Abstract
En reestenosis intra-stent presenta una importante complicación de procedimientos de revascularización base del stent ampliamente utilizados para restablecer el flujo sanguíneo a través de los segmentos estrechados críticamente de las arterias coronarias y periféricas. Stents endovasculares capaces de liberación sintonizable de genes con actividad anti-reestenosis puede presentar una estrategia alternativa para utilizan actualmente los stents liberadores de fármacos. A fin de alcanzar traducción clínica, los stents de elución de genes deben presentar una cinética predecible de liberación de genes vector stent-inmovilizada y la transducción específica de sitio de la vasculatura, evitando al mismo tiempo una respuesta inflamatoria excesiva típicamente asociados con los recubrimientos de polímeros utilizados para atrapamiento físico del vector. Este artículo describe una metodología detallada para la inmovilización sin abrigo de vectores de genes adenovirales a los stents basados en una unión reversible de las partículas adenovirales a polialilamina bifosfonato (PABT) modificada con superficie de acero inoxidable a través de reticulantes hidrolizables (HC). Una familia debifuncional HC (con amina y reactivo con tiol) con una media t medio de la hidrólisis del éster en la cadena que oscila entre los 5 y 50 días se utiliza para vincular el vector con el stent. El procedimiento vector inmovilización se lleva a cabo típicamente en 9 horas y consta de varios pasos: 1) la incubación de las muestras de metal en una solución acuosa de PABT (4 horas); 2) desprotección de grupos tiol instalados en PABT con tris (2-carboxietil) fosfina (20 min); 3) la expansión de la capacidad de reactivo con tiol de la superficie metálica por reacción de las muestras con polietilenimina derivatizados con grupos (PDT) piridilditio (2 hr); 4) la conversión de los grupos PDT a tioles con ditiotreitol (10 min); 5) la modificación de los adenovirus con HC (1 hr); 6) la purificación de partículas adenovirales modificados por cromatografía de exclusión por tamaño en columna (15 min) y 7) la inmovilización de partículas adenovirales reactivos con tiol sobre la superficie de acero tiolada (1 hr). Esta técnica tiene una aplicabilidad potencial amplia más allá de stents,facilitando la ingeniería de superficie de dispositivos bioprotésicas para mejorar su biocompatibilidad a través de la entrega de genes mediada por sustrato a las células de interfaz el material extraño implantado.
Introduction
La eficacia de la terapia génica como una modalidad terapéutica se ve obstaculizada por la escasa capacidad de focalización de los vectores de terapia génica 1,2. La falta de resultados de focalización adecuados en los niveles sub-terapéuticos de la expresión del transgen en la ubicación de destino y conduce a una amplia difusión de los vectores a los órganos ajenos al objetivo 3, incluidos los responsables de montar la respuesta inmune contra tanto el vector como producto terapéutico codificado 4, 5. Un medio potencial para compensar la promiscuidad de transducción y para promover la focalización es introducir vectores de genes en el lugar deseado en una forma que impide su libre difusión a través de la sangre y la linfa. Típicamente, dichos esfuerzos se basan en sistemas de administración local inyectable que comprende ya sea de vectores virales o no virales mezcladas con fibrina, colágeno o ácido hialurónico matrices de hidrogel 6-10 que son capaces de vectores de genes transitoriamente sostienen en el sitio de inyección atrapando físicamente ªem en una red polimérica.
Otro paradigma generalmente aceptado para la terapia génica localizada utiliza inmovilización de vectores génicos en la superficie de los dispositivos prostéticos implantados 11,12. Implantes médicos permanentes (endovasculares, bronquiales, stents urológicos y digestivos, marcapasos, articulaciones artificiales, mallas quirúrgicas y ginecológicas, etc.) Se utilizan cada año en decenas de millones de pacientes 13. Aunque, en general eficaz, estos dispositivos son propensos a complicaciones que no están adecuadamente controlados por las prácticas médicas actuales 14-17. Prótesis implantables presentan una oportunidad única para servir como plataformas de proxy para el tratamiento de la terapia génica localizada. Desde el punto de vista farmacocinético, la derivación de superficie de implantes médicos con dosis relativamente bajas de entrada de vectores de genes resultados en la consecución de los dos altas concentraciones locales de vectores de genes en la interfaz implante / tejido y la desaceleración de la cinética de their eliminación de esta ubicación. Como consecuencia de la residencia prolongada y una mayor captación por la población de células objetivo, vector inmovilización minimiza la propagación del vector de genes. De este modo se reduce la inoculación accidental de los tejidos no diana.
Tethering Superficie de vectores de genes en biomateriales implantables (también denominado como la entrega de genes sustrato o mediada por la entrega de genes en fase sólida) se ha implementado en cultivo de células animales y experimentos utilizando tanto específica (antígeno-anticuerpo 18-20, avidina-biotina 21,22) y no específicos 23-26 (con cargo, de van der Waals) interacciones. La unión covalente de vectores a la superficie del dispositivo implantado se ha considerado previamente como no funcional, ya excesivamente fuertes lazos con la superficie impiden vector de internalización por las células diana. Recientemente se demostró que esta limitación se puede superar mediante el uso de espontáneamente hidrolizable reticulante utilizado como el tetde ella entre la superficie metálica modificada de las proteínas de la cápside de stent y el vector adenoviral 27,28. Por otra parte, la velocidad de liberación del vector y curso temporal de la expresión del transgen in vitro e in vivo pueden ser moduladas con el uso de hidrolizables reticulantes que exhiben diferentes cinéticas de hidrólisis 28.
El presente documento proporciona un protocolo detallado para la unión covalente reversible de vectores adenovirales a la superficie de metal activo y presenta una configuración experimental útil para el estudio subsiguientes eventos de transducción in vitro en el músculo liso cultivadas y las células endoteliales e in vivo en el modelo de carótida de rata de angioplastia stent .
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Protocol
1 Preparación del marcado con Cy3 Adenovirus para los experimentos de liberación
- Suspender 2 x 10 12 partículas de Ad vacío (aproximadamente 2 x 10 11 unidades infectivas) en 650 l de tampón carbonato / bicarbonato (CBB; pH 9.3).
- Disolver el contenido de 1 vial (0,2 mg) de colorante fluorescente-amina reactiva (Cy3 (NHS) 2) en 1 ml CBB a una concentración final de 0,2 mg / ml.
