Summary
En simpel protokol til at bestemme det neutrale lipid indholdet af algeceller hjælp af en nilrødt farvning fremgangsmåde er beskrevet. Denne tidsbesparende teknik giver et alternativ til traditionelle gravimetriske-baserede lipid kvantificering protokoller. Det har været designet til den konkrete anvendelse af overvågning bioproces ydeevne.
Abstract
Alger betragtes fremragende kandidater til brændstof kilder vedvarende på grund af deres naturlige lipid opbevaring kapaciteter. Tæt overvågning af alge gæringsprocesser og screening for nye olierige stammer kræver en hurtig og pålidelig protokol til bestemmelse af intracellulær lipidindhold. Den nuværende praksis store træk er afhængige gravimetriske metoder til at bestemme indholdet af olie, udviklet teknikker årtier siden, der er tidskrævende og kræver store prøvevolumener. I dette papir, er Nile Red, et fluorescerende farvestof, der er blevet brugt til at identificere tilstedeværelsen af lipidlegemerne i mange typer organismer, indarbejdes i en enkel, hurtig og pålidelig protokol til måling af det neutrale lipid indhold Auxenochlorella protothecoides, en grøn alge. Fremgangsmåden anvender ethanol, et relativt mildt opløsningsmiddel til permeabiliserer cellemembranen før farvning og en 96-brønds mikro-plade for at øge prøve kapacitet under fluorescensintensitet målinger. Det har været designed med den konkrete anvendelse af overvågning bioproces ydeevne. Tidligere tørrede prøver og levende prøver fra en voksende kultur kan anvendes i assayet.
Introduction
På grund af deres evne til at lagre lipidlegemerne under visse stress betingelser, har alger fået stor opmærksomhed i de seneste år som en potentiel vedvarende brændstof kilde 1,2. Neutrale lipider kan tegne sig for over 60% af cellens tørvægt under passende betingelser 3 vækst. Alligevel industrien ikke har en enkel, ren, hurtig og pålidelig standardiseret protokol for at kvantificere lipid indholdet af algeceller med henblik på korrekt overvåge bioproces ydeevne, analysere kulturer, og skærm til nye stammer.
Bligh-Dyer gravimetriske metode udviklet omkring 50 år siden, er stadig blandt de mest almindelige teknikker, der anvendes i dag 4,5. Mens denne procedure er enkel, pålidelig og let at udføre, er det tidskrævende, kræver store prøvemængder, og gør brug af giftige opløsningsmidler. Det er ikke praktisk til at analysere mange prøver fra en fermenteringen eller screening for nye olierige stammer. Andre metoder har bEen udviklet, men kræver normalt avanceret udstyr og er ikke blevet standardiseret 6.
Et alternativ, der har vundet en stor interesse er Nilen rød plet. Nilrødt, et farvestof, der fluorescerer fortrinsvis i ikke-polære miljøer, er blevet anvendt til at identificere eller kvantificere lipidlegemerne i forskellige organismer, herunder nematoder 7, gær 8, bakterier 9 og alger 10-19. Indledende teknikker involverer nilrødt var for det meste kvalitativ eller semi-kvantitativ, der kombinerer pletten med single-kuvette spektrofotometri eller flowcytometri. Desuden er nogle klasser af alger såsom grønalger har tykke celle brønde, der er for det meste uigennemtrængelige for farvestoffet, som begrænsede rækkevidde af teknikken 10..
Nylige forbedringer af nilrødt farvningsmetode er blevet rapporteret, at omgå de oprindelige mangler i protokollen 10,11. Farvning af cellerne i nærvær af en Carrier opløsningsmiddel, såsom DMSO 10 eller ethanol 10,11 lineariserer forholdet mellem olieindhold og absorbans, der giver mulighed for pålidelige kvantitative målinger. Opløsningsmidlet hjælper permeabiliserer cellemembranen, således at Nile Red molekyler kan passere igennem. Derudover inkorporerer et spektrofotometer med mikro-plade læsning kapaciteter giver høj throughput protokoller egnet til kvantitativ analyse.
