Abstract
In-stent restenosis presenterer en betydelig komplikasjon av stent-baserte revaskulariseringsprosedyrer mye brukt for å reetablere blodstrømmen gjennom kritisk smalere segmenter av koronare og perifere arterier. Endovaskulære stenter stand tunbare utgivelsen av gener med anti-restenotic aktivitet kan presentere en alternativ strategi til tiden brukt medikamentavgivende stenter. For å oppnå klinisk oversettelse, må genet tent oppviser forutsigbare kinetikken av stent-immobiliserte gen vektormeldingen og setespesifikk transduksjon av vaskulatur, og samtidig unngå en overdreven inflammatorisk respons vanligvis forbundet med polymerbelegg som brukes for fysiske innesperring av vektoren. Dette notatet beskriver en detaljert metodikk for coatless tethering av adenovirus genvektorer til stenter basert på en reversibel binding av de adenoviruspartikler å polyallylamin bisfosfonat (PABT) -modified rustfritt stål overflate via hydro tverrbindere (HC). En familie påbifunksjonelt (amin-og tiol-reaktivt) HC med en gjennomsnittlig t 1/2 av den in-kjeden esterhydrolyse strekker seg mellom 5 og 50 dager ble benyttet for å knytte vektor med stenten. Vektoren immobilisering fremgangsmåte blir vanligvis utført i løpet av 9 timer og består av flere trinn: 1) inkubering av metallprøver i en vandig oppløsning av PABT (4 timer); 2) avbeskyttelse av tiolgrupper som er installert i PABT med tris (2-karboksyetyl) fosfin (20 min); 3) utvidelse av tiol-reaktive kapasitet på metalloverflaten ved omsetning av prøvene med polyetylenimin derivatisert med pyridylditio (PDT) grupper (2 t); 4) omdannelse av PDT grupper til tioler med ditiotreitol (10 min); 5) modifisering av adenovirus med HC (1 time); 6) rensing av modifiserte adenovirus partikler størrelse-utelukkelseskolonne-kromatografi (15 min), og 7) immobilisering av tiol-reaktive adenovirale partikler på tiolerte ståloverflaten (1 time) ved. Denne teknikken har bred potensiell anvendelse utover stenter,ved å tilrettelegge overflaten engineering av bioprotetiske enheter for å forbedre sin biokompatibilitet gjennom underlaget-mediert genet levering til cellene grensesnitt den implanterte fremmedlegemer.
Introduction
Effektiviteten av genterapi som en terapeutisk modalitet er hemmet av den dårlige målretting kapasiteten genterapi vektorer 1,2. Mangel på skikkelig målretting resulterer i sub-terapeutiske nivåer av transgene uttrykk ved målposisjonen og fører til en bred spredning av vektorer til ikke-målorganer 3, inkludert de som er ansvarlige for montering av immunresponser mot både vektoren og kodet terapeutisk produkt 4, 5. En mulig betyr å oppveie promiskuitet av transduksjon og å fremme målretting er å innføre genvektorer på ønsket sted i en form som utelukker deres gratis formidling via blod og lymfe. Vanligvis er slike anstrengelser er avhengige av en lokalt injiserbare leveringssystemer bestående av enten virale eller ikke-virale vektorer blandet med fibrin, kollagen og hyaluronsyre hydrogel matriser 6-10 som er i stand til forbigående nærende genvektorer ved injeksjonsstedet ved fysisk å omslutte them i et polymert nettverk.
Et annet generelt akseptert paradigme for lokaliserte genterapi benytter immobilisering av genvektorer på overflaten av implanterte proteser 11,12. Permanente medisinske implantater (endovaskulære, bronkial, urologiske og gastrointestinale stent, pacemakere, kunstige ledd, kirurgiske og gynekologiske maskene, etc.) Brukes årlig i titalls millioner av pasienter 13. Mens generelt effektive, disse enhetene er utsatt for komplikasjoner som er utilstrekkelig kontrollert for ved dagens medisinske praksis 14-17. Implanterbare proteser presentere en unik mulighet til å tjene som proxy plattformer for lokalisert genterapi behandling. Fra den farmakokinetiske synspunkt, overflate derivatisering av medisinske implantater med relativt lav inngangs doser av genvektorer resultatene for å oppnå både en høy lokal konsentrasjon av genvektorer på implantatet / vev-grensesnitt og bremse kinetikken av their fjernelse fra dette stedet. Som et resultat av langvarige oppholds og forbedret opptak av det målrettede cellepopulasjon, vektor immobilisering reduserer spredningen av genet vektor. Således utilsiktet inokulering av ikke-mål vev reduseres.
Overflate tethering av genvektorer på implanterbare biomaterialer (også betegnet som substrat-mediert genet levering eller fast fase genet levering) er implementert i cellekultur og dyreforsøk ved hjelp av både spesifikke (antigen-antistoff 18-20, avidinbiotin 21,22) og uspesifikke 23-26 (Charge, van der Waals) interaksjoner. Den kovalente binding av vektorer til overflaten av den implanterte innretning har tidligere blitt betraktet som ikke-funksjonelle, siden overdrevet sterke bindinger med overflaten til hinder vektor internalisering av målceller. Nylig ble det vist at denne begrensning kan overvinnes ved bruk av spontant hydrolyserbar krysslinkeren brukes som tethennes mellom den modifiserte metalliske overflaten av stenten og kapsidproteiner av den adenovirale vektor 27,28. Videre kan vektoren frigjøringshastighet og tid løpet av transgene ekspresjon in vitro og in vivo bli modulert med bruk av hydrolyserbare kryssbindere som oppviser forskjellige kinetikken for 28 hydrolyse.
Foreliggende papir gir en detaljert protokoll for den reversible kovalente binding av adenovirale vektorer til aktiverte metallflate og introduserer et nyttig eksperimentelle oppsettet for å studere påfølgende transduksjon hendelser in vitro i dyrkede glatte muskel og endoteliale celler og in vivo i rotte carotis modell av stent angioplastikk .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Utarbeidelse av Cy3-merket Adenovirus for utgivelsen Experiments
- Suspendere 2 x 10 12 partikler av Ad tom (ca. 2 x 10 11 smitte enheter) i 650 mL av karbonat / bikarbonat buffer (CBB, pH 9,3).
- Oppløs innhold i en ampulle (0,2 mg) av amin-reaktivt fluorescerende fargestoff (Cy3 (NHS) 2) i 1 ml CBB til en endelig konsentrasjon på 0,2 mg / ml.
- Tilsett 100 ul av fargestoff oppløsning av virus suspensjon, vortex i 5 sekunder og inkuberes i 1 time ved 28 ° C med risting (100-200 rpm).
- Stabilisere en 20 ml Sepharose 6B kolonne med PBS. Legg 750 mL av Cy3-merket Ad suspensjon dråpevis til midten av gelen sengen.
- Etter viral suspensjon syrer harpiksen, tilsett 5 ml PBS. Kast eluatet.
- Tilsett 0,5 ml PBS og samler eluatet i en merket glassbeholder. Gjenta dette trinnet 10x samle totalt ti 0,5 ml fraksjoner.
