Summary
एक नील लाल धुंधला प्रक्रिया का उपयोग शैवाल कोशिकाओं के तटस्थ लिपिड सामग्री को निर्धारित करने के लिए एक साधारण प्रोटोकॉल में वर्णित है. यह समय की बचत तकनीक पारंपरिक gravimetric आधारित लिपिड मात्रा का ठहराव प्रोटोकॉल के लिए एक विकल्प प्रदान करता है. यह निगरानी बायोप्रोसैस प्रदर्शन के विशिष्ट आवेदन के लिए डिजाइन किया गया है.
Abstract
शैवाल उनके प्राकृतिक लिपिड भंडारण क्षमता की वजह से अक्षय ईंधन के स्रोतों के लिए उत्कृष्ट उम्मीदवार माना जाता है. काई के किण्वन प्रक्रिया और नए तेल समृद्ध उपभेदों के लिए स्क्रीनिंग की मजबूत निगरानी intracellular लिपिड सामग्री के निर्धारण के लिए एक तेज और विश्वसनीय प्रोटोकॉल की आवश्यकता है. वर्तमान प्रथाओं तेल की मात्रा निर्धारित करने के लिए काफी हद तक gravimetric तरीकों पर भरोसा करते हैं, तकनीक समय लगता है और बड़े नमूना संस्करणों की आवश्यकता है कि दशकों पहले विकसित किया है. इस पत्र में, नील लाल, जीवों की अनेक प्रकार के लिपिड निकायों की उपस्थिति की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया गया है कि एक फ्लोरोसेंट रंजक, Auxenochlorella protothecoides के तटस्थ लिपिड सामग्री, एक हरे रंग को मापने के लिए एक सरल, तेज और विश्वसनीय प्रोटोकॉल में शामिल किया है शैवाल. विधि धुंधला पहले कोशिका झिल्ली और प्रतिदीप्ति तीव्रता माप के दौरान नमूना क्षमता बढ़ाने के लिए एक साथ 96 माइक्रो थाली permeabilize करने के लिए, इथेनॉल, एक अपेक्षाकृत हल्के विलायक का उपयोग करता है. यह डिजाइन किया गया हैनिगरानी बायोप्रोसैस प्रदर्शन के विशिष्ट आवेदन के साथ एड. एक बढ़ती संस्कृति से पहले सूखे नमूने या जी नमूने परख में इस्तेमाल किया जा सकता है.
Introduction
कारण कुछ तनाव परिस्थितियों में लिपिड शरीर की दुकान करने की क्षमता के लिए, शैवाल एक संभावित अक्षय ईंधन स्रोत 1,2 के रूप में हाल के वर्षों में ध्यान की एक बहुत कुछ प्राप्त किया है. तटस्थ लिपिड उचित विकास की स्थिति 3 के तहत सेल सूखी वजन के 60% से अधिक के लिए खाते में कर सकते हैं. अभी तक इस उद्योग ठीक से, बायोप्रोसैस प्रदर्शन की निगरानी संस्कृतियों का विश्लेषण, और नए उपभेदों के लिए स्क्रीन के क्रम में शैवाल कोशिकाओं के लिपिड सामग्री quantitate लिए एक सरल, स्वच्छ, तेजी से, और विश्वसनीय मानकीकृत प्रोटोकॉल नहीं है.
Bligh-डायर gravimetric विधि कुछ 50 साल पहले विकसित आज 4,5 सबसे आम तकनीकों के बीच बनी हुई है. इस प्रक्रिया सरल, विश्वसनीय, और बाहर ले जाने के लिए आसान है, यह, समय लेने वाली है बड़ा नमूना मात्रा में जरूरी है, और विषाक्त सॉल्वैंट्स का उपयोग करता है. यह एक किण्वन रन से कई नमूनों का विश्लेषण करने या नए तेल समृद्ध उपभेदों के लिए स्क्रीनिंग के लिए व्यावहारिक नहीं है. अन्य तरीकों ख हैeen विकसित की है, लेकिन आम तौर पर आधुनिक उपकरणों की आवश्यकता होती है और 6 मानकीकृत नहीं किया गया है.
ब्याज का एक बड़ा सौदा है हुई कि एक वैकल्पिक नील लाल दाग है. नील लाल, गैर ध्रुवीय वातावरण में रियायत के तौर पर fluoresces कि एक डाई, नेमाटोड 7, खमीर 8, बैक्टीरिया 9, और शैवाल 10-19 सहित विभिन्न जीवों में लिपिड शवों की पहचान या यों इस्तेमाल किया गया है. नील लाल शामिल प्रारंभिक तकनीक एकल क्युवेट स्पेक्ट्रोफोटोमेट्री साथ या प्रवाह cytometry दाग के संयोजन, ज्यादातर गुणात्मक या अर्द्ध मात्रात्मक थे. इसके अलावा, इस तरह हरी शैवाल के रूप में शैवाल के कुछ वर्गों तकनीक 10 की सीमा सीमित है जो डाई, ज्यादातर अभेद्य हैं कि मोटी सेल कुओं है.
