Abstract
ステント内再狭窄は、広く冠動脈および末梢動脈の批判的に狭めセグメントを通じて再確立血流に使用されるステントベースの血管再生手順の主要な合併症を提示します。抗再狭窄性の活性を有する遺伝子の調節可能な放出が可能な血管内ステントは、現在、薬剤溶出ステントを使用するための代替戦略を提示することができる。典型的には、ベクターの物理的捕捉のために使用されるポリマーコーティングに関連付けられた過剰な炎症性応答を回避しながら、臨床翻訳を達成するために、遺伝子溶出ステントは、ステント固定化遺伝子ベクターの放出及び血管系の部位特異的な形質導入の予測可能な速度論を示さなければならない。本論文では、ビスフォスフォネート（PABT）が加水分解性架橋剤（HC）を介してステンレス鋼表面 - 修飾ポリアリルアミンするアデノウイルス粒子の可逆的結合に基づくステントとアデノウイルス遺伝子ベクターのコートレステザリングするための詳細な方法論を説明しています。の家族5〜50日の範囲内の鎖エステル加水分解の平均のt 1/2と二官能性（アミンおよびチオール反応性）HCは、ステントとベクターを連結するために使用した。ベクトル固定化手順は、一般的に9時間以内に行われ、いくつかのステップで構成されています。PABTの水溶液中の金属試料の1）インキュベーション（4時間）;トリス（2 - カルボキシエチル）ホスフィン（20分）でPABTに設置チオール基の2）の脱保護;ピリジルジチオ（PDT）グループ（2時間）で誘導体化ポリエチレンの試料を反応させて金属表面のチオール反応容量の3）拡張;ジチオスレイトール（10分）とのチオールへのPDT群の4）変換; HC（1時間）とアデノウイルスの5）の修正;サイズ排除カラムクロマトグラフィー（15分）、チオール化鋼表面上のチオール反応性アデノウイルス粒子（1時間）の7）の固定化によって修飾されたアデノウイルス粒子の6）精製。この技術は、ステントを越えて広い適用可能性を有している注入された異物をインターフェース細胞に対する基質媒介遺伝子送達を通じてそれらの生体適合性を強化するために、生体プロテーゼデバイスの表面工学を促進することによって。
Introduction
治療法として、遺伝子治療の有効性は、遺伝子治療ベクター1,2の乏しいターゲティング能力によって妨げられる。標的位置におけるトランスジーン発現の準治療レベルの適切なターゲティングの結果の欠如とは、ベクトルおよび符号化された治療用生成物4の両方に対する免疫応答をマウントするための担当者を含む非標的器官3へのベクターの広範な普及につながる5。一つの可能性は、形質導入の混乱を相殺し、標的化血液やリンパ液を介してそれらの自由普及を妨げる形で所望の位置に遺伝子ベクターを導入することで促進することを意味する。典型的には、このような努力は、物理的に目を捕捉することによって注射部位に一過性に維持遺伝子ベクターが可能であるフィブリン、コラーゲンまたはヒアルロン酸ハイドロゲルマトリックス6-10と混合したウイルスまたは非ウイルスベクターのいずれかを含む、局所的に注射可能な送達システムに依存しているポリマーネットワーク内のem。
ローカライズされた遺伝子治療のための別の一般的に受け入れられているパラダイムは、移植された補綴装置11,12の表面に遺伝子ベクターの固定化を利用する。常設医療用インプラント（血管、気管支、泌尿器及び胃腸ステント、ペースメーカー、人工関節、外科や婦人科のメッシュなどが 。）の患者13数千万で毎年使用されている。一般的に有効であるが、これらのデバイスは、不十分な現在の医療行為のために14〜17によって制御される合併症を起こしやすい。移植可能な人工デバイスは、ローカライズされた遺伝子治療の治療のためのプロキシ·プラットフォームとして機能するユニークな機会を提示する。薬物動態学的見地、インプラント/組織界面に遺伝子ベクターの高い局所濃度を両立し、theiの動態を遅らせる遺伝子ベクターの結果、比較的低い入力用量の医療用インプラントの表面誘導体からこの場所からのR撤廃する。長引く住宅目標とされた細胞集団による強化された取り込みの結果として、ベクトル·固定化は、遺伝子ベクターの拡散を最小限に抑えることができます。したがって非標的組織の不慮の接種が低減される。
（また、基板を介した遺伝子送達または固相遺伝子送達と呼ぶ）移植可能な生体材料上の遺伝子ベクターの表面テザリングは、両方の特定の（抗原-抗体18-20、アビジン-ビオチン21,22）を用いた細胞培養や動物実験で実装されました非特異的な23〜26（電荷、ファンデルワールス）相互作用。表面に過度に強い結合が標的細胞によりベクター内在化を排除するので、移植された装置の表面へのベクターの共有結合は、以前に非機能として考えられてきた。最近、この制限は、tetオペレーターとして使用自発的に加水分解性架橋剤の使用によって克服することができることが実証されたアデノウイルスベクター27,28のステントおよびキャプシドタンパク質の修飾された金属表面との間に彼女。さらに、 インビトロおよびインビボでの導入遺伝子発現のベクター放出速度および時間経過は、加水分解28の異なる動態を示す加水分解性架橋剤を用いて調節することができる。
本研究は、活性化金属表面にアデノウイルスベクターの可逆的共有結合のための詳細なプロトコルを提供し、ステント血管形成のラット頸動脈モデルにおいて培養平滑筋細胞および内皮細胞およびin vivoでのin vitroでのその後の伝達事象を研究するための有用な実験設定を導入。
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Protocol
放出実験のためのCy3標識アデノウイルスの調製
- （; pHは9.3 CBB）炭酸塩/重炭酸塩緩衝液の650μlの空の Adの2×10 12粒子（約2×10 11感染単位）を中断します。
- 0.2ミリグラム/ mlの最終濃度になるように（2のCy3（NHS））を1mlのCBB中のアミン反応性蛍光色素の1バイアル（0.2ミリグラム）の含有量を溶解する。
- 5秒間ウイルス懸濁液、渦に対する染料溶液100μlを加え、（100〜200 rpm）し、振とうしながら28℃で1時間インキュベートする。
- PBSで20ミリリットルロース6Bカラムを平衡化する。 Cy3標識広告サスペンションを滴下ゲル床の中心に750μlのを追加します。
- ウイルス懸濁液を樹脂に浸透した後、5mlのPBSを加える。溶出液は捨ててください。
