Abstract
支架内再狭窄呈现的广泛使用，以重新建立血液穿过冠状动脉和外周动脉的极为狭窄段流基于支架的血管成形术的主要并发症。可调谐释放基因具有抗再狭窄活性可能存在另一种战略血管内支架，以目前使用的药物洗脱支架。为了达到临床平移，基因洗脱支架必须具有支架固定化基因载体释放和血管系统的位点特异性转导的可预测的动力学，同时避免通常与用于所述载体的物理截留在聚合物涂层相关联的严重的炎症反应。本文描述了一种腺病毒基因载体coatless束缚到基于所述腺病毒颗粒的可逆结合支架的详细方法，以聚烯丙胺二膦酸盐（PABT）经由水解的交联剂（HC）改性不锈钢表面。一个家庭的双官能团（胺和硫醇反应性）的HC与中链酯水解测距5-50天的平均吨半被用于与所述支架连接的载体中。该载体的固定化过程典型地是在9小时，包括几个步骤：1）温育的金属样品在PABT（4小时）的水溶液; 2）脱保护以三（2 - 羧乙基）膦（20分钟）安装在PABT硫醇基; 3）膨胀的金属表面的巯基反应的能力通过使与聚乙烯亚胺衍生的吡啶基二硫（PDT）基团（2小时）的样品; 4）变换PDT基与硫醇与二硫苏糖醇（10分钟）; 5）修改腺病毒与HC（1小时）; 6）纯化修饰的腺病毒颗粒通过尺寸排阻柱色谱法（15分钟）和在硫醇化钢表面（1小时），巯基反应性的腺病毒颗粒7）固定。该技术具有超越支架宽的应用潜力，通过促进生物假体装置的表面工程通过基板介导的基因递送到细胞中的接口的植入外来物质，以提高其生物相容性。
Introduction
基因疗法作为治疗方法的有效性是通过基因治疗的载体1,2的差的定位能力受到阻碍。适当的定位结果中的转基因表达在目标位置的亚治疗水平的缺乏，导致载体对非靶器官3，包括那些负责安装针对两个矢量和编码的治疗产物4的免疫应答的广泛传播， 5。一电位是指，以抵消转导的滥交和促进目标是引入基因的载体在所需位置处在于，通过血液和淋巴排除其自由传播的形式。典型地，这样的努力依赖于局部注射的递送系统，包括混有纤维蛋白，胶原蛋白或透明质酸水凝胶基质6-10，其能够在注射部位短暂维持基因的载体通过物理截留第要么病毒或非病毒载体的时间在聚合网络。
用于局部基因治疗另一普遍接受的范例利用基因载体的固定化植入假体装置11,12的表面上。永久性医疗植入物（血管，支气管，泌尿系统和胃肠道支架，起搏器，人工关节，手术和妇科网等 ），每年都用在数以千万计的患者13。虽然通常是有效的，这些设备很容易出现并发症，是由当前的医疗行为14-17控制不佳的。植入假体装置提出了一个独特的机会，作为代理平台局部基因治疗。从药物动力学观点来看，医疗植入物与基因载体的结果相对低的输入剂量植入物/组织界面上实现既高局部浓度基因载体和减缓兵卫的动力学的表面衍生ř消除从这个位置。至于长期居留的后果和增强摄取目标细胞群，固定化载体的最小基因载体的传播。因而不慎接种的非靶组织中被减少。
在植入生物材料的基因的载体（也称为基底介导的基因递送或固相的基因递送）的表面束缚已在细胞培养和动物实验使用实施两个特定（抗原-抗体18-20生物素蛋白-生物素21,22）和非特异性23-26（充电，范德华力）的相互作用。共价连接的载体，以植入装置的表面之前已被视为非功能由于与表面过于强键排除向量的内化通过靶细胞。最近已证明，这种限制可以通过使用作为四面体的使用自发水解的交联剂来克服所述腺病毒载体27,28的支架和壳体蛋白的经修饰的金属表面之间存。此外，该载体释放速率和在体外和体内转基因表达的时间进程可以调制与使用可水解的交联剂呈现不同水解28的动力学。
本文件提供了腺病毒载体活化金属表面的可逆共价连接的详细协议，并引入了一个有用的实验装置来研究在体外随后传导事件在培养的平滑肌和内皮细胞和体内的支架成形术的大鼠颈动脉模型。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1，准备Cy3标记的腺病毒为实验版
- （; pH值9.3 CBB）在650微升的碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液暂停2×10 12颗粒广告空 （约2×10 11感染单位）。
- 溶解的1瓶（0.2毫克）的胺反应性的荧光染料（Cy3标记（NHS）2）在1ml CBB的含量为0.2毫克/毫升的最终浓度。
- 加入100微升的染料溶液，以病毒悬浮液，涡旋5秒并保温1小时，在28℃振荡（100-200转）。
- 平衡用PBS 20ml的琼脂糖凝胶6B柱。加入750微升的Cy3标记的广告在悬浮液中逐滴的凝胶床的中心。
- 经过病毒悬液渗透树脂，加入5毫升的PBS。弃去洗脱液。
- 加入0.5毫升的PBS，并收集在一个标有玻璃容器的洗脱液。重复此步骤，收集10倍的共有100.5毫升分数。
- 法日E按分光光度法（260和280 nm）的病毒DNA含量收集的部分。
- 汇集含有总（F1通过F10总和）的光密度（OD值）的10％以上在260nm处的级分。注意：典型地，馏分F3，F4，F5和F6合并并混合。
- 再测定该混合合并的级分通过分光光度法（260和280nm）和测定用荧光（550 EX / 570 青霉 nm）的病毒DNA含量和Cy3标记的衣壳蛋白。注意：Cy3标记（NHS）2校准曲线覆盖10 -9 -10 -13 mol / L的范围内，制备和fluorimetrically测定在同一平板上的汇集级分。
- 计算标记的病毒产量和标签密度。假定1.19×10 12病毒颗粒/ ml的对应于1的OD单位为1厘米路径长度29。使用公式：收益率= [（外径260nm处 /1.19)*10 12 * V /广告投入量] * 100，其中，外径为260nm的光德将合并的制剂在260nm的nsity和V是汇集制剂（毫升）来计算广告回收率（％）的体积。使用公式：标记密度= C * 6.02 * 10 23 /（OD 260nm处 /1.19)*10 12，其中C是共用的制剂的Cy3标记的浓度（摩尔/毫升）和OD 260nm处是共用的制剂的光密度260纳米，计算平均的Cy3标记的密度。注意：标有病毒的典型复苏的输入剂量> 70％。标记密度为每一个病毒颗粒600-800荧光分子。