नील लाल धुंधला विधि करने के लिए हाल ही में सुधार प्रोटोकॉल 10,11 की प्रारंभिक कमियों को बायपास करने वाले सूचित किया गया है. एक कैर की उपस्थिति में कोशिकाओं को धुंधलाier ऐसे DMSO के रूप में 10 विलायक या इथेनॉल 10,11 विश्वसनीय मात्रात्मक मापन के लिए अनुमति देता है, तेल की मात्रा और absorbance के बीच के रिश्ते linearizes. विलायक नील लाल अणुओं के माध्यम से पारित कर सकते हैं इतना है कि कोशिका झिल्ली permeabilize में मदद करता है. इसके अलावा, सूक्ष्म प्लेट पढ़ने क्षमताओं के साथ एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर शामिल मात्रात्मक विश्लेषण के लिए उपयुक्त उच्च throughput प्रोटोकॉल सक्षम बनाता है.
इस लेख में हम विस्तार से इथेनॉल, एक हल्के विलायक की उपस्थिति में नील लाल के साथ संस्कृतियों धुंधला करके शैवाल कोशिकाओं के तेल की मात्रा को मापने के लिए एक सरल तरीका है. सबसे सही क्रम में माप में पृष्ठभूमि शोर के लिए खाते, तेल सामग्री के लिए प्रतिदीप्ति तीव्रता correlating एक मानक वक्र ज्ञात तेल रचना की algal कोशिकाओं का उपयोग कर विकसित कर रहा है. विधि पहले प्रकाशित प्रोटोकॉल 10,11 से अनुकूलित है. एक 96 अच्छी तरह से स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग करके, एक एक घंटे में था नमूनों की एक ही राशि का विश्लेषण करने में सक्षम हैटी gravimetric तरीके से नजर रखने के लिए दिन लगेंगे. इसके अलावा, वांछित शैवाल प्रजातियों के प्रतिनिधि नमूने का उपयोग औजार से इस विधि सीधे व्याख्या कर रहे हैं कि अपेक्षाकृत सटीक मापन पैदा करता है. अलग उपभेदों और अनुप्रयोगों के लिए अनुकूलित नील लाल के साथ शैवाल धुंधला करने के तरीकों की रूपरेखा कई प्रोटोकॉल मौजूद हैं; यह कई प्रजातियां और कक्षाओं के लिए संभावना उपयुक्त है, हालांकि यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल मूल रूप से, Auxenochlorella protothecoides के लिए डे ला Hoz Siegler एट अल. 11 से Chlorella vulgaris, Scenedesmus dimorphus, और Scenedesmus obliquus विकसित किया गया था. यह निगरानी बायोप्रोसैस प्रदर्शन के विशिष्ट आवेदन के साथ डिजाइन किया गया है और यह एक से बढ़ संस्कृति से पहले सूखे नमूने और गीला नमूने के लिए समान रूप से अच्छी तरह से काम करता है.
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Protocol
1. सूखी Algal बायोमास के अलगाव प्रतिदीप्ति रीडिंग के लिए मानक के रूप में इस्तेमाल किया जाएगा
- शुष्क बायोमास के कम से कम 200 मिलीग्राम प्रदान करेगा कि बढ़ रही काई संस्कृति से एक नमूना मात्रा निकालें, 400-600 मिलीग्राम बेहतर है.
- 10,000 एक्स जी पर 10 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर नमूना अपकेंद्रित्र. सतह पर तैरनेवाला त्यागें और विकास मीडिया के रूप में एक ही पीएच को तैयार फॉस्फेट बफर के एक बराबर मात्रा के साथ गोली धोने.
- 3 धोने कदम के लिए कुल 1.2 चरण दोहराएँ.
- De-ionized पानी में गोली पुनः निलंबित और एक तौलना पूर्व तौला डिश के लिए स्थानांतरण. 48 घंटे के लिए 50 डिग्री सेल्सियस पर शुष्क करते हैं. नोट: वैक्यूम के तहत सुखाने सुखाने समय कम होगा और 50 डिग्री सेल्सियस से ऊपर तापमान पर संस्कृति सुखाने मेजबान कठिन बना सकता है.
- भविष्य में उपयोग के लिए कमरे के तापमान पर स्टोर सूखे काई संस्कृतियों.
हेक्सेन निष्कर्षण द्वारा तटस्थ लिपिड 2. Gravimetric मात्रा (Bligh और डायर 4 से अनुकूलित)
- एक तौलना पकवान में सूखा algal बायोमास के लगभग 50 मिलीग्राम उपाय. नोट: 40-80 मिलीग्राम से लेकर जनता के reproducibility की हानि के बिना इस्तेमाल किया जा सकता है.