- Analyse the samles fraksjoner ved spektrofotometri (260 og 280 nm) for viral DNA-innhold.
- Pool fraksjonene som inneholder mer enn 10% av totalt (summen av F1 til F10) optisk tetthet (OD) ved 260 nm. Merk: Vanligvis fraksjonene F3, F4, F5, F6 og slås sammen og blandes.
- Re-assay den blandede sammenslåtte fraksjoner ved spektrofotometri (260 og 280 nm), og analysen av fluorometri (ex 550/570 em nm) for virus-DNA-innhold og Cy3 merket kapsid protein, respektivt. Merk: En Cy3 (NHS) 2 kalibreringskurve som dekker 10 -9 -10 -13 mol / L utvalg blir fremstilt og fluorimetrisk analysert på den samme plate som de sammenslåtte fraksjonene.
- Beregn den merkede virus yield og merking tetthet. Anta at 1,19 x 10 12 viruspartikler / ml svarer til en OD-enhet for en 1 cm banelengde 29.. Bruke formelen: Yield = [(OD 260nm /1.19)*10 12 * V / inngang Ad beløp] * 100, hvor OD 260nm er den optiske density av den samlede formuleringen ved 260 nm, og V er volumet av den samlede formuleringen (ml) for å beregne Ad Utvinningsutbyttet (%). Bruk formelen: Merking Densitet = C * 6.02 * 10 23 / (OD 260nm /1.19)*10 12, der C er Cy3 konsentrasjon av den samlede formulering (mol / ml), og OD 260 nm er den optiske tetthet av den samlede formulering 260 nm for å beregne gjennomsnittlig Cy3 merking tetthet. MERK: En typisk gjenvinning av merket virus er> 70% av inngangs dose. Merkingen tetthet er 600-800 fluoroformolekyler per enkelt virus partikkel.
- Aliquot Cy3-merket Ad tømmes i mindre deler (typisk 5 x 10 11 partikler) som er egnet for de enkelte utløser eksperimenter. MERK: Gjeldende protokoll spesifiserer bruk av Cy3-merket Ad utelukkende i utgivelsen eksperiment. Alle transduksjon Studier utføres med ikke-merket vektorer.
2. Aktivering av Metal Samples
- Vask rustfritt steel mesh disker eller rustfritt stål stenter fortløpende i isopropanol (5 min x 2) og kloroform (5 min x 2) ved 55 ° C med risting (100 rpm). Fjern løsningsmidlet.
- Varm opp prøvene i 30 min ved 200 ° C.
- Oppløs polyallylamin bisfosfonat med installerte latente tiolgrupper (PABT 27,28,30) i vann (1-2% w / v) ved 72 ° C med risting (100 rpm). Juster pH til 4,5-5 med KHCO tre.
- Inkuber metallprøver i PABT løsning for 2-4 timer ved 72 ° C med risting (100-200 rpm). MERK: Fremgangsmåten kan bli stanset på dette punktet. Prøvene er stabile i 3 dager ved 4 ° C.
- Skyll prøvene tre ganger med dobbelt destillert vann (DDW).
- Eksponer prøvene til tris (2-karboksyetyl) fosfin (TCEP, 15 mg / ml i 0,1 M eddiksyre-buffer) i 15 min ved 28 ° C med risting (100-200 rpm).
- Skyll 5x i avgasset DDW.
- Expose prøvene til 2% polyethylenimin med installerte pyridyldithio grupper (PEI
- Skyll prøvene tre ganger med DDW.
- Eksponer prøvene til 10 mg / ml ditiotreitol / DDW for å konvertere grupper pyridylditio til tioler.
- Skyll 5x igjen i avgasset DDW.
3. Adenovirus Aktivering og Metall Immobilization
- Suspendere 5 x 10 11 partikler av enten Ad EGFP eller Ad Luc (ca. 5 x 10 10 smitte enheter) i 487,5 til 495 mL av karbonat / bikarbonat buffer (CBB, pH 9,3). Merk: for utgivelsen studier, bruk 5 x 10 11 av Cy3 merket Ad tomme partikler (justere volumet til 487,5 til 495 mL med CBB).
- Oppløse HC med varierende hydrolyse priser 28 [(raskt (t 1/2 = 5 d), intermediately (t 1 /2 = 12 d) og langsomt (t 1/2 = 50 d) HC, dvs. RHC, IHC eller SHC; Figur 1] eller ikke-hydrolyserbar kryssbinder (NHC), sulfo-LC-SPDP i CBB på 20 mM.
- Umiddelbart legge 5 til 12,5 ul av tverrbinder løsning for viruset suspensjon til et totalt volum på 500 ul (200-500 pM endelig konsentrasjon av tverrbinder), vortex og inkuberes i 1 time ved 28 ° C med risting (100- 200 rpm).
- Stabilisere en 20 ml Sepharose 6B kolonne med avgasset 5 mM EDTA / PBS (EPBS). Tilsett dråpevis 500 ul av cross-linker-modifiserte Ad suspensjon til sentrum av harpiksseng.
- Tilsett 5 ml av avgasset EPBS. Kast eluatet.
- Tilsett 0,5 ml avgasset EPBS og samler eluatet i en merket glassbeholder. Gjenta dette trinnet 10 ganger samle totalt ti 0,5 ml fraksjoner.
- Bestem OD av de innsamlede fraksjoner ved hjelp av spektrofotometri ved 260 og 280 nm og konvertere OD til virus titer (1,19 x 10 12 / ml CORREnal en OD) 29.
- Pool fraksjonene inneholdende> 10% av det eluerte virus (Merk: Vanligvis fraksjonene F3-F6). Gjenta spectrophotometric titer analysen for den sammenslåtte suspensjon.
- Overfør viral suspensjon til hetteglasset med de aktiverte metallprøver (som per 2.11). Inkuber i en argonatmosfære i 1 time ved 28 ° C med risting (100-200 rpm). Merk: Ad-tethered metallprøver innhentet i dette trinnet er videre brukt i de påfølgende release og transduksjon eksperimenter er beskrevet i protokollen avsnittene 5-7.
4. Kvantifisering av Surface-assosiert Ad Vector ved PCR
- Forbered maskene formulert med overflate immobilisert Ad EGFP tethered via NHC, SHC, IHC og RHC (n = 3 for hver type) som beskrevet i del 2 og 3.
- Bruk en QIAamp DNA Micro kit å isolere virus DNA. Plasser maskene enkeltvis i 1,5 ml plastrør inneholdende 200 ul av blandingen som består av 180 pl av ATL bUffer og 20 mL av proteinase K (både fra settet). Legg kjent mengde av Ad EGFP partikler (som standarder for kalibreringskurven) inn i separate rør inneholdende den samme blanding. Inkuber ved 56 ° C over natten uten risting.
- Tilsett 200 pl av AL-buffer (fra settet), bland ved virvling, tilsett 200 pl 100% etanol, og inkuber ved værelsetemperatur i 5 min.
- Overfør blandingen fra hvert rør til et individ MinElite kolonnen (fra settet) og sentrifugering ved 8000 opm i 1 min. Skyll mesh-holdige rør med 180 pl frisk ALT buffer, tilsett til respektive kolonner og sentrifugering ved 8000 opm i 1 min. Kast eluatene.