- 0.5mlのPBSを追加し、ラベルされたガラス容器に溶出液を収集します。 10 0.5mlの画分の合計を収集し、このステップの10倍を繰り返します。
- アッセイ番目eは、ウイルスDNA含有量について分光光度計（260および280nm）によって画分を集めた。
- 260nmでの合計（F10を通じてF1の合計）の光学密度（OD）の10％以上を含有する画分をプールする。注：典型的な画分F3、F4、F5およびF6をプールし、混合する。
- 再検定ウイルスDNA含量およびCy3用の蛍光測定（550 元 / 570 全角 nm）を分光光度法による（260および280nm）、およびアッセイによって混合プールされた画分を、それぞれ、キャプシドタンパク質を標識した。注：Cy3標識（NHS）2の検量線を10 -9 -10 -13モル/ Lの範囲を調製し、蛍光定量プールした画分を同じプレート上でアッセイされるカバーする。
- ラベルされたウイルス収量と標識密度を計算します。 1.19×10 12ウイルス粒子/ mlでは、1cmの経路長29 1 OD単位に相当すると仮定する。収率= [（外径260nmの /1.19)*10 12 * V /入力広告量] * 100、外径260nmの光デは、：式を使用します。260nmでのプールされた製剤のnsity及びVは、Ad回収率（％）を算出するプールされた処方物（溶液）の体積である。式を使用します。ラベリング密度= C * 6.02 * 10 23 /（OD Cがプールされた製剤のCy3の濃度（モル/ ml）をし、外径260nmのである260nmの /1.19)*10 12は 、プールされた製剤の光学濃度である260nmでの平均のCy3標識密度を算出する。注：標識されたウイルスの典型的な回復は、入力量の> 70％である。ラベリング密度は単一のウイルス粒子当たり600〜800発蛍光分子である。
- 個別の放出実験に適したより小さな部分（典型的には5×10 11粒子）に空の分注しCy3標識広告。注：現在のプロトコルは単に放出実験におけるCy3標識Adの使用を指定します。すべての形質導入の研究は、非標識のベクターを用いて行われる。
金属試料の2の活性化
- ステンレス秒を洗うゴマは、イソプロパノール中で連続してディスクまたはステンレス鋼ステントメッシュ（5分×2）、クロロホルム、振盪（100 rpm）で55℃で（5分×2）。溶剤を除去します。
- 200℃で30分間、試料を加熱する。
- （100 rpm）し、振とうしながら72℃で（w / vの1〜2％）を水にインストールされた潜在的チオール基（PABT 27,28,30）とポリアリルビスホスホネートに溶解する。 KHCO 3で4.5〜5にpHを調整する。
- （100〜200 rpm）し、振とうしながら72℃で2〜4時間、PABT溶液中で金属試料をインキュベートする。注：手順は、この時点で一時停止してもよい。サンプルを4℃で3日間安定である。
- 再蒸留水（DDW）で3回のサンプルを洗浄します。
- トリス（2 - カルボキシエチル）ホスフィンにサンプルをさらす（TCEP; 0.1 M酢酸緩衝液中の15 mg / mlで）を28℃で15分間（100〜200 rpm）し、振とうしながら。
- 脱気したDDWで5回すすいでください。
- インストールされたピリジルジチオ基で2％のポリエチレンイミンにサンプルを公開（PEI
- DDWでサンプルを3回洗浄します。
- チオールにピリジルジチオ基を変換するために10 mg / mlのジチオスレイトール/ DDWにサンプルをさらす。
- 脱気したDDWで再び5回洗浄します。
3アデノウイルスの活性化および金属表面の固定化
- 炭酸塩/重炭酸塩緩衝液（; pHは9.3 CBB）の487.5から495μlの広告のeGFPまたはAd リュックどちらの5×10 11粒子（約5×10 10感染単位）を中断します。注：Cy3標識がAd 空の粒子をラベルの放出研究のために、5×10 11を使用します（CBBで487.5から495μlに音量を調整）。
- 変動する加水分解速度28でHCを溶解[（急速に（T 1/2 = 5日）、中間（T 1 /20 mMのでCBBにおける図1]または非加水分解性架橋剤（NHC）、スルホ-LC-SPDP;ゆっくり= 12 d）および（T 1/2 = 50 d）のHC、 すなわち RHC、IHCまたはSHC 2。
- すぐに、500μlの（架橋剤の200〜500μMの最終濃度）の合計ボリュームに対してウイルス懸濁液に架橋剤溶液の5から12.5μLを加え、ボルテックスし、振盪しながら28℃で1時間インキュベート（100〜 200回転）。
- 脱気した5mMのEDTA / PBS（EPBS）と20ミリリットルロース6Bカラムを平衡化する。樹脂床の中央にクロスリンカー修飾広告懸濁液500μLを滴下添加する。
- 脱気したEPBSを5ml追加します。溶出液は捨ててください。
- 脱気したEPBSの0.5ミリリットルを追加し、ラベルされたガラス容器に溶出液を収集します。 10 0.5mlの画分の合計を集める10回にこの手順を繰り返します。
- 260および280nmで分光光度法を用いて収集した画分のODを決定し、ウイルス力価（1.19×10 12 / mlのCORREにODを変換する1 OD）〜29 sponds。
- 溶出されたウイルスの> 10％を含有する画分をプール（注：通常、画分F3-F6）。プールされたサスペンションのための分光光度価アッセイを繰り返します。
- 活性化された金属サンプル（2.11に従って）でバイアルにウイルス懸濁液を転送します。 （100〜200 rpm）し、振とうしながら28℃で1時間、アルゴン雰囲気中でインキュベートする。注：この工程で得られたのAd-テザー金属試料はさらに、プロトコルのセクション5-7で説明し、その後のリリースおよび形質導入実験に使用されている。
PCRによる表面結合Adベクターの4。定量
- セクション2および3に記載されるように準備する表面固定広告eGFPを用いて製剤化メッシュ（タイプごとにn = 3）のNHC、SHC、IHC及びRHCを介して係留。
- ウイルスDNAを単離するのQIAamp DNAマイクロキットを使用してください。 ATL bの180μlのからなる混合物を200μlを含む1.5 mlのプラスチックチューブに個別にメッシュを配置しますufferおよびプロテアーゼK（共にキットから）20μlの。同じ混合物を含む別のチューブに（検量線用標準規格のような）広告のeGFP粒子の既知量を追加します。一晩振とうせずに56℃でインキュベートする。