I denne artikel vil vi detalje en enkel metode til at måle indholdet af algeceller olie ved farvning kulturer med nilrødt i tilstedeværelse af ethanol, en mild solvent. For at mest præcist redegøre for baggrundsstøj i målingerne, er en standardkurve korrelere fluorescens intensitet til olieindhold udviklet ved hjælp algeceller af kendte olie sammensætning. Metoden er tilpasset fra tidligere publicerede protokoller 10,11. Ved hjælp af en 96-brønds spektrofotometer, man er i stand til at analysere den samme mængde af prøver i en time that ville tage dage at overvåge af gravimetriske metoder. Desuden ved at kalibrere ved hjælp af repræsentative prøver af den ønskede algearter denne metode producerer relativt præcise målinger, der er direkte fortolkelige. Der findes mange protokoller skitserer metoder til farvning alger med Nile Red optimeret til forskellige stammer og applikationer; protokollen præsenteres her blev oprindeligt udviklet af de la Hoz Siegler et al. 11 for Auxenochlorella protothecoides, Chlorella vulgaris, Scenedesmus dimorphus og Scenedesmus obliquus, selvom det er sandsynligt velegnet til mange flere arter og klasser. Det er blevet designet med den konkrete anvendelse af overvågnings bioproces ydeevne, og det virker lige så godt for tidligere tørrede prøver og våde prøver fra en voksende kultur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1.. Isolering af Dry algebiomasse skal bruges som standarder for Fluorescensaflæsninger
- Fjern en prøvemængde fra den voksende algekulturen der vil give mindst 200 mg tør biomasse, 400-600 mg er at foretrække.
- Centrifugeres prøven ved 4 ° C i 10 minutter ved 10.000 x g. Supernatanten fjernes, og vaske pelleten med et tilsvarende volumen phosphatpuffer formuleret til den samme pH-værdi som vækstmediet.
- Gentag trin 1.2 for i alt 3 vaske trin.
- Re-suspendere pellet i deioniseret vand, og overfør til en forud vejet vejer fad. Lad tørre ved 50 ° C i 48 timer. BEMÆRK: Tørring under vakuum vil falde tørretid og tørring kulturen ved temperaturer over 50 ° C kan gøre resuspension vanskelig.
- Store tørret algekulturer ved stuetemperatur til fremtidig brug.
2.. Gravimetrisk Kvantificering af neutrale lipider fra hexanekstraktion (Tilpasset fra Bligh og Dyer 4)
- Måler ca 50 mg tør algemængde i en vejer fad. BEMÆRK: Masse spænder fra 40 til 80 mg kan anvendes uden tab af reproducerbarhed.
- Overfør biomasse i en morter, forvasket med hexan. Hvis det er nødvendigt, vaskes vejes skålen med en lille mængde (1 ml) i hexan ved hjælp af en Pasteur-pipette for helt at overføre biomasse til morteren. BEMÆRK: Hexan er et meget volatilt og giftigt stof. Det skal håndteres i stinkskab med ordentlig beskyttelsesdragt.
- Slibe algebiomasse i 5 min under anvendelse af en pistil. Begynd med blid slibning og gradvist øge intensiteten. Grind biomassen ind i en fin og jævn pasta i 5 min periode. Hvis overskydende hexan anvendes ved overførsel af biomassen mørtel, er det bedst at vente til hexan fordampe inden formaling.
- Der tilsættes nogle ml hexan til morteren og bland den resulterende opslæmning med pistil, indtil den er homogeniseret. Sørg for, at alle celleresterne levet op til væggene i mortjære slået fri og suspenderes i væsken.
- Overfør det hexan-cellemassen blanding til et centrifugerør. BEMÆRK: centrifugeglas skal enten være af glas eller en egnet polymer kompatibel med hexan, såsom Teflon.
- Gentag trin 2.4 og 2.5, indtil al biomassen er blevet overført til centrifugerør (3-5x).
- Centrifugeres prøven ved 4 ° C i 20 minutter ved 10.000 x g.
- Pipette forsigtigt supernatanten i et forvejet metal vejer fad. Opbevar i stinkskab.
- Udfør en 2. hexanekstraktion ved at tilføje 3 ml hexan til pillen og vortex kraftigt i 1 min.
- Gentag trin 2.7 og 2.8. Hvis det er nødvendigt, køres prøverne i 30 minutter i centrifugen under den anden ekstraktion for at sikre alle celleresterne fuldt afregner. Bestem massen af olie udvundet gravimetrisk efter hexan er fordampet helt.
