Abstract
في الدعامات عودة التضيق يقدم من المضاعفات الرئيسية لإجراءات إعادة التوعي القائم على الدعامات المستخدمة على نطاق واسع لإعادة تدفق الدم من خلال قطاعات ضاقت حاد في الشرايين التاجية والطرفية. الدعامات اللف قادرة على إطلاق الانضباطي الجينات مع النشاط المضاد للrestenotic قد يقدم استراتيجية بديلة لاستخدامها في الوقت الحاضر يبلغ حجمه الدعامات المخدرات. من أجل تحقيق الترجمة السريرية، ويجب أن يبلغ حجمه الدعامات الجينات تظهر حركية يمكن التنبؤ بها، يجمد الدعامة الجين إطلاق النواقل والتنبيغ في مواقع محددة من الأوعية الدموية، مع تجنب الاستجابة الالتهابية المفرطة التي ترتبط عادة مع طلاء البوليمر المستخدمة في فخ المادي للناقلات. وتصف هذه الورقة منهجية مفصلة لcoatless الربط ناقلات الجينات الفيروسة الغدانية إلى الدعامات على أساس ملزمة عكسها من الجسيمات الفيروسة الغدانية إلى polyallylamine البايفوسفونيت (PABT) -modified المقاوم للصدأ السطح الصلب عبر المتحللة-linkers عبر (HC). عائلة مناستخدمت bifunctional (amine- وثيول رد الفعل) HC بمتوسط ر 1/2 من استر المائي في سلسلة تتراوح بين 5 و 50 أيام لربط النواقل مع الدعامات. وعادة ما يتم تنفيذ الإجراء ناقلات الشلل في غضون 9 ساعة، ويتكون من عدة خطوات: 1) حضانة العينات المعدنية في محلول مائي من PABT (4 ساعة). 2) deprotection الجماعات ثيول المثبتة في PABT مع تريس (2 carboxyethyl) الفوسفين (20 دقيقة). 3) التوسع في القدرة على رد الفعل ثيول من سطح المعدن عن طريق تفاعل مع العينات polyethyleneimine derivatized مع pyridyldithio (PDT) مجموعات (2 ساعة). 4) تحويل مجموعات PDT إلى التجولات مع dithiothreitol (10 دقيقة). 5) تعديل الفيروسات الغدية مع HC (1 ساعة). 6) تنقية جزيئات الفيروسة الغدانية تعديلها من قبل الحجم استبعاد العمود اللوني (15 دقيقة) و 7) من تجميد الجسيمات ثيول رد الفعل الفيروسة الغدانية على السطح الصلب thiolated (1 ساعة). هذا الأسلوب له تطبيق واسع محتمل خارج الدعامات،من خلال تسهيل الهندسة سطح الأجهزة bioprosthetic لتعزيز توافق مع الحياة من خلال توصيل الجينات بوساطة الركيزة للخلايا تفاعل المواد الأجنبية مزروع.
Introduction
ويعوق فعالية العلاج الجيني كطريقة علاجية بواسطة القدرة استهداف الفقراء من ناقلات العلاج الجيني 1،2. عدم وجود نتائج الاستهداف المناسبة في مستويات فرعية علاجية من التعبير التحوير في الموقع المستهدف ويؤدي إلى نشر واسعة من ناقلات إلى أجهزة غير المستهدفة 3، بما في ذلك المسؤولين عن تصاعد الاستجابات المناعية ضد كل من ناقلات والمنتجات العلاجية المشفرة 4، 5. واحد يعني إمكانية للتعويض عن الاختلاط تنبيغ وتعزيز الاستهداف هو إدخال ناقلات الجينات في الموقع المطلوب في شكل يحول دون نشرها مجانا عبر الدم واللمف. عادة، وتعتمد هذه الجهود على أنظمة تسليم عن طريق الحقن إما محليا تتألف من ناقلات فيروسية أو غير الفيروسية ممزوجة مع الليفين، والكولاجين أو حمض الهيالورونيك هيدروجيل المصفوفات 6-10 القادرة على الحفاظ عابر ناقلات الجينات في موقع الحقن بواسطة entrapping جسديا عشرم في شبكة البوليمرية.
آخر نموذج المقبولة عموما للعلاج بالجينات محلية يستخدم تجميد ناقلات الجينات على سطح الأجهزة التعويضية مزروع 11،12. وتستخدم يزرع الطبية الدائمة (اللف، الشعب الهوائية، الدعامات المسالك البولية والجهاز الهضمي، وأجهزة ضبط نبضات القلب والمفاصل الاصطناعية، تنسجم الجراحية وأمراض النساء، الخ.) سنويا في عشرات الملايين من المرضى 13. في حين فعالة بشكل عام، وهذه الأجهزة عرضة للمضاعفات التي تسيطر عليها كافية الممارسات الطبية الحالية 14-17. زرع الأجهزة التعويضية فرصة فريدة لتكون بمثابة وكيل لمنصات العلاج الموضعي العلاج الجيني. من وجهة نظر الدوائية، اشتقاق سطح يزرع الطبية بجرعات منخفضة نسبيا من إدخال النتائج ناقلات الجينات في تحقيق كل من تركيزات عالية من المحلية ناقلات الجينات على الزرع / واجهة الأنسجة وتباطؤ حركية رغبتهمالقضاء ص من هذا الموقع. نتيجة لإقامة مطولة وتعزيز امتصاص من قبل السكان الخلية المستهدفة، ناقلات تجميد يقلل من انتشار ناقلات الجينات. وبالتالي يتم تقليل التلقيح غير مقصود من الأنسجة غير المستهدفة.
وقد تم تنفيذ الربط سطح ناقلات الجينات على المواد الحيوية القابلة للزرع (وهو ما يسمى أيضا باسم بوساطة الركيزة توصيل الجينات أو المرحلة الصلبة توصيل الجينات) في خلية ثقافة والحيوانية التجارب باستخدام كل محددة (ضد مستضد 18-20، 21،22، أفيدين البيوتين) و23-26 (تهمة، فان دير فال) التفاعلات غير محددة. المرفق التساهمية من ناقلات على سطح الجهاز مزروع وقد اعتبرت سابقا غير وظيفية منذ روابط قوية بشكل مفرط مع السطح تحول دون استيعاب ناقلات بواسطة الخلايا المستهدفة. مؤخرا وقد تبين أن هذا القيد يمكن التغلب عليها من خلال استخدام المتحللة بشكل عفوي عبر رابط تستخدم تيتراتبها بين السطح المعدني معدلة من الدعامات والبروتينات قفيصة من ناقلات الفيروسة الغدانية 27،28. وعلاوة على ذلك، فإن معدل إطلاق النواقل ودوام التعبير التحوير في المختبر وفي الجسم الحي يمكن التضمين مع استخدام المتحللة linkers عبر اظهار حركية مختلفة من التحلل 28.
وتقدم هذه الورقة بروتوكول مفصلة للمرفق التساهمية عكسها من ناقلات الفيروسة الغدانية لتنشيط سطح معدني ويدخل في الإعداد التجريبية مفيدة لدراسة الأحداث التي تلت ذلك التنبيغ في المختبر في العضلات الملساء والخلايا البطانية مثقف والحية في نموذج الفئران من السباتي الدعامات قسطرة .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. إعداد و Cy3 المسمى اتش للتجارب الإصدار
- تعليق 2 × 10 12 جزيئات الإعلان الفارغ (حوالي 2 × 10 11 وحدة المعدية) في 650 ميكرولتر من كربونات / بيكربونات عازلة (مصرف البحرين المركزي، ودرجة الحموضة 9.3).
- حل محتويات القارورة 1 (0.2 ملغ) من رد الفعل، أمين صبغة الفلورسنت (و Cy3 (NHS) 2) في 1 مل مصرف البحرين المركزي لتركيز النهائي من 0.2 ملغ / مل.
- إضافة 100 ميكرولتر من محلول الصبغة لتعليق الفيروس، دوامة لمدة 5 ثانية واحتضان لمدة 1 ساعة عند 28 درجة مئوية مع اهتزاز (100-200 دورة في الدقيقة).
- تتوازن 20 مل سيفاروز 6B العمود مع برنامج تلفزيوني. إضافة 750 ميكرولتر من تعليق و Cy3 المسمى الإعلان قطرة من الحكمة إلى وسط السرير هلام.
- بعد تعليق الفيروسي يتخلل الراتنج، وإضافة 5 مل من برنامج تلفزيوني. تجاهل شطافة.
