Abstract
में स्टेंट restenosis व्यापक रूप से कोरोनरी और परिधीय धमनियों के गंभीर रूप से संकुचित खंडों के माध्यम से फिर से स्थापित रक्त के प्रवाह के लिए इस्तेमाल किया स्टेंट आधारित revascularization प्रक्रियाओं की एक प्रमुख जटिलता प्रस्तुत करता है. एक वैकल्पिक रणनीति उपस्थित हो सकता है विरोधी restenotic गतिविधि के साथ जीन की ट्यून करने योग्य रिलीज करने में सक्षम Endovascular स्टंट्स वर्तमान में दवा eluting स्टेंट का इस्तेमाल किया है. आम तौर पर वेक्टर की भौतिक फंसाने के लिए इस्तेमाल किया बहुलक कोटिंग्स के साथ जुड़े एक अत्यधिक भड़काऊ प्रतिक्रिया से परहेज करते हुए नैदानिक अनुवाद प्राप्त करने के लिए, जीन एल्यूटिंग स्टंट्स, स्टेंट-स्थिर जीन वेक्टर रिहाई और vasculature की साइट विशेष पारगमन की उम्मीद के मुताबिक कैनेटीक्स प्रदर्शन करना चाहिए. इस पत्र बिसफ़ॉस्फ़ोनेट (PABT) hydrolysable पार Linkers (एचसी) के माध्यम से स्टेनलेस स्टील की सतह -modified polyallylamine को adenoviral कणों की एक प्रतिवर्ती बंधन पर आधारित स्टंट्स को adenoviral जीन वैक्टर coatless tethering के लिए एक विस्तृत कार्यप्रणाली का वर्णन है. का एक परिवारबीच 5 और 50 दिनों लेकर में श्रृंखला एस्टर hydrolysis के एक औसत टी 1/2 साथ bifunctional (amine- और thiol प्रतिक्रियाशील) कोर्ट स्टेंट के साथ वेक्टर लिंक करने के लिए इस्तेमाल किया गया. वेक्टर स्थिरीकरण प्रक्रिया आम तौर पर 9 घंटे के भीतर बाहर ले गए और कई चरण होते है: PABT (4 घंटा) की एक जलीय घोल में धातु नमूनों की 1) ऊष्मायन; Tris (2 carboxyethyl) phosphine (20 मिनट) के साथ PABT में स्थापित thiol समूहों के 2) deprotection; Pyridyldithio (पीडीटी) समूह (2 घंटा) के साथ derivatized polyethyleneimine साथ नमूने प्रतिक्रिया द्वारा धातु की सतह के thiol प्रतिक्रियाशील क्षमता के 3) विस्तार; Dithiothreitol (10 मिनट) के साथ thiols को पीडीटी समूहों में से 4) रूपांतरण; कोर्ट (1 घंटा) के साथ एडिनोवायरस की 5) संशोधन; आकार अपवर्जन क्रोमैटोग्राफी स्तंभ (15 मिनट) और thiolated स्टील सतह (1 घंटा) पर thiol प्रतिक्रियाशील adenoviral कणों की 7) स्थिरीकरण द्वारा संशोधित adenoviral कणों की 6) शुद्धि. इस तकनीक, स्टंट्स से परे व्यापक संभावित प्रयोज्यता हैप्रत्यारोपित विदेशी सामग्री interfacing कोशिकाओं को सब्सट्रेट की मध्यस्थता जीन डिलीवरी के माध्यम से उनके biocompatibility बढ़ाने के लिए bioprosthetic उपकरणों की सतह इंजीनियरिंग की सुविधा से.
Introduction
एक चिकित्सीय साधन के रूप में जीन थेरेपी की प्रभावशीलता जीन थेरेपी वैक्टर 1,2 के गरीब लक्ष्यीकरण क्षमता आड़े आती है. लक्ष्य स्थान पर transgene अभिव्यक्ति की उप चिकित्सीय स्तर में उचित लक्ष्यीकरण परिणामों की कमी और, वेक्टर और इनकोडिंग चिकित्सीय उत्पाद 4 दोनों के खिलाफ प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया बढ़ते के लिए जिम्मेदार लोगों सहित गैर लक्ष्य अंगों 3, करने के लिए वैक्टर का एक व्यापक प्रसार की ओर जाता है 5. एक संभावित पारगमन की संकीर्णता ऑफसेट करने और लक्ष्यीकरण रक्त और लसीका के माध्यम से उनके मुक्त प्रसार precludes कि एक प्रपत्र में इच्छित स्थान पर जीन वैक्टर लागू है को बढ़ावा देने के लिए इसका मतलब है. आमतौर पर, इस तरह के प्रयासों को शारीरिक रूप से वें entrapping द्वारा इंजेक्शन स्थल पर क्षणिक बनाए रखने जीन वैक्टर करने में सक्षम हैं कि आतंच, मज्जा या एसिड हाइड्रोजेल matrices 6-10 साथ admixed वायरल या गैर वायरल वैक्टर या तो की, जिसमें एक स्थानीय रूप से इंजेक्शन वितरण प्रणाली पर भरोसाएक polymeric नेटवर्क में उन्हें.
स्थानीयकृत जीन थेरेपी के लिए एक और आम तौर पर स्वीकार प्रतिमान प्रत्यारोपित कृत्रिम उपकरणों 11,12 की सतह पर जीन वैक्टर के स्थिरीकरण का इस्तेमाल करता. स्थायी चिकित्सा प्रत्यारोपण (ENDOVASCULAR, ब्रोन्कियल, मूत्र संबंधी और जठरांत्र स्टंट्स, पेसमेकर, कृत्रिम जोड़ों, शल्य चिकित्सा और स्त्रीरोगों meshes, आदि.) रोगियों 13 के करोड़ों में वार्षिक उपयोग किया जाता है. आम तौर पर प्रभावी जबकि, इन उपकरणों अपर्याप्त मौजूदा चिकित्सा पद्धतियों 14-17 से लिए नियंत्रित कर रहे हैं कि जटिलताओं से ग्रस्त हैं. Implantable कृत्रिम उपकरणों स्थानीयकृत जीन थेरेपी उपचार के लिए प्रॉक्सी प्लेटफॉर्म के रूप में सेवा करने के लिए एक अनूठा अवसर प्रस्तुत करते हैं. फार्माकोकाइनेटिक दृष्टि, उनके व्यापार के कैनेटीक्स प्रत्यारोपण / ऊतक इंटरफेस पर जीन वैक्टर उच्च स्थानीय सांद्रता दोनों को प्राप्त करने और धीमा करने में जीन वैक्टर परिणामों की अपेक्षाकृत कम निवेश खुराक के साथ चिकित्सा प्रत्यारोपण की सतह derivatization सेइस स्थान से आर उन्मूलन. लक्षित सेल की आबादी से एक दीर्घ निवास के परिणाम और बढ़ाया तेज के रूप में, वेक्टर स्थिरीकरण जीन वेक्टर का प्रसार कम करता है. इस प्रकार गैर लक्ष्य ऊतकों के अनजाने टीका कम है.
(भी सब्सट्रेट की मध्यस्थता जीन डिलीवरी या ठोस चरण जीन डिलीवरी के रूप में कहा) प्रत्यारोपण biomaterials पर जीन वैक्टर भूतल tethering का उपयोग सेल संस्कृति और पशु प्रयोगों में लागू किया गया है दोनों विशिष्ट (प्रतिजन प्रतिरक्षी 18-20, avidin बायोटिन 21,22) और 23-26 (प्रभारी, वान डर वाल्स) बातचीत गैर विशिष्ट. सतह के साथ जरूरत से ज्यादा मजबूत बांड लक्ष्य कोशिकाओं द्वारा वेक्टर internalization रोकता के बाद से प्रत्यारोपित डिवाइस की सतह को वैक्टर के सहसंयोजक लगाव पहले गैर कार्यात्मक रूप में माना गया है. हाल ही में यह इस सीमा TET के रूप में इस्तेमाल अनायास hydrolysable पार linker के उपयोग के माध्यम से दूर किया जा सकता है कि प्रदर्शन किया गयाadenoviral वेक्टर 27,28 के स्टेंट और कैप्सिड प्रोटीन की संशोधित धातु की सतह के बीच उसका. इसके अलावा, वेक्टर रिहाई की दर और इन विट्रो में और vivo में transgene अभिव्यक्ति के समय पाठ्यक्रम हाइड्रोलिसिस 28 के विभिन्न कैनेटीक्स प्रदर्शन hydrolysable पार Linkers के उपयोग के साथ संग्राहक जा सकता है.
