Abstract
In-stent restenosi presenta una complicazione maggiore di procedure di rivascolarizzazione basato stent-ampiamente utilizzati per ristabilire il flusso di sangue attraverso segmenti criticamente socchiusi delle arterie coronariche e periferiche. Stent endovascolari capaci di rilascio regolabile di geni con attività anti-restenotico può presentare una strategia alternativa di utilizzare attualmente stent a rilascio di farmaco. Per raggiungere traduzione clinica, gli stent a eluizione di geni devono presentare cinetica prevedibili del gene vettore di rilascio dello stent-immobilizzato e site-specific trasduzione dei vasi, evitando una eccessiva risposta infiammatoria tipicamente associati con i rivestimenti polimerici utilizzati per intrappolamento fisico del vettore. Questo documento descrive una metodologia dettagliata per il tethering senza cappotto di vettori genici adenovirali di stent sulla base di un legame reversibile delle particelle adenovirali per polyallylamine bifosfonati (PABT) -Modified superficie in acciaio inox con idrolizzabili reticolanti (HC). Una famiglia dibifunzionale HC (ammina e nonil fenolo tiolo-reattiva), con una t media mezzo di idrolisi in-catena compresa tra 5 e 50 giorni sono stati usati per collegare il vettore con lo stent. La procedura vettore immobilizzazione viene tipicamente effettuata entro 9 ore e comprende diverse fasi: 1) incubazione dei campioni di metallo in una soluzione acquosa di PABT (4 ore); 2) deprotezione dei gruppi tiolici installati in PABT con tris (2-carbossietil) fosfina (20 min); 3) l'espansione del tiolo capacità reattiva della superficie metallica facendo reagire i campioni con polietileneimmina derivatizzati con pyridyldithio (PDT) gruppi (2 ore); 4) la conversione di gruppi di PDT per tioli con ditiotreitolo (10 min); 5) modifiche di adenovirus con HC (1 ora); 6) la purificazione di particelle adenovirali modificate per dimensione-esclusione cromatografia su colonna (15 min) e 7) immobilizzazione di particelle adenovirali tiolo reattivo sulla superficie di acciaio tiolati (1 ora). Questa tecnica ha ampia applicabilità potenziale oltre stent,facilitando ingegneria delle superfici di dispositivi bioprotesi per migliorare la loro biocompatibilità attraverso la consegna del gene substrato mediata alle cellule di interfacciamento del materiale estraneo impiantato.
Introduction
L'efficacia della terapia genica come modalità terapeutica è ostacolata dalla capacità di targeting poveri di vettori di terapia genica 1,2. La mancanza di risultati di targeting propri in livelli sub-terapeutici di espressione del transgene nella posizione di destinazione e porta a una vasta diffusione dei vettori di organi non bersaglio 3, comprese quelle responsabili per il montaggio risposte immunitarie contro sia il vettore e codificati prodotto terapeutico 4, 5. Un potenziale significa compensare la promiscuità di trasduzione e di promuovere il targeting è quello di introdurre vettori genetici nella posizione desiderata in una forma che impedisce la loro libera diffusione attraverso il sangue e la linfa. Tipicamente, tali sforzi si basano su un sistema di consegna locale iniettabili comprendenti sia di vettori virali o non virali mescolati con fibrina, collagene o acido ialuronico matrici di idrogel 6-10 che sono in grado di transitoriamente sostengono vettori genetici nel sito di iniezione intrappolando fisicamente them in una rete polimerica.
Un altro paradigma generalmente accettato per la terapia genica localizzata utilizza immobilizzazione di vettori genetici sulla superficie dei dispositivi protesici impiantati 11,12. Impianti medici permanenti (endovascolari, bronchiali, stent urologici e gastrointestinali, pacemaker, articolazioni artificiali, maglie chirurgici e ginecologici, ecc.) Sono utilizzati ogni anno in decine di milioni di pazienti 13. Mentre generalmente efficace, questi dispositivi sono inclini a complicazioni che non sono adeguatamente controllati dalla pratiche mediche attuali 14-17. Dispositivi protesici impiantabili presentano un'opportunità unica per fungere da piattaforme di proxy per il trattamento localizzato la terapia genica. Dal punto di vista farmacocinetico, la superficie derivatizzazione di protesi mediche con dosi relativamente basse di ingresso di vettori genici risultati nel raggiungimento sia alte concentrazioni locali di vettori genetici sulla interfaccia impianto / tessuto e rallentare la cinetica di their eliminazione da questa posizione. Come conseguenza di residenza protratto e migliorato assorbimento da parte della popolazione di cellule bersaglio, vettore immobilizzazione minimizza propagazione del vettore gene. Così l'inoculazione involontaria di tessuti non bersaglio è ridotta.