- Tilsett 500 pl av AW1 buffer (fra settet) i kolonnene og sentrifugering ved 8000 opm i 1 min. Kast eluatene.
- Tilsett 500 pl av AW2 buffer (fra settet) i kolonnene og sentrifugering ved 8000 opm i 1 min.
- Kast eluatene.
- Spin på 14.000 rpm for en ekstra 3 min until kolonnene er helt tørre. Kast eluatene.
- Tilsett 50 pl av MilliQ-grade vann inn i kolonnene. Spinne på 14000 rpm i 5 min. Samle 50 ul av eluatet fra hver kolonne i individuell samling rør (fra settet).
- Forbered PCR Master Mix løsning ved å kombinere multipliserer av følgende (12,5 mL of Power SYBR Grønn PCR Master Mix, 0,63 pl 10 mikrometer EGFP forstand primer [5'- ACG TAA ACG GCC ACA AGT TC -3 '], 0,63 mL av 10 mikrometer EGFP anti-sense primer [5'- AAG TCG TGC TGC TTC ATG TG -3 '], 6,3 mL av MilliQ-grade vann). Multiplisere disse volumene med antall planlagte reaksjoner inkludert "ingen DNA" kontroller.
- Last 5 mL av Ad EGFP DNA (fra trinn 4.8) og 20 mL av PCR Master Mix inn tredoble brønner på en mikroampere Optical 96-brønn Reaction plate. Tett plate med mikroampere Optisk selvklebende film. Spinn plate ved 1000 opm i 1 min for å fjerne luftbobler.
- Sett platen i kontakten på en 7500 Real-Time PCR-motor. I hovedmenyen til 7500 System SDS Software (v1.4 eller høyere) velger du "Opprett et nytt eksperiment". Klikk "Next". I "New eksperiment wizard"-skjermen velger SYBR Grønn fra en rullegardinmenyen, og klikk "Legg til". Klikk "Next" for å få et oppsett av platen. Marker alle brønner som skal analyseres, velg SYBR Green. Marker fortløpende ingen DNA kontrollbrønner, Ad EGFP DNA standarder og ukjente, og merk dem med respektive betegnelser fra rullegardinmenyen.
- Bytt til fanen instrument. Velg "Legg til dissosiasjon fase", endre brønnvolum fra standard 50 mL til 25 pl. Klikk på Start.
- Analyser PCR resultater ved hjelp etter å ha sjekket QC oppsummering for uteliggere og andre uregelmessigheter.
5. Slipp Kinetics av hydrolyseprossess kryss-linker-tethered Vector Partikler fra Model Steel Mesh
- Vask mesh prøvene derivatisert med Cy3-merket Ad via RHC, IHC, SHC og NHC (som per 3.9) i 1% BSA / PBS (1 t x 3) med risting (100-200 rpm).
- Ved hjelp av sterile fin pinsett, plasserer maskene i individuelle brønner i en 96-brønns plate fylt inn med 200 ul elueringsbuffer (0,1% BSA / 0,1% Tween-20 / PBS).
- Ta fluorescerende bilder av en sentral del av hver maske. Spill innstillingene for mikroskop og CCD-kamera som brukes for bildeopptak.
- Analysen platen fluorimetrisk (550 ex / 570 em) i godt skannemodus med maksimal reduksjon. Bruk brønner med ikke-derivatiserte masker som en bakgrunnskontroll.
- Inkuber platen ved 37 ° C med risting (50 rpm).
- Ved forutbestemte tider (1-30 dager range) Aspirer elueringsbufferen uten å forstyrre maskene og tilsett 200 ul av frisk elueringsbuffer. Gjenta trinn 4,3-4,5 etter du har byttet buffer.
6. transduksjon av Cultured CelLS av Mesh-immobilisert Ad Vectors
- Vask Ad EGFP - eller Ad Luc -derivatized maskene tre ganger med sterilt PBS i 5 min med risting (100 rpm).
- Ved hjelp av fin steril pinsett fjerne mesh disker en etter en og individuelt å plassere dem i brønner i en 96-brønns plate med celletype av interesse i log-fase vekst.
- Inkuber cellene for 24 timer ved 37 ° C, i 5% CO 2.
- Bruk respektive ikke-terminal endepunkt analysen (fluorescerende mikroskopi, fluorometri for EGFP eller bioluminescens bildebehandling for luciferase) for å bestemme utstrekning og den romlige fordelingen av genuttrykk i brønnene.
- Eventuelt til erstatning medium for PBS øke følsomheten av fluorometri assay (485/535 nm) hvis lav EGFP uttrykk er forventet. Merk: Hvis en fluorometer er utstyrt med godt skanning evne, lese platen i et godt skannemodus for å vurdere den romlige fordelingen av EGFP-uttrykke celler i brønnene. Utveksling PBS for medium etter fullført fluorometri.
- Bilde transduced celler i brønnene med Ad EGFP -eluting masker (både underliggende og avsidesliggende mesh) ved hjelp av FITC filtersettet. Ta representative bilder på 40-200X forstørrelse. Noter nøyaktige innstillingene for fluorescerende mikroskop og CCD-kamera som brukes til kjøp av bilder.
- Tilsett 5 ul av luciferin lager i PBS (10 mg / ml) direkte til brønner med Ad Luc -eluting maskene til en endelig konsentrasjon på 500 pg / ml og inkuberes ved 37 ° C og 5% CO2 i 10 min før Bioluminescens avbildning . Aspirer media og erstatte med luciferin-frie medier etter bildebehandling.
- Gjenta endepunkt analyser på et forhåndsbestemt tidspunkt (opptil 2 uker) for å studere kinetikken av reporter genuttrykk følgende substrat-mediert genoverføring.
7. Validering av Bevarte Transduksjon Kapasitet på utsatte tidspunkter
- Klargjør Ad EGFP derivatized maskene bruker RHC, IHC, SHC og NHC for vektor tethering (som per 02.01 til 02.11 og 03.01 til 03.09) og individuelt plassere maskene i brønnene til en 96-brønns plate med 60-80% konfluente storfe aorta endotelceller (BAEC ).
- Analyser transduksjon av kultivert BAEC med mesh-immobilisert Ad EGFP ved 1 og 2 dager etter mesh plassering ved å bruke fluorescens mikroskopi og fluorometri (som per 06.04 til 06.05).
- 48 timer etter begynnelsen av transduksjon vaske mesh-inneholdende brønner med PBS to ganger.
- Tilsett 200 pl av 0,25% trypsin / EDTA til hver brønn og inkuber i 15 min ved 37 ° C med risting (100 rpm). Vask 3x med PBS.
- Bruk fluorescerende mikroskopi og fluorometri å fastslå fullstendig fjerning av alle EGFP-positive celler er forbundet med maskene.
- Seed fersk passaged BAEC i brønnene med delvis utgitt maskene på en 60-80% første seeding tetthet (2 til 2,7 x 10 4 celler / brønn).