वर्तमान कागज सक्रिय धातु की सतह को adenoviral वैक्टर प्रतिवर्ती सहसंयोजक लगाव के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करता है और स्टेंट एंजियोप्लास्टी की चूहा मन्या मॉडल में सुसंस्कृत चिकनी मांसपेशियों और endothelial कोशिकाओं में और vivo में इन विट्रो में आगामी पारगमन की घटनाओं के अध्ययन के लिए एक उपयोगी प्रयोगात्मक स्थापना का परिचय .
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Protocol
विज्ञप्ति के प्रयोगों के लिए Cy3 लेबल Adenovirus की 1. तैयारी
- (; पीएच 9.3 सीबीबी) कार्बोनेट / बिकारबोनिट बफर के 650 μl में खाली विज्ञापन के 2 एक्स 10 12 कणों (लगभग 2 एक्स 10 11 संक्रामक इकाइयों) को निलंबित.
- 0.2 मिलीग्राम / मिलीलीटर की एक अंतिम एकाग्रता (2 Cy3 (एनएचएस)) 1 मिलीलीटर CBB में amine प्रतिक्रियाशील फ्लोरोसेंट रंजक के 1 शीशी (0.2 मिलीग्राम) की सामग्री भंग.
- 5 सेकंड के लिए वायरस निलंबन, भंवर को डाई समाधान के 100 μl जोड़ें और (100-200 RPM) झटकों के साथ 28 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए सेते हैं.
- पीबीएस के साथ एक 20 मिलीलीटर Sepharose 6B स्तंभ संतुलित करना. Cy3 लेबल विज्ञापन निलंबन बूंद के लिहाज से जेल बिस्तर के केंद्र के 750 μl जोड़ें.
- वायरल निलंबन राल व्याप्त बाद, पीबीएस के 5 मिलीलीटर जोड़ें. Eluate त्यागें.
- पीबीएस के 0.5 मिलीलीटर जोड़ें और एक लेबल ग्लास कंटेनर में eluate इकट्ठा. दस 0.5 मिलीलीटर अंशों की कुल एकत्रित इस कदम 10x दोहराएँ.
- परख वेंई वायरल डीएनए सामग्री के लिए स्पेक्ट्रोफोटोमेट्री (260 और 280 एनएम) से भिन्न एकत्र.
- 260 एनएम पर कुल (F10 के माध्यम से एफ 1 का योग) ऑप्टिकल घनत्व (ओवर ड्राफ्ट) के 10% से अधिक युक्त भिन्न पूल. नोट: आमतौर पर भिन्न F3, F4, करें F5, और F6 जमा और मिश्रित कर रहे हैं.
- पुन: परख वायरल डीएनए सामग्री और Cy3 के लिए fluorometry (550 पूर्व / 570 उन्हें एनएम) द्वारा स्पेक्ट्रोफोटोमेट्री (260 और 280 एनएम) और परख द्वारा मिश्रित जमा भिन्न क्रमशः, कैप्सिड प्रोटीन लेबल. नोट: एक Cy3 (एनएचएस) 2 अंशांकन वक्र 10 -9 -10 -13 मोल / एल श्रृंखला तैयार और fluorimetrically जमा भिन्न रूप में एक ही थाली पर assayed है कवर.
- लेबल वायरस उपज और लेबलिंग घनत्व की गणना. 1.19 x 10 12 वायरस कणों / मिलीलीटर एक 1 सेमी पथ की लंबाई 29 के लिए 1 आयुध डिपो इकाई से मेल खाती है कि मान लें. यील्ड = [(आयुध डिपो 260nm /1.19)*10 12 * वी / इनपुट विज्ञापन राशि] * 100, आयुध डिपो 260nm ऑप्टिकल डे है, जहां: सूत्र का उपयोग करें260 एनएम पर जमा तैयार करने की nsity और वी विज्ञापन वसूली उपज (%) की गणना करने के लिए जमा सूत्रीकरण (माले) की मात्रा है. सूत्र का उपयोग करें: लेबल घनत्व = ग * 6.02 * 10 23 / (आयुध डिपो सी जमा तैयार करने की Cy3 एकाग्रता (मोल / एमएल) और आयुध डिपो 260nm है जहां 260nm /1.19)*10 12, जमा तैयार करने की ऑप्टिकल घनत्व में है 260 एनएम औसत Cy3 लेबलिंग घनत्व की गणना के लिए. नोट: लेबल वायरस की एक ठेठ वसूली इनपुट खुराक के> 70% है. लेबलिंग घनत्व एकल वायरस कण प्रति 600-800 फ्लोरोफोरे अणुओं है.
- विभाज्य व्यक्ति रिहाई के प्रयोगों के लिए उपयुक्त छोटे भागों (आमतौर पर 5 एक्स 10 11 कण) में खाली विज्ञापन Cy3 लेबल. नोट: वर्तमान प्रोटोकॉल केवल रिहाई प्रयोग में Cy3 लेबल विज्ञापन का उपयोग निर्दिष्ट करता है. सभी पारगमन पढ़ाई गैर लेबल वैक्टर के साथ किया जाता है.
धातु नमूने की 2 एक्टिवेशन
- स्टेनलेस धोएंteel isopropanol में लगातार डिस्क या स्टेनलेस स्टील स्टंट्स मेष (5 मिनट एक्स 2) और क्लोरोफॉर्म मिलाते (100 आरपीएम) के साथ 55 डिग्री सेल्सियस (5 मिनट 2 एक्स). विलायक निकालें.
- 200 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए नमूने गरम करें.
- पानी में स्थापित अव्यक्त thiol समूहों (PABT 27,28,30) के साथ polyallylamine बिसफ़ॉस्फ़ोनेट (100 आरपीएम) झटकों के साथ 72 डिग्री सेल्सियस (/ वी डब्ल्यू 1-2%) भंग. KHCO 3 के साथ 4.5-5 पीएच को समायोजित करें.
- (100-200 RPM) झटकों के साथ 72 डिग्री सेल्सियस पर 2-4 घंटे के लिए PABT समाधान में धातु के नमूने सेते हैं. नोट: प्रक्रिया में इस बिंदु पर रुका हुआ जा सकता है. नमूने 4 डिग्री सेल्सियस पर 3 दिन के लिए स्थिर रहे हैं.
- दोहरा आसुत जल (DDW) के साथ तीन बार नमूने कुल्ला.
- Tris (2 carboxyethyl) phosphine के लिए नमूनों को बेनकाब (TCEP, 0.1 एम एसिटिक बफर में 15 मिलीग्राम / एमएल) 28 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए (100-200 RPM) झटकों के साथ.
- Degassed DDW में 5x कुल्ला.
- (स्थापित pyridyldithio समूहों के साथ पी 2% polyethyleneimine के लिए नमूनों को बेनकाब
- DDW साथ नमूने तीन बार कुल्ला.
- Thiols को pyridyldithio समूहों में परिवर्तित करने के लिए 10 मिलीग्राम / एमएल dithiothreitol / DDW के लिए नमूनों को बेनकाब.
- Degassed DDW में फिर 5x कुल्ला.
3 Adenovirus सक्रियण और धातु सतह स्थिरीकरण
- (; पीएच 9.3 सीबीबी) कार्बोनेट / बिकारबोनिट बफर के 487.5-495 μl में विज्ञापन EGFP या विज्ञापन ल्यूक या तो 5 एक्स 10 11 कणों (लगभग 5 एक्स 10 10 संक्रामक इकाइयों) को निलंबित. नोट: Cy3 विज्ञापन खाली कणों लेबल की रिहाई के अध्ययन के लिए, 5 एक्स 10 11 उपयोग (सीबीबी साथ 487.5-495 μl मात्रा को समायोजित).
- Intermediately, (टी 1/2 = 5 डी) तेजी से (hydrolysis दरें 28 [बदलती के साथ कोर्ट भंग (टी 1 /2 = 12 डी) और धीरे धीरे (टी 1/2 = 50 डी) कोर्ट, यानी RHC, आईएचसी या SHC, चित्रा 1] या गैर hydrolysable पार linker (एनएचसी), 20 मिमी CBB में sulfo-नियंत्रण रेखा SPDP.
- इसके तत्काल बाद 500 μl (पार linker के 200-500 माइक्रोन अंतिम एकाग्रता), भंवर की कुल मात्रा के लिए वायरस निलंबन को पार linker समाधान की 5-12.5 μl जोड़ने और (झटकों के साथ 28 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए 100 सेते 200 आरपीएम).
- Degassed 5 मिमी EDTA / पीबीएस (EPBS) के साथ एक 20 मिलीलीटर Sepharose 6B स्तंभ संतुलित करना. राल बिस्तर के केंद्र के पार linker संशोधित विज्ञापन निलंबन के 500 μl dropwise जोड़ें.
- Degassed EPBS के 5 मिलीलीटर जोड़ें. Eluate त्यागें.
- Degassed EPBS के 0.5 मिलीलीटर जोड़ें और एक लेबल ग्लास कंटेनर में eluate इकट्ठा. इस चरण में दस 0.5 मिलीलीटर अंशों की कुल एकत्रित 10 बार दोहराएँ.