Tethering superficie di vettori genici sui biomateriali impiantabili (anche definito come substrato mediata consegna del gene o la consegna del gene fase solida) è stato implementato in colture di cellule animali e gli esperimenti utilizzando sia specifica (antigene-anticorpo 18-20, avidina-biotina 21,22) e 23-26 (a pagamento, di van der Waals) interazioni non-specifiche. L'attacco covalente di vettori per la superficie del dispositivo impiantato è stata precedentemente considerata non funzionale fin troppo forti legami con la superficie precludono vettore internalizzazione dalle cellule bersaglio. Recentemente è stato dimostrato che questa limitazione può essere superata mediante l'uso di spontaneamente idrolizzabile reticolante usato come tetlei tra la superficie metallica modificata dello stent e del capside proteine del vettore adenovirale 27,28. Inoltre, il tasso di rilascio vettoriale e decorso di espressione del transgene in vitro e in vivo possono essere modulati con l'uso di idrolizzabili reticolanti espongono diverse cinetiche di idrolisi 28.
Il presente lavoro fornisce un protocollo dettagliato per il legame covalente reversibile di vettori adenovirali per superficie metallica attivato e introduce un setup sperimentale utile per lo studio successivi eventi di trasduzione in vitro nel muscolo liscio colto e cellule endoteliali e in vivo nel modello di ratto di stent carotideo angioplastica .
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Protocol
1 Preparazione di Cy3-marcato Adenovirus per gli esperimenti di rilascio
- Sospendere 2 x 10 12 particelle di annuncio vuoto (circa 2 x 10 11 unità infettivi) in 650 ml di tampone carbonato / bicarbonato (CBB; pH 9.3).
- Sciogliere il contenuto di 1 fiala (0,2 mg) di colorante fluorescente ammina-reattiva (Cy3 (NHS) 2) in 1 ml CBB ad una concentrazione finale di 0,2 mg / ml.
- Aggiungere 100 ml di soluzione colorante di sospensione di virus, vortex per 5 secondi e incubare per 1 ora a 28 ° C con agitazione (100-200 giri al minuto).
- Equilibrare un ml Sepharose 6B colonna 20 con PBS. Aggiungere 750 ml di Cy3-marcato sospensione annuncio goccia a goccia al centro del letto di gel.
- Dopo la sospensione virale permea la resina, aggiungere 5 ml di PBS. Scartare l'eluato.
- Aggiungere 0,5 ml di PBS e raccogliere l'eluato in un contenitore di vetro con etichetta. Ripetere questo passaggio 10x raccogliendo un totale di dieci 0,5 ml frazioni.
- Assay the raccolte frazioni mediante spettrofotometria (260 e 280 nm) per contenuto di DNA virale.
- Comune le frazioni contenenti più del 10% del totale (somma di F1 a F10) densità ottica (OD) a 260 nm. Nota: in genere le frazioni F3, F4, F5, F6 e sono raggruppati e mescolati.
- Re-test frazioni aggregati misti di spettrofotometria (260 e 280 nm) e test di fluorometria (ex 550 / em 570 nm) per il contenuto di DNA virale e Cy3 etichettati proteina del capside, rispettivamente. Nota: Una curva di calibrazione Cy3 (NHS) 2 che copre la gamma 10 -9 -10 -13 mol / L è preparato e fluorimetrically saggiati sulla stessa piastra come le frazioni pool.