- Añadir 100 l de la solución de colorante a la suspensión de virus, vórtice durante 5 segundos y se incuba durante 1 hora a 28 ° C con agitación (100-200 rpm).
- Equilibrar una columna de 20 ml de Sepharose 6B con PBS. Añadir 750 l de marcado con Cy3 gota a gota a la suspensión Ad centro del lecho de gel.
- Después de la suspensión viral impregna la resina, añadir 5 ml de PBS. Descartar el eluido.
- Añadir 0,5 ml de PBS y recoger el eluido en un recipiente de vidrio etiquetados. Repita este paso 10x recogiendo un total de diez fracciones de 0,5 ml.
- º Ensayoe recogieron las fracciones por espectrofotometría (260 y 280 nm) para el contenido de ADN viral.
- Reunir las fracciones que contienen más de 10% del total (suma de F1 a F10) la densidad óptica (DO) a 260 nm. Nota: Típicamente las fracciones F3, F4, F5, F6 y se reúnen y se mezclan.
- Re-ensayo de las fracciones reunidas mixtas por espectrofotometría (260 y 280 nm) y el ensayo de fluorometría (550 EX / 570 em nm) para el contenido de ADN viral y Cy3 etiquetados proteína de la cápside, respectivamente. Nota: Una curva de calibración Cy3 (NHS) 2 que cubre la gama de 10 -9 -10 -13 mol / L se prepara y fluorimétricamente ensayada en la misma placa como las fracciones reunidas.
- Calcular el rendimiento de virus marcado y la densidad de etiquetado. Suponga que las partículas 1.19 x 10 12 virus / ml corresponde a 1 unidad de DO para una longitud de recorrido de 1 cm 29. Utilice la fórmula: Rendimiento = [(OD 260nm /1.19)*10 12 * cantidad V / Ad entrada] * 100, donde, OD 260 nm es el de ópticansity de la formulación combinada a 260 nm y V es el volumen de la formulación combinada (ml) para calcular el rendimiento de recuperación de Ad (%). Usa la fórmula: Densidad = C * Etiquetado de 6,02 * 10 23 / (OD 260 nm /1.19)*10 12, donde C es la concentración de Cy3 de la formulación combinada (moles / ml) y OD 260 nm es la densidad óptica de la formulación combinada en 260 nm para calcular la densidad media de etiquetado Cy3. NOTA: Una recuperación típica del virus de marcado es> 70% de la dosis de entrada. La densidad de etiquetado es 600-800 moléculas de fluoróforo por partícula de virus solo.
- Ad vacío en porciones más pequeñas (típicamente 5 x 10 11 partículas) adecuados para los experimentos de liberación individuales Alícuota Cy3-etiquetados. NOTA: El protocolo actual se especifica el uso de Ad marcado con Cy3 únicamente en el experimento de liberación. Todos los estudios se llevan a cabo de transducción con vectores no etiquetados.
2. La activación de Metal Samples
- Lávese las s inoxidableteel malla discos o stents de acero inoxidable de forma consecutiva en isopropanol (5 x 2 min) y cloroformo (5 min x 2) a 55 ° C con agitación (100 rpm). Eliminar el disolvente.
- Calentar las muestras durante 30 min a 200 ° C.
- Disolver bisfosfonato polialilamina con instaladas grupos tiol latentes (PABT 27,28,30) en agua (1-2% w / v) a 72 ° C con agitación (100 rpm). Ajustar el pH a 4,5-5 con KHCO3.
- Incubar las muestras de metal en la solución PABT de 2-4 horas a 72 ° C con agitación (100-200 rpm). NOTA: El procedimiento puede ser una pausa en este punto. Las muestras son estables durante 3 días a 4 ° C.
- Enjuague las muestras tres veces con agua destilada doble (DDW).
- Exponer las muestras a tris (2-carboxietil) fosfina (TCEP; 15 mg / ml en tampón acético 0,1 M) durante 15 min a 28 ° C con agitación (100-200 rpm).
- Enjuague 5x en desgasificado DDW.
- Exponga las muestras a 2% de polietilenimina con grupos piridilditio instaladas (PEI
- Enjuague las muestras tres veces con DDW.
- Exponer las muestras a 10 mg / ml de ditiotreitol / DDW para convertir grupos piridilditio a tioles.
- Enjuague 5x nuevo en desgasificado DDW.
3. Adenovirus Activación y Metal La inmovilización de superficie
- Suspender 5 x 10 11 partículas de cualquiera Ad eGFP o Ad Luc (aproximadamente 5 x 10 10 unidades infectivas) en 487,5 hasta 495 l de tampón carbonato / bicarbonato (CBB; pH 9.3). Nota: Para los estudios de liberación, utilice 5 x 10 11 de Cy3 etiquetados partículas vacías del Anuncio (ajustar el volumen de 487,5 a 495 l con CBB).
- Disolver HC con diferentes velocidades de hidrólisis de 28 [(rápidamente (t 1/2 = 5 d), intermedia (t 1 /2 = 12 d) y lentamente (t 1/2 = 50 d) HC, es decir, RHC, IHC o SHC; Figura 1] o no hidrolizable reticulante (NHC), sulfo-LC-SPDP en CBB a 20 mM.
- Inmediatamente después, añadir 5-12,5 l de solución de reticulante a la suspensión de virus para un volumen total de 500 l (concentración final 200-500 M de agente de reticulación), vórtice y se incuba durante 1 hora a 28 ° C con agitación (de 100 200 rpm).
- Equilibrar una columna de 20 ml de Sepharose 6B con 5 mM EDTA desgasificado / PBS (EPB). Añadir gota a gota 500 l de reticulante modificado suspensión Ad al centro del lecho de resina.
- Añadir 5 ml de desgasificado EPBs. Descartar el eluido.
- Añadir 0,5 ml de desgasificado EPBs y recoger el eluido en un recipiente de vidrio etiquetados. Repita este paso 10 veces recogiendo un total de diez fracciones de 0,5 ml.
- Determinar la DO de las fracciones recogidas mediante espectrofotometría a 260 y 280 nm y convertir OD a los títulos de virus (1,19 x 10 12 / ml Correponde a 1 OD) 29.
- Reunir las fracciones que contienen> 10% de los virus eluido (Nota: Típicamente, las fracciones F3-F6). Repita el ensayo de valoración espectrofotométrica para la suspensión combinada.