- 260 और 280 एनएम पर स्पेक्ट्रोफोटोमेट्री का उपयोग कर एकत्र अंशों की आयुध डिपो का निर्धारण करते हैं और वायरस titers (1.19 x 10 12 / मिलीलीटर corre को आयुध डिपो परिवर्तित1 ओवर ड्राफ्ट) 29 sponds.
- Eluted वायरस के> 10% युक्त भिन्न पूल (नोट: आमतौर पर, भिन्न F3-F6). जमा निलंबन के लिए spectrophotometric अनुमापांक परख दोहराएँ.
- (2.11 के अनुसार) सक्रिय धातु नमूनों के साथ शीशी को वायरल निलंबन स्थानांतरण. (100-200 RPM) झटकों के साथ 28 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए एक आर्गन वातावरण में सेते हैं. नोट: इस चरण में प्राप्त विज्ञापन सीमित धातु नमूने आगे प्रोटोकॉल वर्गों 5-7 में वर्णित बाद रिहाई और पारगमन प्रयोगों में इस्तेमाल किया जाता है.
पीसीआर द्वारा सतह से जुड़े विज्ञापन वेक्टर के 4 मात्रा
- एनएचसी, SHC, आईएचसी और RHC (एन = प्रत्येक प्रकार के लिए 3) वर्गों 2 और 3 में वर्णित के रूप में के माध्यम से सीमित सतह immobilized विज्ञापन EGFP के साथ तैयार meshes तैयार करें.
- वायरल डीएनए को अलग करने के लिए एक QIAamp डीएनए माइक्रो किट का प्रयोग करें. ATL बी के 180 μl से बना मिश्रण के 200 μl युक्त 1.5 मिलीलीटर प्लास्टिक ट्यूबों में व्यक्तिगत रूप से meshes रखेंuffer और proteinase कश्मीर के 20 μl (दोनों किट से). एक ही मिश्रण युक्त अलग ट्यूबों में (अंशांकन वक्र के लिए मानकों के रूप में) विज्ञापन EGFP कणों के ज्ञात राशि जोड़ें. रातोंरात मिलाते हुए बिना 56 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं.
- (किट से) अल बफर के 200 μl जोड़ें, vortexing द्वारा मिश्रण 100% इथेनॉल के 200 μl जोड़ने के लिए, और 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर सेते हैं.
- 1 मिनट के लिए 8000 rpm पर एक व्यक्ति MinElite (किट) से स्तंभ और स्पिन पर प्रत्येक ट्यूब से मिश्रण स्थानांतरण. , ताजा एएलटी बफर के 180 μl के साथ जाल युक्त ट्यूब कुल्ला 1 मिनट के लिए 8000 rpm पर संबंधित कॉलम और स्पिन पर जोड़ें. Eluates त्यागें.
- 1 मिनट के लिए 8000 rpm पर AW1 कॉलम में (किट) से बफर और स्पिन के 500 μl जोड़ें. Eluates त्यागें.
- 1 मिनट के लिए 8000 rpm पर AW2 कॉलम में (किट) से बफर और स्पिन के 500 μl जोड़ें.
- Eluates त्यागें.
- Unti एक अतिरिक्त 3 मिनट के लिए 14,000 rpm पर स्पिनएल कॉलम पूरी तरह से सूख रहे हैं. Eluates त्यागें.
- कॉलम में MilliQ ग्रेड पानी के 50 μl जोड़ें. 5 मिनट के लिए 14,000 rpm पर स्पिन. (किट) से व्यक्तिगत संग्रह ट्यूब में प्रत्येक स्तंभ से eluate के 50 μl लीजिए.
- पावर Sybr ग्रीन पीसीआर के निम्नलिखित (12.5 μl मास्टर मिक्स, [5'- ACG TAA ACG जीसीसी एसीए AGT टीसी -3 '], 0.63 μl 10 से 10 माइक्रोन EGFP भावना प्राइमर के 0.63 μl की पलता संयोजन से पीसीआर मास्टर मिक्स समाधान तैयार माइक्रोन EGFP विरोधी भावना प्राइमर [5'- आग टीसीजी टी जी सी टी जी सी टीटीसी ATG टीजी -3 '], MilliQ ग्रेड पानी की 6.3 μl). "कोई डीएनए" नियंत्रण सहित योजना बनाई प्रतिक्रियाओं की संख्या से इन संस्करणों गुणा.
- लोड और एक microamp ऑप्टिकल 96 अच्छी तरह से प्रतिक्रिया प्लेट की तीन प्रतियों कुओं में पीसीआर मास्टर मिक्स के 20 μl (कदम 4.8 से) विज्ञापन EGFP डीएनए के 5 μl. Microamp ऑप्टिकल चिपकने वाली फिल्म के साथ थाली सील. हवाई बुलबुले को खत्म करने के लिए 1 मिनट के लिए 1000 rpm पर थाली स्पिन.
- एक 7500 वास्तविक समय पीसीआर इंजन के गोदाम में थाली रखें. 7500 सिस्टम एसडीएस सॉफ्टवेयर (v1.4 या अधिक) का चयन का मुख्य मेनू में "नया प्रयोग बनाएँ". "अगली" पर क्लिक करें. "नया प्रयोग जादूगर" स्क्रीन में एक स्क्रॉल डाउन मेनू से Sybr ग्रीन चयन और "जोड़ें" पर क्लिक करें. थाली का लेआउट पाने के लिए "अगला" क्लिक करें. Sybr ग्रीन चयन, सभी कुओं विश्लेषण किया जा हाइलाइट करें. लगातार कोई डीएनए नियंत्रण कुओं, विज्ञापन EGFP डीएनए मानकों और अज्ञात हाइलाइट करें, और स्क्रॉल डाउन मेनू से संबंधित पदनाम का उपयोग कर उन्हें चिह्न.
- साधन टैब में स्विच करें. , "हदबंदी चरण जोड़ने" का चयन 25 μl को डिफ़ॉल्ट से 50 μl अच्छी तरह से मात्रा बदल जाते हैं. प्रारंभ क्लिक करें.
- Outliers और अन्य अनियमितताओं के लिए QC सारांश जाँच के बाद का उपयोग पीसीआर परिणामों का विश्लेषण करें.
मॉडल इस्पात मेष से hydrolysable पार linker सीमित वेक्टर कण की 5 विज्ञप्ति काइनेटिक्स
- (100-200 RPM) झटकों के साथ 1% BSA / पीबीएस (1 घंटा एक्स 3) में (3.9 के अनुसार) RHC, आईएचसी, SHC और एनएचसी के माध्यम से Cy3 लेबल विज्ञापन के साथ derivatized जाल नमूने धो लें.
- बाँझ ठीक संदंश का प्रयोग, क्षालन बफर के 200 μl के साथ प्रीफिल्ड एक 96 अच्छी तरह से थाली की व्यक्तिगत कुओं में meshes जगह (0.1% बीएसए / 0.1% बीच 20 / पीबीएस).
- प्रत्येक जाल के मध्य भाग के फ्लोरोसेंट छवियों लो. माइक्रोस्कोप और छवि अधिग्रहण के लिए इस्तेमाल किया सीसीडी कैमरे की सेटिंग में रिकार्ड.
- अधिकतम कमी के साथ अच्छी तरह से स्कैन मोड में fluorimetrically प्लेट (550 पूर्व / 570 EM) परख. एक पृष्ठभूमि नियंत्रण के रूप में गैर derivatized meshes के साथ कुओं का प्रयोग करें.
- (50 आरपीएम) झटकों के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर थाली सेते हैं.
- पूर्व निर्धारित समय (1-30 दिनों सीमा) पर meshes परेशान बिना क्षालन बफर aspirate और ताजा क्षालन बफर के 200 μl जोड़ें. दोहराएँ बफर जगह के बाद 4.3-4.5 कदम.
संवर्धित सेल के 6 पारगमनमेष स्थिर विज्ञापन वैक्टर द्वारा LS
- विज्ञापन EGFP धो - या विज्ञापन ल्यूक (100 आरपीएम) झटकों के साथ 5 मिनट के लिए बाँझ पीबीएस के साथ तीन बार meshes -derivatized.
- ठीक बाँझ संदंश का प्रयोग जाल डिस्क एक एक करके हटाने और व्यक्तिगत विकास की लॉग चरण में ब्याज की सेल प्रकार के साथ एक 96 अच्छी तरह से थाली के कुओं में उन्हें जगह है.
- 5% सीओ 2 में, 37 डिग्री सेल्सियस पर 24 घंटे के लिए कोशिकाओं को सेते हैं.
- हद और वेल्स में जीन अभिव्यक्ति के स्थानिक वितरण निर्धारित करने के लिए (EGFP या luciferase के लिए bioluminescence इमेजिंग के लिए फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी, fluorometry) संबंधित गैर टर्मिनल समापन बिंदु परख का प्रयोग करें.