- Calcolare il rendimento virus etichettati e densità di etichettatura. Si supponga che le particelle di 1.19 x 10 12 virus / ml corrisponde a 1 unità per OD da 1 cm di lunghezza percorso 29. Utilizzare la formula: Yield = [(OD 260 nm /1.19)*10 12 * quantità V / ingresso annuncio] * 100, dove, OD 260nm è il de otticansity della formulazione pool a 260 nm e V è il volume della formulazione pooled (ml) per calcolare la resa di recupero annuncio (%). Utilizzare la formula: Etichettatura Densità = C * 6,02 * 10 23 / (OD 260 nm /1.19)*10 12, dove C è la concentrazione Cy3 della formulazione pooled (moli / ml) e OD 260 nm è la densità ottica della formulazione pool a 260 nm per calcolare la densità media di etichettatura Cy3. NOTA: Un tipico recupero di virus marcato è> 70% della dose di ingresso. La densità di etichettatura è 600-800 molecole di fluoroforo per particella virus singola.
- Ad vuoto in porzioni più piccole (in genere 5 x 10 11 particelle) adatti per gli esperimenti di rilascio singoli Aliquota Cy3-etichettati. NOTA: il protocollo corrente specifica l'uso di Ad Cy3 marcato esclusivamente nell'esperimento rilascio. Tutti gli studi di trasduzione sono effettuate con vettori non etichettati.
2 Attivazione di campioni di metallo
- Lavare le s inossidabiliteel maglia dischi o stent in acciaio inox consecutivamente in isopropanolo (5 min x 2) e cloroformio (5 min x 2) a 55 ° C con agitazione (100 rpm). Togliere il solvente.
- Riscaldare i campioni per 30 minuti a 200 ° C.
- Sciogliere polyallylamine bisfosfonato con installati gruppi tiolici latenti (PABT 27,28,30) in acqua (1-2% w / v) a 72 ° C con agitazione (100 rpm). Regolare il pH a 4,5-5 con KHCO 3.
- Incubare i campioni di metallo nella soluzione PABT per 2-4 ore a 72 ° C con agitazione (100-200 giri al minuto). NOTA: La procedura può essere messo in pausa in questo punto. I campioni sono stabili per 3 giorni a 4 ° C.
- Sciacquare i campioni tre volte con acqua distillata doppio (DDW).
- Esporre i campioni di tris (2-carbossietil) fosfina (TCEP; 15 mg / ml in 0,1 M tampone acetico) per 15 minuti a 28 ° C con agitazione (100-200 giri al minuto).
- Sciacquare 5x in degassato DDW.
- Esporre i campioni al 2% polietileneimmina con gruppi pyridyldithio installati (PEI
- Sciacquare i campioni per tre volte con DDW.
- Esporre i campioni a 10 mg / ml ditiotreitolo / DDW per convertire gruppi pyridyldithio di tioli.
- Sciacquare nuovamente 5x in degassato DDW.
3. Adenovirus Attivazione e Metal Immobilizzazione superficie
- Sospendere 5 x 10 11 particelle di entrambi annuncio eGFP o Ad Luc (circa 5 x 10 10 unità infettivi) in 487,5-495 ml di tampone carbonato / bicarbonato (CBB; pH 9.3). Nota: Per gli studi di rilascio, utilizzare 5 x 10 11 di Cy3 etichettato particelle vuote annuncio (regolare il volume a 487,5-495 microlitri con CBB).
- Sciogliere HC con diversi tassi di idrolisi 28 [(rapidamente (t 1/2 = 5 d), intermedia (t 1 /2 = 12 d) e lentamente (t 1/2 = 50 d) HC, cioè RHC, IHC o SHC; Figura 1] o non idrolizzabili cross-linker (NHC), solfo-LC-SPDP in CBB a 20 mm.
- Aggiungere immediatamente 5-12,5 ml di soluzione cross-linker per la sospensione di virus per un volume totale di 500 ml (200-500 micron concentrazione finale di cross-linker), vortex e incubare per 1 ora a 28 ° C con agitazione (100- 200 rpm).
- Equilibrare un ml Sepharose 6B colonna 20 con degasato 5 mM EDTA / PBS (EPBS). Aggiungere goccia a goccia 500 ml di sospensione Ad-reticolante modificato al centro della resina.
- Aggiungere 5 ml di degassato EPBS. Scartare l'eluato.
- Aggiungere 0,5 ml di degassato EPBS e raccogliere l'eluato in un contenitore di vetro con etichetta. Ripetere questa operazione 10 volte raccogliendo un totale di dieci frazioni da 0,5 ml.