- Inkuber platen ved 37 ° C og 5% CO
8. Ad tent Deployment i Rat carotis Model of Stent Angioplastikk
- Alle dyr prosedyrer beskrevet i denne protokollen i samsvar med føderale forskrifter om forsøksdyr bruk og ble godkjent av IACUC av Barnas Hospital of Philadelphia. Å følge aseptiske kirurgiske tilstander alle instrumenter er autoklav steriliserte. For å sikre kontinuerlig sterilitet en perle sterilisator er ansatt mellom bruk av virkemidlene i inntil fem påfølgende dyr.
- Forbered Ad Luc -eluting stenter etter 02.01 til 02.11 og 03.01 til 03.09. Oppbevar virus-derivatisert stenter i steril PBS ved 4 ° C i ikke lenger enn 24 timer før bruk.
- Bedøve hann Sprague-Dawley rotter (400-450 g) med IP-injeksjon av ketamin (100 mg / kg) og xylazin (5 mg / kg). DeTermine anestesidybden ved pote klype respons og muskel-tonus. Påfør oftalmisk veterinær salve for å hindre tørrhet i hornhinnen og sclera. Merk: inhalering anestesi med 4% og 2% isofluran (1 l / min) for å indusere og opprettholde anestesi, henholdsvis, er mulig, men hindrer fri adgang til nakkeregionen av dyret, og således er ikke anbefalt for en uerfaren bruker.
- Revurdere anestesidybden ved tå klype. Barbere og aseptisk prep nakke og øvre bryst regionen. Administrer antibiotikum (cefazolin, 20 mg / kg, IM), analgetisk (meloksikam, 0,5 mg / kg, SC), og saltløsning (10 ml / kg, SC). Kateterhalevenen med en 24 G kateter og administrere heparin (200 IU / kg, IV). Merk: En dose på 10 mg / kg (IM) enrofloxacin (Baytril) kan brukes i stedet for cefazolin. Unngå bruk av antibiotika som mangler signifikant aktivitet mot Gram-positive bakterier. 10-15 mg / kg karprofen (Rimadyl) kan brukes i stedet for meloksikam som en preventiv analgetikum. Narkotiske analgetika (e.g., bør morfin, buprenorfin) unngås på grunn av deres åndedrett-deprimerende egenskaper.
- Utfør en midtlinjen snitt gjennom huden og nakke fascia. Bruk stump disseksjon teknikker for å isolere venstre ytre halspulsåren. Tie-off den eksterne carotisar på det mest distal approachable nettstedet. Påfør en glid midlertidig ligatur til opprinnelsen av arteria carotis interna.
- Lag en 2-mm arteriotomi snitt i venstre ytre halspulsåren.
- Sett inn en 2-fransk Fogarty kateter inn i vanlig halspulsåren gjennom snitt i ytre halspulsåren. Blås spissen av kateteret med saltvann og passerer 3x fra aortabuen til carotis bifurkasjonen for å denude endotelet.
- Skyv et stykke slange (1,04 mm OD, 0,99 mm ID) over Fogarty kateteret og inn i den felles halsarterie. Trekk Fogarty kateter.
- Mount og krympe Annonse Luc -derivatized stent over ballong av en 1,5mm diameter angioplastisk kateter. Sett stenten gjennom teflonslange og fremme den inn i midt-delen av den felles halsarterie. Unngå å gni stenten mot slangen, eller beholderveggen.
- Distribuere stent ved 12 atm i 30 sek og trekke angioplastikk kateteret.
- Tie-off den eksterne carotisar proksimale til arteriotomi nettstedet og slipp den midlertidige ligatur på arteria carotis interna.
- Reparer operasjonssår i lag med rennende 4,0 Vicryl sutur og stifte huden.
- Gjenopprette dyret på en varmepute til ambulerende og gå tilbake til sin isolerte bur. Mens ingen tegn på smerte eller ubehag blir typisk oppvises av de post-operative dyr utover den første 12 timer etter inngrepet, vurdere forlengelse av meloksikam terapi (0,5 mg / kg, SC daglig) i 72 timer.
9. Bioluminescence Imaging av arteriell Gene Expression
- På forutbestemte tidspunkter (1 dag - 3uker range) etter genet tent distribusjon i arteria carotis communis, bedøve rotte bruker isofluran innånding anestesi (2-4% isofluran i oksygen).
- Fjern de kirurgiske stifter, aseptisk forberede området og åpne operasjonssår. Ved hjelp av stump disseksjon, re-gain tilgang til venstre felles halspulsåren og skille den fra vagus nerve og tilstøtende bindevev.
- Tilbered en blanding av 50 mg / ml Luciferin i PBS og 25% Pluronic F-127 i PBS (1: 4 v / v) og lagre den på is. Merk: Denne formuleringen presenterer som en viskøs løsning ved 4 ° C og umiddelbart slår til gel ved kontakt med vev ved 37 ° C.
- Påfør 200 mL av en kjølt Luciferin / Pluronic blanding direkte til utsatte delen av den felles halspulsåren og verifisere gel soliditet.
- Plasser dyret i liggende posisjon i avbildnings kammer av IVIS-spektrum apparat og opprettholde isofluran anestesi med en ansiktsmaske.
- I acquisitipå panel Vinduskontroll (Leve Image, versjon 4.2 eller høyere) velge posisjon "B" (6,6 cm kamera til objekt avstand) og binning factor "medium" fra rullegardinmenyene tittelen "synsfelt" og "binning", henholdsvis. Skriv inn "2,5 cm" i emnehøyde boks. Velg "min" som en tidsenhet i "eksponeringstiden" boks, og velge en numerisk verdi på "2".
- Tre minutter etter påføring av Luciferin / Pluronic gel, starte bilde oppkjøpet ved å klikke på "Acquire" på skjermen. MERK: Bilde oppkjøpet Tiden kan variere fra 1 til 6 min avhengig av styrken den forventede signal.
- Etter henting av bildet, vaske gel med saltvann og bearbeid periarterial plass med steril kompress og bomulls applikatorer.
- Lukke såret med Vicryl sutur og stifte huden.
- Gjenopprette dyret og gå tilbake til buret sitt. Gjenta bildebehandling til senere tIME poeng å studere tidsforløpet for arteriell uttrykk forårsaket av stent-immobilisert Ad vektorer.
- Alternativt kan utføre avbildning etter en systemisk administrering av luciferin. Bedøve og prep dyret som per 9.1-9.2. Kateterhalevenen med en 24 G kateteret og sikkert kateter med kirurgisk tape.
- Tilbered en løsning av luciferin i PBS (50 mg / ml) og injisere 1 ml av løsningen gjennom kateteret over en 10 sek intervaller. Ett min etter injeksjon starte bilde oppkjøpet som per 09.07 til 09.08. Merk: En raskere injeksjonshastighet (<10 sek) kan provosere anfall aktivitet og respirasjonsstans. Dyret skal avlives hvis anfall eller respirasjonsstans oppstå under bildebehandling.