- वैकल्पिक रूप से, पीबीएस के लिए स्थानापन्न मध्यम निम्न EGFP अभिव्यक्ति की उम्मीद है अगर fluorometry परख (485/535 एनएम) की संवेदनशीलता को बढ़ाने के लिए. नोट: एक fluorometer अच्छी तरह से स्कैन की क्षमता से लैस है, तो कुओं में कोशिकाओं EGFP व्यक्त की स्थानिक वितरण का आकलन करने के लिए एक अच्छी तरह से स्कैन मोड में थाली पढ़ा. विनिमय पीबीFluorometry पूरा करने के बाद मध्यम के लिए एस.
- छवि FITC फिल्टर सेट का उपयोग (अंतर्निहित और दूरस्थ जाल दोनों) विज्ञापन EGFP -eluting meshes के साथ कुओं में transduced कोशिकाओं. 40-200X बढ़ाई प्रतिनिधि छवियों लो. फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप और छवियों के अधिग्रहण के लिए इस्तेमाल किया सीसीडी कैमरे की सटीक सेटिंग्स रिकार्ड.
- सीधे विज्ञापन ल्यूक -eluting साथ वेल्स को पीबीएस में luciferin शेयर के 5 μl जोड़ें (10 मिलीग्राम / एमएल) पूर्व bioluminescence इमेजिंग के लिए 10 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2 सेते / एमएल और 500 ग्राम के एक अंतिम एकाग्रता meshes . महाप्राण मीडिया और इमेजिंग के बाद luciferin मुक्त मीडिया के साथ बदलें.
- पूर्व निर्धारित टाइम्स (2 सप्ताह का समय) पर दोहराएँ समापन बिंदु assays सब्सट्रेट की मध्यस्थता जीन स्थानांतरण निम्नलिखित रिपोर्टर जीन अभिव्यक्ति के कैनेटीक्स अध्ययन करने के लिए.
विलंबित समय अंक में संरक्षित पारगमन क्षमता की 7 मान्यकरण
- तैयार विज्ञापन EGFP डेवेक्टर tethering के लिए RHC, आईएचसी, SHC और एनएचसी का उपयोग rivatized meshes (2.1-2.11 अनुसार और 3.1-3.9) और व्यक्तिगत रूप से (BAEC 60-80% मिला हुआ गोजातीय महाधमनी endothelial कोशिकाओं के साथ एक 96 अच्छी तरह से थाली के कुओं में meshes जगह ).
- (6.4-6.5 के अनुसार) प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी और fluorometry का उपयोग 1 और 2 दिनों के बाद जाली नियुक्ति पर जाल स्थिर विज्ञापन EGFP साथ सुसंस्कृत BAEC के पारगमन का विश्लेषण करें.
- पारगमन के प्रारंभ होने के बाद 48 घंटे में दो बार पीबीएस के साथ जाल युक्त कुओं धो लो.
- अच्छी तरह से प्रत्येक को 0.25% / trypsin EDTA के 200 μl जोड़ें और (100 आरपीएम) झटकों के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए सेते हैं. पीबीएस के साथ 3X धो.
- Meshes के साथ जुड़े सभी EGFP पॉजिटिव कोशिकाओं के पूरी तरह हटाने का पता लगाने के लिए फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी और fluorometry का प्रयोग करें.
- हौसले से एक 60-80% प्रारंभिक बोने घनत्व (2-2.7 x 10 4 कोशिकाओं / अच्छी तरह से) में आंशिक रूप से जारी meshes साथ कुओं में BAEC passaged बीज.
- 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ पर थाली सेते
8 विज्ञापन eluting स्टेंट एंजियोप्लास्टी की चूहा मन्या मॉडल में स्टेंट तैनाती
- इस प्रोटोकॉल में वर्णित सभी पशु प्रक्रियाओं प्रयोगशाला पशु उपयोग पर संघीय नियमों के अनुरूप है और फिलाडेल्फिया के बच्चों के अस्पताल के IACUC द्वारा अनुमोदित किया गया. सभी उपकरणों आटोक्लेव निष्फल रहे सड़न रोकनेवाला शल्य चिकित्सा शर्तों का पालन करना. एक मनका अजीवाणु अप करने के लिए लगातार पांच पशुओं में उपकरणों के उपयोग के बीच कार्यरत है निरंतर बाँझपन आश्वस्त करने के लिए.
- विज्ञापन ल्यूक 2.1-2.11 और 3.1-3.9 के अनुसार स्टंट्स -eluting तैयार करें. उपयोग करने से पहले अब कोई 24 से अधिक घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर बाँझ पीबीएस में वायरस derivatized स्टंट्स स्टोर.
- आईपी ketamine (100 मिलीग्राम / किग्रा) के इंजेक्शन, और xylazine (5 मिलीग्राम / किग्रा) के साथ पुरुष Sprague-Dawley चूहों (400-450 ग्राम) anesthetize. डीपंजा चुटकी प्रतिक्रिया और मांसपेशियों Tonus द्वारा संज्ञाहरण की गहराई termine. कॉर्निया और श्वेतपटल के सूखापन को रोकने के लिए नेत्र पशु चिकित्सक मरहम लागू करें. नोट: 4% और उत्प्रेरण और संज्ञाहरण बनाए रखने के लिए 2 isoflurane% (/ मिनट 1 एल) के साथ साँस लेना संज्ञाहरण, क्रमशः, एक अनुभवहीन उपयोगकर्ता के लिए सिफारिश नहीं है, इस प्रकार संभव है, लेकिन जानवर की गर्दन क्षेत्र के लिए नि: शुल्क प्रवेश में बाधा उत्पन्न करती है.
- पैर के अंगूठे चुटकी द्वारा संज्ञाहरण की गहराई reassess. दाढ़ी और aseptically प्रस्तुत करने का गर्दन और सीने के ऊपरी हिस्से क्षेत्र. एंटीबायोटिक (cefazolin, 20 मिलीग्राम / किग्रा, आईएम) प्रशासन, एनाल्जेसिक (meloxicam, 0.5 मिलीग्राम / किग्रा, अनुसूचित जाति) और नमकीन (10 मिलीग्राम / किग्रा, अनुसूचित जाति). एक 24 जी कैथेटर के साथ पूंछ नस कैथीटेराइज़ और हेपरिन प्रशासन (200 आइयू / किलो, चतुर्थ). नोट: 10 मिलीग्राम / किग्रा (आईएम) Enrofloxacin (Baytril) की एक खुराक के बजाय cefazolin का इस्तेमाल किया जा सकता है. ग्राम पॉजिटिव बैक्टीरिया के खिलाफ महत्वपूर्ण गतिविधि कमी एंटीबायोटिक दवाओं के प्रयोग से बचें. / किलो Carprofen (Rimadyl) 10-15 मिलीग्राम एक रिक्तिपूर्व एनाल्जेसिक के रूप में बजाय meloxicam का इस्तेमाल किया जा सकता है. मादक दर्दनाशक दवाओं (ई.g., अफ़ीम, buprenorphine) क्योंकि उनके श्वसन-निराशाजनक गुणों से बचा जाना चाहिए.
- त्वचा और गर्दन प्रावरणी के माध्यम से एक midline चीरा प्रदर्शन करना. बाएं बाह्य मन्या धमनी अलग करने के लिए कुंद विच्छेदन तकनीकों का प्रयोग करें. टाई बंद बाह्य मन्या धमनी सबसे बाहर पहुंचा साइट पर. आंतरिक मन्या धमनी की उत्पत्ति के लिए एक रपट अस्थायी संयुक्ताक्षर लागू करें.
- बाएं बाह्य मन्या धमनी में एक 2 मिमी arteriotomy चीरा.
- बाह्य मन्या धमनी में चीरा के माध्यम से आम मन्या धमनी में एक 2 फ्रेंच Fogarty कैथेटर डालें. खारा साथ कैथेटर की नोक फुलाना और अन्तःचूचुक उघाड़ना के क्रम में मन्या विभाजन को महाधमनी चाप से 3x गुजरती हैं.
- Fogarty कैथेटर पर और आम मन्या धमनी में ट्यूबिंग का एक टुकड़ा (1.04 मिमी आयुध डिपो, 0.99 मिमी आईडी) स्लाइड. Fogarty कैथेटर वापस ले लें.
- माउंट और एक विज्ञापन ल्यूक समेटना 1.5 के गुब्बारे से अधिक स्टेंट -derivatizedमिमी व्यास एंजियोप्लास्टी कैथेटर. Teflon टयूबिंग के माध्यम से स्टेंट डालने और आम मन्या धमनी के मध्य भाग में यह अग्रिम. ट्यूब या पोत दीवार के खिलाफ स्टेंट रगड़ से बचें.