- （キットから）AL緩衝液200μlを追加し、ボルテックスで混和100％エタノールを200μlを追加し、5分間室温でインキュベートする。
- （キットから）個別のMinEliteカラムに、各チューブから混合物を移し、1分間8,000 rpmでスピン。 1分間8,000 rpmでそれぞれのカラムとスピンに加え、新鮮なALTバッファー180μlのメッシュ含むチューブを洗浄します。溶出液を捨てる。
- 1分間8,000 rpmでのカラムとスピンに（キットから）AW1の緩衝液500μlを追加します。溶出液を捨てる。
- 1分間8,000 rpmでのカラムとスピンに（キットから）AW2バッファーを500μlを追加します。
- 溶出液を捨てる。
- さらに3分間14000 rpmでスピンuntilの列は、完全に乾燥している。溶出液を捨てる。
- 列にミリQグレードの水50μlを加える。 5分間14000rpmでスピン。 （キットから）個人のコレクションチューブに各カラムからの溶出液50μlのを収集します。
- 以下の乗算を組み合わせることにより、PCRマスターミックス溶液を調製する（パワーSYBRグリーンPCRマスターミックス12.5μlの、10μMのeGFPのセンスプライマーの0.63μlの[5'-ACG TAA ACG GCC ACA AGT TC -3 ']、10の0.63μlのμMのeGFPアンチセンスプライマー[5'-AAG TCG TGC TGC TTC ATG TG -3 ']、ミリQグレードの水を6.3μl）を。 「無DNA」コントロールを含む計画された反応の数によってこれらのボリュームを掛けます。
- ロードおよびマイクロアンプ光学96ウェル反応プレートの三重ウェルにPCRマスターミックスを20μl（ステップ4.8）、広告のeGFPのDNAを5μl。マイクロアンプ光学接着フィルムでプレートを密封。気泡を除去するために1分間1000rpmでプレートをスピン。
- 7500リアルタイムPCRエンジンのレセプタクルにプレートを置きます。 7500システムSDSソフトウェア（V1.4以降）のメインメニューで「新しいテストを作成」を選択します。 「次へ」をクリックします。 「新しい実験ウィザード」画面で、スクロールダウンメニューからSYBRグリーンを選択し、「追加」をクリックします。プレートのレイアウトを取得するには「次へ」をクリックします。分析しようとする全てのウェルをハイライト表示し、SYBRグリーンを選択します。連続しないDNA対照ウェル、広告のeGFP DNAスタンダードと未知を強調表示しておらず、スクロールダウンメニューから、それぞれの名称を使用してそれらをマークします。
- 計器タブに切り替えます。 「解離フェーズを追加」を選択し、25μlにデフォルトの50μlの見事なボリュームを変更します。 [開始]をクリックします。
- 外れ値および他の不規則性のためのQCサマリーを確認してから使用してPCRの結果を分析します。
モデルスチールメッシュから加水分解性クロスリンカー - つながベクター粒子の放出動態5。
- （100〜200 rpm）し、振とうしながら1％のBSA / PBS（1時間×3）において（3.9に従って）RHC、IHC、SHCおよびNHCを経由してCy3標識広告で誘導体化メッシュサンプルを洗ってください。
- 無菌微細なピンセットを用いて、溶出緩衝液200μl（0.1％BSA / 0.1％のTween-20 / PBS）を予め充填し、96ウェルプレートの各ウェルにメッシュを配置する。
- 各メッシュの中心部分の蛍光画像を取る。顕微鏡と画像取得のために使用されるCCDカメラの設定を記録します。
- 最大の減少とよくスキャンモードで蛍光定量プレート（550 元 / 570 全角 ）アッセイ。バックグラウンドコントロールなどの非誘導体化メッシュでウェルを使用してください。
- （50 rpm）しながら37℃でプレートをインキュベートする。
- 所定回数（1〜30日の範囲）で、メッシュを乱すことなく、溶出緩衝液を吸引し、新鮮な溶出緩衝液200μlを加える。繰り返してバッファを交換した後に4.3から4.5を繰り返します。
養殖セル画の6形質導入メッシュ固定化AdベクターによるLS
- 広告のeGFPを洗う-またはAd リュックは （100 rpm）し、振盪しながら5分間滅菌PBSで3回メッシュを誘導体化。
- 微細な滅菌ピンセットを使用して、メッシュディスクを一つずつ削除し、個別に対数増殖期における目的の細胞型に、96ウェルプレートのウェルに入れます。
- 5％CO 2中、37℃で24時間、細胞をインキュベートする。
- 程度およびウェル中の遺伝子発現の空間的分布を決定する（eGFPのまたはルシフェラーゼの生物発光イメージングのための蛍光顕微鏡法、蛍光光度法）それぞれ非末端終点アッセイを使用する。
- 任意に、PBSの代わり培地は、低eGFP発現が予想される場合蛍光アッセイ（535分の485 nm）での感度を増加させる。注：蛍光光度計は、よくスキャン機能を装備している場合、ウェル中のeGFP発現細胞の空間分布を評価するために、よくスキャンモードでプレートを読んだ。為替PB蛍光測定を完了した後の媒体に対するS。
- イメージFITCフィルターセットを使用して（基本的な及び離島メッシュの両方）広告のeGFP -elutingメッシュとウェル中の形質導入細胞。 40-200X倍率での代表的な画像を取る。蛍光顕微鏡画像の取得のために使用されるCCDカメラの正確な設定を記録します。
- 直接広告リュック -elutingでウェルにPBSにルシフェリン株式の5μlを添加した（10mg / ml）を前に生物発光イメージングに10分間37℃、5％CO 2でインキュベート/ mlおよび500μgのの最終濃度に噛み合う。培地を吸引し、画像化した後、ルシフェリン非含有培地と交換してください。
- 基板媒介遺伝子導入、次のレポーター遺伝子発現の動態を研究するために、所定の時間（2週間まで）でのエンドポイントアッセイを繰り返します。
ディレイド時点でプリザーブド伝達能力の7の検証
- 広告のeGFPドを準備BAEC（（2.1から2.11と3.1から3.9に従って）、ベクターテザリング用のRHC、IHC、SHCとNHCを使用してメッシュをrivatized、個別に60〜80％コンフルエントのウシ大動脈内皮細胞を96ウェルプレートのウェルにメッシュを配置）。
- （6.4から6.5に従って）蛍光顕微鏡や蛍光光度を使用して1と2日後にメッシュの配置でメッシュを固定化した広告eGFPを用いて培養したBAECの形質導入を分析します。