- Følg trinn 9.10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vector versjons Experiments
Tilknytning av adenovirale vektorer til overflaten av implantater, inkludert intervensjons enheter som endovaskulære stenter, tilnærmet vektoren til sykdomsstedet, delvis at det ikke foreligger mangel på vektorer fysiske målretting. Imidlertid, for å være i stand til å oppnå terapeutiske virkninger via transduksjon av målvevet, må vektoren frigjøres fra overflaten (figur 2). Bruken av hydrolyserbare tverrbindere ble antatt å tillate en) effektivt feste av vektorer for å polybisphosphonate-modifiserte, tiol-installert metallimplantater og 2) vedvarende frigivelse mediert av hydrolyse av tverrbindingsmidlet.
Antallet genomiske kopier av vektoren Ad EGFP forbundet med mesh-plater ved slutten av derivatisering prosedyren bestemmes ved PCR av virus-DNA med EGFP-spesifikke primere (figur 3). Avhengigspesifikk tverrbinder som brukes, mengden av bundet Ad vektoren bør variere mellom 3,5 x 10 og 5,7 x 9 10 9 partikler / mesh. Denne mengden er i virkelig samsvar med den anslåtte maksimale kapasitet (2,5 x 10 9) av en enkelt maske disk med et samlet areal på 0,25 cm 2 for å få plass til 100 nm-Ad partikler i et monosjikt arrangement. Siden start mengden av Ad vektor ved trinnet med tverrbindingsmidlet modifikasjon er 5 x 10 11 partikler, er det bare ~ 1% av den modifiserte vektor slutt immobilisert på PABT / PEI PDT -derivatized rustfritt stål overflate.
Både graden av in-kjeden esterhydrolyse og antallet forbindelser mellom vektor og biomateriale forventes å påvirke de totale kinetikken Ad vektor frigjøring fra overflaten.
For å lette utgivelsen eksperimenter, adenoviruspartikler kan forhånds merket med Cy3 fluoroforen (protokoll, seksjon 1) før kryss-linker modificasjon og overflate immobilisering (protokoll, § 3). Reduksjonen av overflateassosiert fluorescens over tid vurderes samtidig av fluorometri (figur 4A) og fluorescensmikroskopi (figur 4B) kan deretter bli anvendt som en indirekte metode for overvåking av vektormeldingen i fysiologisk buffer. Annonse vektorer festet gjennom RHC og IHC sammenhengene bør vise betydelig raskere utgivelse i sammenligning med deres SHC- og NHC-festet kolleger. I det gitte eksempel ble et 45% og et 39% tap av overflate-assosierte vektor observert med RHC og IHC-bundet vektor ved dag 30, henholdsvis, mens mindre enn 20% av bundet vektor ble observert å foreligge i SHC og NHC -immobilized prøver (Figur 4A).
I tillegg Ad vektorer immobilisert ved å bruke forskjellige konsentrasjoner av den samme HC og således antagelig ha forskjellige antall av stagene mellom vektor og metallsubstratet bør haulike kinetikk vektor utgivelsen. Faktisk, vektor Endring ved hjelp av 0,1 mM RHC førte til betydelig raskere utslippsrater enn observert for vektor immobilisert med 0,5 mM RHC (figur 4A). Fluorescens mikros data (Figur 4B) korrelerer godt med fluorometri baserte kvantitativ vektor utgivelsen analyse, viser en raskere og mer uttalt reduksjon av overflate assosiert fluorescens med mesh prøver formulert ved hjelp IHC-, RHC- og spesielt lav konsentrasjon RHC-tethered vektorer i sammenligning med sine NHC- og SHC-tethered kolleger.
In vitro Transduksjon med Mesh immobilisert Ad Vectors
Ved å være kompatibel med både kvantitative uttrykk analyse (fluorometri) og romlige observasjoner (fluorescens mikroskopi), er Ad EGFP den foretrukne reporter vektor å overvåke transduksjon i SMC og endothelialcellekulturer behandlet med både gratis og mesh-immobilisert Ad vektorer. Kjemisk modifikasjon av Ad kapsid med RHC (figur 5) så vel som med andre kryssbindere (ikke vist) ved konsentrasjoner over 75 pM grad forringer effektiviteten transduksjon av ikke-immobilisert vektor in vitro, mest sannsynlig på grunn av maskering og rekonfigurere fiber knotten domener utnyttet av Ad for binding til cellene gjennom Coxsackie-Adenovirus reseptorer (CAR). Imidlertid er rollen til knotten-CAR interaksjoner mindre viktig for transduksjon med substratet immobilisert vektor ettersom vektoren fastholdes i nærheten av målcellene ved å forankre til underlaget. I cellekultur eksperimenter uavhengig av HC type, mesh-tilknyttede annonsen vektorer er konsekvent i stand til romlig begrense transduksjon hendelser til celler som ligger innenfor 300-500 mikrometer fra maske grenser (Tall 6A og 6C). Typisk toppnivåene av transgene uttrykk oppnås 3-5 dager etter plassering av Ad EGFP belastet nett i SMC (Tall 6A og 6B) eller BAEC (Tall 6C og 6D) kulturer. På samme vektor belastning, peak EGFP uttrykk nivåene øker i følgende rekkefølge: NHC-, SHC-, IHC- og RHC-tethered vektor, noe som reflekterer forskjellene i sine respektive utslipp kinetikk profiler (figur 4). Videre er mer holdbare transgen ekspresjon observert i celler behandlet med IHC-formulert maskene i forhold til celler behandlet med RHC-formulert motparter (figur 6D).
Den benyttes cellekultur system presenterer en praktisk oppsett for etterforskningen av forsinkede transduksjon hendelser forårsaket av vektorpartikler frigjøres fra metalloverflaten på eller senere enn 48 timer etter mesh plassering. I dette programmet, etter å bestemme EGFP uttrykk ved fluorometry og fluorescensmikroskopi ved 48 timer etter oppstart av transduksjon, er BAEC trypsinisert og suges ut fra brønnene uten å forstyrre maskene. Ferskt passaged ikke-omformet BAEC blir deretter re-belagt over de delvis utgitt masker. "Nye" transduksjon hendelser forårsaket av viruspartikler frigjøres fra maskebærer etter 2 dagers tidspunkt blir deretter vurdert av fluorescens mikroskopi og fluorometri (7A og 7B). Robust EGFP uttrykk demonstrerer den karakteristiske romlig begrensning til en mesh locale er vanligvis observert i disse "nye" kulturer (figur 7), bekrefter en godt bevart transduksjon kapasitet av mesh-bundet Ad vektorer selv etter 48 timers eksponering for å fullføre cellekulturmedium ved 37 ° C.
In vivo studier
For å undersøke mulige effekter knyttet til uSE av forskjellig HC på arteriell transduksjon, dyr implantert med Ad Luc -eluting stenter tilberedt med RHC-, IHC-, SHC- og NHC-modifisert vektor gikk bioluminescent bildebehandling 1 og 8 dager etter stent distribusjon (Figur 8). Imaging ble gjennomført etter lokale perivaskulær administrasjon av luciferin (2 mg) co-formulert med Pluronic gel. Denne formuleringen er en viskøs væske når avkjølt på is, men gjennomgår fase umiddelbar overgang til gel når de bringes i kontakt med vev ved 37 ° C. Foreløpige eksperimenter (ikke vist) viste at perivaskulær levering av luciferin resulterer i mer stabile og reproduserbare luminescens signaler i Ad Luc -transduced vaskulært vev sammenlignet med systemisk (ip eller intravenøs) administrering luciferin.