3.. Fluorometric Kvantificering af neutrale lipider Brug nilrødt (som ReportingTED af de la Hoz Siegler et al. 11)
BEMÆRK: Kun 10 pi af en alge suspension på 5 g / L er nødvendig for fluorescens læsning. Generelt isolering af tør algebiomasse fra 1,5 ml af kulturvæsken er mere end tilstrækkeligt. Desuden kan lysintensiteten af lampen i spektrofotometret nedbrydes med tiden. Det anbefales at medtage standarder i hvert forsøg for at sikre, at variationer i instrumentet ikke tilføje unødvendige fejl på målingerne.
- Forbered en Nile Red-opløsning i en koncentration på 10 mg / ml opløst i alkohol reagenskvalitet ethanol. Opbevar denne løsning i mørke ved 4 ° C.
- Der fremstilles en 30% (v / v) ethanol-opløsning i deioniseret vand og opbevares ved 4 ° C.
- Forberede alle alge prøver på samme biomasse koncentration (anbefales 5 g / L), og på samme måde som de standarder, der anvendes i målingen. Gøre dette ved enten suspension præ-tørrede prøver i passende mængdephosphatpuffer (0,6 g / L dibasisk kaliumphosphat, 1,4 g / l monobasisk kaliumphosphat), eller justering af koncentrationen af en voksende algekulturen til 5 g / L med phosphatbuffer efter måling af turbiditet. BEMÆRK: målinger foretaget på levende algekulturer vil ofte have større fejl i forbindelse med dem, afhængigt af præcisionen af uklarhed kalibreringskurve. Resuspendering tørrede prøver kan kræve anvendelse af en homogenisator til fuldt ud at dispergere biomassen.
- For hver prøve, bland 80 pi af 30% ethanol-opløsning, 10 ul af Nile Red-opløsning, og 10 ul af alge suspension i en enkelt brønd i en 96-brønds plade. For at kunne tage højde for variabiliteten af fluorescens måling udføre 5 gentagelser af hver prøve.
- Kør en to point kalibreringskurve med standarder udarbejdet tidligere for at tage højde for dag-til-dag variationer i instrumentet og forberedelse. Forbered standarderne for fluorescens ved hjælp af de same procedure som prøverne. BEMÆRK: Almindeligvis to punkter er tilstrækkelig til rekalibrering af instrumentet, kan tre punkter køres for at kontrollere linearitet.
- Udfør fluorescensmålinger i en multi-brønds plade-læser spektrofotometer. Følgende betingelser viste sig at give de mest konsistente resultater 11:
- Ryst ved 1200 rpm kredsløb 3 mm, til 30 sek.
- Inkuber ved 40 ° C i 10 min.
- Ryst ved 1200 rpm kredsløb 3 mm, til 30 sek.
- Optag fluorescens, excitation ved 530 nm, emission ved 604 nm.
- Konverter fluorescensmålingerne til olieindhold ved hjælp af resultaterne fra de interne standarder.
4.. Fluorescensmikroskopi Teknik
BEMÆRK: farvningsprotokol beskrevet i afsnit 3 er designet til kvantitativ analyse, men det kan også være nyttigt at give visuelle repræsentationer af plet-baserede teknikker til undervisningsbrug og illustrative purposes. At producere billeder af prøven fluorescens en kræver et optisk mikroskop med traditionelle transmissions-og yderligere epifluorescensbelysning kilder. Excitation og emission lysfiltre i 530 nm (grøn) og 604 nm (rød) område henholdsvis er nødvendige for nilrødt pletten samt et mikroskop monteret kamera med tilhørende software. De i denne undersøgelse (figur 1) billeder blev erhvervet ved hjælp af en lys felt mikroskop udstyret med et kamera og Monochrome til RGB konverter enhed. Proceduren til fremstilling af Nile Red fluorescens billeder ved hjælp af disse værktøjer er skitseret nedenfor:
- Forbered en kultur prøve med Nilen rød plet i henhold til § 3 i protokollen. BEMÆRK: en prøve i 5 g / L koncentrationsområde producerer lysbilleder af tilstrækkelig celletæthed uden overbelægning.
- Efter at have afsluttet trin 3.6 i farvningsprotokol, forberede et objektglas af den forarbejdede prøve ifølge standard laboratorie-procedurer.