- एक मोर्टार हेक्सेन के साथ पूर्व धोया बायोमास स्थानांतरण. यदि आवश्यक हो, पूरी तरह से मोर्टार के लिए बायोमास स्थानान्तरण करने के क्रम में एक पाश्चर पिपेट का उपयोग हेक्सेन की एक छोटी राशि (1 मिलीग्राम) के साथ तौलना पकवान धोने. नोट: हेक्सेन एक अत्यधिक अस्थिर और विषाक्त पदार्थ है. यह उचित सुरक्षात्मक कपड़े के साथ धूआं हुड में नियंत्रित किया जाना चाहिए.
- एक पैर का उपयोग कर 5 मिनट के लिए शैवाल बायोमास पीस. कोमल पीस के साथ शुरू और धीरे - धीरे तीव्रता में वृद्धि. 5 मिनट की अवधि में एक ठीक है और चिकनी पेस्ट में बायोमास पीस. मोर्टार के लिए बायोमास स्थानांतरित जब अतिरिक्त हेक्सेन प्रयोग किया जाता है, तो यह हेक्सेन पीसने से पहले लुप्त हो जाना करने के लिए प्रतीक्षा करने के लिए सबसे अच्छा है.
- मोर्टार के लिए हेक्सेन के कुछ मिलीलीटर जोड़ें और यह homogenized है जब तक मूसल के साथ जिसके परिणामस्वरूप घोल मिलाएं. सभी सेल मलबे mor की दीवारों का पालन सुनिश्चित करें किटार मुक्त खटखटाया और तरल में निलंबित कर रहे हैं.
- एक अपकेंद्रित्र ट्यूब हेक्सेन सेल जन मिश्रण स्थानांतरण. नोट: अपकेंद्रित्र ट्यूब गिलास या ऐसे Teflon के रूप में हेक्सेन के साथ संगत एक उपयुक्त बहुलक या तो होना चाहिए.
- सभी बायोमास अपकेंद्रित्र ट्यूब (3-5X) को हस्तांतरित कर दिया गया है जब तक दोहराएँ 2.4 और 2.5 कदम.
- अपकेंद्रित्र 10,000 एक्स जी पर 20 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर नमूना.
- ध्यान एक पूर्व तौला धातु पकवान तौलना में सतह पर तैरनेवाला पिपेट. धूआं हुड में स्टोर.
- गोली हेक्सेन के 3 मिलीलीटर जोड़ने और 1 मिनट के लिए सख्ती vortexing द्वारा एक 2 एन डी हेक्सेन निष्कर्षण प्रदर्शन.
- दोहराएँ 2.7 और 2.8 कदम. यदि आवश्यक हो, सभी सेल मलबे को पूरी तरह सुलझेगी सुनिश्चित करने के लिए दूसरा निष्कर्षण के दौरान अपकेंद्रित्र में 30 मिनट के लिए नमूने चलाते हैं. हेक्सेन पूरी तरह से हवा हो गया है के बाद gravimetrically निकाले तेल के द्रव्यमान का निर्धारण.
नील लाल रंग का प्रयोग तटस्थ लिपिड 3. Fluorometric मात्रा (Repor रूपटेड डे ला Hoz Siegler एट अल. 11 से)
नोट: 5 ग्राम / एल पर एक काई के निलंबन का केवल 10 μl प्रतिदीप्ति पढ़ने के लिए आवश्यक है. आम तौर पर, संस्कृति शोरबा के 1.5 मिलीलीटर से शुष्क algal बायोमास के अलगाव के लिए पर्याप्त से अधिक है. इसके अलावा, स्पेक्ट्रोफोटोमीटर में दीपक के प्रकाश की तीव्रता समय पर नीचा कर सकते हैं. यह साधन में बदलाव मापन के लिए अनावश्यक त्रुटि जोड़ नहीं है कि यह सुनिश्चित करने के लिए हर प्रयोग में मानकों में शामिल करने की सिफारिश की है.
- शराब अभिकर्मक ग्रेड इथेनॉल में भंग 10 माइक्रोग्राम / एमएल के एक एकाग्रता में एक नील नदी लाल समाधान तैयार करें. 4 डिग्री सेल्सियस पर अंधेरे में इस समाधान स्टोर
- 4 डिग्री सेल्सियस पर विआयनीकृत पानी और दुकान में एक 30% (v / v) इथेनॉल समाधान तैयार
- एक ही बायोमास एकाग्रता (एल / 5 ग्राम की सिफारिश की है) पर और माप में इस्तेमाल किया मानकों के रूप में एक ही तरीके से सभी काई के नमूने तैयार करते हैं. उचित मात्रा में या तो निलंबित पूर्व सूखे नमूनों से यह मत करोफॉस्फेट बफर (0.6 छ / एल पोटेशियम फॉस्फेट द्विक्षारकीय, 1.4 ग्राम / एल पोटेशियम फॉस्फेट अकेले आधार), या मैलापन मापने के बाद फॉस्फेट बफर के साथ 5 ग्राम / एल के लिए एक से बढ़ शैवाल संस्कृति की एकाग्रता को एडजस्ट करने की. नोट: लाइव काई संस्कृतियों पर प्रदर्शन माप अक्सर मैलापन अंशांकन वक्र की शुद्धता पर निर्भर करता है उनके साथ जुड़े बड़े त्रुटि होगा. सूखे नमूने resuspending पूरी तरह बायोमास को फैलाने के लिए एक homogenizer के उपयोग की आवश्यकता हो सकती है.