- 等分Cy3标记的广告空成更小的部分（一般为5×10 11颗粒）适于个体释放实验。注：当前协议规定仅在释放实验使用Cy3标记信息的。所有转导的研究进行了与非标记的载体中。
2，激活金属样品
- 清洗不锈钢Š蒂尔网状盘或不锈钢支架连续在异丙醇（5分钟×2）氯仿（5分钟×2）在55℃下振荡（100转）。除去溶剂。
- 加热样品30分钟，在200℃下。
- 溶解的聚烯丙基胺的双膦酸盐与安装潜硫醇基（PABT 27,28,30）的水（1-2％重量/体积）在72℃下振荡培养（100rpm下）。调节pH至4.5-5与KHCO 3。
- 孵育金属样品在2-4小时，在72℃的PABT溶液振摇（100-200转）。注：该过程可在此时被暂停。样品是稳定3天，在4℃下。
- 三次漂洗的样品用双蒸水（DDW）。
- 露出所述样本以三（2 - 羧乙基）膦（TCEP，15毫克/毫升的0.1M醋酸缓冲液）15分钟，在28℃下振荡（100-200转）。
- 在脱气DDW冲洗5倍。
- 揭露样品2％聚乙烯安装吡啶基团（PEI
- 冲洗样本三次DDW。
- 暴露样品到10毫克/毫升二硫苏糖醇/ DDW到吡啶基二硫代基团转化为硫醇。
- 在脱气DDW再次冲洗5倍。
3，腺病毒激活和金属表面固定
- （; pH值9.3 CBB）在487.5-495微升碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液暂停5×10 11颗粒无论是绿色荧光蛋白的广告或广告吕克 （约5×10 10感染单位）。注意：对于发布的研究中，使用5×10 11 Cy3标记的广告空颗粒（音量调节到487.5-495微升用CBB）。
- 慧聪溶解有不同的水解率28 [（快速（T 2 = 5天），中等（T 1 /2 = 12 d）和慢（T 2 = 50 D）HC， 即右心导管检查，免疫组化或SHC; 图1]或非水解交联剂（NHC），磺基-LC-SPDP在CBB为20毫米。
- 立即加入5-12.5微升交联剂溶液的病毒悬浮液为500微升（交联剂200-500μM终浓度），旋涡的总体积，并培育1小时，在28℃下振荡（100〜 200转）。
- 平衡与脱气5毫米EDTA / PBS（EPBS）20ml的琼脂糖凝胶6B柱。逐滴加入500微升的交联剂改性的广告在悬浮到树脂床的中心。
- 加入5 mL脱气EPBS的。弃去洗脱液。
- 加入0.5毫升脱气EPBS，并收集在一个标有玻璃容器的洗脱液。重复此步骤10次收集总共10 0.5毫升的级分。
- 确定采用分光光度法收集到的馏分的外径在260和280 nm和转换OD到病毒滴度（1.19×10 12 / ml的CORREsponds到1外径）29。
- 汇集含有洗脱病毒的> 10％的级分（注意：典型地，馏分F3-F6）。重复分光光度法测定效价为汇集停牌。
- 转移的病毒悬浮液的小瓶中与活化的金属样品（如每2.11）。孵育在28℃氩气氛下进行1小时以摇动（100〜200转）。注意：在此步骤中得到的广告 - 拴系的金属试样中的协议部分5-7所描述的后续版本，以及转导实验中被进一步使用。
4，定量表面相关的广告载体的PCR
- 准备网制定与表面固定广告绿色荧光蛋白 ，通过NHC，特困，免疫组化和右心导管检查在第2和第3条所述（N = 3，每型）束缚。
- 使用的QIAamp DNA微套件隔离病毒DNA。单独放置网格到含有200μl的混合物的180微升ATL的B组成的1.5ml塑料管uffer和20μl蛋白酶K（均来自该试剂盒）。添加广告的eGFP颗粒的已知量（如用于校准曲线的标准）为含有相同的混合物的分离的管。孵育56℃过夜没有动摇。
- 加入200μl的AL缓冲液（由试剂盒），通过涡旋混合，加入200微升的100％乙醇，并在室温下孵育5分钟。
- 从每管中的混合物转移到一个单独的MinElite柱（从盒）和自旋在8000 rpm离心1分钟。冲洗含网状管180微升新鲜ALT缓冲器，添加到各个列和自旋在8000 rpm离心1分钟。弃去洗脱液。
- 加入500μl的AW1缓冲液（由试剂盒）装入柱和旋在8000 rpm离心1分钟。弃去洗脱液。
- 加入500μl的AW2缓冲液（由试剂盒）装入柱和旋在8000 rpm离心1分钟。
- 弃去洗脱液。
- 旋在14000转另外的3分钟unti升列是完全干燥。弃去洗脱液。
- 加入50微升的MilliQ级水入列。转速为14000 rpm离心5分钟。收集50微升洗脱液从每列进（从工具包）单独收集管中。
- 准备PCR反应混合液的解决方案通过结合以下（12.5微升电源的SYBR Green PCR扩增预混，0.63微升10微米绿色荧光蛋白检测引物[5'-ACG的TAA ACG海合会ACA的AGT TC-3']，10 0.63微升乘μMeGFP的反义引物[5'-AAG TCG TGC TGC TTC ATG TG-3']，6.3微升的MilliQ级水）。通过计划的反应，包括“无DNA”控制的数量乘以这些卷。
- 负载5微升的广告eGFP的 DNA（来自步骤4.8）和20μl的PCR主混合物的成微安光学96孔反应板的一式三份的孔中。封板微安光学胶薄膜。旋转该板在1,000 rpm离心1分钟，以消除气泡。
- 将板到7500实时定量PCR发动机的插座。在7500系统SDS软件（V1.4或更高版本）选择主菜单中的“创建新的实验。”单击“下一步”。在“新实验向导”画面从下拉菜单中选择的SYBR Green，点击“添加”。点击“下一步”来获得板的布局。突出显示所有井进行分析，选择的SYBR Green。突出连续无DNA对照孔中，信息eGFP的 DNA标准品和未知量，并使用各自的名称从下拉菜单将它们标记。
- 切换到仪器标签。选择“添加解离相”，改变以及量由默认的50微升至25微升。单击开始。
- 检查质控摘要离群等违规使用后分析PCR结果。
5，释放动力学水解的交联剂拴载体颗粒从塑钢网
- 摇动（100-200转）洗经由RHC，IHC SHC和NHC衍生的Cy3标记的广告在网状样品（按照3.9）中的1％BSA / PBS中（1小时×3）。