Dersom viruset tilknytning til stenten og stenten utplassering kirurgi var teknisk lyd, et veldefinert signal som svarer til stentet segmentetrotte carotisar høres og registrert. En dag etter stent, dyr behandlet med RHC-formulert Ad Luc stenter vanligvis oppviser den høyeste luminescens signal, etterfulgt av rottene som fikk IHC- og SHC- formulert stenter (figurene 8A og 8B). Ingen merkbar signal blir observert i gruppen av rotter implantert med stent fremstilt ved anvendelse NHC-bundet Ad Luc, som understreker viktigheten av uhindret vektormeldingen fra stenten for effektiv transduksjon av vaskulært vev (figurene 8A og 8B). Etter dag 8, gjennomsnittlig intensitet av luciferase uttrykk med RHC-formulert stenter faller flere ganger, mens det øker 1,4 og 1,8 ganger med IHC- og SHC-formulert stenter, henholdsvis (Tall 8A og 8B). Dette funnet er i tråd med hypotesen om mer holdbar vaskulær transduksjon med genet tent utviser en tregere pårørendeETICS av vektor utgivelse fra stent overflate.
Figur 1. Strukturelle formler av tverrbindere (NHC, SHC, IHC og RHC) brukt gjennom de beskrevne studier (modifisert med tillatelse 28).
Figur 2. En ordning som representerer Ad vektor tethering til en PABT / PEI PDT -modified rustfritt stål overflate via en HC og påfølgende utslipp av vektoren på cross-linker hydrolyse (modifisert med tillatelse 28).
Figur 3. PCR-basert quantreduser fuktighet av Ad EGFP immobilisert via kryss-linker tethering på overflaten av PABT / PEI PDT -modified rustfritt stål maskene. Den rustfrie maskene ble formulert med Ad EGFP immobilisert via RHC, IHC, SHC, eller NHC (n = 3 for hver tilstand ). Etter proteinase K-behandling, ble viral DNA ble eluert og renset ved anvendelse av MinElute kolonner. Forsterkning av virus-DNA ved hjelp EGFP-spesifikke primere ble utført i en 7500 Real-Time PCR-motor og ble oppdaget med SYBR Green. Data for normalisering var basert på en kalibreringskurve fremstilt med en kjent mengde av ikke-immobilisert Ad EGFP (modifisert med tillatelse 28).
Figur 4. Slipp kinetikk Ad vektor bundet til metallunderlag med HC. Stainless stål maskene ble derivatisert med ~ 2 x 10 9 Cy3-merket Ad partikler festet til PABT / PEI PDT -modified overflaten etter modifisering med 500 mikrometer NHC, SHC, IHC, RHC og 100 mikrometer RHC (utpekt som RHC-L). Utgivelsen av fluorescensmerkede Ad-partikler ble studert ved de angitte tidspunkter ved (A) godt scan fluorometri på 550/570 nm og (B) fluorescerende mikroskopi (rodamin filter sett; opprinnelige forstørrelse 200X). Fluorometri Resultatene er presentert som gjennomsnitt ± SEM, n = 8-10; p <0,001 for alle sammenligninger mellom NHC og SHC vs IHC, RHC og RHC-L grupper ble bestemt av Anova med en post-hoc Tukey test (modifisert med tillatelse 28).
Figur 5. Transduksjon effektiviteten av ikke-immobilisert Ad eGFP følgende modifisering med RHC. Rotte embryonale aorta-avledet SMC (A10 linje) ble omformet til en MOI av 1000 med enten umodifisert Ad EGFP eller vektor modifisert med RHC som angitt. En reporter uttrykk ble bestemt fluorometrisk (485/535 nm) 48 timer etter transduksjon (modifisert med tillatelse 27).
Figur 6. transduksjon av kultivert SMC og BAEC med Ad vektor immobilisert til rustfritt stål maskene med HC. Meshes ble derivatisert med ~ 2 x 10 9 Ad EGFP partikler vedlagte via NHC, SHC, IHC, og RHC. Maskene ble deretter individuelt plassert på toppen av sub-konfluent A10 (A, B) og BAEC (C, D) monolag. Transduksjon (uttrykt som EGFP uttrykk nivåer) av celler ble behandlet med vektoren Ad-forankrede maskene ble vurdert ved fluorescence mikroskopi (A, C; FITC filter sett; opprinnelige forstørrelse 100X) og vel-scan fluorometri (B, D). Fluorometri resultatene er presentert som gjennomsnitt ± SEM, n = 4 (modifisert med tillatelse 28). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 7. Transduksjon kompetanse substrat immobilisert Ad vektorer på utsatte tidspunkter. Ad EGFP ble immobilisert på stål nett gjennom NHC, SHC, IHC eller RHC stagene. Maskene ble plassert på subconfluent BAEC monolagene. To dager etter plassering, ble BAEC trypsinert og fjernet uten å forstyrre maskene. Ny, ikke-omformet BAEC ble deretter sådd over maskene. AdEGFP transduksjon kompetanse ble målt ved EGFP uttrykk ved hjelp av fluorescerende mikroskopi (A; FITC filter sett; opprinnelige forstørrelse 100X) og fluorometri (B). Målinger ble tatt på angitte dager, ble representative bilder brukt og fluorometri resultatene er midler ± SEM, n = 4 (modifisert fra med tillatelse 28). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 8. Transduksjon effektiviteten av stent-immobilisert Ad Luc in vivo. Ad Luc (1,3 x 10 10 partikler) ble bundet til endovaskulære stenter via NHC, SHC, IHC eller RHC (n = 3-4 for alle grupper). Transduksjon effektiviteten av Ad Luc </ Sub> elueres fra stenter ble målt ved bioluminescens imaging (IVIS Spectrum) 1 og 8 dager etter stent distribusjon (A), og plottet ved hjelp av en logaritmisk skala (B) (modifisert fra med tillatelse 28). Vennligst klikk her for å se et større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den presenterte protokollen beskriver en operativ metode for underlaget mediert genet levering oppnås gjennom reversibel vedlegg av adenovirus vektorer å coatless overflater i rustfritt stål. Mens utviklet for det spesifikke formål stent-baserte genterapi av vaskulær restenose, har denne teknikken mye bredere anvendelse i de områdene av biomaterialer, biomedisinske implantater og genterapi.