- 30 सेकंड के लिए 12 एटीएम में स्टेंट की तैनाती और एंजियोप्लास्टी कैथेटर वापस ले लें.
- Arteriotomy साइट के लिए बाह्य मन्या धमनी समीपस्थ बंद टाई और आंतरिक मन्या धमनी पर अस्थायी संयुक्ताक्षर जारी.
- त्वचा 4.0 Vicryl सिवनी चल रहा है और प्रधान के साथ परतों में ऑपरेटिव घाव मरम्मत.
- चल जब तक एक वार्मिंग पैड पर पशु स्वस्थ और अपनी अलग पिंजरे में लौटने. दर्द या बेचैनी का कोई संकेत आम तौर पर प्रक्रिया के बाद पहले 12 घंटे से परे पोस्ट ऑपरेटिव जानवरों से प्रदर्शित कर रहे हैं, वहीं 72 घंटे के लिए meloxicam थेरेपी (0.5 मिलीग्राम / किग्रा, दैनिक अनुसूचित जाति) के विस्तार पर विचार करें.
धमनी जीन एक्सप्रेशन के 9 Bioluminescence इमेजिंग
- पूर्व निर्धारित समय बिंदुओं पर (1 दिन - 3आम मन्या धमनी में जीन eluting स्टेंट तैनाती के बाद सप्ताह रेंज), isoflurane साँस लेना संज्ञाहरण (ऑक्सीजन में 2-4 isoflurane%) का उपयोग कर चूहे anesthetize.
- , शल्य स्टेपल निकालें aseptically साइट तैयार करने और ऑपरेटिव घाव फिर से खोलना. बाईं आम मन्या धमनी को कुंद विच्छेदन, फिर से लाभ का उपयोग का उपयोग और वेगस तंत्रिका और आसन्न संयोजी ऊतक से अलग.
- पीबीएस में पीबीएस और 25% Pluronic एफ 127 में एक 50 मिलीग्राम के मिश्रण / एमएल Luciferin तैयार (1: 4 वी / वी) और बर्फ पर दुकान. नोट: इस निर्माण 4 डिग्री सेल्सियस पर एक चिपचिपा समाधान के रूप में प्रस्तुत करता है और तुरंत 37 डिग्री सेल्सियस पर ऊतक के साथ संपर्क पर जेल में बदल जाता है.
- सीधे आम मन्या धमनी के संपर्क में क्षेत्र के लिए एक ठंडा Luciferin / Pluronic मिश्रण के 200 μl लागू करें और जेल दृढ़ता सत्यापित.
- IVIS स्पेक्ट्रम तंत्र की इमेजिंग कक्ष में लापरवाह स्थिति में पशु प्लेस और एक चेहरे नकाब के साथ isoflurane संज्ञाहरण बनाए रखें.
- अधिग्रहण मेंनियंत्रण कक्ष की खिड़की पर (दूरी वस्तु को 6.6 सेमी कैमरा) की स्थिति "बी" का चयन (छवि, संस्करण 4.2 या उच्चतर जी) और क्रमशः, "देखने के क्षेत्र" और "binning" हकदार लटकती मेनू से कारक "मध्यम" binning. विषय ऊंचाई बॉक्स में "2.5 सेमी" में टाइप करें. "जोखिम समय" बॉक्स में समय की एक इकाई के रूप में "मिनट" चुनें, और "2" का एक संख्यात्मक मूल्य का चयन करें.
- तीन मिनट Luciferin / Pluronic जेल के आवेदन के बाद, स्क्रीन पर "मोल" बटन पर क्लिक करके छवि अधिग्रहण शुरू. नोट: छवि अधिग्रहण के समय प्रत्याशित सिग्नल की शक्ति के आधार पर 1 से 6 मिनट के लिए भिन्न हो सकते हैं.
- छवि प्राप्त करने के बाद, नमक के साथ जेल से धो और बाँझ धुंध और कपास applicators साथ periarterial अंतरिक्ष थपका.
- Vicryl सिवनी और प्रधान त्वचा के साथ घाव को बंद करें.
- पशु स्वस्थ और अपने पिंजरे में वापस. बाद में टी पर दोहराएँ इमेजिंगIME अंक स्टेंट-immobilized विज्ञापन वैक्टर द्वारा लाया धमनी अभिव्यक्ति के समय पाठ्यक्रम का अध्ययन करना.
- वैकल्पिक रूप से, luciferin के एक प्रणालीगत प्रशासन निम्नलिखित इमेजिंग प्रदर्शन करते हैं. Anesthetize और 9.1-9.2 के अनुसार पशु प्रस्तुत करने का. सर्जिकल टेप के साथ एक 24 जी कैथेटर और सुरक्षित कैथेटर के साथ पूंछ नस कैथीटेराइज़.
- पीबीएस में luciferin के समाधान (50 मिलीग्राम / एमएल) तैयार करें और एक 10 सेकंड के अंतराल पर कैथेटर के माध्यम से समाधान के 1 मिलीलीटर इंजेक्षन. इंजेक्शन के बाद एक मिनट 9.7-9.8 प्रति के रूप में छवि अधिग्रहण शुरू. नोट: एक तेजी से इंजेक्शन की दर (<10 सेकंड) जब्ती गतिविधि और सांस की गिरफ्तारी उत्तेजित कर सकते हैं. दौरे या सांस की गिरफ्तारी इमेजिंग के दौरान हो अगर पशु euthanized किया जाना चाहिए.
- कदम 9.10 पालन करें.
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Representative Results
वेक्टर रिलीज प्रयोगों
ऐसे ENDOVASCULAR स्टंट्स के रूप में हस्तक्षेप उपकरणों सहित प्रत्यारोपण की सतह, को adenoviral वैक्टर tethering, आंशिक रूप से वैक्टर 'भौतिक लक्ष्यों के अभाव obviating, रोग साइट के लिए वेक्टर अनुमान लगाती है. हालांकि, लक्ष्य ऊतक के पारगमन के माध्यम से उपचारात्मक प्रभाव को प्राप्त करने में सक्षम हो, वेक्टर सतह (चित्रा 2) से जारी किया जाना चाहिए. hydrolysable पार Linkers का उपयोग पार linker की hydrolysis द्वारा मध्यस्थता 1 वैक्टर के प्रभावी लगाव संशोधित polybisphosphonate के लिए), thiol से स्थापित धातु प्रत्यारोपण और 2) निरंतर जारी अनुमति देने के लिए धारणा थी.
derivatization प्रक्रिया के अंत तक जाल डिस्क के साथ जुड़े विज्ञापन EGFP वेक्टर के जीनोमिक प्रतियों की संख्या EGFP विशिष्ट प्राइमरों (चित्रा 3) के साथ वायरल डीएनए की पीसीआर द्वारा निर्धारित किया जाता है. पर निर्भर करता हैविशिष्ट पार linker बाध्य विज्ञापन वेक्टर की राशि / जाल 9 10 9 10 एक्स 3.5 के बीच और 5.7 एक्स कणों भिन्न चाहिए, इस्तेमाल किया. इस राशि को एक monolayer व्यवस्था में 100 एनएम विज्ञापन कणों को समायोजित करने के लिए 0.25 सेमी 2 के कुल क्षेत्र के साथ एक एकल जाल डिस्क की अनुमानित अधिकतम क्षमता (2.5 x 10 9) के साथ निष्पक्ष पत्राचार में है. पार linker संशोधन के कदम पर विज्ञापन वेक्टर की शुरुआती राशि 5 एक्स 10 11 कणों, संशोधित वेक्टर का ही ~ 1% अंततः PABT पर स्थिर है चूंकि / पी पीडीटी स्टेनलेस स्टील सतह -derivatized.
दोनों में श्रृंखला एस्टर hydrolysis की दर और वेक्टर और biomaterial के बीच लिंक की संख्या सतह से विज्ञापन वेक्टर रिहाई के समग्र कैनेटीक्स को प्रभावित करने की उम्मीद कर रहे हैं.
पूर्व पार linker modifica लिए; रिहाई प्रयोगों की सुविधा, adenoviral कणों Cy3 फ्लोरोफोरे (खंड 1 प्रोटोकॉल) के साथ पूर्व लेबल किया जा सकता हैtion और सतह स्थिरीकरण (प्रोटोकॉल, धारा 3). सतह से जुड़े प्रतिदीप्ति की कमी fluorometry (चित्रा -4 ए) और प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी (चित्रा 4 बी) द्वारा समवर्ती मूल्यांकन कर समय के साथ तो शारीरिक बफर में वेक्टर रिहाई की निगरानी के लिए एक अप्रत्यक्ष विधि के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है. RHC और आईएचसी लिंकेज के माध्यम से जुड़ी विज्ञापन वैक्टर उनके SHC- और एनएचसी संलग्न समकक्षों के साथ तुलना में काफी तेजी से रिहाई का प्रदर्शन करना चाहिए. दिए गए उदाहरण में, एक 45% और सतह से जुड़े वेक्टर के एक 39% नुकसान सुबह 30 से RHC और आईएचसी सीमित वेक्टर के साथ मनाया गया, क्रमशः, सीमित वेक्टर के कम से कम 20% मनाया गया, जबकि SHC और एनएचसी में जारी किया जाएगा -immobilized नमूने (चित्रा -4 ए).