- إضافة 0.5 مل من برنامج تلفزيوني وجمع شطافة في وعاء زجاجي المسمى. كرر هذه الخطوة جمع ما مجموعه عشرة 0.5 مل الكسور 10X.
- عشر الفحصه جمع الكسور بواسطة القياس الطيفي (260 و 280 نانومتر) لمحتوى الحمض النووي الفيروسي.
- تجميع الكسور التي تحتوي على أكثر من 10٪ من مجموع (مجموع F1 خلال F10) الكثافة الضوئية (OD) في 260 نانومتر. ملاحظة: عادة الكسور F3، F4، F5، F6 ويتم تجميع ومختلطة.
- إعادة فحص الكسور المجمعة مختلطة بواسطة القياس الطيفي (260 و 280 نانومتر) وفحص بواسطة التألق (550 EX / 570 م نانومتر) لمحتوى الحمض النووي الفيروسي وو Cy3 المسمى البروتين قفيصة، على التوالي. ملاحظة: منحنى المعايرة و Cy3 (NHS) 2 تغطي مستعدة مجموعة 10 -9 -10 -13 مول / لتر ويعاير fluorimetrically على نفس لوحة والكسور المجمعة.
- حساب العائد الفيروس المسمى وكثافة العلامات. نفترض أن جسيمات 1.19 × 10 12 فيروس / مل يتوافق مع 1 OD حدة ل1 سم طول المسار 29. استخدام الصيغة: العائد = [(OD 260nm /1.19)*10 12 * مبلغ V / الإدخال الإعلان] * 100، حيث، 260nm OD هو دي البصريnsity من صياغة المجمعة في 260 نانومتر و V هو حجم صياغة المجمعة (مل) لحساب العائد الانتعاش اعلان (٪). استخدام الصيغة: وصفها الكثافة = C * 6.02 * 10 23 / (OD 260nm /1.19)*10 12، حيث C هو تركيز و Cy3 من صياغة المجمعة (الشامات / مل) و260nm OD هو الكثافة البصرية للصياغة في المجمعة 260 نانومتر لحساب متوسط الكثافة و Cy3 العلامات. ملاحظة: انتعاش نموذجية من الفيروس المسمى هو> 70٪ من الجرعة الإدخال. كثافة العلامات هي 600-800 جزيئات fluorophore في جسيمات الفيروس واحد.
- قسامة و Cy3 المسمى الإعلان فارغة إلى أجزاء أصغر (عادة 5 × 10 11 الجسيمات) مناسبة لإطلاق التجارب الفردية. يحدد البروتوكول الحالي استخدام الإعلان و Cy3 المسمى فقط في التجربة الاصدار: ملاحظة. تتم جميع الدراسات التنبيغ خارجا مع نواقل غير المسمى.
2. تفعيل عينات المعادن
- غسل ث المقاوم للصدأالى teel شبكة الأقراص أو الدعامات الفولاذ المقاوم للصدأ على التوالي في الأيزوبروبانول (5 دقائق × 2) وكلوروفورم (5 دقائق × 2) في 55 درجة مئوية مع اهتزاز (100 دورة في الدقيقة). إزالة المذيب.
- تسخين العينات لمدة 30 دقيقة على حرارة 200 درجة مئوية.
- حل polyallylamine البايفوسفونيت مع تثبيت مجموعات ثيول الكامنة (PABT 27،28،30) في الماء (1-2٪ ث / ت) في 72 درجة مئوية مع اهتزاز (100 دورة في الدقيقة). ضبط درجة الحموضة إلى 4.5-5 مع KHCO 3.
- احتضان عينات معدنية في حل PABT لمدة 2-4 ساعة عند 72 درجة مئوية مع اهتزاز (100-200 دورة في الدقيقة). ملاحظة: قد يكون توقف الإجراء في هذه المرحلة. العينات مستقرة لمدة 3 أيام في 4 درجات مئوية.
- شطف العينات ثلاث مرات بالماء المقطر المزدوج (DDW).
- كشف عينات لتريس (2 carboxyethyl) الفوسفين (TCEP، 15 ملغ / مل في 0.1 م العازلة الخليك) لمدة 15 دقيقة عند 28 درجة مئوية مع اهتزاز (100-200 دورة في الدقيقة).
- شطف 5X نزع الغاز في أحواض دبي الجافة العالمية.
- كشف العينات إلى 2٪ polyethyleneimine مع مجموعات pyridyldithio تثبيت (PEI
- شطف العينات ثلاث مرات مع أحواض دبي الجافة العالمية.
- كشف العينات إلى 10 ملغ / مل dithiothreitol / أحواض دبي الجافة العالمية لتحويل مجموعات pyridyldithio إلى التجولات.
- شطف 5X نزع الغاز مرة أخرى في أحواض دبي الجافة العالمية.
3. اتش التنشيط والمعادن الشلل السطحية
- تعليق 5 × 10 11 الجسيمات إما الإعلان EGFP أو الإعلان لوك (حوالي 5 × 10 10 وحدات المعدية) في 487،5-495 ميكرولتر من كربونات / بيكربونات عازلة (مصرف البحرين المركزي، ودرجة الحموضة 9.3). ملاحظة: للحصول على الدراسات الإفراج عنهم، استخدام 5 × 10 11 من الإعلان و Cy3 المسمى جزيئات فارغة (ضبط مستوى الصوت إلى 487،5 حتي 495 ميكرولتر مع مصرف البحرين المركزي).
- حل HC مع اختلاف معدلات التحلل 28 [(بسرعة (ر 1/2 = 5 د)، انتقالية تربط بين (ر 1 /2 = 12 د) وببطء (ر 1/2 = 50 د) HC، أي RHC، IHC أو SHC. الشكل 1] أو غير المتحللة عبر رابط (NHC)، سلفو-LC-SPDP في مصرف البحرين المركزي في 20 ملي.
- على الفور إضافة 5-12.5 ميكرولتر من الحل عبر رابط إلى تعليق فيروس لإجمالي حجم 500 ميكرولتر (200-500 ميكرومتر تركيز النهائي من عبر رابط)، دوامة واحتضان لمدة 1 ساعة عند 28 درجة مئوية مع اهتزاز (100- 200 دورة في الدقيقة).
- تتوازن 20 مل سيفاروز 6B العمود مع نزع الغاز 5 ملي EDTA / PBS (EPBS). إضافة قطرة قطرة 500 ميكرولتر من تعديل عبر رابط، تعليق الإعلان إلى وسط السرير الراتنج.
- إضافة 5 مل من نزع الغاز EPBS. تجاهل شطافة.
- إضافة 0.5 مل من نزع الغاز EPBS وجمع شطافة في وعاء زجاجي المسمى. كرر هذه الخطوة 10 مرات جمع ما مجموعه عشرة كسور 0.5 مل.
- تحديد OD من الكسور جمعها باستخدام القياس الطيفي في 260 و 280 نانومتر، وتحويل OD إلى التتر فيروس (1.19 × 10 12 / مل corresponds إلى 1 OD) 29.
- تجميع الكسور التي تحتوي على> 10٪ من الفيروس مزال (ملاحظة: عادة، والكسور F3-F6). تكرار عيار الفحص الطيفي لتعليق المجمعة.
- نقل تعليق الفيروسي إلى القارورة مع عينات معدنية تنشيط (وفقا لل2.11). احتضان في جو الأرجون لمدة 1 ساعة عند 28 درجة مئوية مع اهتزاز (100-200 دورة في الدقيقة). ملاحظة: يتم استخدام مزيد من عينات المعادن المربوطة الإعلان، والتي تم الحصول عليها في هذه الخطوة في الافراج التنبيغ والتجارب اللاحقة الموصوفة في أقسام بروتوكول 5-7.
4. الكمي للالمرتبط السطحية المتجهات الإعلان بواسطة PCR
- إعداد صيغ تنسجم مع يجمد سطح الإعلان EGFP المربوطة عبر NHC، حالات العسر الشديد، وIHC RHC (ن = 3 لكل نوع) كما هو موضح في الفقرتين 2 و 3.
- استخدام عدة QIAamp DNA مايكرو لعزل الحمض النووي الفيروسي. وضع تنسجم بشكل فردي في أنابيب بلاستيكية 1.5 مل تحتوي على 200 ميكرولتر من خليط مكون من 180 ميكرولتر من ATL بuffer و 20 ميكرولتر من بروتين K (وكلاهما من عدة). إضافة كمية معروفة من الجزيئات الإعلان EGFP (كمعايير لمنحنى المعايرة) في أنابيب منفصلة تحتوي على نفس الخليط. احتضان عند 56 درجة مئوية خلال الليل دون أن تهتز.