- Determinare OD delle frazioni raccolte mediante spettrofotometria a 260 e 280 nm e convertire OD di titoli virus (1.19 x 10 12 / ml corrisponde a 1 OD) 29.
- Comune le frazioni contenenti> 10% del virus eluito (Nota: in genere, le frazioni F3-F6). Ripetere l'analisi titolo spettrofotometrico per la sospensione pool.
- Trasferire la sospensione virale per il flaconcino con i campioni di metallo attivati (come da 2.11). Incubare in atmosfera di argon per 1 ora a 28 ° C con agitazione (100-200 giri al minuto). Nota: I campioni di metallo Ad-tethered ottenuti in questa fase sono ulteriormente utilizzati negli esperimenti di rilascio e di trasduzione successivi descritti nelle sezioni 5-7 del protocollo.
4.-Quantificazione di superficie associata annuncio Vector mediante PCR
- Preparare maglie formulati con superficie immobilizzato annuncio eGFP legato con NHC, SHC, IHC e RHC (n = 3 per ogni tipo), come descritto nelle sezioni 2 e 3.
- Utilizzare un kit QIAamp Micro DNA per isolare il DNA virale. Posizionare le maglie singolarmente in tubi di plastica da 1,5 ml contenente 200 ml di miscela composta da 180 ml di ATL bUffer e 20 ml di proteinasi K (sia dal kit). Aggiungi quantità nota di particelle Ad eGFP (come standard per la curva di calibrazione) nelle provette separate contenenti la stessa miscela. Incubare a 56 ° C per una notte senza agitare.
- Aggiungere 200 ml di tampone AL (dal kit), mescolare nel vortex, aggiungere 200 ml di etanolo al 100%, e incubare a temperatura ambiente per 5 min.
- Trasferire la miscela da ciascuna provetta su una singola colonna MinElite (dal kit) e far girare a 8000 rpm per 1 min. Sciacquare i tubi-maglia contenente 180 ml di tampone ALT fresco, aggiungere sulle rispettive colonne e centrifuga a 8000 rpm per 1 min. Scartare gli eluati.
- Aggiungere 500 ml di tampone AW1 (dal kit) nelle colonne e far girare a 8000 rpm per 1 min. Scartare gli eluati.
- Aggiungere 500 ml di tampone AW2 (dal kit) nelle colonne e far girare a 8000 rpm per 1 min.
- Scartare gli eluati.
- Spin a 14.000 rpm per un ulteriore 3 min until le colonne sono completamente asciutti. Scartare gli eluati.
- Aggiungere 50 ml di acqua MilliQ-grade nelle colonne. Spin a 14.000 rpm per 5 min. Raccogliere 50 ml di eluato da ogni colonna nel tubo di raccolta individuale (dal kit).
- Preparare la soluzione PCR Master Mix combinando moltiplica dei seguenti (12,5 ml di Potenza SYBR Green PCR Master Mix, 0,63 ml di 10 mM eGFP senso di primer [5'-ACG ACG TAA CCG ACA AGT TC -3 '], 0,63 ml di 10 mM eGFP anti-senso di primer [5'-AAG TCG TGC TGC TTC ATG TG -3 '], 6,3 ml di acqua MilliQ-grade). Moltiplicate questi volumi per il numero di reazioni previste compresi i controlli "no" del DNA.
- Carico 5 ml di annuncio eGFP DNA (dal punto 4.8) e 20 ml di PCR Master Mix nei pozzetti in triplicato di una piastra di reazione ottica a 96 pozzetti MicroAmp. Sigillare la piastra con MicroAmp ottico Pellicola adesiva. Gira la piastra a 1000 rpm per 1 min per eliminare le bolle d'aria.
- Posizionare la piastra nella presa di un motore 7500 Real-Time PCR. Nel menu principale del 7500 Sistema SDS Software (v1.4 o superiore) selezionare "Crea nuovo esperimento". Fare clic su "Avanti". Nella schermata "Nuovo esperimento wizard" scegliere Sybr verde da un menu a tendina e cliccare su "add". Fare clic su "Avanti" per ottenere un layout della piastra. Evidenziare tutti i pozzetti da analizzare, selezionare SYBR Green. Evidenziare consecutivamente senza pozzetti di controllo del DNA, annuncio eGFP standard di DNA e di incognite, e contrassegnarli con rispettive designazioni dal menu a tendina.