- 使用无菌细镊子，将网格到96孔板中预充有200微升的洗脱缓冲液的各孔中（0.1％BSA / 0.1％吐温20 / PBS）中。
- 取各网格的中央部的荧光图像。记录显微镜和用于图像采集的CCD摄像机的设置。
- 测定法以及扫描模式，最大限度的降低了板fluorimetrically（ 前 550/570 EM）。使用井非衍生网格为背景的控制。
- 孵育板在37℃振荡（50rpm下）。
- 在预定的时间（1-30天范围内）吸出洗提缓冲液，而不会干扰的网眼，并添加200μl的新鲜的洗脱缓冲液。更换缓冲液后，重复步骤4.3-4.5。
6，转导培养切尔的LS通过网格固定的广告载体
- 洗净的广告EGFP -或广告吕克 -derivatized网格三次用无菌PBS 5分钟振荡（100转）。
- 使用细无菌镊子取出筛网盘逐个地和单独将它们放置到一个96孔板用在生长对数期，感兴趣的细胞类型的孔中。
- 孵育细胞24小时，在37℃下，在5％CO 2。
- 使用相应的非末端的端点检测（荧光显微镜，荧光计为绿色荧光蛋白或生物发光成像的荧光素酶），以确定的范围和基因表达的孔中的空间分布。
- 可选地，代替培养基中的PBS以增加荧光测定法（535分之485纳米），如果低的eGFP表达预期的灵敏度。注意：如果使用荧光配有良好的扫描功能，读取该板在一个良好的扫描模式来评估EGFP-表达细胞的孔中的空间分布。交易所PBS代表完成后，荧光介质。
- 图片用的FITC滤光片组的转导细胞中井广告绿色荧光蛋白 -eluting网（包括底层和外围网）。以代表图像的40-200X放大。记录在荧光显微镜和用于采集图像的CCD照相机的确切设置。
- 加入5微升荧光素股票的PBS中（10毫克/毫升）直接向井用Ad 卢克 -eluting啮合到500微克/毫升和终浓度在37℃和5％CO 2的10分钟前，生物发光成像。吸介质和成像后，用荧光素的培养基更换。
- 重复端点检测在预定的时间（长达2周）研究报告基因表达的以下基介导的基因转移的动力学。
在延迟时间7点确认保存传导能力
- 准备广告绿色荧光蛋白去使用RHC，IHC SHC和NHC矢量圈养rivatized目（如每2.1-2.11和3.1-3.9）及个别地将其放置在96孔板中的60-80％汇合的牛主动脉内皮细胞的孔的网眼（BAEC ）。
- 在1和2天后网格放置使用荧光显微镜和荧光（如每6.4-6.5）分析培养的BAEC转导与网状固定广告的eGFP。
- 开始转了48小时后洗净含网状孔用PBS两次。
- 加入200微升的0.25％胰蛋白酶/ EDTA至每个孔，并孵育15分钟，在37℃振荡（100转）。洗涤3次，用PBS。
- 使用荧光显微镜和荧光，以确定完全除去与网格关联的所有的eGFP阳性细胞。
- 新鲜种子传代BAEC入井带部分释放网格在60-80％的初始接种密度（2-2.7×10 4个细胞/孔）。
- 孵育板在37℃和5％CO
8，广告洗脱支架在血管成形术的大鼠颈动脉支架型部署
- 在这个协议中描述的所有动物的程序符合有关实验动物使用联邦法规，批准了费城儿童医院的IACUC。要坚持以无菌手术条件的所有仪器都釜消毒。为了保证连续不育珠灭菌器使用的仪器之间使用的最多连续五禽戏。
- 准备广告吕克根据2.1-2.11和3.1-3.9 -eluting支架。存储所述病毒衍生的支架在无菌PBS中，在4℃下在使用前不超过24小时。
- 麻醉的雄性Sprague-Dawley大鼠（400-450克）与IP注射氯胺酮（100毫克/千克）的，和甲苯噻嗪（5毫克/千克）。德由爪夹紧响应和肌紧张termine麻醉深度。适用于眼科兽医药膏，以防止角膜和巩膜干燥。注意：吸入麻醉，用4％和2％异氟醚（1升/分钟）用于诱导和维持麻醉，分别是可能的，但阻碍自由进入动物的颈部区域，从而不推荐用于一个没有经验的用户。
- 由脚趾捏重新评估麻醉深度。刮胡子，准备无菌颈部和上胸部区域。施用抗生素（头孢唑啉; 20毫克/千克; IM），镇痛药（美洛昔康; 0.5毫克/公斤; SC）和盐水（10毫升/千克; SC）。导尿尾静脉与地下24导管和管理肝素（200国际单位/千克;四）。注：可以用来代替头孢唑啉10毫克/千克（IM）的恩诺沙星（拜有利）的剂量。避免使用抗生素缺乏显著活性，对革兰氏阳性菌。 10-15毫克/公斤卡洛芬（Rimadyl）可被用来代替美洛昔康作为超前镇痛。麻醉性镇痛药（E.G。，吗啡，丁丙诺啡）应该是因为他们的呼吸，压抑性的回避。
- 执行经皮肤和筋膜颈部正中切口。使用钝性分离技术来分离左侧颈外动脉。扎断颈外动脉在最前端亲和力位点。应用滑动临时结扎，以颈内动脉起始。
- 使一个2毫米动脉切开切口在左侧颈外动脉。
- 通过切口在颈外动脉插入2法国Fogarty的导管插入颈总动脉。膨胀导管用生理盐水的前端，并从主动脉弓到颈动脉分叉以剥蚀内皮通过3倍。
- 滑动的管件的（1.04毫米外径，0.99毫米内径）在Fogarty的导管并进入颈总动脉。撤回福格蒂导管。
- 安装和压接广告吕克 -derivatized支架上的1.5气球毫米直径的血管成形术导管。通过聚四氟乙烯管插入所述支架和推进其插入颈总动脉的中间部分。避免摩擦管或容器壁的支架。
- 展开支架，在12个大气压下30秒和撤回的血管成形术导管。
- 扎断颈外动脉近端动脉切开术位点和释放临时结扎于颈内动脉。
- 修复手术伤口层与运行4.0薇乔缝合线和缝合皮肤。
- 恢复对气候变暖垫动物，直到门诊，并返回到它的隔离笼。而疼痛或不适的迹象通常通过手术后的动物显示出超出该过程后的第12小时，72小时，考虑延长美洛昔康治疗（0.5毫克/公斤，SC每日）。
动脉基因表达九生物发光成像
- 在预定时间点（第1天 - 3周范围）基因洗脱支架部署在颈总动脉后，用异氟醚吸入麻醉（在氧气中2-4％的异氟烷）麻醉大鼠。
- 取出手术钉书针，无菌准备场地并重新打开手术伤口。使用到左颈总动脉钝性分离，再增益获取和它来自迷走神经与相邻的结缔组织中分离出来。
- 制备50mg荧光素在PBS和25％的Pluronic F-127的PBS中的混合物/毫升（1:4体积/体积），并将其存储在冰上。注意：该制剂表现为在4℃下的粘性溶液，并立即接通时与组织接触的凝胶在37℃下。
