Abstract
In-stent-restenos presenterar en stor komplikation av stentbaserad revaskularisering som vanligtvis används för att återupprätta blodflödet genom kritiskt förträngda segment av koronära och perifera artärer. Endovaskulära stent som kan avstämbara frisättning av gener med anti restenosvävnad aktivitet kan utgöra en alternativ strategi för närvarande används läkemedelsavgivande stentar. För att uppnå klinisk översättas ska gen-stent uppvisar förutsägbara kinetik stent-immobiliserade genvektor frisättning och platsspecifik transduktion av kärlsystemet, samtidigt som man undviker en överdriven inflammatorisk reaktion vanligtvis förknippas med polymerbeläggningar som används för fysisk inneslutning av vektorn. Detta dokument beskriver en detaljerad metod för coatless uppbindning av adenovirala genvektorer till stentar som bygger på en reversibel bindning av de adenovirala partiklar att polyallylamin bisfosfonat (PABT) -modifierade yta av rostfritt stål via hydrolyser tvärbindare (HC). En familj avbifunktionella (som aminer och tiolreaktivt) HC med en genomsnittlig t 1/2 av den i-kedjan esterhydrolys som varierar mellan 5 och 50 dagar användes för att länka vektorn med stenten. Vektorn immobilisering förfarande utförs typiskt inom 9 h och består av flera steg: 1) inkubation av de metallprover i en vattenhaltig lösning av PABT (4 h); 2) avskyddande av tiolgrupper installerade i PABT med tris (2-karboxietyl) fosfin (20 min); 3) expansion av tiol reaktiv kapacitet av metallytan genom att bringa proverna med polyetylenimin derivatiserade med pyridylditio (PDT) grupper (2 h); 4) omvandling av PDT grupper tioler med ditiotreitol (10 min); 5) modifiering av adenovirus med HC (1 tim); 6) rening av modifierade adenovirala partiklar genom storleksuteslutning-kolonnkromatografi (15 min) och 7) immobilisering av tiolreaktiva adenovirala partiklar på tiolerade yta stål (1 h). Denna teknik har stort potential tillämplighet utanför stentar,genom att underlätta ytteknik av bioprotetiska enheter för att öka deras biokompatibilitet genom substratet-medierad gen leverans till cellerna gränssnitts det implanterade främmande material.
Introduction
Effektiviteten av genterapi som en terapeutisk modalitet hämmas av den dåliga målskapacitet genterapivektorer 1,2. Bristen på ordentliga inriktnings leder subterapeutiska nivåer av transgenexpression vid målplatsen och leder till en stor spridning av vektorer till icke-målorgan 3, däribland de som ansvarar för montering av immunsvar mot både vektorn och kodade terapeutisk produkt 4, 5. En potentiell betyder att kompensera promiskuitet för transduktion och främja inriktning är att införa genvektorer på önskad plats i en form som hindrar deras fria spridning via blod och lymfa. Vanligtvis sådana insatser är beroende av ett lokalt injicerbara leveranssystem som består av antingen virus eller icke-virala vektorer blandade med fibrin, kollagen eller hyaluronsyra hydrogelmatriser 6-10 som kan övergående sustaining genvektorer vid injektionsstället genom att fysiskt innesluta them i en polymernätverk.
En annan allmänt accepterad paradigm för lokaliserad genterapi utnyttjar immobilisering av genvektorer på ytan av implanterade proteser 11,12. Permanenta medicinska implantat (endovaskulära, bronkial, urologiska och gastrointestinala stentar, pacemakers, artificiella leder, kirurgiska och gynekologiska maskor, osv.) Används årligen i tiotals miljoner patienter 13. Medan allmänhet effektiva, dessa enheter är benägna att komplikationer som otillräckligt kontrolleras genom nuvarande medicinsk praxis 14-17. Implanterbara proteser ett unikt tillfälle att tjäna som proxy plattformar för lokal genterapi behandling. Ur farmakokinetisk synvinkel, yta derivatisering av medicinska implantat med relativt låga ingångsdoser genvektorer leder uppnå både höga lokala koncentrationer av genvektorer på implantatet / vävnadsgränssnittet och bromsa kinetiken för their eliminering från den här platsen. Som en följd av utdragen bostad och ökat upptag av den målsökta cellpopulationen, minimerar vektor immobilisering spridningen av genen vektor. Således oavsiktlig inokulation av icke-mål vävnader minskar.
Surface uppbindning av genvektorer på implanterbara biomaterial (även benämnda som substrat-medierad gen leverans eller fast fas-gen leverans) har genomförts i cellkultur och djurförsök med både specifika (antigen-antikropps 18-20, avidin-biotin 21,22) och ospecifik 23-26 (avgift, van der Waals) interaktioner. Den kovalenta bindningen av vektorer på ytan av den implanterade anordningen har tidigare betraktats som icke-funktionell, eftersom alltför starka bindningar med ytan utesluter vektor intemalisering av målceller. Nyligen har det visats att denna begränsning kan övervinnas genom användning av spontant hydrolyserbar tvärbindare användas som tet-hers mellan den modifierade metalliska ytan av stenten och kapsidproteiner av den adenovirala vektorn 27,28. Dessutom kan vektorn frisättningshastigheten och tidsförloppet för transgen expression in vitro och in vivo att moduleras med användning av hydrolyserbara tvärbindare som uppvisar olika kinetik för hydrolys 28.
Detta dokument ger en detaljerad protokoll för reversibel kovalent bindning av adenovirusvektorer till aktiverade metallytan och innebär ju experimentuppställning för att studera efterföljande transduktion händelser i vitro i odlade glatt muskulatur och endotelceller och in vivo i råtthalsmodell stent angioplastik .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1 Beredning av Cy3-märkt adenovirus för Release Experiment
- Häng 2 x 10 12 partiklar av Ad tomt (ca 2 x 10 11 infektiösa enheter) i 650 l av karbonat / bikarbonatbuffert (CBB, pH 9,3).
- Lös upp innehållet i en injektionsflaska (0,2 mg) av aminreaktiv fluorescerande färgämne (Cy3 (NHS) 2) i 1 ml CBB till en slutkoncentration av 0,2 mg / ml.
- Lägg 100 ul av färgämneslösningen till virussuspension, virvel för 5 sek och inkubera under 1 h vid 28 ° C under skakning (100-200 rpm).
- Jämvikta en 20 ml Sepharose 6B-kolonn med PBS. Lägg 750 pl av Cy3-märkt Ad suspensionen droppvis till centrum i gelbädden.
- Efter virussuspension tränger hartset, tillsätt 5 ml PBS. Kasta bort eluatet.
- Lägg 0,5 ml PBS och samla upp eluatet i en märkt glasbehållare. Upprepa detta steg 10x samla totalt tio 0,5 ml fraktioner.
- Assay the insamlade fraktioner med spektrofotometri (260 och 280 nm) för viral DNA-innehåll.