- 形質導入開始後48時間は、PBSで二回メッシュを含むウェルを洗う。
- 各ウェルに0.25％トリプシン/ EDTAを200μlを加え、（100 rpm）しながら37℃で15分間インキュベートする。 PBSで洗浄する3倍。
- メッシュに関連付けられているすべてのEGFP陽性細胞の完全な除去を確認するために、蛍光顕微鏡や蛍光光度法を使用してください。
- （2から2.7×10 4細胞/ウェル）60〜80％の初期播種密度で部分的に放出されたメッシュとウェル内に新鮮に継代したBAECをシード。
- 37℃、5％CO 2でプレートをインキュベートする
ステント血管形成術のラット頚動脈モデルにおける8広告溶出型ステントの展開
- このプロトコルで説明されているすべての動物の手順は、実験動物の使用に関する連邦の規制に適合し、フィラデルフィア小児病院のIACUCによって承認された。無菌外科の条件を遵守するために、すべての商品は、オートクレーブ滅菌する。ビーズ滅菌器は、最大5つの連続した動物では器具の使用の間に採用されている継続的な無菌性を保証するため。
- 広告リュックが 2.1から2.11と3.1から3.9に従ったステントを-eluting準備します。使用前にはもはや24よりも時間、4℃で滅菌PBS中のウイルス誘導体化ステントを保管してください。
- ケタミンのIP注入（100mg / kgの）、およびキシラジン（5ミリグラム/ kg）での雄性Sprague-Dawleyラット（400〜450グラム）を麻酔。デ足のピンチ応答と筋緊張による麻酔深度termine。角膜と強膜の乾燥を防ぐために、眼科獣医軟膏を適用します。注：4％吸入麻酔及び麻酔を誘導し、維持するための2％のイソフルラン（1 L /分）、可能であるが、動物の頸部への無料アクセスを妨げるため、経験の浅いユーザーにはお勧めしません。
- つま先のピンチによって麻酔の深さを再評価。剃ると無菌的に準備ネックと上胸部。抗生物質（セファゾリンを、20mg / kgの; IM）投与し、鎮痛剤（メロキシカム; 0.5ミリグラム/ kgを、SC）および食塩水（10ミリリットル/ kgで、SC）を。 24 Gカテーテルを尾静脈にカテーテルを挿入し、ヘパリン投与（200 IU / kgで、IV）。注：10mg / kgの（IM）、エンロフロキサシン（バイトリル）の用量は、代わりにセファゾリンを用いることもできる。グラム陽性菌に対して有意な活性を欠いている抗生物質の使用は避けてください。 10-15ミリグラム/ kgのカルプロフェン（リマダイル）が先制鎮痛薬としてではなく、メロキシカムを用いてもよい。麻薬性鎮痛薬（ 電子.G。、モルヒネ、ブプレノルフィン）は、それらの呼吸の押下特性のために避けるべきである。
- 皮膚や首の筋膜を通して正中切開を行います。左外頸動脈を分離するために鈍い切開技術を使用してください。ネクタイオフ外頸動脈を最も遠位親しみサイトで。内頸動脈の原点にスライド一時合字を適用します。
- 左外頸動脈内2mmの動脈切開切開を加えます。
- 外頸動脈の切開部を介して共通頚動脈に2 - フレンチフォガティカテーテルを挿入します。生理食塩水でカテーテルの先端を膨らませると、内皮をはぎ取るために、頸動脈分岐部に大動脈弓から3倍を渡します。
- フォガティカテーテルの上と総頸動脈への配管の一部（1.04ミリメートル外径、0.99ミリメートルID）をスライドさせます。フォガティカテーテルを撤回。
- マウントおよびAd リュッククリンプは、1.5のバルーンの上にステントを誘導体化直径血管形成術用カテーテル。テフロンチューブを通してステントを挿入し、総頸動脈の中央部分にそれを進める。管または血管壁に対してステントをこすることは避けてください。
- 30秒間12気圧でステントを配備し、血管形成術用カテーテルを引き抜く。
- 動脈切開部位への外頸動脈の近位をオフにネクタイと内頸動脈の一時合字をリリース。
- 肌を4.0ビクリル縫合糸を実行し、主食で層における手術創を修復します。
- 外来まで加温パッドの上に動物を回復し、その分離されたケージに戻す。痛みや不快感の徴候は通常、手続き後の最初の12時間を超えて、術後の動物が展示されていないが、72時間メロキシカム療法（0.5ミリグラム/ kgで、毎日SC）の拡張を検討してください。
動脈遺伝子発現の9生物発光イメージング
- 所定の時点（1日目 - 3総頸動脈における遺伝子溶出ステント展開後数週間の範囲）は、イソフルラン吸入麻酔（酸素中の2〜4％イソフルラン）を用いてラットを麻酔。
- サイトを準備し、手術創を再度開く無菌的に、外科用ステープルを外します。左総頸動脈に鈍的切開、再ゲインへのアクセスを使用し、迷走神経および隣接する結合組織から分離。
- PBS中50 mg / mlのルシフェリン、PBS中の25％プルロニックF-127の混合物を準備します（1：4 v / v）で、氷上に保管してください。注：この製剤は、4℃での粘性溶液として存在し、すぐに37℃で組織との接触時にゲル化させる。
- 総頸動脈の露出セグメントに直接冷やしルシフェリン/プルロニック混合物を200μlを適用し、ゲル堅さを確認します。
- IVISスペクトラム装置の撮像チャンバー内の仰臥位で動物を置き、フェイスマスクでイソフルラン麻酔を維持している。
- での買収では、コントロールパネルウィンドウ上で（距離をobjectに6.6センチメートルカメラ）の位置「B」を選択します（画像、バージョン4.2以降を生きる）および、「視野」と「ビニング」と題されたドロップダウンメニューから係数「中」ビニング。対象の高さ]ボックスに「2.5センチ」入力します。 「露出時間」ボックスに、時間の単位として「分」を選択し、「2」の数値を選択します。
- 三分ルシフェリン/プルロニックゲルを塗布した後、画面上の「取得」ボタンをクリックして画像取得を開始します。注記：画像取得時間、予想される信号強度に応じて、1〜6分で変えることができる。
- 画像を取得した後、生理食塩水でゲルを洗浄し、滅菌ガーゼ、コットンアプリケーターで動脈周囲のスペースを軽くたたく。
- ビクリル縫合糸とステープル皮膚に傷を閉じます。
- 動物を回復し、そのケージに戻す。後でtで繰り返しイメージングステントを固定化したAdベクターによってもたらされる動脈発現の時間経過を研究するためのIMEを指しています。
- 代わりに、ルシフェリンの全身投与後撮像を行う。 9.1から9.2に従って動物を麻酔し、分取。 24 Gカテーテルおよびサージカルテープとの安全なカテーテルを尾静脈カテーテルを挿入。