- प्रत्येक नमूना के लिए, एक 96 अच्छी तरह से थाली का एक भी अच्छी तरह से में 30% इथेनॉल के समाधान के 80 μl, नील लाल समाधान के 10 μl, और काई के निलंबन के 10 μl मिश्रण. ठीक से प्रतिदीप्ति माप की परिवर्तनशीलता के लिए खाते में करने के लिए, प्रत्येक नमूने के 5 replicates प्रदर्शन करते हैं.
- साधन और तैयारी में दिन के लिए दिन के रूपांतरों के लिए खाते के क्रम में पहले से तैयार मानकों के साथ एक दो बिंदु अंशांकन वक्र चलाएँ. एस का उपयोग कर प्रतिदीप्ति माप के लिए मानकों को तैयारनमूने के रूप में एएमई प्रक्रिया. नोट: आम तौर पर दो अंक साधन के recalibration के लिए, तीन अंक linearity सत्यापित करने के लिए चलाए जा सकता है पर्याप्त है.
- एक बहु - अच्छी तरह से थाली पाठक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर में प्रतिदीप्ति माप प्रदर्शन. निम्न स्थितियों में सबसे अनुरूप परिणाम 11 उपज पाए गए:
- 30 सेकंड के लिए, 1,200 आरपीएम, कक्षा 3 मिमी पर हिला.
- 10 मिनट के लिए 40 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं.
- 30 सेकंड के लिए, 1,200 आरपीएम, कक्षा 3 मिमी पर हिला.
- रिकॉर्ड प्रतिदीप्ति, 530 एनएम पर उत्तेजना, 604 एनएम उत्सर्जन.
- आंतरिक मानकों से परिणाम का उपयोग कर तेल की मात्रा को प्रतिदीप्ति माप कन्वर्ट.
4. प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी तकनीक
नोट: धारा 3 में वर्णित धुंधला प्रोटोकॉल मात्रात्मक विश्लेषण के लिए बनाया गया है, लेकिन यह भी शिक्षा और इनका पु के लिए दाग आधारित तकनीक का दृश्य निरूपण प्रदान करने के लिए उपयोगी हो सकता हैrposes. नमूना प्रतिदीप्ति एक की छवियों का उत्पादन करने के लिए परंपरागत प्रसारण और अतिरिक्त epifluorescence रोशनी स्रोतों के साथ एक ऑप्टिकल माइक्रोस्कोप की आवश्यकता है. 530 एनएम (हरा) और 604 एनएम (लाल) रेंज में उत्तेजना और उत्सर्जन प्रकाश फिल्टर, क्रमशः, नील लाल दाग के रूप में अच्छी तरह से जुड़े सॉफ्टवेयर के साथ एक माइक्रोस्कोप घुड़सवार कैमरे के लिए आवश्यक हैं. इस अध्ययन (चित्रा 1) में दिखाया छवियों आरजीबी कनवर्टर इकाई के लिए एक कैमरा और मोनोक्रोम से लैस एक चमकदार क्षेत्र माइक्रोस्कोप का उपयोग कर हासिल किया गया. इन उपकरणों का उपयोग नील लाल प्रतिदीप्ति छवियों का निर्माण करने के लिए प्रक्रिया नीचे उल्लिखित है:
- प्रोटोकॉल की धारा 3 के अनुसार नील लाल दाग के साथ एक संस्कृति नमूना तैयार करें. नोट: 5 ग्राम / एल एकाग्रता रेंज में एक नमूना भीड़भाड़ बिना पर्याप्त सेल घनत्व की स्लाइड्स पैदा करता है.
- धुंधला प्रोटोकॉल का कदम 3.6 पूरा करने के बाद, मानक प्रयोगशाला प्रक्रिया के अनुसार कार्रवाई की नमूने के एक खुर्दबीन स्लाइड तैयार करते हैं.
- प्रसारण विधा में माइक्रोस्कोप के साथ शुरू, माइक्रोस्कोप में तैयार स्लाइड लोड, और वांछित बढ़ाई (इस लेख में दिखाया छवियों 100X उद्देश्य से हासिल किया गया) में कोशिकाओं का पता लगाने.