- Startende med mikroskopet i transmissionsform, indlæse forberedt dias i mikroskop, og finde de celler i den ønskede forstørrelse (billeder, der vises i denne artikel, er erhvervet med 100X målsætning).
- Når fokus, skifte mikroskop fra transmission til epifluorescensbelysning mode. Lyskilden skal nu kommer direkte fra objektivlinsen (dette kan bekræftes visuelt ved at observere rummet mellem objektglasset og objektiv).
- Sæt et grønt excitationsfilter i lyskilden og en rød emission filter i observation lysbanen; fluorescens af de farvede celler skulle nu være direkte synlige gennem okularet.
- Skift mikroskop observation mode fra okularet til det monterede kamera og bruge visning software til at tage et billede af de fluorescerende celler. Afhængigt af følsomheden af kameraet, kan prøven i første omgang ikke vises i preview-vinduet (dvs. skærmenvære sort); at afhjælpe dette, skal du justere eksponeringstid og gevinst på kameraet til et niveau, hvor cellerne er synlige. Specifikke indstillinger vil variere med instrumenter, udstyr og celletyper.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Repræsentative algeceller farvet med Nile Red dye er afbildet i fig. 1. del A og B i figur 1 viser billeder A. protothecoides dyrket i overskydende kvælstof, hvilket fører til meget lave intracellulære lipidakkumulering. I del C og D, prøver af A. protothecoides dyrket under nitrogen begrænsning vises. Under transmission belysning kan lipidlegemerne af cellen visualiseres med omhyggelig inspektion af figur 1C, hvor de vises som skinnende cirkulære strukturer og udgør størstedelen af volumen cellen. De i figur 1A-celler, som blev dyrket i overskydende nitrogen, er kun 5% olie ved tør vægt og ikke indeholder betydelige niveauer af lipidlegemer.
Når vist under de passende lysforhold, er forskellene i disse prøver forstørret. Olie-lean cellervises som fluorescerende ringe med mørke organer (figur 1B), mens de olierige celler vise en lys orange-rødt skær, hvor de har akkumuleret lipidlegemerne (figur 1D). I figur 1D, er det vanskeligere at se svag fluorescens af cellemembranen og andre cellestrukturer. Nilrødt fluorescerer i nærvær af ikke-polære proteiner samt lipider, hvilket er grunden til cellemembranen og andre cellulære strukturer giver et baggrundsniveau af fluorescens under spektrofotometermålinger.
Under de optimerede betingelser for assayet kalibreringskurver med R 2-værdier større end 0.980 er let opnåelige (figur 2A). Forholdet mellem celle olieindhold og fluorescens bliver ikke-lineær, hvis cellerne farvet i en opløsning, der mangler et bærer-opløsningsmiddel, såsom ethanol. De data, der præsenteres i figur 2B, med en R2 på 0,395, var 60, opnået ved at udføre protokollen i et 0% ethanolopløsning (rent deioniseret vand).
Figur 1. Billeder af A. protothecoides farvet med Nile Red. En olie-mager prøve (4,4% olieindhold tørvægt) vises under A) transmitteret lys mikroskopi og B) epifluorescensbelysning med grøn exciteringsfilter (510 nm). De lipidlegemer farvet med Nile Red fluorescerer ved 604 nm. En olie-rige prøve (54,7% olieindhold tørvægt) er vist i C) og D) under samme transmitterede og epifluorescence lysforhold som A) og B), hhv.nk "> Klik her for at se større billede.
Figur 2. Kalibreringskurver korrelere indholdet af A. olie protothecoides fluorescens intensitet. I A), blev prøver fremstillet ifølge den beskrevne protokol. I B), blev prøver fremstillet i en 0% ethanolopløsning (deioniseret vand). Lodrette fejlsøjler repræsenterer standardafvigelsen af fem gentagelser i spektrofotometer. Vandrette fejlsøjler rapporterer standardafvigelsen af mindst tre gentagelser fra den gravimetriske kvantificering af neutrale lipider. Klik her for at se større billede.