- إضافة 200 ميكرولتر من العازلة AL (من المجموعة)، ومزيج من قبل vortexing، إضافة 200 ميكرولتر من الإيثانول بنسبة 100٪، ويحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق.
- نقل خليط من كل أنبوب على عمود فردي MinElite (من مجموعة) وتدور في 8،000 دورة في الدقيقة لمدة 1 دقيقة. شطف الأنابيب التي تحتوي على شبكة مع 180 ميكرولتر من العازلة ALT الطازجة، إضافة إلى الأعمدة منها وتدور في 8،000 دورة في الدقيقة لمدة 1 دقيقة. تجاهل eluates.
- إضافة 500 ميكرولتر من AW1 عازلة (من مجموعة) في الأعمدة وتدور بسرعة 8000 دورة في الدقيقة لمدة 1 دقيقة. تجاهل eluates.
- إضافة 500 ميكرولتر من AW2 عازلة (من مجموعة) في الأعمدة وتدور بسرعة 8000 دورة في الدقيقة لمدة 1 دقيقة.
- تجاهل eluates.
- تدور في 14،000 دورة في الدقيقة لمدة 3 دقائق إضافية أونتيل الأعمدة جافة تماما. تجاهل eluates.
- إضافة 50 ميكرولتر من المياه MilliQ الصف في الأعمدة. تدور في 14،000 دورة في الدقيقة لمدة 5 دقائق. جمع 50 ميكرولتر من شطافة من كل عمود في أنبوب جمع الأفراد (من المجموعة).
- يعد حل PCR ميكس ماجستير من خلال الجمع بين يتكاثر مما يلي (12.5 ميكرولتر من الطاقة الخضراء PCR SYBR ميكس ماجستير، 0.63 ميكرولتر من 10 ميكرومتر EGFP الشعور التمهيدي [5'- ACG TAA ACG دول مجلس التعاون الخليجي ACA AGT TC -3 ']، 0.63 ميكرولتر من 10 ميكرومتر EGFP مكافحة الشعور التمهيدي [5'- AAG TCG TGC TGC TTC ATG TG -3 ']، 6.3 ميكرولتر من المياه MilliQ الصف). مضاعفة هذه الكميات من قبل عدد من ردود الفعل المخطط بما في ذلك الضوابط "لا DNA".
- تحميل 5 ميكرولتر من الإعلان EGFP DNA (من الخطوة 4.8) و 20 ميكرولتر من PCR ميكس ماجستير في الآبار ثلاث نسخ من MicroAmp البصرية لوحة رد فعل 96-جيدا. ختم لوحة مع MicroAmp بصري لاصق السينمائي. تدور لوحة عند 1،000 دورة في الدقيقة لمدة 1 دقيقة لإزالة فقاعات الهواء.
- وضع لوحة في وعاء من محرك 7500 PCR في الوقت الحقيقي. في القائمة الرئيسية لل7500 نظام SDS البرمجيات (V1.4 أو أعلى) حدد "إنشاء تجربة جديدة". انقر على "التالي". في "معالج تجربة جديدة" شاشة اختيار SYBR الأخضر من القائمة التمرير إلى أسفل وانقر على زر "إضافة". انقر على "التالي" للحصول على تخطيط لوحة. تسليط الضوء على جميع الآبار لتحليلها، تحديد SYBR الأخضر. تسليط الضوء على التوالي لم آبار المراقبة الحمض النووي، DNA معايير الإعلان EGFP والمجهولة، ووضع علامة عليها باستخدام التسميات منها من القائمة التمرير إلى أسفل.
- التبديل إلى علامة التبويب الصك. حدد "إضافة مرحلة التفكك"، تغيير حجم جيد من الافتراضي إلى 50 ميكرولتر 25 ميكرولتر. انقر فوق ابدأ.
- تحليل النتائج باستخدام PCR بعد التحقق من ملخص لQC القيم المتطرفة وغيرها من المخالفات.
5. الإصدار حركية المتحللة الصليب المربوطة-رابط المتجهات الجسيمات من نموذج للصدأ شبكة
- غسل العينات شبكة derivatized مع الإعلان و Cy3 المسمى عبر RHC، IHC، SHC وNHC (كما في 3.9) في 1٪ BSA / PBS (1 ساعة × 3) مع اهتزاز (100-200 دورة في الدقيقة).
- باستخدام ملقط غرامة معقمة، ضع تنسجم في الآبار الفردية لوحة 96 جيدا مملوءة مسبقا مع 200 ميكرولتر من شطف العازلة (0.1٪ BSA / 0.1٪ توين 20 / PBS).
- التقاط صور من الفلورسنت جزءا أساسيا من كل شبكة. تسجيل إعدادات المجهر وكاميرا CCD المستخدمة للحصول على الصورة.
- مقايسة لوحة fluorimetrically (550 EX / 570 م) في وضع المسح الضوئي بشكل جيد مع الحد الأقصى. استخدام الآبار تنسجم مع غير derivatized كعنصر تحكم الخلفية.
- احتضان لوحة عند 37 درجة مئوية مع اهتزاز (50 دورة في الدقيقة).
- في أوقات محددة سلفا (1-30 أيام المدى) نضح شطف العازلة دون إزعاج تنسجم وإضافة 200 ميكرولتر من العازلة شطف الطازجة. كرر الخطوات من 4،3-4،5 بعد استبدال المخزن المؤقت.
6. تنبيغ من مثقف سلليرة سورية من قبل شبكة يجمد-المتجهات الإعلان
- غسل EGFP الإعلان - أو -derivatized الإعلان لوك تنسجم ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني العقيمة لمدة 5 دقائق مع اهتزاز (100 دورة في الدقيقة).
- باستخدام ملقط معقم غرامة إزالة الأقراص شبكة واحدة تلو الأخرى وبشكل فردي وضعها في الآبار من 96 لوحة جيدا مع نوع من الخلايا في المصالح في المرحلة سجل النمو.
- احتضان الخلايا لمدة 24 ساعة عند 37 درجة مئوية، في 5٪ CO 2.
- استخدام فحص منها غير محطة نقطة النهاية (المجهر الفلورسنت، لقياس التألق EGFP أو التصوير تلألؤ بيولوجي لوسيفيراز) لتحديد مدى والتوزيع المكاني للتعبير الجينات في الآبار.
- اختياريا، متوسطة البديل لبرنامج تلفزيوني لزيادة حساسية مقايسة التألق (485/535 نانومتر) إذا كان من المتوقع انخفاض التعبير EGFP. ملاحظة: إذا تم تجهيز مقياس التألق مع القدرة على المسح الضوئي بشكل جيد، وقراءة لوحة في وضع المسح الضوئي بشكل جيد لتقييم التوزيع المكاني للخلايا في الآبار، معربا عن EGFP. الصرف PBS لمتوسطة بعد الانتهاء من التألق.
- صورة الخلايا transduced في الآبار تنسجم مع الإعلان EGFP -eluting (سواء الكامنة والبعيدة للشبكة) باستخدام مجموعة فلتر FITC. التقاط صور تمثيلية في 40-200X التكبير. تسجيل الضبط الدقيق للمجهر الفلورسنت وكاميرا CCD المستخدمة لاقتناء الصور.
- إضافة 5 ميكرولتر من الأسهم وسيفيرين في برنامج تلفزيوني (10 ملغ / مل) مباشرة إلى الآبار مع الإعلان لوك -eluting تنسجم إلى تركيز النهائي من 500 ميكروغرام / مل واحتضان عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2 لمدة 10 دقيقة قبل التصوير تلألؤ بيولوجي . نضح وسائل الإعلام واستبدالها مع خالية من وسيفيرين سائل الاعلام بعد التصوير.
- المقايسات نقطة النهاية كرر في أوقات محددة سلفا (تصل إلى 2 أسابيع) لدراسة حركية مراسل التعبير الجيني التالية بوساطة الركيزة نقل الجينات.
7. التحقق من القدرة تنبيغ المحفوظة في النقاط تأخر الوقت
- إعداد الإعلان EGFP ديتنسجم rivatized باستخدام RHC، IHC، SHC وNHC لناقلات الربط (كما في 2،1-2،11 و3،1-3،9) ووضع على حدة تنسجم في الآبار من 96 لوحة جيدا مع 60-80٪ الخلايا البطانية الأورطي الأبقار متكدسة (BAEC ).