- ध्यान केंद्रित एक बार, epifluorescence रोशनी मोड के लिए प्रसारण से माइक्रोस्कोप स्विच. प्रकाश स्रोत अब (इस स्लाइड और उद्देश्य लेंस के बीच की जगह को देख कर नेत्रहीन पुष्टि की जा सकती है) उद्देश्य लेंस से सीधे आ जाना चाहिए.
- अवलोकन प्रकाश पथ में प्रकाश स्रोत और एक लाल उत्सर्जन फिल्टर में एक हरे रंग की उत्तेजना फिल्टर डालें; दाग कोशिकाओं के प्रतिदीप्ति अब ऐपिस के माध्यम से सीधे दिखाई जानी चाहिए.
- घुड़सवार कैमरे के लिए ऐपिस से माइक्रोस्कोप अवलोकन मोड स्विच और fluorescing कोशिकाओं की एक छवि पर कब्जा करने के लिए देखने सॉफ्टवेयर का उपयोग करें. कैमरे की संवेदनशीलता पर निर्भर करता है, नमूना शुरू में (पूर्वावलोकन विंडो में प्रकट नहीं हो सकता स्क्रीन यानी होगा) काला हो; इस उपाय, कोशिकाओं दिखाई दे रहे हैं, जहां एक स्तर के लिए जोखिम समय और कैमरे के लाभ को समायोजित. विशिष्ट सेटिंग्स के साधन, उपकरण, और सेल प्रकार के साथ अलग अलग होंगे.
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Representative Results
नील लाल रंग के साथ दाग प्रतिनिधि काई कोशिकाओं चित्र 1 में चित्रित कर रहे हैं. पार्ट्स एक और ए के चित्रा 1 प्रदर्शन छवियों के बी protothecoides बहुत कम intracellular लिपिड संचय के लिए अग्रणी, अतिरिक्त नाइट्रोजन में उगाई. ए के कुछ हिस्सों सी और डी, नमूनों में नाइट्रोजन सीमा के अधीन हो protothecoides दिखाए जाते हैं. प्रसारण रोशनी के तहत, सेल के लिपिड निकायों वे चमकदार परिपत्र संरचनाओं के रूप में दिखाई देते हैं और सेल की मात्रा के बहुमत का गठन जहां चित्रा 1C, के सावधान निरीक्षण के साथ देखे जा सकते हैं. अतिरिक्त नाइट्रोजन में बड़े हो रहे थे जो चित्रा 1 ए में दिखाया कोशिकाओं, सूखी वजन से केवल 5% तेल रहे हैं और लिपिड शरीर के महत्वपूर्ण स्तर को नियंत्रित नहीं है.
उचित प्रकाश परिस्थितियों में दिखाया गया है, इन नमूनों में मतभेद बढ़ाया जाता है. तेल दुबला कोशिकाओंतेल समृद्ध कोशिकाओं वे लिपिड निकायों (चित्रा -1) जमा किया है, जहां एक उज्ज्वल नारंगी लाल चमक को प्रदर्शित करते हुए अंधेरे निकायों (चित्रा 1 बी) के साथ फ्लोरोसेंट के छल्ले के रूप में दिखाई देते हैं. चित्रा -1 में, यह कोशिका झिल्ली और अन्य सेल संरचनाओं के बेहोश प्रतिदीप्ति को देखने के लिए और अधिक कठिन है. नील लाल गैर ध्रुवीय प्रोटीन की उपस्थिति के साथ ही कोशिका झिल्ली और अन्य सेलुलर संरचनाओं स्पेक्ट्रोफोटोमीटर माप दौरान प्रतिदीप्ति की एक पृष्ठभूमि स्तर प्रदान यही वजह है कि लिपिड, में प्रतिदीप्ति जाएगा.
परख के अनुकूलित की शर्तों के तहत, 0.980 से अधिक 2 मूल्यों अधिक अनुसंधान के साथ अंशांकन घटता (2A चित्रा) में आसानी से प्राप्त कर रहे हैं. कोशिकाओं को एक वाहक इथेनॉल जैसे विलायक कमी एक समाधान में दाग रहे हैं, तो सेल तेल की मात्रा और प्रतिदीप्ति के बीच संबंध गैर रेखीय हो जाता है. एक अनुसंधान 0.395 के 2 के साथ चित्रा 2B में प्रस्तुत डाटा, थे 60; एक 0% इथेनॉल समाधान (शुद्ध विआयनीकृत पानी) में प्रोटोकॉल के बाहर ले जाने के द्वारा प्राप्त की.