| Chemical | Firma | Koncentration |
| KH 2 PO4 | Fisher Scientific | 2,8 g · L -1 |
| K 2 HPO 4 | Fisher Scientific | 1,2 g · L -1 |
| MgSO4 · 7H 2 O | Fisher Scientific | 1,2 g · L -1 |
| FeSO4 · 7H 2 O | Fisher Scientific </ Td> | 48 mg · l -1 |
| H 3 BO 3 | Fisher Scientific | 11.6 mg · l -1 |
| CaCl2 · 2H 2 O | Fisher Scientific | 10 mg · l -1 |
| MnCl2 · 4H 2 O | Fisher Scientific | 7,2 g · L -1 |
| ZnSO4 · 7H 2 O | Fisher Scientific | 0,88 mg · l -1 |
| CuSO4 · 5H 2 O | Fishendes Videnskabelige | 0,32 mg · l -1 |
| Na 2 Moo 4 · 4H 2 O | Fisher Scientific | 0,12 mg · l -1 |
| thiaminhydrochlorid | Fisher Scientific | 40 pg · l -1 |
| glukose | Fisher Scientific | 30 g · L -1 |
| glycin | Fisher Scientific | 0,2-2,0 g · L -1 |
Tabel 1.. Kultur medier opskrift. Alle reagenser var af analytisk kvalitet.Opløsninger blev fremstillet ved anvendelse af deioniseret vand. Koncentrationen af glycin blev anvendt til at styre carbon til nitrogen-forhold i kultur og dermed det endelige indhold af alger olie. Celler, der spænder fra 8,5% til 55% neutralt lipid indhold efter vægt (tør basis) blev anvendt til at gøre standardkurven.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Algerne anvendes i standardkurven skal være den samme, der dyrkes under de samme eksperimentelle betingelser som dem, der måles. Væsentlige ændringer i medier sammensætning, dyrkningsteknik og farvningsprotokol kan påvirke intensiteten af fluorescensen læsning. Hexanekstraktion (beskrevet i afsnit 1 og 2) blev anvendt til at bestemme det neutrale lipid indholdet af prøver, der anvendes i standardkurven. For at opnå præcise fluorescensintensitets målinger skal alle prøver analyseres på samme biomassekoncentration (5 g / L blev anvendt i denne undersøgelse). Olie kan derefter let bestemmes ved sammenligning med standardkurven. Til denne protokol blev alger dyrkes i rystekolber under heterotrofe betingelser (28 ° C, 100 rpm) med glucose som carbonkilde (30 g / l) og glycin som nitrogenkilde (0,2-2,0 g / L). For en detaljeret medier opskrift, se tabel 1.
En vigtig overvejelse i udførelsen afprotokollen er betingelserne for at tørre den våde algebiomasse ved udarbejdelsen af standardkurven. Et vakuum ovn ved 45 ° C anbefales. En konventionel ovn ved 45-50 ° C vil også være tilstrækkeligt, så længe der gives henstand til helt tørre prøverne (24-48 t.). Temperaturer over 50 ° C kan forårsage biomassen til at smelte sammen eller danne et uigennemtrængeligt lag, der ikke let resuspenderes i phosphatpuffer. Opblanding kan blive hjulpet med anvendelse af en homogenisator. Kemiske additiver, såsom overfladeaktive midler eller en stærk base bør undgås, da disse normalt påvirke fluorescensaflæsning. Tørrede kulturer kan opbevares i op til 6 måneder i en forseglet beholder uden at opleve en betydelig lipid nedbrydning. Bemærk, at målinger foretaget på levende algekulturer ofte vil have større fejl i forbindelse med dem, afhængigt af præcisionen af uklarhed kalibreringskurve.
En anden overvejelse er den ethanolkoncentration bruges til at køre stempletles i mikropladelæser. Ethanol virker som et bæreropløsningsmiddel lette transporten af Nile Red-molekyler i cellen. Ved lave koncentrationer (<30%) forholdet mellem olieindhold og fluorescens bliver ikke-lineær på grund af dårlig diffusion over cellemembranen (figur 2B). Ved højere ethanolkoncentrationer, er forbedret linearitet opnås på bekostning af reduceret fluorescensintensitet (figur 2A). Til Auxenochlorella protothecoides blev Chlorella vulgaris, Scenedesmus dimorphus og Scenedesmus obliquus, en ethanol-koncentration på 30% sig at give den optimale afvejning mellem forbedret linearitet og faldt fluorescensintensitet 11. Det kan være nødvendigt at justere ethanolkoncentration for at optimere resultaterne for andre organismer.