साथ ही, विज्ञापन वैक्टर इस प्रकार शायद होनी चाहिए वेक्टर और धातु सब्सट्रेट के बीच tethers की संख्या भिन्न होने के विभिन्न उसी कोर्ट की सांद्रता और उपयोग करके स्थिरवेक्टर रिहाई के भिन्न कैनेटीक्स. दरअसल, 0.1 मिमी RHC का उपयोग वेक्टर संशोधन 0.5 मिमी RHC (चित्रा -4 ए) के साथ स्थिर वेक्टर के लिए मनाया की तुलना में काफी तेजी से रिलीज दरों में हुई. प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी डेटा (चित्रा 4 बी) IHC-, RHC- और विशेष रूप से कम एकाग्रता RHC सीमित वैक्टर का उपयोग कर तैयार की जाली नमूनों के साथ सतह से जुड़े प्रतिदीप्ति की एक तेजी से और अधिक गहरा कमी का प्रदर्शन, fluorometry आधारित मात्रात्मक वेक्टर रिहाई विश्लेषण के साथ अच्छी तरह से संबद्ध उनके NHC- और SHC सीमित समकक्षों के साथ तुलना में.
मेष स्थिर विज्ञापन वैक्टर के साथ इन विट्रो पारगमन में
दोनों मात्रात्मक अभिव्यक्ति विश्लेषण (fluorometry) और स्थानिक टिप्पणियों (प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी) के साथ संगत किया जा रहा करके, विज्ञापन EGFP एसएमसी और endothelial में पारगमन नजर रखने के लिए वरीय संवाददाता वेक्टर हैसेल संस्कृतियों मुक्त और जाल स्थिर विज्ञापन वैक्टर दोनों के साथ इलाज किया. रासायनिक RHC (चित्रा 5) के साथ विज्ञापन कैप्सिड के संशोधन के साथ ही साथ 75 माइक्रोन से अधिक सांद्रता में अन्य पार Linkers () नहीं दिखाया काफी विट्रो में, सबसे शायद कारण फाइबर घुंडी की मास्किंग और reconfiguring को गैर स्थिर वेक्टर के पारगमन प्रभावशीलता impairs डोमेन Coxsackie-Adenovirus रिसेप्टर्स (सीएआर) के माध्यम से कोशिकाओं को बाध्य करने के लिए विज्ञापन द्वारा उपयोग किया. वेक्टर सब्सट्रेट करने के लिए tethering द्वारा लक्षित कोशिकाओं के आसपास के क्षेत्र में बनाए रखा है के बाद से हालांकि, घुंडी कार बातचीत की भूमिका सब्सट्रेट स्थिर वेक्टर साथ पारगमन के लिए कम महत्वपूर्ण है. परवाह किए बिना कोर्ट प्रकार के सेल संस्कृति प्रयोगों में, जाल से जुड़े विज्ञापन वैक्टर स्थानिक जाल सीमाओं (आंकड़े 6A और 6C) से 300-500 मीटर के भीतर स्थित कोशिकाओं को पारगमन की घटनाओं सीमित की लगातार सक्षम हैं. Transgen के आम तौर पर शिखर स्तरई अभिव्यक्ति एसएमसी में meshes (आंकड़े 6A और 6B) या BAEC (आंकड़े 6C और 6D) संस्कृतियों -loaded विज्ञापन EGFP की नियुक्ति के बाद 3-5 दिन प्राप्त कर रहे हैं. एक ही वेक्टर लोड पर, शिखर EGFP अभिव्यक्ति के स्तर निम्न क्रम में वृद्धि: NHC-, SHC-, IHC- और RHC सीमित वेक्टर, उनके संबंधित रिलीज कैनेटीक्स प्रोफाइल में मतभेद को दर्शाती है (चित्रा 4). इसके अलावा, अधिक टिकाऊ transgene अभिव्यक्ति RHC तैयार समकक्षों (चित्रा 6D) के साथ इलाज किया कोशिकाओं की तुलना में आईएचसी तैयार meshes के साथ इलाज किया कोशिकाओं में मनाया जाता है.
उपयोग सेल संस्कृति प्रणाली में देरी पारगमन की घटनाओं की जांच के लिए एक सुविधाजनक सेट अप में या बाद में 48 से अधिक घंटे की जाली नियुक्ति के बाद धातु की सतह से जारी वेक्टर कणों द्वारा लाया प्रस्तुत करता है. इस आवेदन में, fluoromet द्वारा EGFP अभिव्यक्ति का निर्धारण करने के बादRY और प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी पारगमन के प्रारंभ होने के बाद 48 घंटे में, BAEC trypsinized रहे हैं और meshes परेशान बिना कुओं से बाहर aspirated. हौसले गैर transduced BAEC तो आंशिक रूप से जारी meshes के ऊपर फिर से चढ़ाया जाता है passaged. 2 दिन का समय बिंदु के बाद जाल वाहक से जारी वायरस कणों की वजह से "नया" पारगमन की घटनाओं फिर प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी और fluorometry से मूल्यांकन कर रहे हैं (आंकड़े 7A और 7 बी). एक जाल स्थान के लिए विशेषता स्थानिक प्रतिबंध का प्रदर्शन मजबूत EGFP अभिव्यक्ति आमतौर पर सेल संस्कृति के माध्यम से पूरा करने के लिए भी 48 घंटे प्रदर्शन के बाद जाल बाध्य विज्ञापन वैक्टर की एक अच्छी तरह से संरक्षित पारगमन क्षमता की पुष्टि, इन "नया" संस्कृतियों में (चित्रा 7) मनाया जाता है 37 डिग्री सेल्सियस पर.
Vivo अध्ययन में
यू से संबंधित संभावित प्रभाव की जांच करने के लिएधमनी पारगमन, विज्ञापन ल्यूक RHC-, IHC-, SHC- और साथ तैयार स्टंट्स -eluting साथ प्रत्यारोपित जानवरों पर अलग कोर्ट के एसई एनएचसी संशोधित वेक्टर 1 और 8 दिन स्टेंट तैनाती (8 चित्रा) के बाद bioluminescent इमेजिंग कराना पड़ा. इमेजिंग luciferin के स्थानीय परिवाहकीय प्रशासन के बाद बाहर किया गया था (2 मिलीग्राम) Pluronic जेल के साथ सह तैयार की. इस निर्माण बर्फ पर ठंडा जब एक चिपचिपा तरल पदार्थ है, लेकिन 37 डिग्री सेल्सियस पर ऊतक के संपर्क में लाया जब जेल को तत्काल चरण संक्रमण आए. प्रारंभिक प्रयोगों () नहीं दिखाया प्रणालीगत (intraperitoneal या नसों) luciferin प्रशासन की तुलना में जब विज्ञापन ल्यूक में अधिक स्थिर और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य luminescence संकेतों में luciferin परिणामों की परिवाहकीय वितरण संवहनी ऊतक -transduced कि प्रदर्शन किया.
स्टेंट और स्टेंट तैनाती सर्जरी करने के लिए वायरस tethering तकनीकी ध्वनि थे, एक अच्छी तरह से परिभाषित संकेत के stented खंड के लिए इसीचूहे मन्या धमनी उत्सर्जित और दर्ज की गई है. स्टेंट आरोपण के बाद एक दिन, RHC तैयार विज्ञापन ल्यूक स्टंट्स के साथ इलाज जानवरों आम तौर पर IHC- और SHC- प्राप्त चूहों द्वारा पीछा उच्चतम luminescence संकेत, स्टंट्स तैयार (आंकड़े 8A और 8B) दिखा रहे हैं. कोई प्रत्यक्ष संकेत स्टंट्स के साथ प्रत्यारोपित चूहों के समूह में मनाया जाता है संवहनी ऊतक के प्रभावी पारगमन के लिए स्टेंट से बेरोक वेक्टर रिहाई के महत्व को रेखांकित, एनएचसी सीमित विज्ञापन ल्यूक का उपयोग कर तैयार (आंकड़े 8A और 8B). यह 1.4 और क्रमशः IHC- और SHC तैयार स्टंट्स, साथ 1.8 गुना (आंकड़े 8A और 8B) बढ़ जाती है, जबकि सुबह 8 से, RHC तैयार स्टंट्स के साथ luciferase अभिव्यक्ति की औसत तीव्रता, कई गुना बूँदें. यह निष्कर्ष एक धीमी परिजनों का प्रदर्शन जीन eluting स्टेंट के साथ अधिक टिकाऊ संवहनी पारगमन की परिकल्पना के अनुरूप हैस्टेंट सतह से वेक्टर रिहाई की etics.