- Pool de fraktioner som innehåller mer än 10% av det totala (summan av F1 till F10) optiska densitet (OD) vid 260 nm. Anmärkning: Normalt fraktionerna F3, F4, F5 och F6 poolas och blandas.
- Åter assay de blandade poolade fraktionerna genom spektrofotometri (260 och 280 nm) och analys av fluorometri (550 ex / 570 em nm) för viral DNA-innehåll och Cy3 märkt kapsidprotein, respektive. Anmärkning: En Cy3 (NHS) 2 kalibreringskurva som täcker 10 -9 -10 -13 mol / L-serien är förberedd och fluorimetriskt analyseras på samma platta som de sammanslagna fraktionerna.
- Beräkna den märkta virusutbyte och märkning densitet. Antag att 1,19 x 10 12 viruspartiklar / ml motsvarar 1 OD enhet för en 1 cm väglängd 29. Använd formeln: Utbyte = [(OD 260 nm /1.19)*10 12 * V / input Annons belopp] * 100 där, OD 260 nm är den optiska density av den poolade formuleringen vid 260 nm och V är volymen av den poolade formuleringen (ml) för att beräkna återhämtnings Ad utbyte (%). Använd formeln: Labeling Densitet = C * 6,02 * 10 23 / (OD 260 nm /1.19)*10 12, där C är Cy3 koncentration av den poolade formulering (mol / ml) och OD 260 nm är den optiska densiteten för den poolade formuleringen vid 260 nm för att beräkna genomsnittlig Cy3 märkningsdensitet. NOT: En typisk återhämtning av märkt virus är> 70% av den ingående dosen. Märkningen Tätheten är 600-800 fluoroforenheter molekyler per enda viruspartikel.
- Fördela Cy3-märkt Ad tomt i mindre delar (vanligtvis 5 x 10 11 partiklar) är lämpliga för frisättningsförsök enskilda. OBS: Aktuellt protokoll anger användningen av Cy3-märkt Ad enbart i frigör experimentet. Alla transduktion studier genomförs med omärkta vektorer.
2 Aktivering av Metal Prov
- Tvätta rostfritt sTEEL mesh diskar eller stentar av rostfritt stål konsekutivt i isopropanol (5 minuter x 2) och kloroform (5 min x 2) vid 55 ° C med skakning (100 rpm). Avlägsna lösningsmedlet.
- Värm proverna i 30 min vid 200 ° C.
- Lös polyallylamin bisfosfonat med installerade latenta tiolgrupper (PABT 27,28,30) i vatten (1-2% vikt / volym) vid 72 ° C med skakning (100 rpm). Justera pH till 4.5-5 med KHCO3.
- Inkubera metallprover i PABT lösningen för 2-4 h vid 72 ° C under skakning (100-200 rpm). OBS: Proceduren kan pausas på denna punkt. Proverna är stabila i 3 dagar vid 4 ° C.
- Skölj proverna tre gånger med dubbeldestillerat vatten (DDW).
- Exponera proverna till tris (2-karboxietyl) fosfin (TCEP; 15 mg / ml i 0,1 M ättiksyra-buffert) under 15 min vid 28 ° C under skakning (100-200 rpm).
- Skölj 5x i avgasad DDW.
- Exponera proverna till 2% polyetylenimin med installerade pyridylditio grupper (PEI
- Skölj proverna tre gånger med DDW.
- Exponera proverna till 10 mg / ml ditiotreitol / DDW konverterar pyridylditio grupper till tioler.
- Skölj 5x igen i avgasad DDW.
3 Adenovirus Aktivering och Rengöringsmedel Immobilisering
- Suspendera 5 x 10 11 partiklar av antingen Ad EGFP eller Ad Luc (ca 5 x 10 10 infektiösa enheter) i 487,5-495 il av karbonat / bikarbonatbuffert (CBB, pH 9,3). Obs! Releasestudier, använd 5 x 10 11 i Cy3 märkt Ad tomma partiklar (justera volymen till 487,5 till 495 l med CBB).
- Lös HC med varierande hydrolyshastigheter 28 [(snabbt (t 1/2 = 5 d), mellanliggande (t 1 /2 = 12 d) och långsamt (t 1/2 = 50 d) HC, dvs RHC, IHC eller SHC Figur 1] eller icke-hydrolyser tvärbindare (NHC), sulfo-LC-SPDP i CBB på 20 mM.
- Omedelbart lägga 5-12,5 il av tvärbindare lösning på virussuspension till en total volym av 500 | il (200 till 500 | iM slutlig koncentration av tvärbindare), vortexa och inkubera i 1 h vid 28 ° C med skakning (100- 200 rpm).
- Jämvikta en 20 ml Sepharose 6B kolonn med avluftad 5 mM EDTA / PBS (EPBS). Droppvis tillsattes 500 pl av tvärbindare modifierade Ad suspensionen till centrum av hartsbädden.
- Lägg 5 ml avgasad EPBS. Kasta bort eluatet.
- Lägg 0,5 ml avgasad EPBS och samla upp eluatet i en märkt glasbehållare. Upprepa detta steg 10 gånger samlar totalt tio 0,5 ml-fraktioner.
- Bestäm OD av de uppsamlade fraktionerna med hjälp av spektrofotometri vid 260 och 280 nm och konvertera OD till virustitrar (1,19 x 10 12 / ml Correrar 1 OD) 29.
- Pool de fraktioner som innehåller> 10% av den eluerade virus (Notera: Normalt fraktionerna F3-F6). Upprepa spektrofotometrisk titer analysen för den poolade fjädring.
- Överför viral suspensionen till flaskan med de aktiverade metallprover (per den 2.11). Inkubera i en argonatmosfär under 1 h vid 28 ° C under skakning (100-200 rpm). Obs: Ad-bundna metallproverna i detta steg vidare används i de efterföljande frisättning och transduktion experiment som beskrivs i protokoll avsnitten 5-7.
4 Kvantifiering av Surface-associerad Ad Vector med PCR
- Förbered maskor formulerade med utanpå immobiliserade Ad eGFP bundna via NHC, SHC, IHC och RHC (n = 3 för varje typ) som beskrivs i avsnitt 2 och 3.
- Använd en QIAamp DNA Micro kit för att isolera virus-DNA. Placera maskorna individuellt i 1,5 ml plaströr som innehåller 200 fil blandning bestående av 180 l av ATL bUffer och 20 pl av proteinas K (båda från kitet). Lägg känd mängd Ad EGFP partiklar (som standarder för kalibreringskurvan) i de separata rör innehållande samma blandning. Inkubera vid 56 ° C över natten utan skakning.
- Lägg 200 pl av AL-buffert (från kitet), omskakas, tillsätt 200 | il 100% etanol, och inkubera vid rumstemperatur under 5 min.
- Överför blandningen från varje rör till en individuell MinElite kolonn (från kitet) och snurra vid 8000 rpm under 1 min. Skölj maskinnehållande rör med 180 l av färska ALT buffert, lägga på respektive kolumner och snurra vid 8000 rpm i 1 minut. Släng eluat.