At vælge den rigtige excitation og emission bølgelængder til aflæsning af fluorescens i algernes prøver er afgørende for ensure kun neutrale lipider indgår i målingen. Nile Red fluorescensintensitet vil variere ved forskellige bølgelængder, der er afhængige af polariteten af miljøet 11,13. For A. protothecoides er topemission for neutrale lipider observeret ved 590 nm; en sekundær spids, der repræsenterer mere polære lipider kan observeres på 645 nm 11. Derfor blev fluorescensintensitet målinger er beskrevet i denne procedure udføres under anvendelse af et 530 nm excitationsfilter, med halv båndbredde = 10 nm, og en 604 nm emission filter med halv båndbredde = 10 nm. Valg af excitation og emission bølgelængde bør kontrolleres for hver alge testede stamme.
Da nilrødt fluorescerer i nogen ikke-polært miljø, vil cellestrukturer foruden lipidlegemer detekteres af spektrofotometer (se figur 1B). Dette faktum kombineret med den iboende heterogenitet cellebiomasse, fører til en ikke-lineær sammenhæng mellemcellebiomasse og fluorescens 11. Dette problem løses ved at sikre, at alle prøver er fremstillet ved en konstant tørvægt (5 g / L anbefales). Ved fortyndede koncentrationer signalet bliver svag og dens tendenser er svære at skelne. Derudover kan fluorescens-signalet være støjende grundet celle-til-celle variationer og partikler suspensioner i medierne. Derfor er 5 gentagelser af hver prøve anbefales til pålidelige resultater 11.
Nogle protokoller anvender en olie standard som triolein at kalibrere målingen 10,20,21. Selv om denne teknik er blevet rapporteret med succes for visse arter af alger, såsom Bacillariophyceae og Dinophyceae, er det mindre egnet til tykvæggede alger som Chlorella grund diffusionsbegrænsninger tværs af cellemembranen. Endvidere kan tilsætning af triolein forstyrre fordelingen af Nile Red molekyler mellem standard og lipidlegemer, der fører to unøjagtige vurderinger af olieindhold. Brug alge prøver af kendt olieindhold som standarder undgår disse potentielle mangler, og tegner sig for enhver baggrund fluorescens forårsaget af biomasse og vækstbetingelser.
Protokollen præsenteres i denne undersøgelse giver en enkel, billig og hurtig metode til at kvantificere neutrale lipider i alge prøver. Ved hjælp af en multi-brønds plade, er høj prøve gennemløb opnås med betydelige tidsbesparelser i forhold til andre farvningsprotokoller. Desuden har assaybetingelserne blevet optimeret til at give reproducerbare lineære tendenser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Forfatterne vil gerne takke de naturvidenskab og teknik Forskningsråd Canada for at yde finansiel støtte til dette projekt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dry Weight | |||
| 25 ml disposable pipettes | Fisher | 13-676-10K | |
| Pipette Bulb | Fisher | 13-681-51 | |
| 40 ml Nalgene Teflon Centrifuge Tubes | Fisher | 05-562-16A | Teflon needed for hexane |
| Weigh Dishes (polypropylene) | Fisher | 2-202B | |
| 1.5 ml microcentrifuge tubes | Fisher | 05-408-129 | |
| Centrifuge | Sorvall | RC6plus | |
| Drying Oven (Fisher 625D) | Fisher | 13-254-2 | |
| Storage vials | Fisher | 0337-4 | |
| Bench-top microcentrifuge (Eppendorf 5415D) | Fisher | 05-40-100 | |
| Gravimetric Quantification | |||
| Porcelain Mortar (Coorstek) | Fisher | 12-961A | |
| Porcelain Pestle (Coorstek) | Fisher | 12-961-5A | |
| 40 ml Centrifugation tubes (FEP) | Fisher | 05-562-16A | Could also use glass tubes |
| Pasteur glass pipettes | Fisher | 13-678-20C | |
| Aluminum weigh dishes | Fisher | 08-732-101 | |
| Hexanes | Fisher | H292-4 | |
| Fluorometric quantification of oil content | |||
| Fluorescence multi-well plate reader | Thermo Lab Systems | Fluoroskan Ascent | |
| Fluorescence reader software | Thermo Lab Systems | Ascent Software 2.6 | |
| COSTAR 96 well plate with round bottom | Fisher | 06-443-2 | |
| Nile Red | Sigma | N3013-100MG | |
| Ethanol (alcohol reagent grade) | Fisher | AC65109-0020 | |
| Imaging Fluorescent cells | |||
| Leica DMRXA2 (or equivalent) microscope | Leica | DMRXA2 | |
| Microscope slides | Fisher | 12-550-15 | |
| Microscope cover slips | Fisher | 12-541B | |
| Camera | Qimaging | Retiga Ex | |
| Imaging software | Qimaging | QCapture v.1.1.8 |
References
- Chisti, Y. Biodiesel from microalgae. Biotechnol. Adv. 25, 294-306 (2007).