- PBSでルシフェリン溶液を調製（50 mg / ml）を10秒間隔でカテーテルを通して溶液1mlを注入する。注射後1分間は9.7から9.8に従って画像取得を開始します。注：より速い注入速度（<10秒）発作活動や呼吸停止を引き起こすことができます。発作や呼吸停止が撮像中に発生した場合、動物を安楽死させなければなりません。
- ステップ9.10に従ってください。
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Representative Results
ベクター放出実験
そのような血管内ステントなどの介入装置を含む、インプラントの表面へのアデノウイルスベクターのテザリングは、部分的にベクトル '物理的なターゲティングの欠如をなくす、疾患部位へのベクトルを近似する。しかし、標的組織の形質導入を介して治療効果を達成することができるように、ベクターは、（ 図2）表面から放出されなければならない。加水分解性架橋剤の使用は、架橋剤の加水分解によって媒介さ1のベクトルの有効な付着は変性polybisphosphonateする）、チオール設置金属インプラントと、2）持続放出を可能にするために仮定された。
誘導体化手順の終わりまでに、メッシュディスクに関連付けられた広告のeGFPベクターのゲノムコピー数のeGFP特異的プライマー（ 図3）でウイルスDNAのPCRにより決定される。に応じて、具体的な架橋剤に用い、結合したAdベクターの量は、9 10×9 10×3.5〜5.7個/メッシュを変化させる必要があります。この量は、単層構成で100 nmの広告粒子を収容0.25 cm 2の総面積を持つ単一のメッシュディスクの推定の最大容量（2.5×10 9）との公正な対応をしている。クロスリンカー修飾の工程においてAdベクターの出発量が5×10 11粒子であるため、修正されたベクトルのわずか約1％が最終的にPABT / PEI PDT上に固定化されたステンレス鋼表面を誘導体化。
両方の鎖中のエステルの加水分解の速度およびベクトルと生体材料との間のリンクの数は、表面からのAdベクターの放出の全体的な動力学に影響を与えることが期待される。
前の架橋剤modificaに、放出実験を容易にするために、アデノウイルス粒子は、Cy3の蛍光団（第1プロトコル）で予め標識することができるると、表面の固定化（プロトコル;項3）。表面結合蛍光の減少は、蛍光（ 図4A）および蛍光顕微鏡（ 図4B）によって同時に評価時間かけて生理的緩衝ベクターの放出を監視するための間接的な方法として使用することができる。 RHCおよびIHC結合を介して付着したAdベクターは、それらのSHC-とNHC付カウンターパートと比較して大幅に高速リリースを実証する必要があります。テザーベクターの20％未満がSHCとNHC中に放出されることが観察された所与の例では、45％表面結合ベクトルの39％の損失が、それぞれ、30日目によりRHC及びIHC係留ベクターで観察された固定化サンプル（ 図4A）。
さらに、Adベクターは、従って、おそらく持つべきベクトルと金属基板との間にテザー異なる数の異なる同一のHCの濃度とを用いて、固定化ベクトルの放出の非類似動力学。実際、0.1 mMのRHCを用いてベクター改変は、0.5 mMのRHC（ 図4A）を固定化し、ベクターで観察されたよりもかなり短い時間で放出速度をもたらした。蛍光顕微鏡データ（ 図4B）は、メッシュサンプルと表面結合蛍光のより速く、より深遠な減少を実証し、蛍光測定に基づく定量的なベクトル·リリース解析とよく相関IHC-、RHC-、特に低濃度のRHC-テザーのベクトルを用いて処方彼らのNHC-とSHC-テザーカウンターパートと比較して。
メッシュ固定化広告のベクターを用いたin vitro伝達に
定量的な発現解析（蛍光法）と空間の観察（蛍光顕微鏡）の両方と互換性があることで、広告のeGFPは SMCで形質導入および内皮を監視するための好ましいレポーターベクターである細胞培養は無料で、メッシュを固定化したAdベクターの両方で処理した。 75μMを超える濃度でRHC（ 図5）、ならびに他の架橋剤を有する（図示せず）を用いて広告キャプシドの化学修飾が大幅ファイバーノブのマスキングおよび再構成のために、おそらく、 インビトロで非固定化ベクターの形質導入効率を損なうコクサッキーアデノウイルス受容体（CAR）を介して細胞への結合のための広告が利用するドメイン。ベクターは、基板に係留することにより、標的細胞の近傍に保持されているので、ノブ-CAR相互作用の役割は、基板に固定化ベクターを用いた形質導入のためのより少ない重要である。かかわらず、HCタイプの細胞培養実験では、メッシュに関連したAdベクターは、空間的にメッシュの境界線（ 図6Aおよび6C）から300〜500ミクロンの範囲内に位置する細胞に伝達事象を制限一貫して可能である。典型的には、トランスジーンのピークレベル電子式は、SMCに噛み合う（ 図6Aおよび6B）またはBAEC（ 図6Cおよび6D）の培養物-loaded広告eGFPの配置後3〜5日後に達成される。同じベクトルロードでは、ピークのeGFP発現レベルは、次の順序で増加する：NHC-、SHC-、IHC-とRHC-テザーのベクトルを、それぞれの放出動態プロファイルの違いを反映した（ 図4）。さらに、より耐久性の導入遺伝子発現は、RHC製剤化対応物（ 図6D）で処理した細胞と比較して、IHC処方メッシュで処理した細胞で観察される。
利用される細胞培養系のメッシュを配置した後、後48時間未満で、または金属表面から放出されたベクター粒子によってもたらされる遅延伝達事象の調査のための便利なセットアップを示す。このアプリケーションでは、fluorometによりeGFP発現を決定した後RYおよび蛍光顕微鏡検査は、形質導入の開始後48時間で、BAECをトリプシン処理され、メッシュを乱すことなくウェルから吸引した。たてに継代非形質導入されたBAECその後部分的に放出されたメッシュの上に再プレートです。 2日目の時点の後のメッシュ担体から放出されたウイルス粒子による「新規」伝達事象は、蛍光顕微鏡および蛍光によって評価される（ 図7Aおよび7B）。メッシュロケールに特徴空間的制約を示す強固なeGFP発現は、典型的には、細胞培養培地を完了するためにさえ、48時間曝露後のメッシュに結合したAdベクターのよく保存形質導入能力を確認し、これらの「新しい」培養物（ 図7）で観察される37℃で。
in vivo研究