- Lägg 500 pl av AW1 buffert (från kitet) i kolonnerna och centrifugering vid 8000 rpm under 1 min. Släng eluat.
- Lägg 500 pl av AW2 buffert (från kitet) i kolonnerna och centrifugering vid 8000 rpm under 1 min.
- Släng eluat.
- Centrifugera vid 14.000 rpm under ytterligare 3 minuter until kolumnerna är helt torra. Släng eluat.
- Lägg 50 pl MilliQ-grade vatten i kolumnerna. Snurra vid 14.000 rpm under 5 min. Samla 50 pl eluat från varje kolumn i individuella provrör (ur satsen).
- Förbered PCR Master Mix-lösning genom att kombinera multiplicerar av följande (12,5 pl Ström SYBR Grön PCR Master Mix, 0.63 l av 10 nM eGFP sensprimer [5 'ACG TAA ACG GCC ACA AGT TC -3'], 0.63 l av 10 iM eGFP anti sensprimer [5'AAG TCG TGC TGC TTC ATG TG -3 '], 6,3 pl MilliQ-grade vatten). Multiplicera dessa volymer med antalet planerade reaktioner inklusive "ingen DNA" kontroller.
- Load 5 ^ Ad EGFP DNA (från steg 4,8) och 20 pl PCR Master Mix i tredubbla brunnar i en MicroAmp Optical 96 brunnar Reaction platta. Täta plattan med MicroAmp Optical Adhesive Film. Snurra plattan vid 1000 rpm under 1 min för att eliminera luftbubblor.
- Placera plattan i kärlet av en 7500 realtids-PCR-motor. I huvudmenyn för 7500 System SDS Software (v1.4 eller högre) Välj "Skapa nytt experiment". Klicka på "Nästa". I "Nytt experiment wizard" skärm väljer SYBR Green från en rullgardinsmeny och klicka på "lägg till". Klicka på "nästa" för att få en layout av plattan. Markera alla brunnar som ska analyseras väljer SYBR Green. Markera i följd inga DNA kontrollbrunnarna, Ad EGFP DNA standarder och okända, och markera dem med respektive beteckningar från rullningsrutan.
- Växla till fliken instrumentet. Välj "Lägg till dissociation fasen", ändrar väl volymen från standard 50 ^ till 25 ^. Klicka på start.
- Analysera PCR-resultat genom att använda efter kontroll sammanfattningen QC för extremvärden och andra oegentligheter.
5. Release Kinetics av hydrolyser tvärbindare-bundna Vector Partiklar från Model Steel Mesh
- Tvätta maskprov derivatiserade med Cy3-märkt Ad via RHC, IHC, SHK och NHC (enligt 3.9) i 1% BSA / PBS (1 tim x 3) med skakning (100-200 rpm).
- Använda sterila fin pincett, placera maskorna i individuella brunnar i en 96-brunnar förfylld med 200 ul av elueringsbuffert (0,1% BSA / 0,1% Tween-20 / PBS).
- Ta fluorescerande bilder av en central del i varje maska. Anteckna de inställningar av mikroskopet och CCD-kameran används för bildinhämtning.
- Analysera plattan fluorimetriskt (550 ex / 570 em) i väl skanningsläge med maximal minskning. Använd brunnarna med icke-derivatiserade maskor som bakgrund kontroll.
- Inkubera plattan vid 37 ° C med skakning (50 rpm).
- Vid förutbestämda tider (1-30 dagar) intervall aspirera elueringsbufferten utan att störa maskorna och tillsätt 200 l av färskt elueringsbuffert. Upprepa steg 4.3-4.5 efter byte av bufferten.
6. Transduktion av odlade Cells av Mesh-immobiliserade Ad vektorer
- Tvätta Ad eGFP - eller Ad Luc -derivatized maskor tre gånger med steril PBS i 5 min med skakning (100 rpm).
- Med fin steril pincett avlägsna maskskivor en genom en och individuellt placera dem i brunnarna i en 96-brunnars platta med celltypen av intresse i log-fas av tillväxt.
- Inkubera cellerna under 24 h vid 37 ° C, i 5% CO2.
- Använd respektive icke-terminal endpoint analys (fluorescerande mikroskopi, fluorometri för eGFP eller mareld avbildning för luciferas) för att fastställa omfattningen och den geografiska fördelningen av genuttryck i brunnarna.
- Eventuellt att ersätta medium för PBS öka känsligheten för fluorometri analysen (485/535 nm) om låg EGFP uttryck förväntas. Obs: Om en fluorometer är utrustad med väl scan kapacitet, läs plattan i en väl skanningsläge för att bedöma den geografiska fördelningen av EGFP-uttryckande celler i brunnarna. Utbyte PBS för medel efter avslutad fluorometri.
- Bild de omvandlade cellerna i brunnarna med Ad eGFP -eluting maskor (både underliggande och perifera i mesh) med hjälp av FITC-filter set. Ta representativa bilder på 40-200X förstoring. Spela de exakta inställningarna för fluorescensmikroskop och CCD-kamera som används för förvärv av bilder.
- Lägg 5 ^ il luciferin lager i PBS (10 mg / ml) direkt till brunnarna med Ad Luc -eluting maskor för en slutlig koncentration av 500 | ig / ml och inkubera vid 37 ° C och 5% CO2 under 10 min före bioluminescens avbildning . Aspirera media och ersätta med luciferin-fria medier efter avbildning.
- Upprepa endpoint analyser vid förutbestämda tidpunkter (upp till 2 veckor) för att studera kinetiken för reportergenuttryckning följande substrat genöverföring.
7 Validering av Konserverad Transduktion Kapacitet vid fördröjd tidpunkter
- Förbered Ad eGFP derivatized maskor använder RHC, IHC, SHK och NHC för vektor tethering (per den 2,1-2,11 och 3,1-3,9) och individuellt placera maskorna i brunnarna i en 96-brunnar med 60-80% sammanflytande nötkreatur aortaendotelceller (BAEC ).
- Analysera transduktion av odlade BAEC med mesh-immobiliserade Ad eGFP vid 1 och 2 dagar efter mesh placering med hjälp av fluorescens mikroskopi och fluorometri (enligt 6,4-6,5).
- 48 timmar efter påbörjandet av transduktion tvätta mesh-innehållande brunnar med PBS två gånger.
- Lägg 200 ul av 0,25% trypsin / EDTA till varje brunn och inkubera under 15 min vid 37 ° C med skakning (100 rpm). Tvätta 3x med PBS.
- Använd fluorescerande mikroskopi och fluorometri att fastställa fullständigt avlägsnande av alla EGFP-positiva celler i förening med maskorna.
- Seed nyligen passe BAEC i brunnarna med delvis släppt maskor på 60-80% initial seeding densitet (2-2,7 x 10 4 celler / brunn).