- تحليل تنبيغ مثقف BAEC مع شبكة يجمد الإعلان EGFP في 1 و 2 أيام بعد وضع شبكة باستخدام المجهر مضان والتألق (حسب 6،4-6،5).
- 48 ساعة بعد بدء التنبيغ غسل الآبار التي تحتوي على شبكة مع برنامج تلفزيوني مرتين.
- إضافة 200 ميكرولتر من 0.25٪ التربسين / EDTA إلى كل بئر واحتضان لمدة 15 دقيقة عند 37 درجة مئوية مع اهتزاز (100 دورة في الدقيقة). غسل 3X مع برنامج تلفزيوني.
- استخدام المجهر الفلورسنت والتألق للتأكد من إزالة كاملة لجميع خلايا EGFP الايجابية المرتبطة تنسجم.
- passaged البذور الطازجة BAEC في الآبار تنسجم مع صدر جزئيا في 60-80٪ كثافة البذر الأولية (2-2،7 × 10 4 خلايا / جيد).
- احتضان لوحة في CO 37 درجة مئوية و 5٪
8. الدعامة نشر السباتي في نموذج فأر من الدعامات القسطرة يبلغ حجمه الإعلان
- جميع الإجراءات الحيوان الموصوفة في هذا البروتوكول مطابقة للوائح الاتحادية على استخدام الحيوانات المختبرية وتمت الموافقة من قبل IACUC من مستشفى الاطفال في فيلادلفيا. التمسك الظروف جراحية معقمة يتم تعقيم الأوتوكلاف جميع الصكوك. لضمان العقم المستمر يعمل على تعقيم حبة بين استخدام الصكوك في ما يصل إلى خمسة حيوانات متتالية.
- إعداد الإعلان لوك -eluting الدعامات وفقا ل2،1-2،11 و3،1-3،9. تخزين الدعامات derivatized الفيروس في برنامج تلفزيوني العقيمة عند 4 درجة مئوية لمدة لا تزيد عن 24 ساعة قبل استخدامها.
- تخدير الذكور سبراغ داولي الفئران (400-450 ز) مع حقن IP من الكيتامين (100 ملغ / كلغ)، وزيلازين (5 ملغ / كلغ). ديتيرمينى عمق التخدير بواسطة مخلب استجابة قرصة وتوترية العضلات. تطبيق مرهم للعين الطبيب البيطري لمنع جفاف القرنية والصلبة. ملاحظة: استنشاق التخدير مع 4٪ و 2٪ الأيزوفلورين (1 لتر / دقيقة) لإحداث والمحافظة على التخدير، على التوالي، من الممكن ولكن يعوق حرية الوصول إلى منطقة الرقبة من الحيوان وبالتالي لا ينصح للمستخدم عديم الخبرة.
- إعادة تقييم عمق التخدير عن طريق قرصة أخمص قدميه. ويحلق جو معقم و مطهر الإعدادية الرقبة ومنطقة الصدر العلوية. إدارة المضادات الحيوية (سيفازولين و 20 مغ / كغ، IM)، مسكن (ميلوكسيكام؛ 0.5 مغ / كغ، SC) والمالحة (10 مل / كغ، SC). يقثطر الوريد الذيل مع G قسطرة 24 وإدارة الهيبارين (200 وحدة دولية / كغ، IV). ملاحظة: جرعة من 10 ملغ / كغ (IM) انروفلوكساسين (Baytril) يمكن استخدامها بدلا من سيفازولين. تجنب استخدام المضادات الحيوية التي تفتقر إلى النشاط الكبير ضد البكتيريا إيجابية الجرام. يمكن استخدام 10-15 مغ / كغ كاربروفين (Rimadyl) بدلا من ميلوكسيكام بمثابة مسكن وقائية. المسكنات المخدرة (ه.G. والمورفين والبوبرينورفين) ينبغي تجنبها بسبب خصائص الاكتئاب التنفس الخاصة بهم.
- إجراء شق خط الوسط من خلال الجلد والرقبة رباط. استخدام تقنيات تشريح حادة لعزل الأيسر الشريان السباتي الخارجي. التعادل قبالة الشريان السباتي الخارجي في موقع ودود الأكثر القاصي. تطبيق ربطة مؤقت الانزلاق إلى أصل الشريان السباتي الداخلي.
- جعل 2 ملم شق في بضع الشريان الأيسر الشريان السباتي الخارجي.
- ادخال القسطرة فوغارتي 2 الفرنسية في الشريان السباتي المشترك من خلال شق في الشريان السباتي الخارجي. تضخيم غيض من القسطرة بمحلول ملحي وتمرير 3X من قوس الأبهر إلى التشعب السباتي من أجل تعرية البطانة.
- حرك قطعة من الأنبوب (1.04 ملم OD، 0.99 ملم ID) عبر القسطرة فوغارتي وإلى الشريان السباتي المشترك. سحب القسطرة فوغارتي.
- جبل وتجعيد ولوك الإعلان -derivatized الدعامة فوق البالون ل1.5مم قسطرة القسطرة. إدراج الدعامات من خلال أنابيب تفلون وتقدم عليه في منتصف مقطع من الشريان السباتي المشترك. تجنب فرك الدعامة ضد سفينة أو أنبوب الجدار.
- نشر في الدعامة 12 أجهزة الصراف الآلي لمدة 30 ثانية وسحب القسطرة قسطرة.
- التعادل قبالة الشريان السباتي الخارجي الأقرب إلى الموقع بضع الشريان والافراج عن ربطة مؤقت على الشريان السباتي الداخلي.
- إصلاح الجرح المنطوق في طبقات مع تشغيل 4.0 Vicryl خياطة والتيلة الجلد.
- استرداد الحيوان على وسادة الاحترار حتى الإسعافية والعودة إلى قفصه معزولة. في حين لا علامات الألم أو عدم الراحة وعادة ما عرضت من قبل الحيوانات اللاحقة للعمليات الجراحية وراء 12 ساعة الأولى بعد العملية، والنظر في تمديد العلاج ميلوكسيكام (0.5 ملغم / كغم، SC يوميا) لمدة 72 ساعة.
9. ضوء بارد من التصوير الشرياني التعبير الجيني
- في نقطة زمنية محددة سلفا (1 يوم - 3أسابيع المدى) بعد نشر الازاله stent الجينات في الشريان السباتي المشترك، تخدير الفئران باستخدام تخدير استنشاق الأيزوفلورين (2-4٪ الأيزوفلورين في الأكسجين).
- إزالة الدبابيس الجراحية، جو معقم و مطهر إعداد الموقع وإعادة فتح الجرح المنطوق. باستخدام حادة الوصول تشريح، وإعادة كسب لالشريان السباتي المشترك اليسار وفصلها عن العصب المبهم والأنسجة الضامة المجاورة.
- إعداد خليط من 50 ملغ / مل وسيفيرين في برنامج تلفزيوني و 25٪ بلورونيك F-127 في برنامج تلفزيوني (1: 4 ت / ت) وتخزينها على الجليد. ملاحظة: تقدم هذه الصيغة كحل لزج عند 4 درجة مئوية، وعلى الفور تتحول إلى هلام على اتصال مع الأنسجة عند 37 درجة مئوية.
- تطبيق 200 ميكرولتر من المبرد وسيفيرين / خليط بلورونيك مباشرة إلى الجزء الظاهر من الشريان السباتي المشترك وتحقق هلام صلابة.
- وضع الحيوان في موقف ضعيف في غرفة التصوير لجهاز IVIS الطيف والحفاظ على التخدير الأيزوفلورين مع قناع الوجه.
- في acquisitiالسيطرة على نافذة لوحة (الحياة صورة، الإصدار 4.2 أو أعلى) اختيار موقف "B" (6.6 سم الكاميرا الاعتراض بعد) وbinning عامل "المتوسطة" من القوائم المنسدلة بعنوان "مجال الرؤية" و "binning"، على التوالي. اكتب في "2.5 سم" في مربع الارتفاع الموضوع. اختيار "دقيقة" كوحدة من الوقت في مربع "زمن التعرض"، واختيار قيمة عددية "2".