Uに関連した潜在的な影響を調べるため、動脈伝達、広告リュックは RHC-、IHC-、SHC-とを用いて調製されたステント-elutingを移植した動物で異なるHCのSE NHCを修飾されたベクターは、1および8日ステント配置します（ 図8）の後に生物発光イメージングを施行した。イメージングは、ルシフェリンの局所血管周囲投与（2 mg）をプルロニックゲルと同時処方に従って行った。この配合物は、氷上で冷却粘性流体であるが、37℃で組織と接触させたときにゲルに直接の相転移を受ける。予備実験は、図示しない全身（腹腔内または静脈内）ルシフェリンの投与と比較した場合、広告リュックでより安定で再現性の発光信号におけるルシフェリン結果の血管周囲送達は、血管組織を-transducedことを実証した。
ステントとステント配備手術ウイルステザリングが技術的に音だったら、明確に定義された信号は、ステント付きセグメントに対応するラット頚動脈が放出されて記録される。 IHC-とSHC-を受けたラットに続くステント移植後のある日、通常は最も高い発光シグナルを示すRHC-策定広告リュックステントで治療した動物は、ステント（ 図8Aおよび8B）を策定しました。無知覚可能信号は、血管組織（ 図8Aおよび8B）の効果的な形質導入のためのステントからのスムーズなベクターの放出の重要性を強調し、NHC係留広告リュックを用いて調製されたステントを移植したラットの群では観察されない。それはそれぞれIHC-とSHC-策定ステント、（ 図8Aおよび8B）で1.4〜1.8倍に増加させながら、8日目では、RHC-策定ステントとルシフェラーゼ発現の平均強度は、数倍に低下する。この知見は、より遅い親族を示す遺伝子溶出ステントで、より耐久性のある血管の伝達の仮説と一致するステント表面からのベクトルの放出ETICS。
記載された研究全体で使用される架橋剤（NHC、SHC、IHCおよびRHC）の1。構造式図 （許可28で修飾された）。
図2 PABTにAdベクターテザリングを表すスキームは/ PEI PDTは HCや架橋剤加水分解の際にベクトルの今後のリリースを経由してステンレス鋼表面-修飾 （許可28で修飾された）。
図3 PCRベースの定量PABT / PEI PDTの表面に架橋剤テザリングを介して固定化された広告eGFPのificationは、 ステンレス鋼メッシュを-修飾ステンレスメッシュ各条件についてRHC、IHC、SHC、またはNHCた（n = 3を介して固定化された広告eGFPを用いて処方された）。プロテイナーゼK処理の後、ウイルスDNAのMinEluteカラムを用いて溶出して精製した。 eGFPの特異的プライマーを用いてウイルスDNAの増幅は、7500リアルタイムPCRエンジンで行い、SYBRグリーンで検出した。データ正規化は、非固定化広告のeGFP（パーミッション28で修飾された）既知量の検量線に基づいていた。
Adベクターの図4リリース動態は、HCと金属基板に繋留。セントainlessスチールメッシュがPABTに装着〜2×10 9 Cy3標識広告粒子で誘導体化された/ PEI PDTは 500μMのNHC、SHC、IHC、RHCと（RHC-Lと呼ぶ）、100μMRHCによる修飾後の表面-修飾。蛍光標識されたAd-粒子の放出は、（A）570分の550 nmおよび（B）によくスキャン蛍光蛍光顕微鏡（;原倍率200Xローダミンフィルターセット）によって指示された時点で調べた。蛍光測定結果は、平均±SEMとして提示さはn = 8-10されます。 P <NHCとSHC IHC、RHC VsとRHC-L基との間のすべての比較について0.001（許可28で修飾された）の事後Tukey検定と分散分析により決定した。
非固定の広告e の図5。形質導入の有効性RHC。ラット胚性大動脈由来のSMC（A10ライン） による修飾、以下 GFPは変更されていない広告のeGFPまたはベクトル示されるように、RHCで修飾されたいずれかで1000のMOIで形質導入した。レポーター発現は、48時間（パーミッション27で修飾された）形質導入後（535分の485 nm）の蛍光定量的に決定した。
ステンレス鋼に固定化Adベクターを用いて培養SMCとBAECの図6形質導入は、HCと噛み合っている。メッシュはNHC、SHC、IHC、およびRHCを経由して、添付の〜2×10 9 [広告のeGFP粒子で誘導体化した。メッシュはその後個別にサブコンフルエントA10（A、B）およびBAEC（C、D）の単層の上に配置した。 Adベクター係留メッシュで処理した細胞の形質導入（eGFP発現レベルとして表現）は、fで評価した。luorescence顕微鏡（A、C、FITCフィルターセット、元の倍率100X）でよくスキャン蛍光（B、D）。蛍光測定結果は、平均±SEMとして提示されているn = 4の（許可28で修飾された）。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
遅延した時点でのAdベクターを固定化した基板の図7形質導入能力。広告のeGFPは NHC、SHC、IHCまたはRHCテザーを通じて噛み合う鋼上に固定化した。メッシュはサブコンフルBAEC単層上に置いた。二日配置後、BAECをトリプシン処理し、メッシュを乱すことなく除去。新しい、非形質導入されたBAECその後メッシュの上に播種した。広告（; FITCフィルターセット、元の倍率100X）および蛍光（B） のeGFP形質導入能力を、蛍光顕微鏡を用いてeGFP発現によって測定した。 。（許可28から変更）測定は、指示された日に撮影された代表的な画像が使用されたと蛍光測定の結果は、平均値±SEMであり、n = 4 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
生体内 。広告リュック （1.3×10 10個の粒子） でのステントを固定化した広告リュックの図8形質導入効率は NHC、SHC、IHCまたはRHC（すべての群についてはn = 3〜4）を介して血管内ステントに繋留された。広告リュックの導入効率<ステントから溶出/サブ>生物発光イメージング（IVISスペクトル）1および8日後のステントの展開（A）で測定したところ、（許可28から変更）対数目盛（B）。使用してプロットで拡大表示こちらをクリックしてくださいをこの図のバージョン。
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Discussion