- Inkubera plattan vid 37 ° C och 5% CO
8 Ad stent Deployment i Rat Carotid modellen Stent angioplastik
- Alla djurförsök som beskrivs i detta protokoll överensstämmer med federala bestämmelser om försöksdjursanvändning och godkändes av IACUC för barnsjukhuset i Philadelphia. Att hålla sig till aseptiska kirurgiska förhållanden samtliga instrument autoklav steriliseras. För att säkerställa kontinuerlig sterilitet en pärla autoklav används mellan användning av instrumenten i upp till fem på varandra följande djur.
- Förbered Ad Luc -eluting stentar enligt 2,1-2,11 och 3,1-3,9. Förvara virus derivatiserade stentar i steril PBS vid 4 ° C i högst 24 timmar före användning.
- Bedöva Sprague-Dawley-råttor (400-450 g) med IP-injektion av ketamin (100 mg / kg) och xylazin (5 mg / kg). DeTermine anestesidjupet med tass nypa respons och muskeltonus. Applicera ögon veterinär salva för att förhindra torrhet och sklera. Obs! Inhalationsanestesi med 4% och 2% isofluran (1 L / min) för att inducera och upprätthålla anestesi, respektive, är möjligt men hindrar fri tillgång till halsen av djuret och därför rekommenderas inte för en oerfaren användare.
- Omvärdera anestesidjup genom tå nypa. Raka och aseptiskt prep nacke och övre bröstregionen. Administrera antibiotikum (cefazolin, 20 mg / kg; IM), analgetika (meloxikam; 0,5 mg / kg; SC) och saltlösning (10 ml / kg, SC). Kateterisera svansvenen med en 24 G kateter och administrera heparin (200 lU / kg, IV). Obs: En dos på 10 mg / kg (IM) enrofloxacin (Baytril) kan användas i stället för cefazolin. Undvik användning av antibiotika som saknar signifikant aktivitet mot grampositiva bakterier. 10-15 mg / kg karprofen (Rimadyl) kan användas i stället för meloxikam som ett förebyggande smärtstillande. Narkotiska analgetika (e.g. bör morfin, buprenorfin) undvikas på grund av sina andnings-deprimerande egenskaper.
- Gör en mittlinjen snitt genom huden och halsen fascia. Använd trubbig dissektion tekniker för att isolera den vänstra yttre halspulsådern. Knyt-off den yttre halspulsådern på den mest distala lättillgänglig plats. Applicera en glidande tillfällig ligatur till ursprunget av den inre halspulsådern.
- Lägg till en 2-mm arteriotomi snitt i den vänstra yttre halspulsådern.
- Sätt i en 2-fransk Fogarty kateter i den gemensamma halsartären genom snittet i yttre halspulsådern. Pumpa spets katetern med saltlösning och passera 3x från aortabågen till den karotiska bifurkationen för att beröva endotelet.
- Skjut en bit slang (1,04 mm ytterdiameter, 0,99 mm ID) över Fogarty katetern och in i den gemensamma halsartären. Dra ut Fogarty kateter.
- Montera och kläm in annons Luc -derivatized stent över ballongen av en 1,5mm angioplastik diameter kateter. Sätt i stenten genom rör av Teflon och avancera den i den mellersta delen av den gemensamma halsartären. Undvik att gnugga stenten mot röret eller kärlväggen.
- Distribuera stenten vid 12 atm under 30 sek och återkalla angioplastikkateter.
- Knyt-off den yttre halspulsådern proximalt arteriotomin platsen och släpp den tillfälliga ligaturen på den inre halspulsådern.
- Reparera operationssår i skikt med rinnande 4.0 Vicryl sutur och häfta huden.
- Åter djuret på en värmande dyna tills ambulatorisk och återgå till sin isolerade bur. Även om inga tecken på smärta eller obehag är typiskt uppvisas av de postoperativa djur utöver den första 12 tim efter proceduren, överväga förlängning av meloxikam terapi (0,5 mg / kg, SC dagligen) under 72 tim.
9. Bioluminescens avbildning av Arterial Gene Expression
- Vid förutbestämda tidpunkter (1 dag - 3veckors intervall) efter gen stent utbyggnaden i den gemensamma halsartären, söva råttan använder isofluran inhalationsanestesi (2-4% isofluran i syre).
- Ta bort de kirurgiska häftklamrar, aseptiskt förbereda platsen och öppna operationssår. Med hjälp av dissektion, åter får tillgång till den vänstra gemensamma halspulsådern och skilja den från vagusnerven och angränsande bindväv.
- Förbered en blandning av 50 mg / ml Luciferin i PBS och 25% Pluronic F-127 i PBS (1: 4 v / v) och lagra den på is. Not: Denna formulering presenteras som en viskös lösning vid 4 ° C och omedelbart förvandlas till gel vid kontakt med vävnad vid 37 ° C.
- Apply 200 ul av en kyld Luciferin / Pluronic blandningen direkt till den exponerade delen av den gemensamma halspulsådern och kontrollera gel soliditet.
- Placera djuret i ryggläge i avbildningskammaren i IVIS-Spectrum apparater och upprätthålla isoflurananestesi med en ansiktsmask.
- I acquisitipå kontrollpanelen fönster (Living Image, version 4.2 eller högre) välja position "B" (6,6 cm kamera till objektavstånd) och binning faktor "medium" från rullgardinsmenyerna med titeln "synfältet" och "binning", respektive. Skriv in "2,5 cm" i ämnet höjdrutan. Välj "min" som en tidsenhet i "exponeringstid" rutan och välj ett numeriskt värde på "2".
- Tre minuter efter applicering av Luciferin / Pluronic gel, börja bild förvärv genom att klicka på knappen "Hämta" på skärmen. OBS: Bild förvärvstiden kan variera från 1 till 6 minuter, beroende på den förväntade signalstyrkan.
- Efter förvärvet av bilden, tvätta gelen av med koksaltlösning och badda periarterial utrymme med steril gasbinda och bomull applikatorer.
- Stäng såret med Vicryl sutur och häfta huden.
- Åter djuret och återgå till sin bur. Upprepa avbildning på senare tIME punkter för att studera tidsförloppet av arteriell uttryck följd av stent-immobiliserade Annons vektorer.
- Alternativt utför avbildning efter systemisk administrering av luciferin. Söva och prep djuret enligt 9.1-9.2. Kateterisera svansvenen med en 24 G kateter och säkra katetern med kirurgisk tejp.
- Bered en lösning av luciferin i PBS (50 mg / ml) och injicera 1 ml av lösningen genom katetern under en 10 sek intervall. En min efter injektionen påbörja bild förvärv enligt 9,7-9,8. Obs: Ett snabbare injektionshastighet (<10 sek) kan framkalla kramper och andningsstillestånd. Djuret ska avlivas, om kramper eller andningsstillestånd inträffar under avbildning.