चित्रा 1. ए की छवियाँ नील लाल के साथ दाग protothecoides. एक तेल दुबला नमूना (सूखा वजन से 4.4% तेल सामग्री)) ए के तहत दिखाया प्रकाश माइक्रोस्कोपी प्रेषित और हरे रंग उत्तेजना फिल्टर (510 एनएम) के साथ बी) epifluorescence रोशनी है. नील लाल के साथ दाग लिपिड निकायों 604 एनएम प्रतिदीप्ति. एक तेल समृद्ध नमूना (सूखा वजन से 54.7% तेल सामग्री) क्रमश: एक ही प्रेषित और epifluorescence प्रकाश के रूप में की स्थिति) और बी) के तहत सी) और डी) में दिखाया गया है.एन.के. "> बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें.
ए के तेल सामग्री correlating चित्रा 2. अंशांकन वक्र protothecoides तीव्रता प्रतिदीप्ति. ए में), नमूने वर्णित प्रोटोकॉल के अनुसार तैयार की गई. बी) में, नमूने एक 0% इथेनॉल समाधान (विआयनीकृत पानी) में तैयार किए गए. कार्यक्षेत्र त्रुटि सलाखों स्पेक्ट्रोफोटोमीटर में पांच replicates के मानक विचलन का प्रतिनिधित्व करते हैं. क्षैतिज त्रुटि सलाखों तटस्थ लिपिड gravimetric मात्रा का ठहराव से कम से कम तीन प्रतिकृति के मानक विचलन की रिपोर्ट. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें.
| रासायनिक | कंपनी | एकाग्रता |
| के.एच. 2 पीओ 4 | फिशर साइंटिफिक | 2.8 छ · एल -1 |
| कश्मीर 2 4 HPO | फिशर साइंटिफिक | 1.2 छ · एल -1 |
| 4 MgSO · 7 2 हे | फिशर साइंटिफिक | 1.2 छ · एल -1 |
| FeSO 4 · 7 2 हे | फिशर साइंटिफिक </ P> | 48 मिलीग्राम · एल -1 |
| एच 3 बो 3 | फिशर साइंटिफिक | 11.6 मिलीग्राम · एल -1 |
| 2 CaCl · 2H 2 हे | फिशर साइंटिफिक | 10 मिलीग्राम · एल -1 |
| 2 MnCl · 4H 2 हे | फिशर साइंटिफिक | 7.2 छ · एल -1 |
| ZnSO 4 · 7 2 हे | फिशर साइंटिफिक | 0.88 मिलीग्राम · एल -1 |
| CuSO 4 · 5H 2 हे | वित्तीय संस्थाओंउसके वैज्ञानिक | 0.32 मिलीग्राम · एल -1 |
| ना 2 4 Moo · 4H 2 हे | फिशर साइंटिफिक | 0.12 माइक्रोग्राम · एल -1 |
| thiamine हाइड्रोक्लोराइड | फिशर साइंटिफिक | 40 माइक्रोग्राम · एल -1 |
| ग्लूकोज | फिशर साइंटिफिक | 30 ग्राम · एल -1 |
| ग्लाइसिन | फिशर साइंटिफिक | 0.2-2.0 छ · एल -1 |
तालिका 1. संस्कृति मीडिया नुस्खा. सभी अभिकर्मकों विश्लेषणात्मक ग्रेड के थे.समाधान विआयनीकृत पानी का उपयोग कर तैयार कर रहे थे. ग्लाइसिन एकाग्रता संस्कृति में नाइट्रोजन अनुपात करने के लिए कार्बन को नियंत्रित करने और शैवाल के फलस्वरूप, अंतिम तेल सामग्री के लिए इस्तेमाल किया गया था. 8.5% से जन (शुष्क आधार) द्वारा 55% तटस्थ लिपिड सामग्री को लेकर प्रकोष्ठों मानक वक्र बनाने के लिए इस्तेमाल किया गया.
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Discussion
मानक वक्र में इस्तेमाल शैवाल उन मापा जा रहा है के रूप में एक ही प्रयोगात्मक शर्तों के तहत खेती की एक ही प्रजाति होना चाहिए. मीडिया रचना, खेती तकनीक, और धुंधला प्रोटोकॉल में महत्वपूर्ण परिवर्तन प्रतिदीप्ति पढ़ने की तीव्रता को प्रभावित कर सकते हैं. (वर्गों 1 और 2 में वर्णित) हेक्सेन निष्कर्षण मानक वक्र में इस्तेमाल नमूनों की तटस्थ लिपिड सामग्री निर्धारित किया गया था. सही प्रतिदीप्ति तीव्रता माप के लिए, सभी के नमूने एक ही बायोमास एकाग्रता (5 ग्राम / एल इस अध्ययन में इस्तेमाल किया गया था) पर विश्लेषण किया जाना चाहिए. तेल सामग्री तो आसानी से मानक वक्र की तुलना द्वारा निर्धारित किया जा सकता है. इस प्रोटोकॉल के लिए, शैवाल नाइट्रोजन स्रोत (0.2-2.0 ग्राम / एल) के रूप में कार्बन स्रोत (30 जी / एल) और ग्लाइसिन के रूप में ग्लूकोज के साथ परपोषी शर्तों (28 डिग्री सेल्सियस, 100 आरपीएम) के तहत हिला बोतल में खेती की जाती थी. एक विस्तृत मीडिया नुस्खा के लिए, 1 टेबल देखें.