- ثلاث دقائق بعد تطبيق وسيفيرين / هلام بلورونيك، بدء الحصول على الصور من خلال النقر على الزر "الحصول" على الشاشة. ملاحظة: صورة اكتساب الوقت يمكن أن تختلف 1-6 دقيقة اعتمادا على قوة الإشارة المتوقعة.
- بعد الحصول على الصورة، وغسل هلام قبالة مع المياه المالحة وربت الفضاء المحيط بالشرايين مع معقمة الشاش والقطن تطبيقها.
- إغلاق الجرح مع Vicryl خياطة وغذائيا رئيسيا الجلد.
- استرداد الحيوانية والعودة إلى قفصه. تكرار التصوير في وقت لاحق رنقاط IME لدراسة دوام التعبير الشرايين الناجمة عن ناقلات الإعلان، وثبتوا الدعامات.
- بدلا من ذلك، نفذ التصوير بعد إدارة النظامية من وسيفيرين. تخدير الحيوان والإعدادية وفقا 9،1-9،2. يقثطر الوريد الذيل مع G القسطرة والقسطرة 24 آمنة مع الشريط الجراحية.
- يعد حل من وسيفيرين في برنامج تلفزيوني (50 ملغ / مل) وحقن 1 مل من محلول عن طريق القسطرة على مدى فترة 10 ثانية. واحدة دقيقة بعد حقن بدء الحصول على الصور كما في 9،7-9،8. ملاحظة: معدل الحقن أسرع (<10 ثانية) يمكن أن يثير النشاط الحجز وتوقف التنفس. يجب أن يتم التخلص من الحيوان لو المضبوطات أو توقف التنفس تحدث أثناء التصوير.
- اتبع الخطوة 9.10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
تجارب ناقلات الإصدار
الربط ناقلات الفيروسة الغدانية على سطح يزرع، بما في ذلك أجهزة التدخلية مثل الدعامات اللف، الذي يقارب متجه إلى موقع المرض، وتفادي جزئيا عدم وجود الاستهداف الجسدي النواقل. ومع ذلك، لتكون قادرة على تحقيق الآثار العلاجية عبر تنبيغ الأنسجة المستهدفة، ويجب أن يتم الافراج عن ناقلات من السطح (الشكل 2). وقد افترض استخدام المتحللة linkers عبر السماح 1) المرفق الفعال للناقلات لتعديل polybisphosphonate، يزرع المعدنية المثبتة ثيول و2) إطلاق سراح متواصلة بوساطة التحلل المائي للرابط الصليب.
يتم تحديد عدد النسخ الجينية من الإعلان EGFP ناقلات المرتبطة أقراص شبكة بنهاية الإجراء اشتقاق بواسطة PCR من الحمض النووي الفيروسي مع الاشعال EGFP محددة (الشكل 3). تبعا لمعين عبر رابط تستخدم، ومقدار متجه الإعلان المربوطة يجب أن تختلف بين 3.5 × 10 9 و 5.7 × 10 9 الجسيمات / شبكة. هذا المبلغ هو في المراسلات العادلة مع القدرة القصوى المقدرة (2.5 × 10 9) من قرص شبكة واحدة مع مساحة إجمالية قدرها 0.25 سم 2 لاستيعاب جزيئات الإعلان 100 نانومتر في ترتيب أحادي الطبقة. لأن كمية بدءا من ناقلات الإعلان في خطوة من التعديل عبر رابط هو 5 × 10 11 الجسيمات، ويجمد في نهاية المطاف فقط ~ 1٪ من ناقلات تعديل على PABT / PEI PDT -derivatized المقاوم للصدأ السطح الصلب.
كلا من المتوقع أن تؤثر على حركية الشاملة للإعلان الإفراج متجه من سطح معدل في سلسلة استر التحلل وعدد من الروابط بين ناقلات وبيولوجية.
لتسهيل الافراج عن التجارب، والجسيمات الفيروسة الغدانية يمكن قبل المسمى مع fluorophore و Cy3 (البروتوكول؛ القسم 1) قبل عبر رابط modificaنشوئها والشلل السطحية (البروتوكول؛ القسم 3). انخفاض مضان المرتبط السطح مع مرور الوقت تقييمها بشكل متزامن من قبل التألق (الشكل 4A) والمجهري مضان (الشكل 4B) ويمكن بعد ذلك أن تستخدم الطريقة غير المباشرة لرصد الإفراج عن ناقلات في عازلة الفسيولوجية. يجب ناقلات الإعلان المرفقة من خلال RHC وIHC الروابط تظهر إطلاق أسرع بشكل ملحوظ بالمقارنة مع SHC- ونظيراتها NHC المرفقة. في المثال المذكور، لوحظ وجود 45٪ وخسارة 39٪ من ناقلات المرتبطة السطح مع RHC وIHC-المربوطة ناقلات بعد يوم 30، على التوالي، في حين لوحظ أقل من 20٪ من ناقلات المربوطة أن يطلق سراحه في حالات العسر الشديد وNHC عينات -immobilized (الشكل 4A).
بالإضافة إلى ذلك، ناقلات الإعلان يجمد باستخدام تركيزات مختلفة من نفس HC وبالتالي يفترض وجود أعداد الحبال اختلاف بين النواقل والركيزة المعدنية ينبغي أن يكونحركية متباينة من إطلاق النواقل. في الواقع، أدى تعديل المتجه باستخدام 0.1 ملي RHC في معدلات الانبعاث أسرع بكثير من لاحظ ناقلات ثبتوا مع 0.5 ملي RHC (الشكل 4A). البيانات مضان المجهري (الشكل 4B) يرتبط بشكل جيد مع التحليل الكمي الإفراج ناقلات القائم على قياس التألق، مما يدل على انخفاض أسرع وأكثر عمقا من مضان المرتبط السطح مع عينات شبكة صياغتها باستخدام IHC-، RHC- وخاصة انخفاض تركيز ناقلات RHC-المربوطة بالمقارنة مع نظرائهم NHC- وSHC المربوطة.
تنبيغ في المختبر مع شبكة يجمد الإعلان المتجهات
من خلال كونها متوافقة مع كل من التحليل الكمي التعبير (التألق) والملاحظات المكانية (مضان المجهري)، الإعلان EGFP هي ناقلات مراسل فضل لمراقبة التنبيغ في SMC والبطانيةمزارع الخلايا تعامل مع كل حرة ويجمد شبكة ناقلات الإعلان. التعديل الكيميائي للقفيصة الإعلان مع RHC (الشكل 5)، وكذلك مع غيرها من linkers عبر (لا يظهر) بتركيزات تزيد عن 75 ميكرومتر يضعف إلى حد كبير فعالية تنبيغ ناقلات غير ثبتوا في المختبر، على الأرجح بسبب اخفاء وإعادة تشكيل الألياف مقبض مجالات استخدامها من قبل الإعلان للربط إلى الخلايا من خلال المستقبلات كوكساكي-اتش (CAR). ومع ذلك، فإن دور التفاعلات مقبض-CAR أقل حيوي لتنبيغ مع الركيزة يجمد ناقلات منذ يتم الاحتفاظ ناقلات في محيط الخلايا المستهدفة من قبل يربطون إلى الركيزة. في تجارب زراعة الخلايا بغض النظر عن نوع HC، ناقلات الإعلان المرتبط مش قادرة باستمرار تقييد مكانيا الأحداث التنبيغ إلى خلايا تقع داخل 300-500 ميكرون من الحدود شبكة (أرقام 6A 6C و). عادة مستويات الذروة من transgenوتتحقق البريد تعبير 3-5 أيام بعد وضع الإعلان EGFP -loaded تنسجم في SMC (أرقام 6A و 6B) أو BAEC (أرقام 6C و 6D) الثقافات. في نفس حمولة ناقلات، وزيادة مستويات الذروة التعبير EGFP في التسلسل التالي: NHC-، SHC-، IHC- وناقلات RHC-المربوطة، مما يعكس الاختلافات في كل ملامح حركية الإفراج عنهم (الشكل 4). وعلاوة على ذلك، لوحظ أكثر دواما التعبير التحوير في الخلايا تعامل مع الشبكات IHC ضعت في مقارنة مع الخلايا المعالجة مع نظرائهم RHC ضعت (الشكل 6D).