- Följ steg 9,10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vektor Release Experiment
Delning av adenovirala vektorer på ytan av implantat, inklusive ingripande anordningar såsom endovaskulära stent, approximerar vektorn till sjukdomsstället, delvis undanröja bristen på vektorer fysiska målinriktning. Men för att kunna uppnå terapeutiska effekter via transduktion av målvävnaden, måste vektorn att frigöras från ytan (figur 2). Användningen av hydrolyser tvärbindare var hypotesen att tillåta en) effektiv fastsättning av vektorer för att polybisphosphonate modifierade, tiol installerade metallimplantat och 2) fördröjd frisättning förmedlade genom hydrolys av tvärbindaren.
Antalet genomiska kopior av Ad EGFP vektor förknippade med mask diskarna i slutet av derivatiseringen förfarandet är baserat på PCR av virus-DNA med EGFP specifika primers (Figur 3). Beroende påspecifika tvärbindare används, mängden bundet Ad vektor bör variera mellan 3,5 x 10 9 och 5.7 x 10 9 partiklar / mesh. Detta belopp är i verkligt korrespondens med den beräknade maximala kapacitet (2,5 x 10 9) av ett enda mask skiva med en total yta på 0,25 cm2 för att rymma Annonspartiklar 100 nm i ett monolager arrangemang. Eftersom utgångsbeloppet för annons vektorn vid steget att tvärbindnings modifiering är 5 x 10 11 partiklar, bara ~ 1% av den modifierade vektorn småningom immobiliserade på PABT / PEI PDT -derivatized yta av rostfritt stål.
Både graden av in-kedjan esterhydrolys och antalet länkar mellan vektorn och biomaterial väntas påverka den totala kinetiken för annons vektor frisättning från ytan.
För att underlätta frigör experiment adenovirala partiklar kan i förväg märkt med Cy3 fluorofor (protokollet, avsnitt 1) innan tvärbindande modification och ytan immobilisering (protokollet, avsnitt 3). Minskningen av yta-associerad fluorescens över tiden utvärderas samtidigt genom fluorometri (Figur 4A) och fluorescensmikroskopi (figur 4B) kan sedan användas som en indirekt metod för övervakning vektor utsättning fysiologisk buffert. Annons vektorer anslutna via RHC och IHC kopplingar bör visa betydligt snabbare frisättning i jämförelse med deras SHC- och NHC lösa motsvarigheter. I det givna exemplet, var en 45% och en förlust 39% av ytan associerad vektor observerats med RHC och IHC-bundna vektor för dag 30, respektive, medan mindre än 20% av uppbundna vektor observerades att släppas i SHK och NHC -immobilized prover (Figur 4A).
Dessutom Annons vektorer immobiliserade genom att använda olika koncentrationer av samma HC och därmed antagligen ha olika antal tjuder mellan vektorn och metallsubstrat bör haolika kinetik vektor frigivning. Faktum vektor modifiering med hjälp av 0,1 mM RHC i signifikant snabbare frisättningshastigheter än observerade för vektor immobiliserade med 0,5 mM RHC (Figur 4A). Den fluorescens mikroskopi data (Figur 4B) korrelerar väl med fluorometri baserade kvantitativ vektorfrigöranalys, visar en snabbare och mer djupgående minskning av ytan associerad fluorescens med maskprov formulerade med hjälp IHC-, RHC- och speciellt låg koncentration RHC-bundna vektorer i jämförelse med deras NHC- och SHC-bundna motsvarigheter.
In vitro Transduktion med Mesh immobiliserade Ad vektorer
Genom att vara kompatibel med både kvantitativ expressionsanalys (fluorometri) och rumsliga observationer (fluorescensmikroskopi), är Ad eGFP den föredragna reportervektor för att övervaka transduktion i SMC och endotelcellkulturer behandlade med både fria och mesh-immobiliserad Ad-vektorer. Kemisk modifiering av annons kapsid med RHC (Figur 5) samt med andra tvärbindare (visas ej) i koncentrationer som överstiger 75 ^ M avsevärt hindrar transduktion effektivitet icke immobiliserade vektorn in vitro, sannolikt beroende på maskering och omkonfigurera fiberknopp domäner utnyttjas av annonser för bindning till cellerna genom Coxsackie-Adenovirus receptorer (CAR). Dock är den roll som knopp-CAR interaktioner mindre avgörande för transduktion med substrat immobiliserade vektor eftersom vektorn behålls i närheten av målceller uppbundna till substrat. I cellodlingsförsök oavsett typ HC, mesh-associerad Ad-vektorer är genomgående kan rumsligt begränsa överförings händelser till celler som ligger inom 300-500 nm från mask gränser (figur 6A och 6C). Typiskt är toppnivåer av transgene uttryck uppnås 3-5 dagar efter placeringen av Ad eGFP laddad maskor i SMC (figurerna 6A och 6B) eller BAEC (figur 6C och 6D) kulturer. På samma vektor belastning, topp EGFP uttryck nivåer ökar i följande ordning: NHC-, SHC-, IHC- och RHC-bundna vektor, avspeglar skillnaderna i deras respektive frigöringskinetik profiler (Figur 4). Dessutom är tåligare transgenuttryck observerats i celler som behandlats med IHC-formulerade maskor i jämförelse med celler som behandlats med RHC-formulerade motsvarigheter (Figur 6D).
Utnyttjad cellodlingssystem utgör en bekväm set-up för utredning av fördröjda omvandlingshändelser till följd av vektorpartiklar frigörs från metallytan vid eller senast 48 timmar efter maskplacering. I denna ansökan, efter bestämning av EGFP expression genom fluorometry och fluorescensmikroskopi vid 48 h efter påbörjandet av transduktion är BAEC trypsineras och sögs ut ur brunnarna utan att störa maskorna. Nyligen passe icke transducerade BAEC sedan åter klädd under de delvis släppt maskor. "Nya" transduktion händelser som orsakas av viruspartiklarna som frigörs från maskbäraren efter 2 dagars tidpunkt sedan bedöms av fluorescensmikroskopi och fluorometri (figurerna 7A och 7B). Robust EGFP uttryck som visar den karakteristiska rumsliga begränsning till ett nät locale typiskt observeras i dessa "nya" kulturer (Figur 7), vilket bekräftar en välbevarad transduktion kapacitet maskbundna Ad vektorer även efter 48 h exponering för att slutföra cellodlingsmedium vid 37 ° C.
In vivo studier
För att undersöka potentiella effekter i samband med use olika HC på arteriell transduktion, djur implanterade med Ad Luc -eluting stentar framställda med RHC-, IHC-, SHC- och NHC-modifierad vektor gick självlysande avbildning 1 och 8 dagar efter stentutveckling (Figur 8). Den avbildning utfördes efter lokal perivaskulär administrering av luciferin (2 mg) tillsammans formulerade med Pluronic gel. Denna beredning är en viskös vätska när kyldes på is, men undergår omedelbar fasövergång till gel när de bringas i kontakt med vävnaden vid 37 ° C. Preliminära experiment (ej visade) visade att perivaskulär leverans av luciferin resultat i mer stabila och reproducerbara luminiscens signaler i Ad Luc -transduced kärlvävnad jämfört med systemisk (intraperitoneal eller intravenös) luciferin administrering.