बाहर ले जाने में एक महत्वपूर्ण विचारप्रोटोकॉल मानक वक्र तैयारी जब गीला algal बायोमास सुखाने के लिए स्थितियां है. 45 डिग्री सेल्सियस पर एक निर्वात ओवन की सिफारिश की है. 45-50 डिग्री सेल्सियस पर एक पारंपरिक ओवन भी इतने लंबे समय के अतिरिक्त समय पूरी तरह से नमूने (24-48 घंटे) सूखे की अनुमति दी है के रूप में पर्याप्त होगा. 50 डिग्री सेल्सियस से ऊपर तापमान बायोमास एक साथ फ्यूज या आसानी से फॉस्फेट बफर में resuspend नहीं है कि एक अभेद्य परत फार्म का कारण हो सकता है. मेजबान एक homogenizer के उपयोग के साथ सहायता प्राप्त की जा सकती है. ये आम तौर पर प्रतिदीप्ति पढ़ने प्रभाव के रूप में इस तरह के surfactants या एक मजबूत आधार के रूप में रासायनिक additives से बचा जाना चाहिए. सूखे संस्कृतियों महत्वपूर्ण लिपिड गिरावट का सामना कर के बिना एक मोहरबंद कंटेनर में अप करने के लिए 6 महीनों के लिए भंडारित किया जा सकता है. लाइव काई संस्कृतियों पर प्रदर्शन माप अक्सर मैलापन अंशांकन वक्र की शुद्धता पर निर्भर करता है उनके साथ जुड़े बड़े त्रुटि होगा कि ध्यान दें.
दूसरा विचार यह samp चलाने के लिए इस्तेमाल इथेनॉल एकाग्रता हैसूक्ष्म प्लेट रीडर में लेस. इथेनॉल सेल में नील लाल अणुओं के परिवहन की सुविधा, एक वाहक विलायक के रूप में कार्य करता है. कम मात्रा में (<30%) तेल की मात्रा और प्रतिदीप्ति के बीच संबंधों के कारण कोशिका झिल्ली (चित्रा 2B) के पार गरीब प्रसार करने के लिए गैर रेखीय हो जाता है. उच्च इथेनॉल सांद्रता में, सुधार linearity प्रतिदीप्ति तीव्रता (2A चित्रा) की कमी हुई. Auxenochlorella protothecoides के लिए, Chlorella vulgaris, Scenedesmus dimorphus, और Scenedesmus obliquus, 30% की एक इथेनॉल एकाग्रता इष्टतम व्यापार बंद दे पाया था की कीमत पर प्राप्त किया जाता है linearity सुधार हुआ है और प्रतिदीप्ति तीव्रता 11 की कमी हुई के बीच. यह अन्य जीवों के लिए परिणामों का अनुकूलन करने के लिए इथेनॉल एकाग्रता को समायोजित करने के लिए आवश्यक हो सकता है.
काई के नमूनों में प्रतिदीप्ति पढ़ने के लिए उचित उत्तेजना और उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य का चयन ensu करने के लिए महत्वपूर्ण हैकेवल तटस्थ लिपिड माप में शामिल किए गए हैं फिर से. नील लाल प्रतिदीप्ति तीव्रता पर्यावरण 11,13 के polarity पर निर्भर तरंग दैर्ध्य अलग अलग होंगे. ए के लिए protothecoides, तटस्थ लिपिड के लिए उत्सर्जन शिखर 590 एनएम पर मनाया जाता है; अधिक ध्रुवीय लिपिड का प्रतिनिधित्व एक माध्यमिक शिखर 645 एनएम 11 पर देखा जा सकता है. नतीजतन, इस प्रक्रिया में उल्लिखित प्रतिदीप्ति तीव्रता माप आधा बैंडविड्थ = 10 एनएम के साथ, आधा बैंड चौड़ाई = 10 एनएम, और एक 604 एनएम उत्सर्जन फिल्टर के साथ, एक 530 एनएम उत्तेजना फिल्टर का उपयोग कर प्रदर्शन किया गया. उत्तेजना और उत्सर्जन तरंगदैर्ध्य के विकल्प का परीक्षण हर काई के तनाव के लिए सत्यापित किया जाना चाहिए.