يقدم نظام زراعة الخلايا المستخدمة مريحة مجموعة المتابعة للتحقيق في الأحداث التنبيغ تأخر الناجمة عن الجسيمات ناقلات سراحه من سطح المعدن أو في موعد أقصاه 48 ساعة بعد وضع شبكة. في هذا التطبيق، بعد تحديد EGFP التعبير fluorometالمجهر راي ومضان في 48 ساعة بعد بدء التنبيغ، وtrypsinized BAEC ويستنشق من الآبار من دون إزعاج تنسجم. passaged حديثا غير transduced BAEC ثم يتم إعادة مطلي على مدى تنسجم صدر جزئيا. ثم يتم تقييم "جديدة" الأحداث التنبيغ الناجمة عن جزيئات الفيروس صدر من الناقل شبكة بعد نقطة زمنية 2 يوم بواسطة المجهر مضان والتألق (أرقام 7A و 7B). وعادة ما يلاحظ قوي EGFP التعبير يدل على تقييد المكاني المميز للغة شبكة في هذه الثقافات "الجديدة" (الشكل 7)، مؤكدا قدرة التنبيغ المحفوظة جيدا من ناقلات الإعلان متجهة شبكة حتى بعد 48 ساعة من التعرض لاستكمال خلية ثقافة المتوسط عند 37 درجة مئوية.
في الدراسات المجراة
لدراسة الآثار المحتملة المتعلقة شخضع ناقلات ذاتها من HC مختلفة على التنبيغ الشرايين والحيوانات مزروع مع الإعلان لوك -eluting الدعامات أعدت مع RHC-، IHC-، SHC- وNHC تعديل التصوير إضاءة الحيوية بعد 1 و 8 أيام نشر الدعامة (الشكل 8). تم تنفيذ التصوير في أعقاب الادارة المحلية المحيطة بالأوعية من وسيفيرين (2 ملغ) شارك صياغتها مع هلام بلورونيك. هذه الصيغة هي السائل اللزج عندما المبردة على الجليد، ولكن تمر المرحلة الانتقالية فورا إلى هلام عندما جلبت على اتصال مع الأنسجة عند 37 درجة مئوية. أظهرت التجارب الأولية (لا يظهر) أن تسليم ماحول الأوعية النتائج وسيفيرين في إشارات التلألؤ أكثر استقرارا وقابلة للتكرار في الإعلان لوك -transduced الأنسجة الوعائية بالمقارنة مع النظامية (داخل الصفاق أو في الوريد) إدارة وسيفيرين.
إذا كان الربط الفيروس إلى الدعامات والجراحة نشر الدعامات سليمة من الناحية الفنية، وهي إشارة واضحة المعالم المقابلة لجزء من stentedينبعث الشريان السباتي الجرذان وتسجيلها. يوم واحد بعد زرع الدعامة، الحيوانات تعامل مع RHC صياغتها-الدعامات الإعلان لوك تظهر عادة أعلى إشارة التلألؤ، تليها الفئران تلقي IHC- SHC- وضعت الدعامات (الأرقام 8A و 8B). لوحظ عدم وجود إشارة محسوسة في مجموعة من الفئران مزروع مع الدعامات إعدادها باستخدام NHC المربوطة-AD لوك، مما يؤكد على أهمية إطلاق سراح ناقلات دون عوائق من الدعامات لالتنبيغ الفعال الأنسجة الوعائية (الأرقام 8A و 8B). بعد يوم 8، ومتوسط كثافة التعبير وسيفيراز مع الدعامات RHC ضعت قطرات عدة أضعاف، في حين أنه يزيد 1.4- و 1.8 أضعاف مع IHC- والدعامات SHC صياغتها، على التوالي (الأرقام 8A و 8B). هذه النتيجة متسقة مع فرضية تنبيغ الأوعية الدموية أكثر دواما مع الدعامات يبلغ حجمه الجينات واظهار القربى أبطأetics الإفراج متجه من سطح الدعامات.
الرقم 1. الصيغ التركيبية لل-linkers عبر (NHC، حالات العسر الشديد، وIHC RHC) المستخدمة في الدراسات وصفها (معدل بإذن 28).
الشكل 2. مخطط يمثل الإعلان ناقلات الربط إلى PABT / PEI PDT -modified المقاوم للصدأ السطح الصلب عبر HC وإطلاق اللاحق للناقلات عليه عبر رابط المائي (تعديل بإذن 28).
الرقم 3. ضليع في الرياضيات القائم على PCRification من الإعلان EGFP يجمد عبر الربط عبر رابط على سطح PABT / PEI PDT -modified تنسجم الفولاذ المقاوم للصدأ. صيغت والفولاذ المقاوم للصدأ تنسجم مع الإعلان EGFP يجمد عبر RHC، IHC، حالات العسر الشديد، أو NHC (ن = 3 لكل حالة ). بعد العلاج بروتين كاف، كان مزال الحمض النووي الفيروسي وتنقيتها باستخدام أعمدة MinElute. أجريت التضخيم من الحمض النووي الفيروسي باستخدام بادئات محددة من EGFP في 7500 في الوقت الحقيقي PCR المحرك وتم الكشف مع SYBR الأخضر. واستند تطبيع البيانات على منحنى المعايرة أعدت مع كمية معروفة من غير يجمد EGFP اعلان (تعديل بإذن 28).
الرقم 4. حركية الإفراج عن ناقلات الإعلان المربوطة إلى ركائز معدنية مع HC سانتainless تم derivatized تنسجم مع الصلب ~ 2 × 10 و Cy3 المسمى 9 جزيئات الإعلان تعلق على PABT / PEI PDT -modified السطح بعد التعديل مع 500 ميكرومتر NHC، SHC، IHC، RHC و 100 ميكرومتر RHC (تسمى RHC-L). وقد درس الافراج عن fluorescently المسمى الإعلان الجسيمات في نقاط زمنية المشار إليها بواسطة (A) قياس التألق-SCAN جيدا في 550/570 نانومتر و (B) المجهري الفلورسنت (مجموعة فلتر رودامين، 200X التكبير الأصلي). يتم عرض نتائج قياس التألق كما يعني ± SEM، ن = 8-10. ع <0.001 لجميع المقارنات بين NHC وSHC مقابل IHC، RHC والجماعات RHC-L تم تحديدها من قبل أنوفا مع اختبار توكي بعد خاصة (معدل بإذن 28).
الرقم فعالية 5. تنبيغ من غير يجمد البريد الإعلانتم transduced GFP التالية مع تعديل RHC. الفئران الجنينية المستمدة SMC-الشريان الأبهر (خط A10) في وزارة الداخلية من 1،000 إما الإعلان معدلة EGFP أو تعديل ناقلات مع RHC كما هو مبين. تم تحديد التعبير مراسل fluorometrically (485/535 نانومتر) 48 ساعة بعد التنبيغ (تعديل بإذن 27).
الرقم 6. تنبيغ من مثقف SMC وBAEC مع ناقلات الإعلان يجمد لالفولاذ المقاوم للصدأ تنسجم مع HC. تم derivatized تنسجم مع ~ 2 × 10 9 الإعلان الجسيمات EGFP إلحاق عبر NHC، SHC، IHC، وRHC. ثم تم وضعها تنسجم بشكل فردي على رأس A10 الفرعية متموجة (A، B) وBAEC (C، D) الطبقات الوحيدة. تم تقييم التنبيغ (كنسبة مستويات التعبير EGFP) من الخلايا تعامل مع الشبكات الإعلانية ناقلات المربوطة التي كتبها fluorescence المجهري (A، C، FITC مجموعة فلتر، 100X التكبير الأصلي) والتألق-SCAN جيدا (B، D). يتم عرض نتائج قياس التألق كما يعني ± SEM، ن = 4 (معدل بإذن 28). يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 7. تنبيغ اختصاص الركيزة يجمد ناقلات الإعلان في نقاط زمنية تأخر. كان يجمد الإعلان EGFP على الصلب من خلال تنسجم NHC، SHC، IHC أو RHC الحبال. تم وضع تنسجم على الطبقات الوحيدة BAEC subconfluent. بعد يومين التنسيب، تم trypsinized BAEC وإزالتها من دون إزعاج تنسجم. والجديد، غير transduced-BAEC ثم المصنف على الشبكات. الإعلانوقد تم قياس الكفاءة EGFP تنبيغ بواسطة EGFP التعبير باستخدام المجهر الفلورسنت (A؛ FITC فلتر مجموعة، 100X التكبير الأصلي) والتألق (B). أخذت القياسات في الأيام المشار إليها، تم استخدام الصور التمثيلية ونتائج قياس التألق وسائل ± SEM، ن = 4 (معدلة من بإذن 28). يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
تم المربوطة الرقم 8. كفاءة تنبيغ من الدعامات-يجمد الإعلان لوك في الجسم الحي. لوك اعلان (1.3 × 10 10 الجسيمات) إلى الدعامات اللف عبر NHC، SHC، IHC أو RHC (ن = 3-4 لجميع الفئات). كفاءة تنبيغ الإعلان لوك <تم قياس / الفرعية> مزال من الدعامات التي تلألؤ بيولوجي التصوير (IVIS الطيف) 1 و 8 أيام آخر نشر الدعامة (A)، وتآمر يستخدم مقياس لوغاريتمي (B) (معدلة من بإذن 28). الرجاء انقر هنا لعرض أكبر نسخة من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
يصف بروتوكول المعروضة طريقة التشغيلي للالركيزة بوساطة توصيل الجينات التي تحققت من خلال مرفق عكسها من ناقلات الفيروسة الغدانية إلى coatless أسطح الفولاذ المقاوم للصدأ. بينما وضعت لغرض معين من العلاج الجيني القائم على دعامات من عودة التضيق الوعائي، هذه التقنية لها تطبيقات أوسع في مجالات الحيوية، ويزرع الطبية الحيوية والعلاج الجيني.