Om viruset tethering på stenten och stenten utplacering kirurgi var tekniskt ljud, en väldefinierad signal motsvarande den stentade segment avråtthalspulsådern emitteras och registreras. En dag efter stentimplantation, djur behandlade med RHC-formulerade Ad Luc stentar uppvisar typiskt den högsta luminiscens signalen, följt av de råttor som erhöll IHC- och SHC- formulerade stentar (figurerna 8A och 8B). Ingen märkbar signal observeras i den grupp råttor som implanterats med stentar framställts med användning NHC-bundna Ad Luc, understryker vikten av att obehindrat vektor frisättning från stenten för effektiv transduktion av kärlvävnad (figurerna 8A och 8B). Vid dag 8, sjunker den genomsnittliga intensiteten i luciferasuttryck med RHC-formulerade stentar flera gånger, samtidigt som det ökar 1,4 respektive 1,8 gånger med IHC- och SHC-formulerade stentar, respektive (figur 8A och 8B). Detta resultat överensstämmer med hypotesen av mer hållbara kärl transduktion med gen-stent som uppvisar en långsammare anhörigETICS av vektor frisättning från stentytan.
Figur 1. Strukturella formler av tvärbindare (NHC, SHC, IHC och RHC) som används i de beskrivna studierna (modifierad med tillstånd 28).
Figur 2 Ett system som representerar Ad vektor tethering till en PABT / PEI PDT -modifierade yta av rostfritt stål via en HC och efterföljande frisättning av vektorn att tvärlänk hydrolys (modifierad med tillstånd 28).
Figur 3 PCR-baserad quantläggande av Ad EGFP immobiliserad via tvärbindare tethering på ytan av PABT / PEI PDT -modifierade maskorna av rostfritt stål. Maskorna rostfritt stål formulerades med Ad EGFP immobiliserad via RHC, IHC, SHC, eller NHC (n = 3 för varje tillstånd ). Efter proteinas K behandling, var virus-DNA elueras och renas med hjälp MinElute kolonner. Förstärkning av virus-DNA med hjälp av EGFP-specifika primers utfördes i en 7500 realtids-PCR-motor och detekterades med SYBR Green. Data normaliserades baserat på en kalibreringskurva framställd med en känd mängd av icke-immobiliserat Ad EGFP (modifierad med tillstånd 28).
Figur 4 Release kinetik Ad vektor bundna till metallsubstrat med HC. Stainless maskor stål derivatiserades med ~ 2 x 10 Ad partiklar 9 Cy3-märkta kopplade till PABT / PEI PDT -modifierade yta efter modifiering med 500 iM NHC, SHC, IHC, RHC och 100 iM RHC (betecknas som RHC-L). Frisläppandet av fluorescerande Ad-partiklar studerades vid de angivna tidpunkterna från (A) väl scan fluorometri vid 550/570 nm och (B) fluorescensmikroskopi (rhodamin filter set, ursprunglig förstoring 200X). Fluorometri Resultaten presenteras som medelvärden ± SEM, n = 8-10; p <0,001 för alla jämförelser mellan NHC och SHC vs IHC, RHC och RHC-L-grupper bestämdes genom Anova med en post-hoc Tukey-test (modifierad med tillstånd 28).
Figur 5 Transduktion effektiviteten av icke-immobiliserade Ad eGFP efter modifiering med RHC. Råtta embryonala aorta-härledda SMC (A10 linje) transducerades vid ett MOI av 1000 med antingen omodifierad Ad eGFP eller vektor modifierad med RHC som anges. En reporter uttryck bestämdes fluorometriskt (485/535 nm) 48 timmar efter transduktion (modifierad med tillstånd 27).
Figur 6 Transduktion av odlade SMC och BAEC med Ad vektor immobiliserade till rostfritt stål maskor med HC. Meshes derivatiserades med ~ 2 x 10 9 Ad EGFP partiklar bifogade via NHC, SHC, IHC, och RHC. Meshes ades därefter individuellt placerades ovanpå sub-sammanflytande A10 (A, B) och BAEC (C, D) monoskikt. Transduktion (uttryckt som EGFP uttryck nivåer) i celler som behandlats med Ad vektor-bundna maskor bedömdes genom fluorescence mikroskopi (A, C; FITC-filter set, ursprunglig förstoring 100X) och väl-scan fluorometri (B, D). Fluorometri Resultaten presenteras som medelvärden ± SEM, n = 4 (modifierad med tillstånd 28). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 7 Transduktion kompetens substrat immobiliserade Ad-vektorer på försenade tidpunkter. Ad eGFP immobiliserades på stål maskor genom NHC, SHC, IHC eller RHC tjuder. Maskorna placerades på subkonfluenta BAEC monolager. Två dagar efter placering, var BAEC trypsinbehandlades och tas bort utan att störa maskorna. Ny, ej transducerade BAEC sedan såddes över maskorna. AdEGFP transduktion kompetens mättes med EGFP expression med användning av fluorescensmikroskopi (A; FITC filter set; ursprunglig förstoring 100X) och fluorometri (B). Mätningar gjordes på angivna dagar, representativa bilder som används och fluorometri Resultaten är medelvärden ± SEM, n = 4 (modifierad från med tillstånd 28). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 8 Transduktion effektivitet stent-immobiliserade Ad Luc in vivo. Ad Luc (1.3 x 10 10 partiklar) var bundna till endovaskulära stent via NHC, SHC, IHC eller RHC (n = 3-4 för alla grupper). Transduktion effektivitet Ad Luc </ Sub> elueras från stentar mättes med mareld imaging (IVIS Spectrum) 1 och 8 dagar efter stentutveckling (A), och ritas med hjälp av en logaritmisk skala (B) (modifierad från med tillstånd 28). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den presenterade protokoll beskriver en operativ metod för substrat medierad gen leverans uppnås genom reversibel fastsättning av adenovirusvektorer att coatless rostfria ytorna. Medan utvecklats för det specifika syftet att stent-baserad genterapi av vaskulär restenos, har denna teknik mycket bredare tillämpningar inom områdena biomaterial, biomedicinska implantat och genterapi.
Även presenterade studier har enbart utnyttjat rostfritt stål som ett protometallsubstrat, PABT binder andra metallegeringar såsom kobolt / krom och nitinol med jämförbar affinitet (publiceras inte). Den indiscriminant interaktionen mellan PABT med metaller expanderar kraftigt antalet potentiella biomedicinska tillämpningar för denna teknik 31. Dessutom är användning av HC-tjudrade genvektorer, om än att kräva andra metoder för tiol installation på materialytan, är genomförbart med andra typer av biomaterial.
ontent "> Även Annons genvektorer uppnå robust transduktion i många mänskliga celltyper och vävnader, deras kliniska betydelse begränsas av starka inflammatoriska och immunsvar som framkallades av Adenoviridae 4. Därför långvarig (4 månader) arteriell uttryck med gen stentar formulerade med hjälp av HC modifiering av luciferas-uttryck adenoassocierade virala vektorer visades nyligen (publiceras inte).Metodiken är robust. Små avvikelser från huvudprotokollet i allmänhet inte leda till betydande förändringar av genuttryck in vitro och in vivo. Ändå har flera viktiga frågor som kan påverka utfallet identifieras.