वर्णित पढ़ाई भर में इस्तेमाल पार Linkers (एनएचसी, SHC, आईएचसी और RHC) की 1 स्ट्रक्चरल फार्मूले आंकड़ा (अनुमति 28 के साथ संशोधित).
चित्रा 2 एक PABT लिए विज्ञापन वेक्टर tethering का प्रतिनिधित्व एक योजना / पी पीडीटी एक कोर्ट और पार linker हाइड्रोलिसिस पर वेक्टर के बाद रिहाई के माध्यम से स्टेनलेस स्टील की सतह -modified (अनुमति 28 के साथ संशोधित).
चित्रा 3 पीसीआर आधारित क्वांटPABT / पी पीडीटी की सतह पर पार linker tethering के माध्यम से स्थिर विज्ञापन EGFP की ification स्टेनलेस स्टील meshes -modified. स्टेनलेस स्टील meshes हर हालत के लिए RHC, आईएचसी, SHC, या एनएचसी (एन = 3 के माध्यम से स्थिर विज्ञापन EGFP के साथ तैयार किया गया ). Proteinase कश्मीर उपचार के बाद, वायरल डीएनए eluted और MinElute कॉलम का उपयोग कर शुद्ध किया गया. EGFP विशिष्ट प्राइमरों का उपयोग वायरल डीएनए के प्रवर्धन एक 7500 वास्तविक समय पीसीआर इंजन में बाहर किया गया था और Sybr ग्रीन के साथ पकड़ा गया था. डाटा सामान्यीकरण गैर स्थिर विज्ञापन EGFP की एक ज्ञात राशि के साथ तैयार एक अंशांकन वक्र के आधार पर किया गया था (अनुमति 28 के साथ संशोधित).
विज्ञापन वेक्टर के 4 चित्र रिलीज कैनेटीक्स कोर्ट के साथ धातु substrates के लिए सीमित. सेंटainless इस्पात meshes PABT से जुड़ी ~ 2 एक्स 10 9 Cy3 लेबल विज्ञापन कणों के साथ derivatized गया / पी पीडीटी 500 माइक्रोन एनएचसी, SHC, आईएचसी, RHC और (RHC एल के रूप में नामित) 100 माइक्रोन RHC साथ संशोधन के बाद सतह -modified. के fluorescently विज्ञापन कणों लेबल रिलीज (ए) ने संकेत समय बिंदुओं पर अध्ययन किया गया 550/570 एनएम और (बी) फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी (rhodamine फिल्टर सेट, मूल बढ़ाई 200X) पर अच्छी तरह से स्कैन fluorometry. ± SEM मतलब, एन = 8-10 रूप Fluorometry परिणाम प्रस्तुत कर रहे हैं; पी <एनएचसी और SHC आईएचसी, RHC बनाम और RHC एल समूहों के बीच सभी की तुलना के लिए 0,001 (अनुमति 28 से संशोधित) एक के बाद हॉक Tukey परीक्षण के साथ Anova द्वारा निर्धारित किया गया है.
गैर स्थिर विज्ञापन ई की चित्रा 5 पारगमन प्रभावशीलतासंकेत के रूप में RHC साथ संशोधन निम्नलिखित GFP. भ्रूण महाधमनी व्युत्पन्न एसएमसी (A10 लाइन) चूहा असंशोधित विज्ञापन EGFP या RHC साथ संशोधित वेक्टर या तो साथ 1,000 के एक MOI में transduced थे. एक संवाददाता अभिव्यक्ति fluorometrically निर्धारित (485/535 एनएम) 48 घंटा पारगमन के बाद (अनुमति 27 से संशोधित) था.
स्टेनलेस स्टील के लिए स्थिर विज्ञापन वेक्टर साथ सुसंस्कृत एसएमसी और BAEC की चित्रा 6 पारगमन कोर्ट साथ meshes. Meshes एनएचसी, SHC, आईएचसी, और RHC के माध्यम से संलग्न ~ 2 एक्स 10 9 विज्ञापन EGFP कणों के साथ derivatized गया. Meshes तो व्यक्तिगत रूप से उप मिला हुआ A10 (ए, बी) और BAEC (सी, डी) monolayers के शीर्ष पर रखा गया. विज्ञापन वेक्टर सीमित meshes के साथ इलाज किया कोशिकाओं के पारगमन (EGFP अभिव्यक्ति के स्तर के रूप में व्यक्त) च द्वारा मूल्यांकन किया गया थाluorescence माइक्रोस्कोपी (ए, सी, FITC फिल्टर सेट, मूल बढ़ाई 100x) और अच्छी तरह से स्कैन fluorometry (बी, डी). Fluorometry परिणाम, ± SEM मतलब के रूप में प्रस्तुत कर रहे हैं N = 4 (अनुमति 28 के साथ संशोधित). इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.
देरी समय बिंदुओं पर सब्सट्रेट स्थिर विज्ञापन वैक्टर 7 चित्रा पारगमन क्षमता. विज्ञापन EGFP स्टील पर स्थिर था एनएचसी, SHC, आईएचसी या RHC tethers के माध्यम से meshes. meshes subconfluent BAEC monolayers पर रखा गया था. दो दिन नियुक्ति के बाद, BAEC trypsinized थे और meshes परेशान बिना हटा दिया. नई, गैर transduced BAEC तो meshes के ऊपर वरीयता प्राप्त थे. विज्ञापन(; FITC फिल्टर सेट, मूल बढ़ाई 100X ए) और fluorometry (बी) EGFP पारगमन योग्यता फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी का उपयोग EGFP अभिव्यक्ति द्वारा मापा गया था. माप संकेत दिनों में ले जाया गया, प्रतिनिधि छवियों का उपयोग किया गया और fluorometry परिणाम ± SEM के साधन हैं, एन = (अनुमति 28 के साथ से संशोधित) 4. यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.
विवो. विज्ञापन ल्यूक (1.3 x 10 10 कण) में स्टेंट-immobilized विज्ञापन ल्यूक के 8 चित्रा पारगमन क्षमता एनएचसी, SHC, आईएचसी या RHC (सभी समूहों के लिए एन = 3-4) के माध्यम से ENDOVASCULAR स्टंट्स के लिए सीमित था. विज्ञापन ल्यूक के पारगमन क्षमता <स्टंट्स से eluted / उप> bioluminescence इमेजिंग (IVIS स्पेक्ट्रम) 1 और 8 दिनों के बाद स्टेंट तैनाती (ए) द्वारा मापा गया था, और (अनुमति 28 के साथ से संशोधित) एक लघुगणकीय पैमाने (बी). का उपयोग कर साजिश रची एक बड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें इस आंकड़े का संस्करण.
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Discussion
प्रस्तुत प्रोटोकॉल स्टेनलेस स्टील सतहों coatless को adenoviral वैक्टर प्रतिवर्ती लगाव के माध्यम से हासिल की सब्सट्रेट मध्यस्थता जीन डिलीवरी के लिए एक संचालन विधि का वर्णन है. नाड़ी restenosis की स्टेंट आधारित जीन थेरेपी के विशिष्ट प्रयोजन के लिए विकसित करते हैं, इस तकनीक biomaterials, जैव चिकित्सा प्रत्यारोपण और जीन थेरेपी के क्षेत्र में बहुत व्यापक आवेदन किया है.
प्रस्तुत पढ़ाई केवल एक प्रोटोटाइप धातु सब्सट्रेट के रूप में स्टेनलेस स्टील का उपयोग किया है, PABT ऐसे तुलनीय आत्मीयता के साथ कोबाल्ट / क्रोमियम और Nitinol के रूप में अन्य धातु मिश्र बांध (प्रकाशित नहीं). धातुओं के साथ PABT की indiscriminant बातचीत काफी इस तकनीक 31 के लिए संभावित जैव चिकित्सा अनुप्रयोगों की संख्या बढ़ती है. इसके अलावा, कोर्ट सीमित जीन वैक्टर का उपयोग, सामग्री की सतह पर thiol अधिष्ठापन के अन्य तरीकों की आवश्यकता होती है, यद्यपि biomaterials के अन्य प्रकार के साथ संभव है.