- Transferir la suspensión viral para el vial con las muestras de metal activadas (como por 2.11). Incubar en una atmósfera de argón durante 1 hora a 28 ° C con agitación (100-200 rpm). Nota: Las muestras de metal de Ad-atado obtenido en esta etapa se utilizan además en los experimentos de liberación y de transducción de posteriores descritos en las secciones de protocolo 5-7.
4. Cuantificación de Ad asociado a superficies del vector por PCR
- Preparar mallas formulados con superficie inmovilizada Ad eGFP atado a través de NHC, SHC, IHC y RHC (n = 3 para cada tipo) como se describe en las secciones 2 y 3.
- Utilice un kit QIAamp DNA Micro para aislar el ADN viral. Colocar las mallas individualmente en tubos de plástico de 1,5 ml que contienen 200 l de mezcla compuesta de 180 l de ATL bUffer y 20 l de proteinasa K (tanto desde el kit). Añadir cantidad conocida de partículas de Ad eGFP (como estándares para la curva de calibración) en los tubos separados que contienen la misma mezcla. Se incuba a 56 ° C durante la noche sin agitación.
- Añadir 200 l de tampón AL (del kit), mezclar mediante agitación, añadir 200 l de etanol al 100%, y se incuba a temperatura ambiente durante 5 min.
- Transferir la mezcla de cada tubo sobre una columna individual MinElite (del kit) y centrifugado a 8.000 rpm durante 1 min. Enjuague los tubos que contienen malla con 180 l de tampón ALT fresco, añadir sobre las respectivas columnas y centrifugado a 8.000 rpm durante 1 min. Desechar los eluatos.
- Añadir 500 l de tampón AW1 (del kit) en las columnas y centrifugado a 8.000 rpm durante 1 min. Desechar los eluatos.
- Añadir 500 l de tampón AW2 (del kit) en las columnas y centrifugado a 8.000 rpm durante 1 min.
- Desechar los eluatos.
- Centrifugado a 14.000 rpm durante 3 min adicionales un until las columnas estén completamente secas. Desechar los eluatos.
- Añadir 50 l de agua MilliQ grado en las columnas. Haz girar a 14.000 rpm durante 5 min. Recoger 50 l de eluato de la columna en cada tubo individual colección (del kit).
- Preparar la solución de PCR Master Mix se multiplica mediante la combinación de de los siguientes (12,5 l de SYBR Green Potencia PCR Master Mix, 0,63 l de 10 mM eGFP cebador sentido [5'-TAA ACG ACG GCC AGT ACA TC -3 '], 0,63 l de 10 M eGFP anti-sentido cartilla [5'-AAG TCG TGC TGC TTC ATG TG 3 '], 6,3 l de agua Milli-Q-grado). Multiplicar estos volúmenes por el número de reacciones previstas incluidos los controles "no" de ADN.
- Carga 5 l de eGFP ADN Ad (desde el paso 4.8) y 20 l de PCR Master Mix en los pocillos por triplicado de un óptico Placa de reacción de 96 pocillos MicroAmp. Sellar la placa con MicroAmp óptico Película adhesiva. Haga girar la placa a 1.000 rpm durante 1 min para eliminar las burbujas de aire.
- Colocar la placa en el receptáculo de un 7500 Real-Time PCR motor. En el menú principal del 7500 Sistema SDS Software (v1.4 o superior), seleccione "Crear nuevo experimento". Haga clic en "Siguiente". En la pantalla "Asistente para nuevo experimento" elegir Sybr verde de un menú de desplazamiento hacia abajo y haga clic en "agregar". Haga clic en "siguiente" para conseguir un diseño de la placa. Resalte todos los pocillos a analizar, seleccione Sybr Verde. Resalta de forma consecutiva sin control de los pozos de ADN, normas y incógnitas ADN Ad eGFP, y marcarlos mediante respectivas designaciones en el menú de desplazamiento hacia abajo.
- Cambie a la ficha instrumento. Seleccione "añadir fase de disociación", cambiar el volumen así de forma predeterminada 50 l 25 l. Haga clic en iniciar.
- Analizar los resultados de PCR utilizando después de comprobar el resumen QC para los valores atípicos y otras irregularidades.
5. Cinética de liberación de hidrolizables reticulante-atado partículas de vector de la malla de acero Modelo
- Lavar las muestras de malla derivatizados con Ad marcado con Cy3 a través de RHC, IHC, SHC y NHC (según 3.9) en 1% de BSA / PBS (1 hr x 3) con agitación (100-200 rpm).
- Usando unas pinzas finas estériles, colocar las mallas en pocillos individuales de una placa de 96 pocillos rellenados con 200 l de tampón de elución (0,1% de BSA / 0,1% Tween-20 / PBS).
- Tomar imágenes fluorescentes de una parte central de cada malla. Grabar los ajustes del microscopio y la cámara CCD utilizada para la adquisición de imágenes.
- Analice la placa fluorimétricamente (550 EX / 570 em) en modo bien-scan con la máxima reducción. Utilice los pocillos con mallas no derivatizado como un control de fondo.
- Incubar la placa a 37 ° C con agitación (50 rpm).
- En momentos predeterminados (1-30 días) Rango de aspirar el tampón de elución sin molestar a las mallas y añadir 200 l de tampón de elución fresca. Repita los pasos 4.3 a 4.5 después de sustituir la memoria intermedia.
6. Transducción de Cultivadas Cells por inmovilizadas-Mesh Ad Vectores
- Lavar el eGFP Ad - Luc o Ad -derivatized mallas tres veces con PBS estéril durante 5 min con agitación (100 rpm).
- El uso de pinzas estériles finas eliminar los discos de malla de uno en uno y los coloca individualmente en los pocillos de una placa de 96 pocillos con el tipo de célula de interés en la fase logarítmica de crecimiento.
- Se incuban las células durante 24 horas a 37 ° C, en 5% de CO 2.
- Utilice el ensayo respectivo no terminal de punto final (microscopía fluorescente, fluorometría para EGFP o imágenes de bioluminiscencia para la luciferasa) para determinar la extensión y la distribución espacial de la expresión génica en los pocillos.