Först, som namnet antyder, hydrolyser tvärbindare är klyvbara vid reaktion med vatten på grund av hydrolys av in-kedjan ester. Dessutom amin reaktiv del, är N -sulfosuccinimidyl hydrolyserbar också. Tvärbindare bör lagras under en argonatmosfär vid -20 ° C för att bevara deras aktivitet. Av samma skäl, efter framställning av lösningar av HC (protokollsektionen 3,2) omedelbart fortsätta med tillsats av HC lösningar till virus preps.
För det andra är tiolgrupper som bildas på metallytan under flera mellansteg i den presenterade biokonjugering sekvensen snabbt oxideras av luften syre. För att förhindra detta, hålla utsatta metallproverna nedsänkta i avgasat vatten hela tiden.
För det tredje krävs en perfekt inriktning av ingrepp med botten av brunnen för framgångsrik transduktion. Böj inte mask diskar under hantering.
Fjärde, undvika överdriven gnidning av gen-stent mot teflonmantel och kärlväggen under stent insättning för att förhindra rubbning av yt-associerad Annons vektorer.
Kovalent bindning av genvektor till ytan av implanterbara biomaterials har en uppenbar fördel med bättre kontroll över vektor frigöringskinetik än realiserbara med icke-kovalent uppbindning av vektor. I inställningen av genen leverans från stentplattform rapporterar de flesta studier fullständig frisättning av virala och icke-virala vektorer inom 1-7 dagar efter stent utplacering 32-34. Å andra sidan, Ad vektor immobilisering via HC påvisas frisättning av endast 20-45% av vektorn lasten i den första månaden (figurerna 4A och 4B). Dessutom är en partiell modulering av utsläpp och transduktion kinetik uppnås med hjälp av olika HC uppvisar olika hydrolys kinetik eller genom att variera koncentrationen av HC används för virus ytbearbetning. Dessutom ger en samtidig samtidig modifiering av vektorn med olika tvärbindande molekyler, men inte utforskas i denna studie, en annan möjlighet för finjustering vektor release och transduktion.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 316 stainless steel mesh disks | Electon Microscopy Sciences | E200-SS | |
| Generic 304-grade stainless steel stents | Laserage | custom order | |
| AdeGFP | University of Pennsylvania Vector Core | AD-5-PV0504 | |
| AdLuc | University of Pennsylvania Vector Core | AD-5-PV1028 | |
| AdEMPTY | University of Pennsylvania Vector Core | A858 | |
| Cy3(NHS)2 | GE Healthcare | PA23000 | |
| Sepharose 6B | Sigma-Aldrich | 6B100-500ML | |
| UV 96-well plates | Costar | 3635 | |
| Fluorometry 96-well plates | Costar | 3915 | |
| Cell culture 96-well plates | Falcon | 353072 | |
| Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride (TCEP) | Pierce Thermo Scientific | 20490 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Pierce Thermo Scientific | 20290 | |
| sulfo-LC-SPDP | Pierce Thermo Scientific | 21650 | |
| Spectrophotometer | Molecular Devices | SpectraMax 190 | |
| Spectrofluorometer | Molecular Devices | SpectraMax Gemini EM | |
| Orbital shaker incubator | VWR | 1575R | |
| Horizontal airflow oven | Shel Lab | 1350 FM | |
| Centra-CL2 centrifuge | International Equipment Company | 426 | |
| Digital vortex mixerer | Fisher Thermo Scientific | 02-215-370 | |
| Eclipse TE300 fluorescence microscope | Nikon | TE300 | |
| DC 500 CCD camera | Leica | DC-500 | |
| 7500 Real-Time PCR system | Applied Biosystems | not available | |
| IVIS Spectrum bioluminescence station | Perkins-Elmer | not available | |
| EDTA dipotassium salt | Sigma-Aldrich | ED2P | |
| Bovine serum albumin fraction V (BSA) | Fisher Thermo Scientific | BP1600-100 | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P1379 | |
| Dumont forceps | Fine Science Tools | 11255-20 | |
| A10 cell line | ATCC | CRL-1476 | |
| Bovine aortic endothelial cells | Lonza | BW-6002 | |
| Luciferin, potassium salt | Gold Biotechnology | LUCK-1Ge | |
| Pluronic F-127 | Sigma-Aldrich | P2443-250G | |
| PBS without calcium and magnesium | Gibco | 14190-136 | |
| Fetal bovine serum | Gemini Bio-Products | 100-106 | |
| Penicillin/Streptomycin solution | Gibco | 11540-122 | |
| DMEM, high glucose | Corning cellgro | 10-013-CV | |
| 0.25% Trypsin/EDTA | Gibco | 25200-056 | |
| QIAamp DNA micro kit | Qiagen | 56304 | |
| Power Sybr Green PCR Master Mix | Applied Biosystems | 4367659 | |
| MicroAmp Optical 96-well Reaction Plate | Applied Biosystems | N8010560 | |
| MicroAmp Optical Adhesive Film | Applied Biosystems | 4360954 | |
| Cephazolin | Apotex | not available | |
| Loxicom (Meloxicam) | Norbrook | not available | |
| Heparin sodium | APP Pharmaceuticals | not available | |
| Ketavet (Ketamine) | VEDCO | not available | |
| Anased (Xylazine) | Lloid | not available | |
| Forane (Isoflurane) | Baxter | not available | |
| Curved Moria iris forceps | Fine Science tools | 11370-31 | |
| Curved extra-fine Graefe forceps | Fine Science Tools | 11152-10 | |
| Dumont #5 forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| Vannas spring scissors | Fine Science Tools | 15018-10 | |
| Fine scissors - ToughCut | Fine Science Tools | 14058-09 | |
| Surgical scissors | Fine Science Tools | 14101-14 | |
| Vicryl suture (5-0) | Ethicon | J385 | |
| Suture thread (4/0 silk) | Fine Science Tools | 18020-40 | |
| Michel suture clips | Fine Science Tools | 12040-02 | |
| Wound dilator (Lancaster eye specula) | KLS Martin | 34-149-07 | |
| Hot bead sterilizer | Fine Science Tools | 18000-45 | |
| Michel suture clip applicator | Fine Science Tools | 112028-12 | |
| Insyte Autoguard 24 G IV catheter | Beckton-Dickinson | 381412 | |
| 2F Fogarty catheter | Edwards Lifesciences | 120602F | |
| Teflon tubing | Vention | 041100BST | |
| PTA catheter | NuMed | custom order | |
| Gauze pads | Kendall Healthcare | 9024 | |
| Cotton applicators | Solon Manufacturing | WOD1003 | |
| Saline | Baxter | 281321 | |
| 10 ml syringe (Luer-Lok) | Beckton-Dickinson | 309604 | |
| 1 ml syringe (Luer-Lok) | Beckton-Dickinson | 309628 | |
| Clippers with #40 blade | Oster | 78005-314 | |
| Transpore surgical tape | 3M | MM 15271 | |
| Puralube vet ointment | Pharmaderm | not available |
References
- Boeckle, S., Wagner, E. Optimizing targeted gene delivery: chemical modification of viral vectors and synthesis of artificial virus vector systems. AAPS J. 8, E731-E742 (2006).