- 应用200微升冷却的萤光素/尼克混合物直接向颈总动脉的暴露部分和验证的凝胶坚固性。
- 将动物在IVIS谱装置的成像室仰卧位并保持异氟烷麻醉用面罩。
- 在acquisiti在控制面板窗口（生活图像，版本4.2或更高版本）选择位置“B”（6.6厘米相机被摄物距离）和题为“视野”和“装箱”，分别下拉菜单分档系数“中等”。键入在主题高度盒子“2.5厘米”。选择“分钟”为单位时间内，在“曝光时间”复选框，并选择“2”的数值。
- 三分钟的应用程序的萤光素/尼克凝胶后，通过点击屏幕上的“获取”按钮启动图像采集。注：图像采集时间可以有所不同，从1到6分钟取决于预期的信号强度。
- 获取图像后，用生理盐水冲洗凝胶关闭并轻轻用无菌纱布和棉花涂药动脉周围的空间。
- 关闭与薇乔缝线和缝合皮肤上的伤口。
- 恢复动物，回到笼子里。在后来吨重复成像IME点，研究动脉表达的时间进程由所述支架固定的Ad载体带来的。
- 另外，请执行下列成像荧光素的全身用药。麻醉和预习动物按9.1-9.2。导尿尾静脉与地下24导管和安全的导管，手术胶带。
- 制备荧光素的PBS溶液（50毫克/毫升）并在10秒的时间间隔注入1ml溶液通过导管。注射后1分钟开始图像采集按9.7-9.8。注：一个较快的注射速率（<10秒）可引发癫痫发作和呼吸骤停。如果成像过程中出现抽搐或呼吸停止的动物必须被安乐死。
- 按照步骤9.10。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
矢量释放实验
腺病毒载体到植入物的表面，包括介入器械如血管内支架的束缚，近似向量到疾病部位，部分避免了缺乏矢量“物理定位。然而，为了能够实现通过靶组织的转导的治疗效果，所述载体必须释放从表面（ 图2）。使用水解的交联剂是假设为允许通过该交联剂的水解介1）〜polybisphosphonate改性的有效附着载体，硫醇 - 安装金属植入物和2）的持续释放。
广告的eGFP载体的基因组拷贝与网格磁盘的衍生过程结束关联的数目是由病毒DNA的PCR扩增和eGFP的特异性引物（ 图3）来确定。根据特定的交联剂使用时，结合的Ad载体的量应介于3.5×10 9 5.7×10 9个粒子/网格。这一数额是公允对应一个网盘的预计最大容量（2.5×10 9）0.25平方厘米的总面积，以容纳100纳米的广告颗粒单层排列 。由于Ad载体的的交联剂改性工序的起始量为5×10 11颗粒，只有约1％的改性载体的最终固定在PABT / PEI PDT -derivatized不锈钢表面。
无论是在链酯水解速率和的矢量和生物材料之间的链接数量预计影响Ad载体释放的总动力学的表面。
以促进释放实验，腺病毒颗粒可预先用Cy3标记的荧光团（协议第1节）之前，交联剂modifica化和表面固定（协议第3节）。表面相关的荧光随时间降低由荧光（ 图4A）和荧光显微镜（ 图4B）同时评估然后可以用作用于监测载体释放到生理缓冲液中的间接方法。通过右心导管检查和免疫组化键连接的广告载体应证明显著更快的释放与他们SHC-和NHC连同行比较。在给定的例子中，有45％及表面相关矢量的39％的损失观察到RHC和IHC - 拴系的矢量由第30天，分别，同时观察到的系留向量的不到20％被释放在SHC和NHC -immobilized样品（ 图4A）。
此外，Ad载体固定化通过使用不同浓度的相同的HC和由此推测具有该载体与金属衬底之间不同的连接臂的数目应该有不同的动力学载体释放。的确，使用0.1mM的RHC向量修改导致了比观察矢量固定用0.5mM RHC（ 图4A）显著更快的释放速率。荧光显微镜的数据（ 图4B）以及相关的荧光为基础的定量载体发布的分析，显示了更快，更深刻的降低表面相关荧光网眼样品使用IHC-，RHC-尤其是低浓度RHC拴载体配制在与他们的NHC-和SHC-拴同行比较。
在体外转导与固定化网广告载体
通过与定量表达分析（荧光）和空间观测（荧光显微镜）兼容，广告绿色荧光蛋白是首选的报告载体监察转导中的SMC和内皮细胞培养与处理免费和网格固定的广告载体。广告衣壳具有RHC（ 图5）的化学修饰，以及与其它交联剂（未示出），其浓度超过75微米显著损害非固定化载体的转导效力的体外 ，最可能是由于纤维旋钮的掩蔽和重新配置域采用了广告的结合，通过对柯萨奇 - 腺病毒受体（CAR）的细胞。然而，把手-CAR的相互作用的作用是用于与基板固定的载体转导的少十分重要，因为该载体是由系留到衬底保持在靶细胞附近。在细胞培养实验中无论HC型的，网状的关联Ad载体是始终能够在空间上限制传导事件到位于细胞内的网状边界（ 图6A和6C）300-500微米。 transgen的典型的峰值电平Ë表达得以实现3-5天的放置广告的eGFP后-loaded啮合到SMC（ 图6A和6B）或BAEC（ 图6C和6D）培养物。在相同的载体负载，峰值eGFP的表达水平按以下顺序增大：NHC-，SHC-，IHC-和RHC -拴系的矢量，这反映在它们各自的释放动力学曲线的差异（ 图4）。此外，更耐用的转基因表达是在与IHC配制的网格处理相比，具有RHC-配制的对应（ 图6D）处理的细胞的细胞观察。
在使用细胞培养体系提供了一个方便的建立为延迟传导事件的调查所带来的从金属表面释放时或之后不迟于48小时网格放置载体颗粒。在本申请中，之后确定由fluoromet eGFP的表达RY和荧光显微镜在开始转导后48小时，BAEC用胰蛋白酶消化和吸出孔中，而不会干扰的网格。新鲜传代的非转导BAEC然后再镀覆在该部分释放的网格。所造成的2天时间点之后从网格载体释放的病毒颗粒“新建”转导事件，然后通过荧光显微镜和荧光进行评估（ 图7A和7B）。健壮的eGFP表达展现的特征空间的限制的网格区域，通常在这些“新”的培养物观察到（ 图7），确定网格方向的Ad载体的保存完好的转导能力，即使经过48小时暴露于完成细胞培养基在37℃。
体内研究