提示されたプロトコルは、ステンレス鋼表面をコートレスするアデノウイルスベクターの可逆的結合によって達成基板を介した遺伝子送達のための運用方法について説明します。血管再狭窄のステントベースの遺伝子治療の特定の目的のために開発されているが、この技術は、生体材料、生物医学的インプラントおよび遺伝子治療の領域ではるかに広い用途を有する。
提示の研究はもっぱら原型金属基材としてステンレス鋼を利用しているが、PABTは、同等の親和性を有するコバルト/クロムおよびニチノールなどの他の金属合金と結合する（公開されていない）。金属とPABTの無差別相互作用が大きく、この技術31の可能性の生物医学アプリケーションの数を拡大する。また、HC-テザー遺伝子ベクターの使用は、材料表面上にチオールインストールする他の方法を必要とするにもかかわらず、生体材料の他のタイプの実行可能である。
ontent広告遺伝子ベクターは、多くのヒト細胞型および組織中で堅牢な伝達を実現する一方で">、その臨床的意義は、 アデノウイルス 4によって誘発された、強力な炎症性および免疫応答によって制限されます。策定遺伝子溶出ステントでこの目的を達成するために、長期化（4ヶ月）動脈表現ルシフェラーゼを発現するアデノ随伴ウイルスベクターを用いて、HC改質は、最近（公開されていない）が示された。方法論は堅牢である。メインプロトコルからの小さな偏差は、一般的に、インビトロおよびインビボで遺伝子発現の有意な変化をもたらさない。それにもかかわらず、成果に影響を及ぼし得るいくつかの重要な問題を同定した。
名前が示すように、まず、加水分解性架橋剤が原因で鎖エステルの加水分解に水と反応して切断可能である。さらに、アミン-反応性部分は、Nの -sulfosuccinimidylも同様に加水分解可能である。架橋剤は、Uに格納する必要がありますファインダー-20℃でアルゴン雰囲気は、それらの活性を保存する。同じ理由で、HC（プロトコルセクション3.2）の溶液を調製した後、ウイルスプレップへのHCのソリューションを追加してすぐに進みます。
第二に、提示生物結合配列のいくつかの中間ステップ中に金属表面上に形成されているチオール基は急速に周囲の空気中の酸素によって酸化される。これを防ぐために、常に脱気水に沈め脆弱な金属試料を保つ。
第三に、井戸の底とメッシュの完全な位置合わせが成功した形質導入のために必要とされる。取扱い中のメッシュディスクを曲げないでください。
第四に、表面結合Adベクターの脱落を防止するために、ステント挿入の際にテフロンシースと血管壁に対する遺伝子溶出ステントの過度の擦れを避ける。
移植可能なbiomateriaの表面への遺伝子ベクターの共有結合lsがベクターの非共有結合テザリングでは実現よりも、ベクトル放出動態より良好な制御の見かけの利点を有する。ステントプラットフォームから遺伝子送達の設定では、ほとんどの研究では、ステント展開32-34の後1-7日以内にウイルスおよび非ウイルスベクターの完全な放出を報告している。一方、HC経由Adベクターの固定化は、最初の月のベクトル負荷のわずか20から45パーセント（ 図4Aおよび4B）の放出を示した。また、放出および形質導入動態の部分的な変調は、異なる加水分解速度論を示す異なったHCを用いて、またはウイルス表面改質に用いられるHCの濃度を変化させることによって達成可能である。さらに、本研究で検討されていないが、別の架橋剤分子とベクターとの共同修正同時微調整ベクトルのリリースおよび形質導入のための別の機会を提供しています。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 316 stainless steel mesh disks | Electon Microscopy Sciences | E200-SS | |
| Generic 304-grade stainless steel stents | Laserage | custom order | |
| AdeGFP | University of Pennsylvania Vector Core | AD-5-PV0504 | |
| AdLuc | University of Pennsylvania Vector Core | AD-5-PV1028 | |
| AdEMPTY | University of Pennsylvania Vector Core | A858 | |
| Cy3(NHS)2 | GE Healthcare | PA23000 | |
| Sepharose 6B | Sigma-Aldrich | 6B100-500ML | |
| UV 96-well plates | Costar | 3635 | |
| Fluorometry 96-well plates | Costar | 3915 | |
| Cell culture 96-well plates | Falcon | 353072 | |
| Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride (TCEP) | Pierce Thermo Scientific | 20490 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Pierce Thermo Scientific | 20290 | |
| sulfo-LC-SPDP | Pierce Thermo Scientific | 21650 | |
| Spectrophotometer | Molecular Devices | SpectraMax 190 | |
| Spectrofluorometer | Molecular Devices | SpectraMax Gemini EM | |
| Orbital shaker incubator | VWR | 1575R | |
| Horizontal airflow oven | Shel Lab | 1350 FM | |
| Centra-CL2 centrifuge | International Equipment Company | 426 | |
| Digital vortex mixerer | Fisher Thermo Scientific | 02-215-370 | |
| Eclipse TE300 fluorescence microscope | Nikon | TE300 | |
| DC 500 CCD camera | Leica | DC-500 | |