- Opcionalmente, el medio sustituto de PBS para aumentar la sensibilidad del ensayo de fluorometría (485/535 nm) si se espera una baja expresión eGFP. Nota: Si un fluorómetro está equipado con capacidad de exploración bien, lee la placa en un modo bien-scan para evaluar la distribución espacial de las células en los pocillos que expresan eGFP. Tipo PBS para el medio después de completar fluorometría.
- Imagen de las células transducidas en los pozos con mallas Ad eGFP -eluting (tanto subyacentes y periféricas de la malla) utilizando el filtro para FITC. Tome imágenes representativas en 40-200X ampliación. Registre la configuración exacta del microscopio fluorescente y la cámara CCD utilizada para la adquisición de imágenes.
- Añadir 5 l de luciferina en PBS (10 mg / ml) directamente a los pozos con Ad Luc -eluting engrana a una concentración final de 500 mg / ml y se incuba a 37 ° C y 5% de CO 2 durante 10 minutos antes de la bioluminiscencia de imágenes . Aspirar los medios de comunicación y reemplazar con los medios de comunicación-luciferina libre después de la impresión.
- Ensayos de punto final de repetición en momentos predeterminados (hasta 2 semanas) para el estudio de la cinética de la expresión del gen indicador después de la transferencia génica mediada por sustrato.
7. Validación de Conservado Capacidad Transducción en Puntos de tiempo de retardo
- Preparar el anuncio de eGFPmallas rivatized utilizando RHC, IHC, SHC y NHC por vector tethering (como por 02.01 a 02.11 y de 03.01 hasta 03.09) y colocar de forma individual las mallas en los pocillos de una placa de 96 pocillos con 60-80% de células endoteliales aórticas bovinas confluentes (BAEC ).
- Analizar la transducción de BAEC cultivadas con inmovilizada malla Ad-eGFP en 1 y 2 días después de la colocación de malla usando microscopía de fluorescencia y fluorometría (según 6.4 a 6.5).
- 48 horas después del comienzo de la transducción de lavar los pozos que contienen malla con PBS dos veces.
- Añadir 200 l de 0,25% de tripsina / EDTA a cada pocillo e incubar durante 15 min a 37 ° C con agitación (100 rpm). Lave 3 veces con PBS.
- Utilice la microscopía fluorescente y fluorometría para determinar la eliminación completa de todas las células EGFP-positivos asociados con las mallas.
- Semilla pase reciente BAEC en los pocillos con mallas parcialmente liberadas a una densidad inicial de siembra de 60-80% (2-2,7 x 10 4 células / pocillo).
- Incubar la placa a 37 ° C CO y el 5%
8. Ad-stent liberador de despliegue en la carótida Modelo de Stent La angioplastia Rata
- Todos los animales procedimientos descritos en este protocolo se ajustan a las reglamentaciones federales sobre el uso de animales de laboratorio y fueron aprobados por el IACUC del Hospital de Niños de Filadelfia. Para cumplir con las condiciones quirúrgicas asépticas todos los instrumentos se esterilizan en autoclave. Para asegurar la esterilidad continua un esterilizador de cuentas se emplea entre el uso de los instrumentos en un máximo de cinco animales consecutivos.
- Prepare Ad Luc -eluting stents según 02.01 a 02.11 y de 03.01 a 03.09. Guarde los stents virus derivado en PBS estéril a 4 ° C durante no más de 24 horas antes de su uso.
- Anestesiar ratas macho Sprague-Dawley (400-450 g) con inyección IP de ketamina (100 mg / kg) y xilazina (5 mg / kg). DeTermine la profundidad de la anestesia por la pata respuesta pellizco y el tono muscular. Aplique un ungüento oftálmico veterinario para evitar la sequedad de la córnea y la esclerótica. Nota: La anestesia por inhalación con un 4% y 2% de isoflurano (1 L / min) para inducir y mantener la anestesia, respectivamente, es posible, pero impide el acceso gratuito a la zona del cuello del animal y por lo tanto no se recomienda para un usuario inexperto.
- Vuelva a evaluar la profundidad de la anestesia por pizca dedo del pie. Afeitado y cuello preparación aséptica y la región superior del pecho. Administrar antibiótico (cefazolina; 20 mg / kg; IM), analgésicos (meloxicam; 0,5 mg / kg; SC) y solución salina (10 ml / kg; SC). Cateterizar la vena de la cola con una G catéter 24 y administrar heparina (200 UI / kg; IV). Nota: Una dosis de / kg (IM) 10 mg de enrofloxacino (Baytril) se puede utilizar en lugar de cefazolina. Evitar el uso de antibióticos que carecen de actividad significativa frente a bacterias Gram-positivas. 10-15 mg / kg de carprofeno (Rimadyl) puede utilizarse en lugar de meloxicam como un analgésico preventivo. Los analgésicos narcóticos (e.g., morfina, buprenorfina) debe evitarse debido a sus propiedades de respiración-deprimente.
- Realizar una incisión de línea media a través de la fascia de la piel y el cuello. Utilizar técnicas de disección roma para aislar la arteria carótida externa izquierda. Tie-off de la arteria carótida externa en el lugar accesible más distal. Aplique una ligadura temporal deslizante para el origen de la arteria carótida interna.
- Haga una incisión de 2 mm arteriotomía en la arteria carótida externa izquierda.
- Insertar un catéter Fogarty 2-francesa en la arteria carótida común a través de la incisión en la arteria carótida externa. Inflar la punta del catéter con solución salina y pasar 3x desde el arco aórtico hasta la bifurcación de la carótida con el fin de desnudar el endotelio.
- Deslizar un trozo de tubo (1,04 mm OD, 0,99 mm ID) sobre el catéter Fogarty y en la arteria carótida común. Retirar el catéter de Fogarty.
- Monte y engarce un anuncio Luc -derivatized stent sobre el balón de un 1,5catéter de angioplastia mm de diámetro. Inserte el stent a través del tubo de teflón y avanzar en la sección media de la arteria carótida común. Evite frotar el stent contra la pared del tubo o vaso.
- Implementar el stent a las 12 atm durante 30 segundos y retirar el catéter de angioplastia.
- Tie-off el proximal de la arteria carótida externa al sitio arteriotomía y suelte la ligadura temporal en la arteria carótida interna.
- Reparar la herida operatoria en capas con el funcionamiento de 4,0 Vicryl y grapar la piel.