审查有关的U潜在影响不同的HC上动脉传导，动物植入广告卢克 -eluting制备RHC-，IHC-，SHC-和支架本身NHC改性的载体进行生物发光成像支架展开（ 图8）后1和8天。摄像，进行以下的荧光素的局部血管周围施用（2毫克）共同配制和尼克凝胶。此制剂是在冰上冷却时的粘性流体，但经历直接相变凝胶当与组织接触，在37℃下提出。初步实验（未示出）表明，相比于全身（腹膜内或静脉内）给药的荧光素血管周围输送萤光素结果中更加稳定和可再现的发光信号中的广告卢克 -transduced血管组织。
如果病毒束缚到所述支架和所述支架置放手术技术上是正确的，对应的支架段定义良好的信号大鼠颈动脉被发射并记录。支架植入后的一天，用RHC-配制的广告卢克支架治疗的动物通常表现出最高的亮度信号，然后通过接收IHC-和SHC-大鼠配制支架（ 图8A和8B）。没有可感知的信号的组大鼠植入支架中观察到制备使用NHC-拴广告卢克 ，强调从支架的血管组织有效转导无阻载体释放的重要性（ 图8A和8B）。由第8天，荧光素酶表达和RHC-配制的支架的平均强度下降几倍，而它增加了1.4和1.8倍，IHC-和SHC-配制的支架，分别为（ 图8A和8B）。这一发现与更持久的血管转导与基因洗脱支架表现出较慢的亲属的假设是一致从支架表面释放载体的ETICS。
整个图所描述的研究中使用的交联剂（NHC，特困，免疫组化和RHC）1。结构式 （修改许可28）。
图2表示的广告载体圈养到PABT的方案/裴PDT通过HC和后续版本在交联剂的水解载体修饰的不锈钢表面 （修改许可28）。
图3：基于PCR的定量广告的eGFP ification 经由交联剂圈养PABT / PEI PDT的表面上固定化的修饰的不锈钢网眼的不锈钢网孔被配制用Ad eGFP的经由RHC，IHC，SHC，或NHC（n = 3时为每个条件固定）。经过蛋白酶K处理，病毒DNA被洗脱，并使用MinElute柱纯化。利用绿色荧光蛋白特异性引物的病毒DNA的扩增反应在7500实时PCR发动机和带的SYBR Green检测。数据归一化的基础制备的非固定化广告的eGFP的已知量的校准曲线（改性权限28）。
图4发布广告载体的动力学拴在金属基材与慧聪圣ainless钢网孔被衍生化以〜2×10 9 Cy3标记信息附加到PABT颗粒变形以500μMNHC，SHC，IHC RHC和100μM的RHC（指定为RHC-L）的后/ PEI PDT修饰的表面。荧光标记的广告粒子的释放进行了研究，在由（A）指定的时间点以及扫描荧光在五百七十分之五百五十nm和（B）的荧光显微镜（罗丹明滤波器组;原放大倍数200倍）。荧光结果以平均值±SEM，N = 8-10; P <0.001为NHC和SHC与免疫组化，RHC和RHC-L组之间的所有比较采用方差分析与事后Tukey检验（修改许可28）确定。
图5转非固定广告é成效GFP 以下的修改与右心导管检查。大鼠胚胎主动脉衍生的SMC（A10线）转导在1000 MOI与未经修饰的广告绿色荧光蛋白或载体修饰RHC所示。有记者表达荧光测定法（535分之485nm）的48小时转导后（修改许可27）。
图6转导培养的SMC和BAEC与固定在不锈钢广告载体网格与慧聪，网孔被衍生化〜2×10 9广告绿色荧光蛋白 ，通过NHC，特困，免疫组化和RHC附加颗粒。网格，然后分别放在亚汇合A10（A，B）和BAEC（C，D）单层的顶部。用Ad载体 - 拴系的网格处理的细胞的转导（表示为eGFP的表达水平）溶液用f评估luorescence显微镜（A，C，FITC滤光片组，原放大倍数100倍），并同时扫描荧光（B，D）。荧光结果以平均值±SEM，N = 4（修改许可28）。 请点击这里查看该图的放大版本。
基板固定广告载体的延迟时间点图7转导能力。广告绿色荧光蛋白固定在钢网，通过NHC，特困，免疫组化或右心导管检查系绳。的网孔被放置在汇合BAEC细胞单层。放置两天后，BAEC用胰蛋白酶处理，并不会干扰网格中删除。新的，非转导的BAEC然后接种过的网格。广告（; FITC滤光片组，原放大倍数100X A）和荧光（B） 绿色荧光蛋白转导能力，用荧光显微镜用绿色荧光蛋白表达的检测。测量是在指定的日子里，代表图像被用来和荧光效果的手段±标准差，N = 4（从许可28修改）。 请点击这里查看该图的放大版本。
支架固定的广告吕克 体内 。广告吕克 （1.3×10 10颗粒） 图8。转导效率 ，通过NHC，特困，免疫组化或右心导管检查（各组N = 3-4）拴在血管内支架。广告吕克转导效率</ SUB>从洗脱支架采用生物发光成像（IVIS频谱）1和8天后支架置放（A）测定，并采用对数刻度（B）（经许可28修改为从）。划出的曲线图，请点击这里查看大图这个版本的人物。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
所提出的协议描述了一种用于通过腺病毒载体的可逆附着取得到coatless不锈钢表面衬底介导的基因递送的操作方法。而开发出用于血管再狭窄的支架为基础的基因疗法的特定目的，该技术具有在生物材料，生物医学植入物和基因治疗等领域的更广泛的应用。
虽然提出的研究仅使用不锈钢作为一个典型的金属基板，PABT结合其他金属的合金，如钴/铬和镍钛合金具有相当的亲和力（未发表）。 PABT与金属的不加选择的互动显著拓展潜在的生物医学应用的数量这项技术31。此外，采用HC系留基因载体，尽管需要硫醇安装的其他方法到材料表面上，是与其它类型的生物材料是可行的。
ontent“>虽然广告在基因载体实现健壮的转导在许多人的细胞类型和组织，它们的临床意义是通过腺病毒 4引起强烈的炎症和免疫应答的限制，为此，延长（4个月）动脉表达与配制基因洗脱支架使用HC的荧光素酶表达腺相关病毒载体改性最近显示（未发表）。该方法的鲁棒性。从主协议小的偏差一般不导致在体外和体内显著改变基因的表达。不过，这可能会影响结果的几个关键问题进行了鉴定。
首先，正如其名称所暗示的，可水解的交联剂是在与水反应可切割的，由于在链酯的水解。另外，胺反应性基团，N -sulfosuccinimidyl是可水解为好。交联剂应存放ü升气管在-20℃氩气氛下保持其活性。出于同样的原因，制备HC（协议第3.2节）的溶液后，立即进行通过加入HC解的病毒棉片。