- Waehler, R., Russell, S. J., Curiel, D. T. Engineering targeted viral vectors for gene therapy. Nat Rev Genet. 8, 573-587 (2007).
- Campos, S. K., Barry, M. A. Current advances and future challenges in Adenoviral vector biology and targeting. Curr Gene Ther. 7, 189-204 (2007).
- Bangari, D. S., Mittal, S. K. Current strategies and future directions for eluding adenoviral vector immunity. Curr Gene Ther. 6, 215-226 (2006).
- Barry, M. A., et al. Systemic delivery of therapeutic viruses. Curr Opin Mol Ther. 11, 411-420 (2009).
- De Laporte, L., Shea, L. D. Matrices and scaffolds for DNA delivery in tissue engineering. Adv Drug Deliv Rev. 59, 292-307 (2007).
- Gustafson, J. A., Price, R. A., Greish, K., Cappello, J., Ghandehari, H. Silk-elastin-like hydrogel improves the safety of adenovirus-mediated gene-directed enzyme-prodrug therapy. Mol Pharm. 7, 1050-1056 (2010).
- Kidd, M. E., Shin, S., Shea, L. D. Fibrin hydrogels for lentiviral gene delivery in vitro and in vivo. J Control Release. 157, 80-85 (2012).
- Lei, Y., et al. Incorporation of active DNA/cationic polymer polyplexes into hydrogel scaffolds. Biomaterials. 31, 9106-9116 (2010).
- Lei, Y., Rahim, M., Ng, Q., Segura, T. Hyaluronic acid and fibrin hydrogels with concentrated DNA/PEI polyplexes for local gene delivery. J Control Release. 153, 255-261 (2011).
- Jang, J. H., Schaffer, D. V., Shea, L. D. Engineering biomaterial systems to enhance viral vector gene delivery. Mol Ther. 19, 1407-1415 (2011).
- Salvay, D. M., Zelivyanskaya, M., Shea, L. D. Gene delivery by surface immobilization of plasmid to tissue-engineering scaffolds. Gene Ther. 17, 1134-1141 (2010).
- Moss, A. J., Hamburger, S., Moore, R. M., Jeng, L. L., Vol Howie, L. J. Advance Data. 191, National Center for Health Statistics Vital and Health Statistics. (1991).
- Gristina, A. G., Naylor, P., Myrvik, Q. Infections from biomaterials and implants: a race for the surface). Med Prog Technol. 14, 205-224 (1988).
- Santerre, J. P., Woodhouse, K., Laroche, G., Labow, R. S. Understanding the biodegradation of polyurethanes: from classical implants to tissue engineering materials. Biomaterials. 26, 7457-7470 (2005).
- Tang, L., Eaton, J. W. Inflammatory responses to biomaterials. Am J Clin Pathol. 103, 466-471 (1995).
- Zimmerli, W., Sendi, P. Pathogenesis of implant-associated infection: the role of the host. Semin Immunopathol. 33, 295-306 (2011).
- Fishbein, I., et al. Bisphosphonate-mediated gene vector delivery from the metal surfaces of stents. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 159-164 (2006).
- Levy, R. J., et al. Localized adenovirus gene delivery using antiviral IgG complexation. Gene Ther. 8, 659-667 (2001).
- Ma, G., et al. Anchoring of self-assembled plasmid DNA/anti-DNA antibody/cationic lipid micelles on bisphosphonate-modified stent for cardiovascular gene delivery. Int J Nanomedicine. 8, 1029-1035 (2013).
- Hu, W. W., Lang, M. W., Krebsbach, P. H. Development of adenovirus immobilization strategies for in situ gene therapy. J Gene Med. 10, 1102-1112 (2008).
- Jang, J. H., et al. Surface immobilization of hexa-histidine-tagged adeno-associated viral vectors for localized gene delivery. Gene Ther. 17, 1384-1389 (2010).
- Bengali, Z., Shea, L. D. Gene Delivery by Immobilization to Cell-Adhesive Substrates. MRS Bull. 30, 659-662 (2005).
- Holmes, C. A., Tabrizian, M. Substrate-mediated gene delivery from glycol-chitosan/hyaluronic acid polyelectrolyte multilayer films. ACS Appl Mater Interfaces. 5, 524-531 (2013).
- Pannier, A. K., Wieland, J. A., Shea, L. D. Surface polyethylene glycol enhances substrate-mediated gene delivery by nonspecifically immobilized complexes. Acta Biomater. 4, 26-39 (2008).
- Wang, C. H., Pun, S. H. Substrate-mediated nucleic acid delivery from self-assembled monolayers. Trends Biotechnol. 29, 119-126 (2011).
- Fishbein, I., et al. Local delivery of gene vectors from bare-metal stents by use of a biodegradable synthetic complex inhibits in-stent restenosis in rat carotid arteries. Circulation. 117, 2096-2103 (2008).
- Fishbein, I., et al. Adenoviral vector tethering to metal surfaces via hydrolyzable cross-linkers for the modulation of vector release and transduction. Biomaterials. 34, 6938-6948 (2013).
- Mittereder, N., March, K. L., Trapnell, B. C. Evaluation of the concentration and bioactivity of adenovirus vectors for gene therapy. J. Virol. 70, 7498-7509 (1996).
- Forbes, S. P., et al. Modulation of NO and ROS production by AdiNOS transduced vascular cells through supplementation with L-Arg and BH4: Implications for gene therapy of restenosis. Atherosclerosis. 230, 23-32 (2013).
- Niinomi, M., Nakai, M., Hieda, J. Development of new metallic alloys for biomedical applications. Acta Biomater. 8, 3888-3903 (2012).
- Brito, L. A., Chandrasekhar, S., Little, S. R., Amiji, M. M. Non-viral eNOS gene delivery and transfection with stents for the treatment of restenosis. Biomed Eng Online. 9, 56 (2010).
- Egashira, K., et al. Local delivery of anti-monocyte chemoattractant protein-1 by gene-eluting stents attenuates in-stent stenosis in rabbits and monkeys. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 27, 2563-2568 (2007).
- Ohtani, K., et al. Stent-based local delivery of nuclear factor-kappaB decoy attenuates in-stent restenosis in hypercholesterolemic rabbits. Circulation. 114, 2773-2779 (2006).