- Recuperar el animal sobre una almohadilla de calentamiento hasta ambulatoria y volver a su jaula aislada. Mientras que no hay signos de dolor o malestar son típicamente exhibidos por los animales después de la operación más allá de la primera 12 horas después del procedimiento, considere la extensión de la terapia de meloxicam (0,5 mg / kg, SC al día) durante 72 hr.
9. bioluminiscencia Imaging arterial de la Expresión Génica
- En los puntos de tiempo predeterminados (1 día - 3semana rango) después del despliegue del stent gen de rapamicina en la arteria carótida común, anestesiar la rata con anestesia de inhalación de isoflurano (2-4% de isoflurano en oxígeno).
- Retire las grapas quirúrgicas, asépticamente preparar el sitio y volver a abrir la herida operatoria. Usando el acceso disección, re-ganancia contundente en la arteria carótida común izquierda y separarlo del nervio vago y el tejido conectivo adyacente.
- Preparar una mezcla de 50 mg / ml en PBS luciferina y 25% de Pluronic F-127 en PBS (1: 4 v / v) y almacenar en hielo. Nota: Esta formulación se presenta como una solución viscosa a 4 ° C e inmediatamente la convierte en gel al entrar en contacto con el tejido a 37 ° C.
- Aplicar 200 l de una mezcla enfriada luciferina / Pluronic directamente al segmento expuesta de la arteria carótida común y verificar la solidez de gel.
- Colocar el animal en posición supina en la cámara de imágenes del aparato IVIS Spectrum-y mantener la anestesia isoflurano con una máscara facial.
- En la acquisitien la ventana del panel de control (imagen vida, versión 4.2 o superior) elegir la posición "B" (6.6 cm de la cámara a la distancia del objeto) y se va a agrupar el factor "medio" en los menús desplegables titulado "campo de visión" y "binning", respectivamente. El tipo de "2,5 cm" en el cuadro de altura tema. Elija "min", como una unidad de tiempo en el cuadro de "tiempo de exposición", y seleccione un valor numérico de "2".
- Tres minutos después de la aplicación de la / gel Pluronic luciferina, iniciar la adquisición de imágenes haciendo clic en el botón "Adquirir" en la pantalla. NOTA: el tiempo de adquisición de imágenes se puede variar de 1 a 6 min dependiendo de la intensidad de la señal esperada.
- Después de la adquisición de la imagen, lavar el gel con solución salina y aplique el espacio periarterial con gasa y algodón aplicadores estériles.
- Cierre la herida con sutura Vicryl y grapar la piel.
- Recuperar el animal y volver a su jaula. Repetir imágenes en adelante tpuntos iempo para estudiar la evolución temporal de la expresión arterial provocada por los vectores de Ad-stent inmovilizado.
- Alternativamente, realizar las imágenes después de una administración sistémica de luciferina. Anestesiar y preparar el animal como por 9.1-9.2. Cateterizar la vena de la cola con una G catéter 24 y el catéter segura con cinta quirúrgica.
- Preparar una solución de luciferina en PBS (50 mg / ml) y se inyecta 1 ml de la solución a través del catéter en un intervalo de 10 seg. Uno min después de la inyección se inicia la adquisición de imágenes como por 9.7 a 9.8. Nota: Una tasa de inyección más rápida (<10 seg) puede provocar actividad convulsiva y paro respiratorio. El animal debe ser sacrificado si se presentan convulsiones o paro respiratorio durante la exploración.
- Siga el paso 9.10.
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Representative Results
Experimentos vector de liberación
Tethering de vectores adenovirales a la superficie de los implantes, incluyendo dispositivos de intervención, tales como stents endovasculares, se aproxima el vector al sitio de la enfermedad, obviando parcialmente la falta de orientación física vectores. Sin embargo, para ser capaz de lograr efectos terapéuticos a través de la transducción de tejido diana, el vector debe ser liberado de la superficie (Figura 2). El uso de hidrolizables reticulantes se planteó la hipótesis de permitir 1) de acoplamiento efectivo de vectores para modificados polybisphosphonate, implantes metálicos tiol-instalado y 2) liberación sostenida mediada por hidrólisis del agente de reticulación.
El número de copias genómicas del Ad eGFP vector asociadas con los discos de malla por el final del procedimiento de derivatización se determina por PCR de ADN viral con cebadores específicos eGFP (Figura 3). Dependiendo de lareticulante específicos utilizados, la cantidad de límite Ad vector debe variar entre 3,5 x 10 9 y 5,7 x 10 9 partículas / malla. Esta cantidad está en justa correspondencia con la capacidad estimada máxima (2,5 x 10 9) de un disco de malla individual con una superficie total de 0,25 cm 2 para dar cabida a las partículas hasta 100 nm en un arreglo monocapa. Puesto que la cantidad de partida de Ad vector en la etapa de modificación reticulante es 5 x 10 11 partículas, sólo ~ 1% de el vector modificado es finalmente inmovilizado en la PABT / PEI PDT -derivatized superficie de acero inoxidable.
Ambos se espera que la tasa de hidrólisis del éster en la cadena y el número de enlaces entre el vector y el biomaterial para afectar la cinética global de Ad vector de liberación de la superficie.
Para facilitar los experimentos de liberación, las partículas adenovirales pueden ser pre-etiquetados con Cy3 fluoróforo (Protocolo; sección 1) antes de la modifi reticulanteción y la inmovilización de superficie (Protocolo; sección 3). La disminución de la fluorescencia asociada a la superficie con el tiempo evaluado simultáneamente por fluorometría (Figura 4A) y microscopía de fluorescencia (Figura 4B), entonces se puede utilizar como un método indirecto para el seguimiento de la liberación vector en tampón fisiológico. Vectores de Ad unidos a través de RHC y IHC vínculos deben demostrar liberación significativamente más rápido en comparación con su SHC- y homólogos unidos-NHC. En el ejemplo dado, se observó un 45% y una pérdida de 39% de vector asociado a la superficie con RHC y IHC-atado vector por día 30, respectivamente, mientras que se observó menos de 20% de vector atado para ser lanzado en SHC y NHC -immobilized muestras (Figura 4a).