Selv om frem studier har utelukkende benyttet rustfritt stål som en prototypisk metallsubstrat, binder PABT andre metallegeringer slik som kobolt / krom og Nitinol med sammenlignbar affinitet (ikke publisert). Den skjeln samspillet PABT med metaller betydelig utvider antall potensielle biomedisinske applikasjoner for denne teknologien 31. Videre, bruk av HC-tjoret genvektorer, enskjønt krever andre metoder for tiol installasjon på materialoverflaten, er mulig med andre typer av biomaterialer.
ontent "> Mens Ad genvektorer oppnå robust transduksjon i mange menneskelige celletyper og vev, deres kliniske betydningen er begrenset av sterke inflammatoriske og immunrespons oppnådd med Adenoviridae fire. For dette formål, langvarig (4 måneder) arteriell uttrykk med genet tent formulert ved hjelp av HC modifikasjon av luciferase-uttrykke adenoassosiert virale vektorer ble nylig vist (ikke publisert).Metodikken er robust. Små avvik fra hoved protokollen vanligvis ikke føre til vesentlige endringer i genuttrykk in vitro og in vivo. Likevel ble flere kritiske problemer som kan påvirke utfallet identifisert.
Først, som navnet antyder, hydrolyserbare kryssbindere er spaltbar ved omsetning med vann på grunn av hydrolyse av den in-kjeden ester. Videre amin-reaktiv del, er N -sulfosuccinimidyl hydrolyserbar også. Kryssbindere bør lagres under en argonatmosfære ved -20 ° C for å bevare sin aktivitet. Av samme grunner, etter å forberede løsninger av HC (protokoll punkt 3.2) fortsette umiddelbart med tillegg av HC løsninger for viruset forbereder.
Sekund, tiolgrupper som er dannet på metalloverflaten under flere mellomliggende trinn av frem bioconjugation sekvensen raskt oksidert av omgivelsesluft oksygen. For å unngå dette, holde de sårbare metallprøver nedsenket i avgasset vann til alle tider.
For det tredje er en perfekt innretting av inngrep med bunnen av brønnen som kreves for vellykket transduksjon. Ikke bøy mesh disker under håndtering.
Fjerde, unngå overdreven rubbing av genet tent mot Teflon skjede og åreveggen under stent for å hindre løsner overflate tilknyttede annonsen vektorer.
Kovalent binding av genet vektor til overflaten av implanterbare biomaterials har en tilsynelatende fordel av bedre kontroll over de vektor-frigjøringskinetikk enn realiserbar med ikke-kovalent tilknytning av vektorene. I innstillingen av genet levering fra stent plattform fleste studier rapporterer fullstendig frigjøring av virus og ikke-virale vektorer innen 1-7 dager etter stent distribusjon 32-34. På den annen side, Ad vektor immobilisering via HC demonstrert frigjøring av bare 20-45% av vektoren last i den første måneden (figurene 4A og 4B). Dessuten er en delvis modulering av frigjøringskinetikken og transduksjon oppnåelig med bruk av forskjellige hydrokarboner som oppviser ulike hydrolysekinetikk, eller ved å variere konsentrasjonen av HC anvendt for virusoverflatemodifisering. I tillegg en samtidig co-modifisering av vektor med forskjellige kryss-linker molekyler, men ikke utforsket i denne studien, gir en annen mulighet for finjustering vektor release og transduksjon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 316 stainless steel mesh disks | Electon Microscopy Sciences | E200-SS | |
| Generic 304-grade stainless steel stents | Laserage | custom order | |
| AdeGFP | University of Pennsylvania Vector Core | AD-5-PV0504 | |
| AdLuc | University of Pennsylvania Vector Core | AD-5-PV1028 | |
| AdEMPTY | University of Pennsylvania Vector Core | A858 | |
| Cy3(NHS)2 | GE Healthcare | PA23000 | |
| Sepharose 6B | Sigma-Aldrich | 6B100-500ML | |
| UV 96-well plates | Costar | 3635 | |
| Fluorometry 96-well plates | Costar | 3915 | |
| Cell culture 96-well plates | Falcon | 353072 | |
| Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride (TCEP) | Pierce Thermo Scientific | 20490 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Pierce Thermo Scientific | 20290 | |
| sulfo-LC-SPDP | Pierce Thermo Scientific | 21650 | |
| Spectrophotometer | Molecular Devices | SpectraMax 190 | |
| Spectrofluorometer | Molecular Devices | SpectraMax Gemini EM | |
| Orbital shaker incubator | VWR | 1575R | |
| Horizontal airflow oven | Shel Lab | 1350 FM | |
| Centra-CL2 centrifuge | International Equipment Company | 426 | |
| Digital vortex mixerer | Fisher Thermo Scientific | 02-215-370 | |
| Eclipse TE300 fluorescence microscope | Nikon | TE300 | |
| DC 500 CCD camera | Leica | DC-500 | |
| 7500 Real-Time PCR system | Applied Biosystems | not available | |
| IVIS Spectrum bioluminescence station | Perkins-Elmer | not available | |
| EDTA dipotassium salt | Sigma-Aldrich | ED2P | |
| Bovine serum albumin fraction V (BSA) | Fisher Thermo Scientific | BP1600-100 | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P1379 | |
| Dumont forceps | Fine Science Tools | 11255-20 | |
| A10 cell line | ATCC | CRL-1476 | |
| Bovine aortic endothelial cells | Lonza | BW-6002 | |
| Luciferin, potassium salt | Gold Biotechnology | LUCK-1Ge | |
| Pluronic F-127 | Sigma-Aldrich | P2443-250G | |
| PBS without calcium and magnesium | Gibco | 14190-136 | |
| Fetal bovine serum | Gemini Bio-Products | 100-106 | |
| Penicillin/Streptomycin solution | Gibco | 11540-122 | |
| DMEM, high glucose | Corning cellgro | 10-013-CV | |
| 0.25% Trypsin/EDTA | Gibco | 25200-056 | |
| QIAamp DNA micro kit | Qiagen | 56304 | |
| Power Sybr Green PCR Master Mix | Applied Biosystems | 4367659 | |
| MicroAmp Optical 96-well Reaction Plate | Applied Biosystems | N8010560 | |
| MicroAmp Optical Adhesive Film | Applied Biosystems | 4360954 | |
| Cephazolin | Apotex | not available | |
| Loxicom (Meloxicam) | Norbrook | not available | |
| Heparin sodium | APP Pharmaceuticals | not available | |
| Ketavet (Ketamine) | VEDCO | not available | |
| Anased (Xylazine) | Lloid | not available | |
| Forane (Isoflurane) | Baxter | not available | |
| Curved Moria iris forceps | Fine Science tools | 11370-31 | |
| Curved extra-fine Graefe forceps | Fine Science Tools | 11152-10 | |
| Dumont #5 forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| Vannas spring scissors | Fine Science Tools | 15018-10 | |
| Fine scissors - ToughCut | Fine Science Tools | 14058-09 | |
| Surgical scissors | Fine Science Tools | 14101-14 | |
| Vicryl suture (5-0) | Ethicon | J385 | |
| Suture thread (4/0 silk) | Fine Science Tools | 18020-40 | |
| Michel suture clips | Fine Science Tools | 12040-02 | |
| Wound dilator (Lancaster eye specula) | KLS Martin | 34-149-07 | |
| Hot bead sterilizer | Fine Science Tools | 18000-45 | |
| Michel suture clip applicator | Fine Science Tools | 112028-12 | |
| Insyte Autoguard 24 G IV catheter | Beckton-Dickinson | 381412 | |
| 2F Fogarty catheter | Edwards Lifesciences | 120602F | |
| Teflon tubing | Vention | 041100BST | |
| PTA catheter | NuMed | custom order | |
| Gauze pads | Kendall Healthcare | 9024 | |
| Cotton applicators | Solon Manufacturing | WOD1003 | |
| Saline | Baxter | 281321 | |
| 10 ml syringe (Luer-Lok) | Beckton-Dickinson | 309604 | |
| 1 ml syringe (Luer-Lok) | Beckton-Dickinson | 309628 | |
| Clippers with #40 blade | Oster | 78005-314 | |
| Transpore surgical tape | 3M | MM 15271 | |
| Puralube vet ointment | Pharmaderm | not available |
References
- Boeckle, S., Wagner, E. Optimizing targeted gene delivery: chemical modification of viral vectors and synthesis of artificial virus vector systems. AAPS J. 8, E731-E742 (2006).