नील लाल किसी भी गैर ध्रुवीय वातावरण में प्रतिदीप्ति जाएगा, लिपिड निकायों के अलावा सेल संरचनाओं (चित्रा 1 बी देखें) स्पेक्ट्रोफोटोमीटर द्वारा पता लगाया जाएगा. इस तथ्य को, सेल बायोमास के निहित विविधता के साथ संयोजन में, के बीच एक गैर रेखीय रिश्ता करने के लिए सुरागसेल बायोमास और प्रतिदीप्ति 11. यह समस्या सभी नमूनों एक निरंतर सूखी वजन (5 ग्राम / एल की सिफारिश) पर तैयार कर रहे हैं सुनिश्चित करने के द्वारा हल है. पतला सांद्रता में संकेत बेहोश हो जाता है और उसके रुझान भेद करना मुश्किल है. इसके अतिरिक्त, प्रतिदीप्ति संकेत की वजह से मीडिया में सेल करने वाली सेल विविधताओं और कण निलंबन के लिए शोर हो सकते हैं. नतीजतन, प्रत्येक नमूने के 5 replicates विश्वसनीय परिणाम 11 के लिए सिफारिश कर रहे हैं.
कुछ प्रोटोकॉल ऐसे माप 10,20,21 जांचना triolein के रूप में एक तेल मानक का उपयोग करें. इस तकनीक ऐसी बैरीलेिरफेिशए और Dinophyceae के रूप में शैवाल की कुछ प्रजातियों के लिए सफलता के साथ सूचित किया गया है, यह कारण कोशिका झिल्ली भर में प्रसार सीमाओं को ऐसे Chlorella के रूप में मोटी दीवारों शैवाल के लिए कम उपयुक्त है. इसके अलावा, triolein के अलावा मानक और लिपिड निकायों, अग्रणी टी के बीच नील लाल अणुओं का वितरण खलल पड़ सकता हैतेल सामग्री की ओ गलत अनुमानों. मानकों के रूप में जाना जाता है तेल की मात्रा का काई के नमूनों का प्रयोग इन संभावित खामियों से बचा जाता है और बायोमास और विकास की स्थिति की वजह से किसी भी पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति के लिए खातों.
इस अध्ययन में प्रस्तुत प्रोटोकॉल काई के नमूनों में तटस्थ लिपिड बढ़ाता का एक सरल, सस्ता और तेजी से विधि प्रदान करता है. एक बहु - अच्छी तरह से थाली का उपयोग करके, उच्च नमूना throughputs अन्य धुंधला प्रोटोकॉल पर महत्वपूर्ण समय की बचत के साथ प्राप्त कर रहे हैं. इसके अलावा, परख की शर्तों प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य रेखीय रुझान उपज के लिए अनुकूलित किया गया है.
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Disclosures
लेखकों वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है कि घोषित.
Acknowledgments
लेखकों के लिए इस परियोजना के लिए वित्तीय सहायता प्रदान करने के लिए प्राकृतिक विज्ञान और कनाडा के इंजीनियरिंग रिसर्च काउंसिल को धन्यवाद देना चाहूंगा.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dry Weight | |||
| 25 ml disposable pipettes | Fisher | 13-676-10K | |
| Pipette Bulb | Fisher | 13-681-51 | |
| 40 ml Nalgene Teflon Centrifuge Tubes | Fisher | 05-562-16A | Teflon needed for hexane |
| Weigh Dishes (polypropylene) | Fisher | 2-202B | |
| 1.5 ml microcentrifuge tubes | Fisher | 05-408-129 | |
| Centrifuge | Sorvall | RC6plus | |
| Drying Oven (Fisher 625D) | Fisher | 13-254-2 | |
| Storage vials | Fisher | 0337-4 | |
| Bench-top microcentrifuge (Eppendorf 5415D) | Fisher | 05-40-100 | |
| Gravimetric Quantification | |||
| Porcelain Mortar (Coorstek) | Fisher | 12-961A | |
| Porcelain Pestle (Coorstek) | Fisher | 12-961-5A | |
| 40 ml Centrifugation tubes (FEP) | Fisher | 05-562-16A | Could also use glass tubes |
| Pasteur glass pipettes | Fisher | 13-678-20C | |
| Aluminum weigh dishes | Fisher | 08-732-101 | |
| Hexanes | Fisher | H292-4 | |
| Fluorometric quantification of oil content | |||
| Fluorescence multi-well plate reader | Thermo Lab Systems | Fluoroskan Ascent | |
| Fluorescence reader software | Thermo Lab Systems | Ascent Software 2.6 | |
| COSTAR 96 well plate with round bottom | Fisher | 06-443-2 | |
| Nile Red | Sigma | N3013-100MG | |
| Ethanol (alcohol reagent grade) | Fisher | AC65109-0020 | |
| Imaging Fluorescent cells | |||
| Leica DMRXA2 (or equivalent) microscope | Leica | DMRXA2 | |
| Microscope slides | Fisher | 12-550-15 | |
| Microscope cover slips | Fisher | 12-541B | |
| Camera | Qimaging | Retiga Ex | |
| Imaging software | Qimaging | QCapture v.1.1.8 |
References
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