Además, los vectores de Ad inmovilizan mediante el uso de diferentes concentraciones de la misma y por lo tanto presumiblemente HC tener diferentes números de correas de sujeción entre el vector y el sustrato de metal debe tenerla cinética de liberación de diferentes vectores. En efecto, la modificación vector utilizando 0,1 mM RHC resultó en tasas de liberación significativamente más rápidas que las observadas para el vector inmovilizado con RHC 0,5 mM (Figura 4A). Los datos de microscopía de fluorescencia (Figura 4B) se correlaciona bien con el análisis de liberación vector cuantitativo basado-fluorometría, demostrando una disminución más rápida y profunda de la fluorescencia asociada a la superficie con las muestras de malla formulado utilizando IHC-, RHC- y, especialmente, de baja concentración vectores RHC-atados en comparación con sus homólogos atados-SHC NHC- y.
En Transducción vitro con gorros inmovilizados Anuncio Vectores
Al ser compatible tanto con el análisis cuantitativo de expresión (fluorometría) y las observaciones espaciales (microscopía de fluorescencia), eGFP Ad es el vector reportero preferido para monitorizar la transducción de SMC y endotelialcultivos celulares tratados con ambos vectores de anuncios gratis e inmovilizado de malla. La modificación química de la cápside del anuncio con RHC (Figura 5), así como con otros reticulantes (no mostrados) en concentraciones superiores a 75 mM entorpece seriamente la eficacia de transducción de vectores no inmovilizado in vitro, muy probablemente debido al enmascaramiento y reconfiguración de la perilla de la fibra dominios utilizados por Ad para la unión a las células a través de los receptores de Coxsackie-adenovirus (CAR). Sin embargo, el papel de las interacciones perilla-CAR es menos vital para la transducción con vector sustrato inmovilizado ya que el vector se mantiene en la proximidad de las células diana por la inmovilización al sustrato. En experimentos de cultivo celular independientemente del tipo HC, vectores de Ad asociado de malla son consistentemente capaz de restringir espacialmente eventos de transducción a células situadas dentro de 300-500 micras de las fronteras de malla (Figuras 6A y 6C). Normalmente los niveles máximos de transgene expresión se alcanzan 3-5 días después de la colocación del anuncio eGFP -Cargadas mallas en SMC (figuras 6A y 6B) o BAEC (Figuras 6C y 6D) culturas. Al mismo vector de carga, los niveles máximos de expresión eGFP aumentan en la siguiente secuencia: NHC-, SHC-, IHC- y vectores RHC-tethered, lo que refleja las diferencias en sus respectivos perfiles de cinética de liberación (Figura 4). Además, la expresión del transgen más duradera se observa en las células tratadas con mallas formulados IHC en comparación con las células tratadas con las contrapartes formulados-RHC (Figura 6D).
El sistema de cultivo celular utilizado presenta una conveniente puesta a punto para la investigación de los eventos de transducción de retraso causado por partículas de vector liberados de la superficie del metal en o después de las 48 horas después de la colocación de la malla. En esta aplicación, después de determinar la expresión eGFP por fluorometmicroscopía de fluorescencia a RY y 48 h después del inicio de la transducción, BAEC se tripsinizan y se aspira de los pocillos sin perturbar las mallas. Pase reciente no transducidas BAEC son entonces re-chapada en las mallas parcialmente liberadas. "Nuevos" eventos de transducción de causadas por las partículas de virus liberadas desde el soporte de malla después del punto de tiempo de 2 días se evaluaron por microscopía de fluorescencia y fluorometría (Figuras 7A y 7B). Robusto eGFP expresión que demuestra la restricción espacial característico a un lugar de malla se observa típicamente en estas "nuevas" culturas (Figura 7), lo que confirma una capacidad de transducción bien conservado de los vectores de Ad-bound malla, incluso después de 48 h de exposición para completar medio de cultivo celular a 37 ° C.
En estudios in vivo
Para examinar los posibles efectos relacionados con la uvector SE de diferente HC sobre la transducción arterial, animales implantados con Ad Luc -eluting stents preparados con RHC-, IHC-, SHC- y NHC modificada se sometió a bioluminiscente de imágenes 1 y 8 días después del despliegue del stent (Figura 8). La formación de imágenes se llevó a cabo después de la administración perivascular local de la luciferina (2 mg) co-formulado con gel de Pluronic. Esta formulación es un líquido viscoso cuando se enfrió en hielo, sino que experimenta transición de fase inmediata a gel cuando se pone en contacto con el tejido a 37 ° C. Los experimentos preliminares (no mostrados) demostraron que la entrega de los resultados perivascular luciferina en señales de luminiscencia más estables y reproducibles en Ad Luc -transduced tejido vascular en comparación con sistémica (intraperitoneal o intravenosa) luciferina.
Si la inmovilización virus a la stent y la cirugía de despliegue del stent eran técnicamente sonido, una señal bien definida correspondiente al segmento con stent dede la arteria carótida de rata se emite y se registra. Un día después de la implantación del stent, los animales tratados con stents formulados-RHC Ad Luc típicamente exhiben la señal de luminiscencia más alta, seguida por las ratas que recibieron IHC- y SHC- formulado stents (Figuras 8A y 8B). No se observa ninguna señal perceptible en el grupo de ratas implantadas con stents prepararon utilizando atado-NHC Ad Luc, lo que subraya la importancia de la liberación de vectores sin obstáculos desde el stent para la transducción eficaz de tejido vascular (Figuras 8A y 8B). Por día 8, la intensidad media de la expresión de luciferasa con los stents formulados-RHC gotas varias veces, mientras que aumenta 1,4 y 1,8 veces con IHC- y los stents formulados-SHC, respectivamente (Figuras 8A y 8B). Este hallazgo es consistente con la hipótesis de la transducción vascular más duradera con los stents de elución de genes que exhiben un pariente más lentoetics de liberación vector de la superficie del stent.
Figura 1. fórmulas estructurales de reticulantes (NHC, SHC, IHC y RHC) utilizados en los estudios descritos (modificado con autorización 28).
Figura 2. Un esquema que representa Ad vector tethering a un PABT / PEI PDT modificada con superficie de acero inoxidable a través de una HC y posterior liberación del vector tras la hidrólisis reticulante (modificada con permiso 28).