| 7500 Real-Time PCR system | Applied Biosystems | not available | |
| IVIS Spectrum bioluminescence station | Perkins-Elmer | not available | |
| EDTA dipotassium salt | Sigma-Aldrich | ED2P | |
| Bovine serum albumin fraction V (BSA) | Fisher Thermo Scientific | BP1600-100 | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P1379 | |
| Dumont forceps | Fine Science Tools | 11255-20 | |
| A10 cell line | ATCC | CRL-1476 | |
| Bovine aortic endothelial cells | Lonza | BW-6002 | |
| Luciferin, potassium salt | Gold Biotechnology | LUCK-1Ge | |
| Pluronic F-127 | Sigma-Aldrich | P2443-250G | |
| PBS without calcium and magnesium | Gibco | 14190-136 | |
| Fetal bovine serum | Gemini Bio-Products | 100-106 | |
| Penicillin/Streptomycin solution | Gibco | 11540-122 | |
| DMEM, high glucose | Corning cellgro | 10-013-CV | |
| 0.25% Trypsin/EDTA | Gibco | 25200-056 | |
| QIAamp DNA micro kit | Qiagen | 56304 | |
| Power Sybr Green PCR Master Mix | Applied Biosystems | 4367659 | |
| MicroAmp Optical 96-well Reaction Plate | Applied Biosystems | N8010560 | |
| MicroAmp Optical Adhesive Film | Applied Biosystems | 4360954 | |
| Cephazolin | Apotex | not available | |
| Loxicom (Meloxicam) | Norbrook | not available | |
| Heparin sodium | APP Pharmaceuticals | not available | |
| Ketavet (Ketamine) | VEDCO | not available | |
| Anased (Xylazine) | Lloid | not available | |
| Forane (Isoflurane) | Baxter | not available | |
| Curved Moria iris forceps | Fine Science tools | 11370-31 | |
| Curved extra-fine Graefe forceps | Fine Science Tools | 11152-10 | |
| Dumont #5 forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| Vannas spring scissors | Fine Science Tools | 15018-10 | |
| Fine scissors - ToughCut | Fine Science Tools | 14058-09 | |
| Surgical scissors | Fine Science Tools | 14101-14 | |
| Vicryl suture (5-0) | Ethicon | J385 | |
| Suture thread (4/0 silk) | Fine Science Tools | 18020-40 | |
| Michel suture clips | Fine Science Tools | 12040-02 | |
| Wound dilator (Lancaster eye specula) | KLS Martin | 34-149-07 | |
| Hot bead sterilizer | Fine Science Tools | 18000-45 | |
| Michel suture clip applicator | Fine Science Tools | 112028-12 | |
| Insyte Autoguard 24 G IV catheter | Beckton-Dickinson | 381412 | |
| 2F Fogarty catheter | Edwards Lifesciences | 120602F | |
| Teflon tubing | Vention | 041100BST | |
| PTA catheter | NuMed | custom order | |
| Gauze pads | Kendall Healthcare | 9024 | |
| Cotton applicators | Solon Manufacturing | WOD1003 | |
| Saline | Baxter | 281321 | |
| 10 ml syringe (Luer-Lok) | Beckton-Dickinson | 309604 | |
| 1 ml syringe (Luer-Lok) | Beckton-Dickinson | 309628 | |
| Clippers with #40 blade | Oster | 78005-314 | |
| Transpore surgical tape | 3M | MM 15271 | |
| Puralube vet ointment | Pharmaderm | not available |
References
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