第二，在一些中间步骤所呈现的生物结合序列的形成在金属表面上的硫醇基团由周围空气的氧迅速氧化。为了防止这种情况，保持在任何时候都浸没于脱气的水的脆弱的金属样品。
第三，与井的底部的网孔的精确对准所需的成功转导。在处理过程中不要弯曲网格磁盘。
四，忌支架置入过程中对聚四氟乙烯套管和血管壁的基因洗脱支架的过度摩擦，防止表面相关的广告载体撞出。
共价连接的基因载体的可植入biomateria的表面LS具有更好的控制比变现与载体非共价系链的载体释放动力学的表观优点。在基因递送的从支架平台的设置多数研究报告支架展开32-34后完全释放的内1-7天的病毒和非病毒载体。另一方面，通过HC Ad载体的固定化证实了只有20％-45％的载体负载的第一个月释放（ 图4A和4B）。此外，释放和传递的动力学部分的调制是可以实现与使用不同慧聪参展不同的水解动力学或通过改变慧聪用于病毒表面改性的浓度。此外，并发共修饰具有不同交联剂分子的载体，尽管在本研究中没有研究，提供了另一种机会进行微调载体释放和转导。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 316 stainless steel mesh disks | Electon Microscopy Sciences | E200-SS | |
| Generic 304-grade stainless steel stents | Laserage | custom order | |
| AdeGFP | University of Pennsylvania Vector Core | AD-5-PV0504 | |
| AdLuc | University of Pennsylvania Vector Core | AD-5-PV1028 | |
| AdEMPTY | University of Pennsylvania Vector Core | A858 | |
| Cy3(NHS)2 | GE Healthcare | PA23000 | |
| Sepharose 6B | Sigma-Aldrich | 6B100-500ML | |
| UV 96-well plates | Costar | 3635 | |
| Fluorometry 96-well plates | Costar | 3915 | |
| Cell culture 96-well plates | Falcon | 353072 | |
| Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride (TCEP) | Pierce Thermo Scientific | 20490 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Pierce Thermo Scientific | 20290 | |
| sulfo-LC-SPDP | Pierce Thermo Scientific | 21650 | |
| Spectrophotometer | Molecular Devices | SpectraMax 190 | |
| Spectrofluorometer | Molecular Devices | SpectraMax Gemini EM | |
| Orbital shaker incubator | VWR | 1575R | |
| Horizontal airflow oven | Shel Lab | 1350 FM | |
| Centra-CL2 centrifuge | International Equipment Company | 426 | |
| Digital vortex mixerer | Fisher Thermo Scientific | 02-215-370 | |
| Eclipse TE300 fluorescence microscope | Nikon | TE300 | |
| DC 500 CCD camera | Leica | DC-500 | |
| 7500 Real-Time PCR system | Applied Biosystems | not available | |
| IVIS Spectrum bioluminescence station | Perkins-Elmer | not available | |
| EDTA dipotassium salt | Sigma-Aldrich | ED2P | |
| Bovine serum albumin fraction V (BSA) | Fisher Thermo Scientific | BP1600-100 | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P1379 | |
| Dumont forceps | Fine Science Tools | 11255-20 | |
| A10 cell line | ATCC | CRL-1476 | |
| Bovine aortic endothelial cells | Lonza | BW-6002 | |
| Luciferin, potassium salt | Gold Biotechnology | LUCK-1Ge | |
| Pluronic F-127 | Sigma-Aldrich | P2443-250G | |
| PBS without calcium and magnesium | Gibco | 14190-136 | |
| Fetal bovine serum | Gemini Bio-Products | 100-106 | |
| Penicillin/Streptomycin solution | Gibco | 11540-122 | |
| DMEM, high glucose | Corning cellgro | 10-013-CV | |