Figura 3.-quant basado en la PCRficación de Ad eGFP inmovilizada a través de la inmovilización reticulante en la superficie de PABT / PEI PDT modificada con mallas de acero inoxidable. Las mallas de acero inoxidable se formularon con Ad eGFP inmovilizada a través de RHC, IHC, SHC, o NHC (n = 3 para cada condición ). Después de tratamiento con proteinasa K, el ADN viral se eluyó y se purificó usando columnas MinElute. La amplificación de ADN viral usando cebadores específicos eGFP-se llevó a cabo en un motor 7500 Real-Time PCR y se detectó con SYBR Green. La normalización de datos se basa en una curva de calibración preparada con una cantidad conocida de no inmovilizado Ad eGFP (modificada con permiso 28).
Figura 4. cinética de liberación de Ad vector atados a sustratos metálicos con HC. Stainless mallas de acero fueron derivatizados con ~ 2 x 10 partículas AD 9 Cy3-etiquetados unidos a la PABT / PEI PDT modificada con superficie después de la modificación con 500 M NHC, SHC, IHC, RHC y 100 M RHC (designado como RHC-L). La liberación de la etiqueta fluorescente Ad-partículas se estudió en los puntos de tiempo indicados por (A) fluorometry bien escaneado a 550/570 nm y (B) la microscopía fluorescente (conjunto de filtros rodamina; 200X ampliación original). Resultados Fluorometría se presentan como medias ± SEM, n = 8-10; p <0,001 para todas las comparaciones entre el NHC y SHC vs IHC, RHC y grupos RHC-L se determinaron por Anova con una prueba post-hoc de Tukey (modificado con autorización 28).
Figura 5. eficacia de transducción no inmovilizado ad eGFP siguiente modificación con RHC. Rata embrionario (A10 línea) aorta derivados SMC se transduce a una MOI de 1000, ya sea con anuncios sin modificar eGFP o vector modificado con RHC como se indica. Un reportero de expresión se determinó fluorométricamente (485/535 nm) 48 horas después de la transducción (modificado con autorización 27).
Figura 6. Transducción de culta SMC y BAEC con el vector Ad inmovilizado en acero inoxidable engrana con HC. Mallas fueron derivados con ~ 2 x 10 9 Anuncio partículas eGFP adjuntas a través de NHC, SHC, IHC, y RHC. Las mallas se colocaron entonces individualmente en la parte superior de A10 sub-confluente (A, B) y BAEC (C, D) monocapas. Transducción (expresado como niveles de expresión de EGFP) de las células tratadas con mallas vector Ad-atados se evaluó por fmicroscopía luorescence (A, C; conjunto FITC filtro; 100X ampliación original) y fluorometría bien-scan (B, D). Resultados Fluorometría se presentan como medias ± SEM, n = 4 (modificado con autorización 28). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 7. Transducción competencia del sustrato inmovilizado vectores de anuncios en momentos tardíos. Ad eGFP se inmovilizó sobre acero mallas través NHC, SHC, IHC o RHC ataduras. Las mallas se colocaron sobre las monocapas subconfluentes BAEC. Dos días después de la colocación, BAEC se tripsinizaron y se retira sin alterar las mallas. Nuevo, BAEC no transducidas fueron luego sembradas sobre las mallas. AdeGFP competencia transducción se midió por la expresión de eGFP usando microscopía de fluorescencia (A; conjunto de filtros FITC; 100X magnificación original) y fluorometría (B). Las mediciones se tomaron en los días indicados, se utilizaron imágenes representativas y los resultados fluorometría son medias ± SEM, n = 4 (modificado de con permiso 28). Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 8. eficacia de transducción de stent inmovilizada Ad Luc in vivo. Ad Luc (1,3 x 10 10 partículas) estaba atado a los stents endovasculares mediante NHC, SHC, IHC o RHC (n = 3-4 para todos los grupos). La eficacia de transducción de Ad Luc </ Sub> eluida de stents se midió mediante imágenes de bioluminiscencia (IVIS Spectrum) 1 y 8 días después de la colocación del stent (A), y se representa mediante una escala logarítmica (B) (modificado de con permiso 28). Haga clic aquí para ver una mayor versión de esta figura.
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Discussion
El protocolo presentado describe un método operativo para la entrega de genes mediada sustrato logrado a través de unión reversible de vectores adenovirales sin abrigo para superficies de acero inoxidable. Si bien desarrollado para el propósito específico de la terapia génica basada en stent de la reestenosis vascular, esta técnica tiene aplicaciones mucho más amplias en las áreas de biomateriales, implantes biomédicos y la terapia génica.
Aunque los estudios presentados únicamente han utilizado el acero inoxidable como un sustrato metálico prototípico, PABT une otras aleaciones de metales como el cobalto / cromo y nitinol con afinidad comparable (no publicado). La interacción indiscriminada de PABT con metales expande significativamente el número de posibles aplicaciones biomédicas para esta tecnología 31. Por otra parte, el uso de vectores de genes-HC atado, aunque requieren otros métodos de instalación de tiol en la superficie del material, es factible con otros tipos de biomateriales.
ontenido "> Mientras vectores génicos Anuncio lograr transducción robusto en muchos tipos de células y tejidos humanos, su importancia clínica está limitada por fuertes respuestas inflamatorias e inmunitarias producidas por Adenoviridae 4. Con este fin, prolongada (4 meses) la expresión de genes arterial con stents liberadores formuladas mediante modificación HC de vectores virales adeno-asociados luciferasa que expresan se demostró recientemente (no publicado).La metodología es robusto. Las pequeñas desviaciones del protocolo principal generalmente no conducen a alteraciones significativas de la expresión génica in vitro e in vivo. Sin embargo, se identificaron varios problemas críticos que pueden afectar los resultados.
En primer lugar, como el nombre sugiere, hidrolizables reticulantes son escindible después de la reacción con agua debido a la hidrólisis del éster en la cadena. Por otra parte, el resto de amina reactiva, N -sulfosuccinimidyl es hidrolizable también. Agentes de reticulación deben almacenarse under una atmósfera de argón a -20 ° C para preservar su actividad. Por las mismas razones, después de preparar las soluciones de HC (servicio de protocolo 3.2) proceder inmediatamente con la adición de soluciones de HC a las preparaciones de virus.
En segundo lugar, los grupos tiol que se forman en la superficie metálica durante varios pasos intermedios de la secuencia bioconjugation presentado se oxidan rápidamente por el oxígeno del aire ambiente. Para evitar esto, mantener las muestras de metal vulnerables sumergidas en agua desgasificada en todo momento.