विज्ञापन जीन वैक्टर कई मानव कोशिका प्रकार और ऊतकों में मजबूत पारगमन प्राप्त जबकि ontent ">, उनके नैदानिक महत्व Adenoviridae 4 से हासिल मजबूत भड़काऊ और प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया द्वारा सीमित है. इसके लिए तैयार जीन eluting स्टेंट के साथ (4 महीने) धमनी अभिव्यक्ति लंबे समय तक luciferase व्यक्त एडिनो जुड़े वायरल वैक्टर का उपयोग कर कोर्ट संशोधन हाल ही में प्रकाशित (नहीं) दिखाया गया था.कार्यप्रणाली मजबूत है. मुख्य प्रोटोकॉल से छोटे विचलन आम तौर पर इन विट्रो में और vivo में जीन अभिव्यक्ति का महत्वपूर्ण परिवर्तन का कारण नहीं है. फिर भी, परिणामों को प्रभावित कर सकता है कि कई महत्वपूर्ण मुद्दों की पहचान की गई.
नाम का सुझाव के रूप में पहले, hydrolysable पार Linkers कारण में श्रृंखला एस्टर की hydrolysis के लिए पानी के साथ प्रतिक्रिया पर cleavable हैं. इसके अलावा, amine प्रतिक्रियाशील आधा भाग, एन -sulfosuccinimidyl के रूप में अच्छी तरह से hydrolysable है. क्रॉस Linkers यू संग्रहित किया जाना चाहिएnder -20 डिग्री सेल्सियस पर एक आर्गन वातावरण उनकी गतिविधि को बनाए रखने के लिए. एक ही कारण के लिए, कोर्ट (प्रोटोकॉल खंड 3.2) के समाधान की तैयारी के बाद वायरस preps को कोर्ट के समाधान के अलावा के साथ तुरंत आगे बढ़ना.
दूसरा, प्रस्तुत bioconjugation अनुक्रम के कई मध्यवर्ती चरणों के दौरान धातु की सतह पर गठन कर रहे हैं कि thiol समूहों तेजी परिवेशी वायु ऑक्सीजन से ऑक्सीकरण हो जाता है. इसे रोकने के लिए, हर समय degassed पानी में डूबे हुए कमजोर धातु नमूने रहते हैं.
तीसरा, अच्छी तरह से नीचे के साथ जाल का एक सही संरेखण सफल पारगमन के लिए आवश्यक है. से निपटने के दौरान जाल डिस्क मोड़ नहीं है.
चौथा, सतह से जुड़े विज्ञापन वैक्टर dislodging को रोकने के लिए स्टेंट सम्मिलन के दौरान Teflon म्यान और पोत दीवार के खिलाफ जीन एल्यूटिंग स्टंट्स के अत्यधिक संपर्क में आए बचें.
प्रत्यारोपण biomateria की सतह के लिए जीन वेक्टर के सहसंयोजक लगावलोकसभा वैक्टर गैर सहसंयोजक tethering साथ वसूली से वेक्टर रिलीज कैनेटीक्स पर बेहतर नियंत्रण के लिए एक स्पष्ट लाभ दिया है. स्टेंट मंच से जीन वितरण की सेटिंग में सबसे अधिक अध्ययन स्टेंट तैनाती 32-34 के बाद 1-7 दिनों के भीतर वायरल और गैर वायरल वैक्टर का पूरा रिहाई की रिपोर्ट. दूसरी ओर, कोर्ट के माध्यम से विज्ञापन वेक्टर स्थिरीकरण पहले महीने में वेक्टर भार का केवल 20-45% की रिहाई का प्रदर्शन (आंकड़े -4 ए और 4 बी). इसके अलावा, रिहाई और पारगमन कैनेटीक्स का आंशिक मॉडुलन भिन्न हाइड्रोलिसिस कैनेटीक्स का प्रदर्शन विभिन्न कोर्ट के उपयोग के साथ या वायरस सतह संशोधन के लिए कार्यरत कोर्ट की एकाग्रता अलग से प्राप्त है. साथ ही, वर्तमान अध्ययन में पता लगाया नहीं है, हालांकि अलग पार linker अणुओं के साथ वेक्टर के एक समवर्ती सह संशोधन,, ठीक ट्यूनिंग वेक्टर रिहाई और पारगमन के लिए एक और अवसर प्रदान करता है.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 316 stainless steel mesh disks | Electon Microscopy Sciences | E200-SS | |
| Generic 304-grade stainless steel stents | Laserage | custom order | |
| AdeGFP | University of Pennsylvania Vector Core | AD-5-PV0504 | |
| AdLuc | University of Pennsylvania Vector Core | AD-5-PV1028 | |
| AdEMPTY | University of Pennsylvania Vector Core | A858 | |
| Cy3(NHS)2 | GE Healthcare | PA23000 | |
| Sepharose 6B | Sigma-Aldrich | 6B100-500ML | |
| UV 96-well plates | Costar | 3635 | |
| Fluorometry 96-well plates | Costar | 3915 | |
| Cell culture 96-well plates | Falcon | 353072 | |
| Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride (TCEP) | Pierce Thermo Scientific | 20490 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Pierce Thermo Scientific | 20290 | |
| sulfo-LC-SPDP | Pierce Thermo Scientific | 21650 | |
| Spectrophotometer | Molecular Devices | SpectraMax 190 | |
| Spectrofluorometer | Molecular Devices | SpectraMax Gemini EM | |
| Orbital shaker incubator | VWR | 1575R | |
| Horizontal airflow oven | Shel Lab | 1350 FM | |
| Centra-CL2 centrifuge | International Equipment Company | 426 | |
| Digital vortex mixerer | Fisher Thermo Scientific | 02-215-370 | |
| Eclipse TE300 fluorescence microscope | Nikon | TE300 | |
| DC 500 CCD camera | Leica | DC-500 | |
| 7500 Real-Time PCR system | Applied Biosystems | not available | |
| IVIS Spectrum bioluminescence station | Perkins-Elmer | not available | |
| EDTA dipotassium salt | Sigma-Aldrich | ED2P | |
| Bovine serum albumin fraction V (BSA) | Fisher Thermo Scientific | BP1600-100 | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P1379 | |
| Dumont forceps | Fine Science Tools | 11255-20 | |
| A10 cell line | ATCC | CRL-1476 | |
| Bovine aortic endothelial cells | Lonza | BW-6002 | |
| Luciferin, potassium salt | Gold Biotechnology | LUCK-1Ge | |
| Pluronic F-127 | Sigma-Aldrich | P2443-250G | |
| PBS without calcium and magnesium | Gibco | 14190-136 | |
| Fetal bovine serum | Gemini Bio-Products | 100-106 | |
| Penicillin/Streptomycin solution | Gibco | 11540-122 | |
| DMEM, high glucose | Corning cellgro | 10-013-CV | |
| 0.25% Trypsin/EDTA | Gibco | 25200-056 | |
| QIAamp DNA micro kit | Qiagen | 56304 | |
| Power Sybr Green PCR Master Mix | Applied Biosystems | 4367659 | |
| MicroAmp Optical 96-well Reaction Plate | Applied Biosystems | N8010560 | |
| MicroAmp Optical Adhesive Film | Applied Biosystems | 4360954 | |
| Cephazolin | Apotex | not available | |
| Loxicom (Meloxicam) | Norbrook | not available | |
| Heparin sodium | APP Pharmaceuticals | not available | |
| Ketavet (Ketamine) | VEDCO | not available | |
| Anased (Xylazine) | Lloid | not available | |
| Forane (Isoflurane) | Baxter | not available | |
| Curved Moria iris forceps | Fine Science tools | 11370-31 | |
| Curved extra-fine Graefe forceps | Fine Science Tools | 11152-10 | |
| Dumont #5 forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| Vannas spring scissors | Fine Science Tools | 15018-10 | |
| Fine scissors - ToughCut | Fine Science Tools | 14058-09 | |
| Surgical scissors | Fine Science Tools | 14101-14 | |
| Vicryl suture (5-0) | Ethicon | J385 | |
| Suture thread (4/0 silk) | Fine Science Tools | 18020-40 | |
| Michel suture clips | Fine Science Tools | 12040-02 | |
| Wound dilator (Lancaster eye specula) | KLS Martin | 34-149-07 | |
| Hot bead sterilizer | Fine Science Tools | 18000-45 | |
| Michel suture clip applicator | Fine Science Tools | 112028-12 | |
| Insyte Autoguard 24 G IV catheter | Beckton-Dickinson | 381412 | |
| 2F Fogarty catheter | Edwards Lifesciences | 120602F | |
| Teflon tubing | Vention | 041100BST | |
| PTA catheter | NuMed | custom order | |
| Gauze pads | Kendall Healthcare | 9024 | |
| Cotton applicators | Solon Manufacturing | WOD1003 | |
| Saline | Baxter | 281321 | |
| 10 ml syringe (Luer-Lok) | Beckton-Dickinson | 309604 | |
| 1 ml syringe (Luer-Lok) | Beckton-Dickinson | 309628 | |
| Clippers with #40 blade | Oster | 78005-314 | |
| Transpore surgical tape | 3M | MM 15271 | |
| Puralube vet ointment | Pharmaderm | not available |
References
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