| 0.25% Trypsin/EDTA | Gibco | 25200-056 | |
| QIAamp DNA micro kit | Qiagen | 56304 | |
| Power Sybr Green PCR Master Mix | Applied Biosystems | 4367659 | |
| MicroAmp Optical 96-well Reaction Plate | Applied Biosystems | N8010560 | |
| MicroAmp Optical Adhesive Film | Applied Biosystems | 4360954 | |
| Cephazolin | Apotex | not available | |
| Loxicom (Meloxicam) | Norbrook | not available | |
| Heparin sodium | APP Pharmaceuticals | not available | |
| Ketavet (Ketamine) | VEDCO | not available | |
| Anased (Xylazine) | Lloid | not available | |
| Forane (Isoflurane) | Baxter | not available | |
| Curved Moria iris forceps | Fine Science tools | 11370-31 | |
| Curved extra-fine Graefe forceps | Fine Science Tools | 11152-10 | |
| Dumont #5 forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| Vannas spring scissors | Fine Science Tools | 15018-10 | |
| Fine scissors - ToughCut | Fine Science Tools | 14058-09 | |
| Surgical scissors | Fine Science Tools | 14101-14 | |
| Vicryl suture (5-0) | Ethicon | J385 | |
| Suture thread (4/0 silk) | Fine Science Tools | 18020-40 | |
| Michel suture clips | Fine Science Tools | 12040-02 | |
| Wound dilator (Lancaster eye specula) | KLS Martin | 34-149-07 | |
| Hot bead sterilizer | Fine Science Tools | 18000-45 | |
| Michel suture clip applicator | Fine Science Tools | 112028-12 | |
| Insyte Autoguard 24 G IV catheter | Beckton-Dickinson | 381412 | |
| 2F Fogarty catheter | Edwards Lifesciences | 120602F | |
| Teflon tubing | Vention | 041100BST | |
| PTA catheter | NuMed | custom order | |
| Gauze pads | Kendall Healthcare | 9024 | |
| Cotton applicators | Solon Manufacturing | WOD1003 | |
| Saline | Baxter | 281321 | |
| 10 ml syringe (Luer-Lok) | Beckton-Dickinson | 309604 | |
| 1 ml syringe (Luer-Lok) | Beckton-Dickinson | 309628 | |
| Clippers with #40 blade | Oster | 78005-314 | |
| Transpore surgical tape | 3M | MM 15271 | |
| Puralube vet ointment | Pharmaderm | not available |
References
- Boeckle, S., Wagner, E. Optimizing targeted gene delivery: chemical modification of viral vectors and synthesis of artificial virus vector systems. AAPS J. 8, E731-E742 (2006).
- Waehler, R., Russell, S. J., Curiel, D. T. Engineering targeted viral vectors for gene therapy. Nat Rev Genet. 8, 573-587 (2007).
- Campos, S. K., Barry, M. A. Current advances and future challenges in Adenoviral vector biology and targeting. Curr Gene Ther. 7, 189-204 (2007).
- Bangari, D. S., Mittal, S. K. Current strategies and future directions for eluding adenoviral vector immunity. Curr Gene Ther. 6, 215-226 (2006).