على الرغم من أن الدراسات المقدمة واستخدمت فقط الفولاذ المقاوم للصدأ باعتبارها الركيزة المعدنية نموذجية، PABT يربط السبائك المعدنية الأخرى مثل الكوبالت / الكروم والننتول مع تقارب مماثل (لم تنشر). التفاعل لا يفرق بين من PABT مع المعادن توسع كبير في عدد من التطبيقات الطبية الحيوية المحتملة لهذه التكنولوجيا 31. وعلاوة على ذلك، واستخدام ناقلات الجينات-HC المربوطة، ولو تتطلب أساليب أخرى لتثبيت ثيول على سطح المادة، هو ممكن مع أنواع أخرى من المواد الحيوية.
ontent "> بينما ناقلات الجينات الإعلان على تحقيق التنبيغ القوي في العديد من أنواع الخلايا والأنسجة البشرية، وأهميتها السريرية محدودة بسبب الاستجابات الالتهابية والمناعية القوية التي تسببها Adenoviridae 4. تحقيقا لهذه الغاية، لفترات طويلة (4 أشهر) التعبير الشرياني مع الجين يبلغ حجمه الدعامات صيغت وقد أظهرت باستخدام تعديل HC لل، معربا عن وسيفيراز الغدة المرتبطة ناقلات فيروسية مؤخرا (لم تنشر).منهجية متينة. الانحرافات صغيرة من البروتوكول الرئيسي لا تؤدي عادة إلى تغييرات كبيرة في التعبير الجيني في المختبر وفي الجسم الحي. ومع ذلك، تم تحديد العديد من القضايا الهامة التي قد تؤثر على النتائج.
أولا، وكما يوحي الاسم، المتحللة عبر linkers هي شطورة على التفاعل مع الماء بسبب التحلل المائي للاستر في السلسلة. وعلاوة على ذلك، شاردة، أمين رد الفعل، N -sulfosuccinimidyl غير المتحللة كذلك. يجب أن يتم تخزين linkers عبر شالتانجو جو الأرجون في -20 درجة مئوية للحفاظ على نشاطهم. لنفس الأسباب، بعد إعداد حلول HC (القسم بروتوكول 3.2) الشروع فورا مع إضافة حلول HC إلى محضرات الفيروس.
ثانيا، مجموعات ثيول التي تتشكل على سطح المعدن خلال عدة خطوات وسيطة من تسلسل bioconjugation عرض تتأكسد بسرعة عن طريق الهواء المحيط الأكسجين. لمنع هذا، والحفاظ على عينات المعادن الضعيفة المغمورة في المياه نزع الغاز في جميع الأوقات.
ثالثا، لا بد من مواءمة مثالية للشبكة مع قاع البئر لالتنبيغ ناجحة. لا ينحني أقراص شبكة أثناء المناولة.
رابعا، تجنب فرك المفرط للالدعامات يبلغ حجمه الجين ضد غمد تفلون وجدار الوعاء الدموي خلال الدعامة الإدراج إلى منع بإزاحة ناقلات الإعلان المرتبط السطح.
التساهمية مرفق من ناقلات الجينات إلى سطح biomateria للزرعليرة سورية لديها ميزة واضحة للسيطرة أفضل على حركية الإفراج عن ناقلات من تحقيقها مع الربط غير التساهمية من ناقلات. في الإعداد لتوصيل الجينات من منصة الدعامة تفيد معظم الدراسات الإفراج الكامل من النواقل الفيروسية وغير الفيروسية في غضون 1-7 أيام بعد نشر الدعامة 32-34. من ناحية أخرى، الإعلان الموجه عبر تجميد HC أظهرت الإفراج عن 20-45٪ فقط من حمولة ناقلات في الشهر الأول (الشكلان 4A و 4B). علاوة على ذلك، تعديل جزئي للإفراج عنهم والتنبيغ حركية يمكن تحقيقه باستخدام HC مختلف اظهار حركية التحلل متباينة أو متفاوتة تركيز HC المستخدمة لتعديل سطح الفيروس. بالإضافة إلى ذلك، المتزامنة المشارك تعديل ناقلات مع مختلف الجزيئات عبر رابط، وإن لم يكن استكشافها في هذه الدراسة، ويوفر فرصة أخرى لصقل إطلاق النواقل وترنسدوكأيشن.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 316 stainless steel mesh disks | Electon Microscopy Sciences | E200-SS | |
| Generic 304-grade stainless steel stents | Laserage | custom order | |
| AdeGFP | University of Pennsylvania Vector Core | AD-5-PV0504 | |
| AdLuc | University of Pennsylvania Vector Core | AD-5-PV1028 | |
| AdEMPTY | University of Pennsylvania Vector Core | A858 | |
| Cy3(NHS)2 | GE Healthcare | PA23000 | |
| Sepharose 6B | Sigma-Aldrich | 6B100-500ML | |
| UV 96-well plates | Costar | 3635 | |
| Fluorometry 96-well plates | Costar | 3915 | |
| Cell culture 96-well plates | Falcon | 353072 | |
| Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride (TCEP) | Pierce Thermo Scientific | 20490 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Pierce Thermo Scientific | 20290 | |
| sulfo-LC-SPDP | Pierce Thermo Scientific | 21650 | |
| Spectrophotometer | Molecular Devices | SpectraMax 190 | |
| Spectrofluorometer | Molecular Devices | SpectraMax Gemini EM | |
| Orbital shaker incubator | VWR | 1575R | |
| Horizontal airflow oven | Shel Lab | 1350 FM | |
| Centra-CL2 centrifuge | International Equipment Company | 426 | |
| Digital vortex mixerer | Fisher Thermo Scientific | 02-215-370 | |
| Eclipse TE300 fluorescence microscope | Nikon | TE300 | |
| DC 500 CCD camera | Leica | DC-500 | |
| 7500 Real-Time PCR system | Applied Biosystems | not available | |
| IVIS Spectrum bioluminescence station | Perkins-Elmer | not available | |
| EDTA dipotassium salt | Sigma-Aldrich | ED2P | |
| Bovine serum albumin fraction V (BSA) | Fisher Thermo Scientific | BP1600-100 | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P1379 | |
| Dumont forceps | Fine Science Tools | 11255-20 | |
| A10 cell line | ATCC | CRL-1476 | |
| Bovine aortic endothelial cells | Lonza | BW-6002 | |
| Luciferin, potassium salt | Gold Biotechnology | LUCK-1Ge | |
| Pluronic F-127 | Sigma-Aldrich | P2443-250G | |
| PBS without calcium and magnesium | Gibco | 14190-136 | |
| Fetal bovine serum | Gemini Bio-Products | 100-106 | |
| Penicillin/Streptomycin solution | Gibco | 11540-122 | |
| DMEM, high glucose | Corning cellgro | 10-013-CV | |
| 0.25% Trypsin/EDTA | Gibco | 25200-056 | |
| QIAamp DNA micro kit | Qiagen | 56304 | |
| Power Sybr Green PCR Master Mix | Applied Biosystems | 4367659 | |
| MicroAmp Optical 96-well Reaction Plate | Applied Biosystems | N8010560 | |
| MicroAmp Optical Adhesive Film | Applied Biosystems | 4360954 | |
| Cephazolin | Apotex | not available | |
| Loxicom (Meloxicam) | Norbrook | not available | |
| Heparin sodium | APP Pharmaceuticals | not available | |
| Ketavet (Ketamine) | VEDCO | not available | |
| Anased (Xylazine) | Lloid | not available | |
| Forane (Isoflurane) | Baxter | not available | |
| Curved Moria iris forceps | Fine Science tools | 11370-31 | |
| Curved extra-fine Graefe forceps | Fine Science Tools | 11152-10 | |
| Dumont #5 forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| Vannas spring scissors | Fine Science Tools | 15018-10 | |
| Fine scissors - ToughCut | Fine Science Tools | 14058-09 | |
| Surgical scissors | Fine Science Tools | 14101-14 | |
| Vicryl suture (5-0) | Ethicon | J385 | |
| Suture thread (4/0 silk) | Fine Science Tools | 18020-40 | |
| Michel suture clips | Fine Science Tools | 12040-02 | |
| Wound dilator (Lancaster eye specula) | KLS Martin | 34-149-07 | |
| Hot bead sterilizer | Fine Science Tools | 18000-45 | |
| Michel suture clip applicator | Fine Science Tools | 112028-12 | |
| Insyte Autoguard 24 G IV catheter | Beckton-Dickinson | 381412 | |
| 2F Fogarty catheter | Edwards Lifesciences | 120602F | |
| Teflon tubing | Vention | 041100BST | |
| PTA catheter | NuMed | custom order | |
| Gauze pads | Kendall Healthcare | 9024 | |
| Cotton applicators | Solon Manufacturing | WOD1003 | |
| Saline | Baxter | 281321 | |
| 10 ml syringe (Luer-Lok) | Beckton-Dickinson | 309604 | |
| 1 ml syringe (Luer-Lok) | Beckton-Dickinson | 309628 | |
| Clippers with #40 blade | Oster | 78005-314 | |
| Transpore surgical tape | 3M | MM 15271 | |
| Puralube vet ointment | Pharmaderm | not available |
References
- Boeckle, S., Wagner, E. Optimizing targeted gene delivery: chemical modification of viral vectors and synthesis of artificial virus vector systems. AAPS J. 8, E731-E742 (2006).