En tercer lugar, se requiere una alineación perfecta de la malla con el fondo del pozo para la transducción con éxito. No doble los discos de malla durante el manejo.
En cuarto lugar, evitar el frotamiento excesivo de los stents liberadores de genes contra la vaina de teflón y la pared del depósito durante la inserción del stent para evitar el desplazamiento de vectores de Ad-asociadas a la superficie.
La unión covalente del gen vector a la superficie de biomateria implantablels tiene una aparente ventaja de un mejor control sobre la cinética de liberación vector que realizable con la inmovilización no covalente de los vectores. En el contexto de la entrega de genes de la plataforma de stent mayoría de los estudios informan de la liberación completa de vectores virales y no virales dentro de 1-7 días después del despliegue del stent 32-34. Por otro lado, Ad inmovilización vector a través de HC demostró liberación de sólo 20-45% de la carga del vector en el primer mes (Figuras 4A y 4B). Por otra parte, una modulación parcial de liberación y de transducción de la cinética se puede lograr con el uso de diferentes HC exhibe cinética de hidrólisis diferentes o variando la concentración de HC empleado para la modificación de superficie del virus. Además, un co-modificación concurrente del vector con diferentes moléculas de entrecruzamiento, aunque no explorado en el presente estudio, ofrece otra oportunidad para afinar la liberación de vectores y la transducción.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 316 stainless steel mesh disks | Electon Microscopy Sciences | E200-SS | |
| Generic 304-grade stainless steel stents | Laserage | custom order | |
| AdeGFP | University of Pennsylvania Vector Core | AD-5-PV0504 | |
| AdLuc | University of Pennsylvania Vector Core | AD-5-PV1028 | |
| AdEMPTY | University of Pennsylvania Vector Core | A858 | |
| Cy3(NHS)2 | GE Healthcare | PA23000 | |
| Sepharose 6B | Sigma-Aldrich | 6B100-500ML | |
| UV 96-well plates | Costar | 3635 | |
| Fluorometry 96-well plates | Costar | 3915 | |
| Cell culture 96-well plates | Falcon | 353072 | |
| Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride (TCEP) | Pierce Thermo Scientific | 20490 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Pierce Thermo Scientific | 20290 | |
| sulfo-LC-SPDP | Pierce Thermo Scientific | 21650 | |
| Spectrophotometer | Molecular Devices | SpectraMax 190 | |
| Spectrofluorometer | Molecular Devices | SpectraMax Gemini EM | |
| Orbital shaker incubator | VWR | 1575R | |
| Horizontal airflow oven | Shel Lab | 1350 FM | |
| Centra-CL2 centrifuge | International Equipment Company | 426 | |
| Digital vortex mixerer | Fisher Thermo Scientific | 02-215-370 | |
| Eclipse TE300 fluorescence microscope | Nikon | TE300 | |
| DC 500 CCD camera | Leica | DC-500 | |
| 7500 Real-Time PCR system | Applied Biosystems | not available | |
| IVIS Spectrum bioluminescence station | Perkins-Elmer | not available | |
| EDTA dipotassium salt | Sigma-Aldrich | ED2P | |
| Bovine serum albumin fraction V (BSA) | Fisher Thermo Scientific | BP1600-100 | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P1379 | |
| Dumont forceps | Fine Science Tools | 11255-20 | |
| A10 cell line | ATCC | CRL-1476 | |
| Bovine aortic endothelial cells | Lonza | BW-6002 | |
| Luciferin, potassium salt | Gold Biotechnology | LUCK-1Ge | |
| Pluronic F-127 | Sigma-Aldrich | P2443-250G | |
| PBS without calcium and magnesium | Gibco | 14190-136 | |
| Fetal bovine serum | Gemini Bio-Products | 100-106 | |
| Penicillin/Streptomycin solution | Gibco | 11540-122 | |
| DMEM, high glucose | Corning cellgro | 10-013-CV | |
| 0.25% Trypsin/EDTA | Gibco | 25200-056 | |
| QIAamp DNA micro kit | Qiagen | 56304 | |
| Power Sybr Green PCR Master Mix | Applied Biosystems | 4367659 | |
| MicroAmp Optical 96-well Reaction Plate | Applied Biosystems | N8010560 | |
| MicroAmp Optical Adhesive Film | Applied Biosystems | 4360954 | |
| Cephazolin | Apotex | not available | |
| Loxicom (Meloxicam) | Norbrook | not available | |
| Heparin sodium | APP Pharmaceuticals | not available | |
| Ketavet (Ketamine) | VEDCO | not available | |
| Anased (Xylazine) | Lloid | not available | |
| Forane (Isoflurane) | Baxter | not available | |
| Curved Moria iris forceps | Fine Science tools | 11370-31 | |
| Curved extra-fine Graefe forceps | Fine Science Tools | 11152-10 | |
| Dumont #5 forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| Vannas spring scissors | Fine Science Tools | 15018-10 | |
| Fine scissors - ToughCut | Fine Science Tools | 14058-09 | |
| Surgical scissors | Fine Science Tools | 14101-14 | |
| Vicryl suture (5-0) | Ethicon | J385 | |
| Suture thread (4/0 silk) | Fine Science Tools | 18020-40 | |
| Michel suture clips | Fine Science Tools | 12040-02 | |
| Wound dilator (Lancaster eye specula) | KLS Martin | 34-149-07 | |
| Hot bead sterilizer | Fine Science Tools | 18000-45 | |
| Michel suture clip applicator | Fine Science Tools | 112028-12 | |
| Insyte Autoguard 24 G IV catheter | Beckton-Dickinson | 381412 | |
| 2F Fogarty catheter | Edwards Lifesciences | 120602F | |
| Teflon tubing | Vention | 041100BST | |
| PTA catheter | NuMed | custom order | |
| Gauze pads | Kendall Healthcare | 9024 | |
| Cotton applicators | Solon Manufacturing | WOD1003 | |
| Saline | Baxter | 281321 | |
| 10 ml syringe (Luer-Lok) | Beckton-Dickinson | 309604 | |
| 1 ml syringe (Luer-Lok) | Beckton-Dickinson | 309628 | |
| Clippers with #40 blade | Oster | 78005-314 | |
| Transpore surgical tape | 3M | MM 15271 | |
| Puralube vet ointment | Pharmaderm | not available |
References
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