- National Algal Biofuels Technology Roadmap. Energy Efficiency & Renewable Energy. U.S. Department of Energy, Office of Energy Efficiency and Renewable Energy, Biomass Program. , Available from: http://www1.eere.energy.gov/bioenergy/pdfs/algal_biofuels_roadmap.pdf (2010).
- de la Hoz Siegler, H., et al. Optimization of microalgal productivity using an adaptive, non-linear model based strategy. Bioresour. Technol. 104, 537-546 (2012).
- Bligh, E. G., Dyer, W. J. A Rapid method of total lipid extraction and purification. Can. J. Biochem. Physiol. 37, 911-917 (1959).
- Hara, A., Radin, N. S. Lipid extraction of tissues with a low-toxicity solvent. Anal. Biochem. 90, 420-426 (1978).
- Han, Y., et al. Review of methods used for microalgal lipid-content analysis. Energ. Procedia. 12, 944-950 (2011).
- Pino, E. C., et al. Biochemical and high throughput microscopic assessment of fat mass in Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (73), (2013).
- Sitepu, I. R., et al. An improved high-throughput Nile red fluorescence assay for estimating intracellular lipids in a variety of yeast species. J. Microbiol. Meth. 91, 321-328 (2012).
- Izard, J., Limberger, R. J. Rapid screening method for quantitation of bacterial cell lipids from whole cells. J. Microbiol. Meth. 55, 411-418 (2003).
- Chen, W., et al. A high throughput Nile red method for quantitative measurement of neutral lipids in microalgae. J. Microbiol. Meth. 77, 41-47 (2009).
- de la Hoz Siegler, H., et al. Improving the reliability of fluorescence-based neutral lipid content measurements in microalgal cultures. Algal Res. 1, 176-184 (2012).
- de la Jara, A., et al. Flow cytometric determination of lipid content in a marine dinoflagellate, Crypthecodinium cohnii. J. Appl. Phycol. 15, 433-438 (2003).
- Elsey, D., et al. Fluorescent measurement of microalgal neutral lipids. J. Microbiol. Meth. 68, 639-642 (2007).
- Feng, G. -D., et al. Evaluation of FT-IR and Nile Red methods for microalgal lipid characterization and biomass composition determination. Bioresour. Technol. 128, 107-112 (2013).
- Guzmán, H., et al. Estimate by means of flow cytometry of variation in composition of fatty acids from Tetraselmis suecica in response to culture conditions. Aquacult. Int. 18, 189-199 (2010).
- Huang, G. -H., et al. Rapid screening method for lipid production in alga based on Nile red fluorescence. Biomass Bioenerg. 33, 1386-1392 (2009).
- Lee, S., et al. Rapid method for the determination of lipid from the green alga Botryococcus braunii. Biotechnol. Tech. 12, 553-556 (1998).
- Montero, M., et al. Isolation of high-lipid content strains of the marine microalga Tetraselmis suecica for biodiesel production by flow cytometry and single-cell sorting. J. Appl. Phycol. 23, 1053-1057 (2011).
- Vigeolas, H., et al. Isolation and partial characterization of mutants with elevated lipid content in Chlorella sorokiniana and Scenedesmus obliquus. J. Biotechnol. 162, 3-12 (2012).
- Bertozzini, E., et al. Application of the standard addition method for the absolute quantification of neutral lipids in microalgae using Nile red. J. Microbiol. Meth. 87, 17-23 (2011).
- Kou, Z., et al. Fluorescent measurement of lipid content in the model organism Chlamydomonas reinhardtii. J. Appl. Phycol. , 1-9 (2013).