- Waehler, R., Russell, S. J., Curiel, D. T. Engineering targeted viral vectors for gene therapy. Nat Rev Genet. 8, 573-587 (2007).
- Campos, S. K., Barry, M. A. Current advances and future challenges in Adenoviral vector biology and targeting. Curr Gene Ther. 7, 189-204 (2007).
- Bangari, D. S., Mittal, S. K. Current strategies and future directions for eluding adenoviral vector immunity. Curr Gene Ther. 6, 215-226 (2006).
- Barry, M. A., et al. Systemic delivery of therapeutic viruses. Curr Opin Mol Ther. 11, 411-420 (2009).
- De Laporte, L., Shea, L. D. Matrices and scaffolds for DNA delivery in tissue engineering. Adv Drug Deliv Rev. 59, 292-307 (2007).
- Gustafson, J. A., Price, R. A., Greish, K., Cappello, J., Ghandehari, H. Silk-elastin-like hydrogel improves the safety of adenovirus-mediated gene-directed enzyme-prodrug therapy. Mol Pharm. 7, 1050-1056 (2010).
- Kidd, M. E., Shin, S., Shea, L. D. Fibrin hydrogels for lentiviral gene delivery in vitro and in vivo. J Control Release. 157, 80-85 (2012).
- Lei, Y., et al. Incorporation of active DNA/cationic polymer polyplexes into hydrogel scaffolds. Biomaterials. 31, 9106-9116 (2010).
- Lei, Y., Rahim, M., Ng, Q., Segura, T. Hyaluronic acid and fibrin hydrogels with concentrated DNA/PEI polyplexes for local gene delivery. J Control Release. 153, 255-261 (2011).
- Jang, J. H., Schaffer, D. V., Shea, L. D. Engineering biomaterial systems to enhance viral vector gene delivery. Mol Ther. 19, 1407-1415 (2011).
- Salvay, D. M., Zelivyanskaya, M., Shea, L. D. Gene delivery by surface immobilization of plasmid to tissue-engineering scaffolds. Gene Ther. 17, 1134-1141 (2010).
- Moss, A. J., Hamburger, S., Moore, R. M., Jeng, L. L., Vol Howie, L. J. Advance Data. 191, National Center for Health Statistics Vital and Health Statistics. (1991).
- Gristina, A. G., Naylor, P., Myrvik, Q. Infections from biomaterials and implants: a race for the surface). Med Prog Technol. 14, 205-224 (1988).
- Santerre, J. P., Woodhouse, K., Laroche, G., Labow, R. S. Understanding the biodegradation of polyurethanes: from classical implants to tissue engineering materials. Biomaterials. 26, 7457-7470 (2005).
- Tang, L., Eaton, J. W. Inflammatory responses to biomaterials. Am J Clin Pathol. 103, 466-471 (1995).
- Zimmerli, W., Sendi, P. Pathogenesis of implant-associated infection: the role of the host. Semin Immunopathol. 33, 295-306 (2011).
- Fishbein, I., et al. Bisphosphonate-mediated gene vector delivery from the metal surfaces of stents. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 159-164 (2006).
- Levy, R. J., et al. Localized adenovirus gene delivery using antiviral IgG complexation. Gene Ther. 8, 659-667 (2001).
- Ma, G., et al. Anchoring of self-assembled plasmid DNA/anti-DNA antibody/cationic lipid micelles on bisphosphonate-modified stent for cardiovascular gene delivery. Int J Nanomedicine. 8, 1029-1035 (2013).
- Hu, W. W., Lang, M. W., Krebsbach, P. H. Development of adenovirus immobilization strategies for in situ gene therapy. J Gene Med. 10, 1102-1112 (2008).
- Jang, J. H., et al. Surface immobilization of hexa-histidine-tagged adeno-associated viral vectors for localized gene delivery. Gene Ther. 17, 1384-1389 (2010).
- Bengali, Z., Shea, L. D. Gene Delivery by Immobilization to Cell-Adhesive Substrates. MRS Bull. 30, 659-662 (2005).
- Holmes, C. A., Tabrizian, M. Substrate-mediated gene delivery from glycol-chitosan/hyaluronic acid polyelectrolyte multilayer films. ACS Appl Mater Interfaces. 5, 524-531 (2013).
- Pannier, A. K., Wieland, J. A., Shea, L. D. Surface polyethylene glycol enhances substrate-mediated gene delivery by nonspecifically immobilized complexes. Acta Biomater. 4, 26-39 (2008).
- Wang, C. H., Pun, S. H. Substrate-mediated nucleic acid delivery from self-assembled monolayers. Trends Biotechnol. 29, 119-126 (2011).
- Fishbein, I., et al. Local delivery of gene vectors from bare-metal stents by use of a biodegradable synthetic complex inhibits in-stent restenosis in rat carotid arteries. Circulation. 117, 2096-2103 (2008).
- Fishbein, I., et al. Adenoviral vector tethering to metal surfaces via hydrolyzable cross-linkers for the modulation of vector release and transduction. Biomaterials. 34, 6938-6948 (2013).
- Mittereder, N., March, K. L., Trapnell, B. C. Evaluation of the concentration and bioactivity of adenovirus vectors for gene therapy. J. Virol. 70, 7498-7509 (1996).
- Forbes, S. P., et al. Modulation of NO and ROS production by AdiNOS transduced vascular cells through supplementation with L-Arg and BH4: Implications for gene therapy of restenosis. Atherosclerosis. 230, 23-32 (2013).
- Niinomi, M., Nakai, M., Hieda, J. Development of new metallic alloys for biomedical applications. Acta Biomater. 8, 3888-3903 (2012).
- Brito, L. A., Chandrasekhar, S., Little, S. R., Amiji, M. M. Non-viral eNOS gene delivery and transfection with stents for the treatment of restenosis. Biomed Eng Online. 9, 56 (2010).
- Egashira, K., et al. Local delivery of anti-monocyte chemoattractant protein-1 by gene-eluting stents attenuates in-stent stenosis in rabbits and monkeys. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 27, 2563-2568 (2007).
- Ohtani, K., et al. Stent-based local delivery of nuclear factor-kappaB decoy attenuates in-stent restenosis in hypercholesterolemic rabbits. Circulation. 114, 2773-2779 (2006).