- Barry, M. A., et al. Systemic delivery of therapeutic viruses. Curr Opin Mol Ther. 11, 411-420 (2009).
- De Laporte, L., Shea, L. D. Matrices and scaffolds for DNA delivery in tissue engineering. Adv Drug Deliv Rev. 59, 292-307 (2007).
- Gustafson, J. A., Price, R. A., Greish, K., Cappello, J., Ghandehari, H. Silk-elastin-like hydrogel improves the safety of adenovirus-mediated gene-directed enzyme-prodrug therapy. Mol Pharm. 7, 1050-1056 (2010).
- Kidd, M. E., Shin, S., Shea, L. D. Fibrin hydrogels for lentiviral gene delivery in vitro and in vivo. J Control Release. 157, 80-85 (2012).
- Lei, Y., et al. Incorporation of active DNA/cationic polymer polyplexes into hydrogel scaffolds. Biomaterials. 31, 9106-9116 (2010).
- Lei, Y., Rahim, M., Ng, Q., Segura, T. Hyaluronic acid and fibrin hydrogels with concentrated DNA/PEI polyplexes for local gene delivery. J Control Release. 153, 255-261 (2011).
- Jang, J. H., Schaffer, D. V., Shea, L. D. Engineering biomaterial systems to enhance viral vector gene delivery. Mol Ther. 19, 1407-1415 (2011).
- Salvay, D. M., Zelivyanskaya, M., Shea, L. D. Gene delivery by surface immobilization of plasmid to tissue-engineering scaffolds. Gene Ther. 17, 1134-1141 (2010).
- Moss, A. J., Hamburger, S., Moore, R. M., Jeng, L. L., Vol Howie, L. J. Advance Data. 191, National Center for Health Statistics Vital and Health Statistics. (1991).
- Gristina, A. G., Naylor, P., Myrvik, Q. Infections from biomaterials and implants: a race for the surface). Med Prog Technol. 14, 205-224 (1988).
- Santerre, J. P., Woodhouse, K., Laroche, G., Labow, R. S. Understanding the biodegradation of polyurethanes: from classical implants to tissue engineering materials. Biomaterials. 26, 7457-7470 (2005).
- Tang, L., Eaton, J. W. Inflammatory responses to biomaterials. Am J Clin Pathol. 103, 466-471 (1995).
- Zimmerli, W., Sendi, P. Pathogenesis of implant-associated infection: the role of the host. Semin Immunopathol. 33, 295-306 (2011).
- Fishbein, I., et al. Bisphosphonate-mediated gene vector delivery from the metal surfaces of stents. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 159-164 (2006).
- Levy, R. J., et al. Localized adenovirus gene delivery using antiviral IgG complexation. Gene Ther. 8, 659-667 (2001).
- Ma, G., et al. Anchoring of self-assembled plasmid DNA/anti-DNA antibody/cationic lipid micelles on bisphosphonate-modified stent for cardiovascular gene delivery. Int J Nanomedicine. 8, 1029-1035 (2013).
- Hu, W. W., Lang, M. W., Krebsbach, P. H. Development of adenovirus immobilization strategies for in situ gene therapy. J Gene Med. 10, 1102-1112 (2008).
- Jang, J. H., et al. Surface immobilization of hexa-histidine-tagged adeno-associated viral vectors for localized gene delivery. Gene Ther. 17, 1384-1389 (2010).
- Bengali, Z., Shea, L. D. Gene Delivery by Immobilization to Cell-Adhesive Substrates. MRS Bull. 30, 659-662 (2005).
- Holmes, C. A., Tabrizian, M. Substrate-mediated gene delivery from glycol-chitosan/hyaluronic acid polyelectrolyte multilayer films. ACS Appl Mater Interfaces. 5, 524-531 (2013).
- Pannier, A. K., Wieland, J. A., Shea, L. D. Surface polyethylene glycol enhances substrate-mediated gene delivery by nonspecifically immobilized complexes. Acta Biomater. 4, 26-39 (2008).
- Wang, C. H., Pun, S. H. Substrate-mediated nucleic acid delivery from self-assembled monolayers. Trends Biotechnol. 29, 119-126 (2011).
- Fishbein, I., et al. Local delivery of gene vectors from bare-metal stents by use of a biodegradable synthetic complex inhibits in-stent restenosis in rat carotid arteries. Circulation. 117, 2096-2103 (2008).
- Fishbein, I., et al. Adenoviral vector tethering to metal surfaces via hydrolyzable cross-linkers for the modulation of vector release and transduction. Biomaterials. 34, 6938-6948 (2013).
- Mittereder, N., March, K. L., Trapnell, B. C. Evaluation of the concentration and bioactivity of adenovirus vectors for gene therapy. J. Virol. 70, 7498-7509 (1996).
- Forbes, S. P., et al. Modulation of NO and ROS production by AdiNOS transduced vascular cells through supplementation with L-Arg and BH4: Implications for gene therapy of restenosis. Atherosclerosis. 230, 23-32 (2013).
- Niinomi, M., Nakai, M., Hieda, J. Development of new metallic alloys for biomedical applications. Acta Biomater. 8, 3888-3903 (2012).
- Brito, L. A., Chandrasekhar, S., Little, S. R., Amiji, M. M. Non-viral eNOS gene delivery and transfection with stents for the treatment of restenosis. Biomed Eng Online. 9, 56 (2010).
- Egashira, K., et al. Local delivery of anti-monocyte chemoattractant protein-1 by gene-eluting stents attenuates in-stent stenosis in rabbits and monkeys. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 27, 2563-2568 (2007).
- Ohtani, K., et al. Stent-based local delivery of nuclear factor-kappaB decoy attenuates in-stent restenosis in hypercholesterolemic rabbits. Circulation. 114, 2773-2779 (2006).
