setas vermelhas indicam os mutantes mucoides identificados usando este procedimento.om/files/ftp_upload/51346/51346fig1highres.jpg "target =" _blank "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. . Representante IPCR e os resultados de sequenciamento A) eletroforese em gel de agarose a 1% de amplificação IPCR utilizando os primers frente Gm3OUT e Gm5OUT reversa e uma escada de 1 kB: PAO1 (controle negativo), PAO1-VE2 (1396 pb), e PAO1-VE13 (999 pb). O DNA genômico a partir de três cepas de P. aeruginosa foi extraído e digerido com as enzimas de restrição Sall, seguido por auto-ligação. O ADN circular fechado foi utilizado como modelo para IPCR como descrito no texto. B) análise de sequência comparativa usando o genoma de referência PAO1 determina a localização exacta do marin himar1er transposão inserção em PAO1-VE2 e PAO1-VE13. A sequência marcada em vermelho indica a extremidade 5 'de repetição invertida em PFAC. O local de inserção do TA foi sublinhado. Uma pesquisa BLAST das duas sequências irão mapear a localização exacta e orientação do transposão himar1 dentro do genoma de PAO1.
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Discussion
É importante notar que este método pode ser utilizado em outras espécies de Pseudomonas com essas alterações: incubar P. e P. fluorescens putida a 30 ° C, e P. stutzeri a 42 ° C; p stuzeri devem ser cultivadas em placas de LB suplementadas com 150 ug / ml de gentamicina; no passo 1.11, P. células stutzeri deve ser transferido para 500 mL de LB em vez de 1 ml. Para além disso, existem dois passos críticos para este protocolo. Em primeiro lugar, a estirpe recipiente devem ser cultivadas a uma temperatura adequada. Por exemplo, PAO1 devem ser incubados a 42 ° C para aumentar a frequência de recombinação 15. A eficiência da biblioteca de mutantes foi significativamente reduzida se a estirpe receptora, se não cultivadas a temperatura correcta. Em segundo lugar, IPCR é altamente reprodutível, mas o ADNg deve ser completamente digerido para tornar assegurar que um DNA circular covalentemente fechado, pode ser feito através da ligação de DNA. Euf isto é feito correctamente, o produto de IPCR aparece como uma banda num gel de agarose. Se várias bandas são identificadas, eles indicam que há múltiplas inserções no mutante. Descobrimos que os resultados IPCR foram fortemente correlacionados com os nossos resultados blot Sul (~ 100%). Portanto, IPCR pode ser usado no lugar da análise de transferência de Southern para o número de inserções por mutante.
O mini-himar1 mariner transposão em PFAC não tem o terminador de transcrição, e que é regulado através de um promotor σ 70-dependente dirigir a expressão da cassete de gentamicina. Observou-se que a posição e orientação da inserção himar1 tinha vários efeitos sobre a regulação de um gene particular. Os genes foram inactivados quando integrado no meio de um gene. Um exemplo disto é a inactivação do gene da cinase kinB sensorial (PA5484), que provoca uma conversão para mucoidy em PAO1 (PAO1-VE13) 11. Além disso, também pode up-regulam a expressão do gene que, quando inserido a montante da região de codificação, na mesma orientação que o gene. Um exemplo disto é PAO1-VE2, onde o himar1 dirige a expressão de Muce (PA4033) 13. A limitação deste protocolo é de que apenas os genes reguladores que não são essenciais para o crescimento podem ser identificados. Além disso, esses mutantes mucoides identificados usando este método pode não ocorrer naturalmente.
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Disclosures
O autor Hongwei D. Yu é a Ciência Officer e co-fundador da progênese Technologies, LLC Chefe.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado pelo Aeronautics and Space Administration West Virginia Space Grant Consortium Nacional (NASA WVSGC), Cystic Fibrosis Foundation (CFF-YU11G0) e NIH P20RR016477 e P20GM103434 à Rede IDeA West Virginia for Biomedical Research Excellence. Agradecemos Vonya M. Eisinger para a assistência técnica com este trabalho.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Luria Broth | Difco | 240230 | via Fisher Scientific |
| Pseudomonas isolation agar | Difco | 292710 | via Fisher Scientific |
| Small Plates (100 O.D. x 10 mm) | Fisher Scientific | 08-757-13 | |
| Large Plates (150 O.D. x 15 mm) | Fisher Scientific | 08-757-14 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | BP229-4 | |
| Benchtop Shaking Incubator | New Brunswick Scientific | Innova 4080 | shake at 200 rpm |
| Cabinet Incubator | VWR | 1540 | |
| Benchtop Microcentrifuge | Sorvall | 75-003-287 | via Fisher Scientific |
| SmartSpec Plus Spectrophotometer | Bio-Rad | 170-2525 | or preferred method/vendor |
| Diposable Inoculation Loops | Fisher Scientific | 22-363-597 | |
| 1.5 ml Microcentrifuge Tubes | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| 2.0 ml Cryogenic Vials | Corning | 430659 | via Fisher Scientific |
| 15 ml Tubes | Fisher Scientific | 05-539-12 | |
| Skim Milk | Difco | DF0032-17-3 | via Fisher Scientific |
| DNeasy Blood and Tissue (250) | Qiagen | 69506 | or preferred method/vendor |
| QIAquick PCR Purification Kit (250) | Qiagen | 28106 | or preferred method/vendor |
| QIAprep Spin Miniprep Kit (250) | Qiagen | 27106 | or preferred method/vendor |
| FastLink II DNA Ligation Kit | Epicentre Technologies | LK6201H | via Fisher Scientific |
| Accu block Digital Dry Bath | Labnet | NC0205808 | via Fisher Scientific |
| Sal1, restriction endonuclease | New England BioLabs | R0138L | |
| EasyStart Micro 50 | Molecular BioProducts | 6020 | via Fisher Scientific |
| Taq DNA Polymerase | New England BioLabs | M0267L | |
| iCycler, Thermocycler | Bio-Rad | 170-8740 | |
| LE agarose | Genemate | 3120-500 | via Fisher Scientific |
| Gentamycin Sulfate | Fisher Scientific | BP918-1 | |
| 2.0 ml Cryogenic Vials | Corning | 430659 | via Fisher Scientific |
References
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