- Waehler, R., Russell, S. J., Curiel, D. T. Engineering targeted viral vectors for gene therapy. Nat Rev Genet. 8, 573-587 (2007).
- Campos, S. K., Barry, M. A. Current advances and future challenges in Adenoviral vector biology and targeting. Curr Gene Ther. 7, 189-204 (2007).
- Bangari, D. S., Mittal, S. K. Current strategies and future directions for eluding adenoviral vector immunity. Curr Gene Ther. 6, 215-226 (2006).
- Barry, M. A., et al. Systemic delivery of therapeutic viruses. Curr Opin Mol Ther. 11, 411-420 (2009).
- De Laporte, L., Shea, L. D. Matrices and scaffolds for DNA delivery in tissue engineering. Adv Drug Deliv Rev. 59, 292-307 (2007).
- Gustafson, J. A., Price, R. A., Greish, K., Cappello, J., Ghandehari, H. Silk-elastin-like hydrogel improves the safety of adenovirus-mediated gene-directed enzyme-prodrug therapy. Mol Pharm. 7, 1050-1056 (2010).
- Kidd, M. E., Shin, S., Shea, L. D. Fibrin hydrogels for lentiviral gene delivery in vitro and in vivo. J Control Release. 157, 80-85 (2012).
- Lei, Y., et al. Incorporation of active DNA/cationic polymer polyplexes into hydrogel scaffolds. Biomaterials. 31, 9106-9116 (2010).
- Lei, Y., Rahim, M., Ng, Q., Segura, T. Hyaluronic acid and fibrin hydrogels with concentrated DNA/PEI polyplexes for local gene delivery. J Control Release. 153, 255-261 (2011).
- Jang, J. H., Schaffer, D. V., Shea, L. D. Engineering biomaterial systems to enhance viral vector gene delivery. Mol Ther. 19, 1407-1415 (2011).
- Salvay, D. M., Zelivyanskaya, M., Shea, L. D. Gene delivery by surface immobilization of plasmid to tissue-engineering scaffolds. Gene Ther. 17, 1134-1141 (2010).
- Moss, A. J., Hamburger, S., Moore, R. M., Jeng, L. L., Vol Howie, L. J. Advance Data. 191, National Center for Health Statistics Vital and Health Statistics. (1991).
- Gristina, A. G., Naylor, P., Myrvik, Q. Infections from biomaterials and implants: a race for the surface). Med Prog Technol. 14, 205-224 (1988).
- Santerre, J. P., Woodhouse, K., Laroche, G., Labow, R. S. Understanding the biodegradation of polyurethanes: from classical implants to tissue engineering materials. Biomaterials. 26, 7457-7470 (2005).
- Tang, L., Eaton, J. W. Inflammatory responses to biomaterials. Am J Clin Pathol. 103, 466-471 (1995).
- Zimmerli, W., Sendi, P. Pathogenesis of implant-associated infection: the role of the host. Semin Immunopathol. 33, 295-306 (2011).
- Fishbein, I., et al. Bisphosphonate-mediated gene vector delivery from the metal surfaces of stents. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 159-164 (2006).
- Levy, R. J., et al. Localized adenovirus gene delivery using antiviral IgG complexation. Gene Ther. 8, 659-667 (2001).
- Ma, G., et al. Anchoring of self-assembled plasmid DNA/anti-DNA antibody/cationic lipid micelles on bisphosphonate-modified stent for cardiovascular gene delivery. Int J Nanomedicine. 8, 1029-1035 (2013).
- Hu, W. W., Lang, M. W., Krebsbach, P. H. Development of adenovirus immobilization strategies for in situ gene therapy. J Gene Med. 10, 1102-1112 (2008).
- Jang, J. H., et al. Surface immobilization of hexa-histidine-tagged adeno-associated viral vectors for localized gene delivery. Gene Ther. 17, 1384-1389 (2010).
- Bengali, Z., Shea, L. D. Gene Delivery by Immobilization to Cell-Adhesive Substrates. MRS Bull. 30, 659-662 (2005).
- Holmes, C. A., Tabrizian, M. Substrate-mediated gene delivery from glycol-chitosan/hyaluronic acid polyelectrolyte multilayer films. ACS Appl Mater Interfaces. 5, 524-531 (2013).
- Pannier, A. K., Wieland, J. A., Shea, L. D. Surface polyethylene glycol enhances substrate-mediated gene delivery by nonspecifically immobilized complexes. Acta Biomater. 4, 26-39 (2008).
- Wang, C. H., Pun, S. H. Substrate-mediated nucleic acid delivery from self-assembled monolayers. Trends Biotechnol. 29, 119-126 (2011).
- Fishbein, I., et al. Local delivery of gene vectors from bare-metal stents by use of a biodegradable synthetic complex inhibits in-stent restenosis in rat carotid arteries. Circulation. 117, 2096-2103 (2008).
- Fishbein, I., et al. Adenoviral vector tethering to metal surfaces via hydrolyzable cross-linkers for the modulation of vector release and transduction. Biomaterials. 34, 6938-6948 (2013).
- Mittereder, N., March, K. L., Trapnell, B. C. Evaluation of the concentration and bioactivity of adenovirus vectors for gene therapy. J. Virol. 70, 7498-7509 (1996).
- Forbes, S. P., et al. Modulation of NO and ROS production by AdiNOS transduced vascular cells through supplementation with L-Arg and BH4: Implications for gene therapy of restenosis. Atherosclerosis. 230, 23-32 (2013).
- Niinomi, M., Nakai, M., Hieda, J. Development of new metallic alloys for biomedical applications. Acta Biomater. 8, 3888-3903 (2012).
- Brito, L. A., Chandrasekhar, S., Little, S. R., Amiji, M. M. Non-viral eNOS gene delivery and transfection with stents for the treatment of restenosis. Biomed Eng Online. 9, 56 (2010).
- Egashira, K., et al. Local delivery of anti-monocyte chemoattractant protein-1 by gene-eluting stents attenuates in-stent stenosis in rabbits and monkeys. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 27, 2563-2568 (2007).
- Ohtani, K., et al. Stent-based local delivery of nuclear factor-kappaB decoy attenuates in-stent restenosis in hypercholesterolemic rabbits. Circulation. 114, 2773-2779 (2006).