- Passare alla scheda strumento. Selezionare "aggiungi fase di dissociazione", modificare il volume e dal default 50 ml a 25 ml. Fare clic su Start.
- Analizzare i risultati della PCR utilizzando dopo aver controllato il riepilogo QC per valori anomali e di altre irregolarità.
5 Rilascio Cinetica di idrolizzabili Croce-linker-legato Vector particelle dal modello in maglia di acciaio
- Lavare i campioni di maglia derivatizzati con Ad Cy3 marcato via RHC, IHC, SHC e NHC (come da 3.9) a 1% BSA / PBS (1 ora x 3) con agitazione (100-200 giri al minuto).
- Utilizzando sterili pinza sottile, posizionare le maglie in singoli pozzetti di una piastra a 96 pozzetti pre-riempite con 200 ml di tampone di eluizione (0.1% BSA / 0,1% Tween-20 / PBS).
- Prendere immagini fluorescenti di una parte centrale di ciascuna maglia. Registrare le impostazioni del microscopio e la camera CCD utilizzata per l'acquisizione delle immagini.
- Analizzare la piastra fluorimetrically (ex 550/570 em) in modalità ben scansione con la massima riduzione. Utilizzare i pozzetti con maglie non derivatizzate come controllo di sfondo.
- Incubare la piastra a 37 ° C con agitazione (50 rpm).
- A orari prestabiliti (range 1-30 giorni) aspirare il tampone di eluizione senza disturbare le maglie e aggiungere 200 ml di tampone di eluizione fresco. Ripetere i passaggi 4,3-4,5 dopo la sostituzione il buffer.
6. trasduzione di Cultured CelLS di Mesh-immobilizzati Ad vettori
- Lavare l'annuncio eGFP - o Ad Luc -derivatized maglie tre volte con PBS sterile per 5 minuti con agitazione (100 rpm).
- Utilizzando pinza sottile sterile rimuovere i dischi della maglia uno per uno e individualmente metterli nei pozzetti di una piastra a 96 pozzetti con il tipo cellulare di interesse nella fase di log di crescita.
- Incubare le cellule per 24 ore a 37 ° C in 5% CO 2.
- Utilizzare il rispettivo test non terminale endpoint (microscopia a fluorescenza, fluorometria per eGFP o bioluminescenza di imaging per luciferasi) per determinare l'entità e la distribuzione spaziale di espressione genica nei pozzetti.
- Facoltativamente, media sostituto di PBS per aumentare la sensibilità del test fluorometria (485/535 nm) se si prevede bassa espressione eGFP. Nota: Se un fluorimetro è dotato di capacità ben scansione, leggere la piastra in una modalità ben scansione per valutare la distribuzione spaziale delle cellule nei pozzetti eGFP-esprimono. Scambio PBS per mezzo dopo aver completato fluorometria.
- Immagine le cellule trasdotte nei pozzetti con maglie annuncio eGFP -eluting (sia sottostanti e periferiche della maglia) utilizzando il set di filtri FITC. Prendere immagini rappresentative a 40-200X ingrandimento. Registrare le impostazioni esatte del microscopio a fluorescenza e la camera CCD utilizzata per l'acquisizione delle immagini.
- Aggiungere 5 ml di luciferina magazzino in PBS (10 mg / ml) direttamente pozzetti con Ad Luc -eluting maglie a una concentrazione finale di 500 mg / ml ed incubare a 37 ° C e 5% di CO 2 per 10 min prima di imaging bioluminescenza . Aspirare i media e sostituirli con supporti libero-luciferina dopo l'imaging.
- Ripetere dosaggi endpoint ad orari prestabiliti (fino a 2 settimane) per studiare la cinetica di espressione del gene reporter seguenti trasferimento di geni substrato-mediata.
7 Convalida dei Conservato trasduzione capacità ai punti di ritardata
- Preparare l'annuncio eGFP demaglie rivatized utilizzando RHC, IHC, SHC e NHC per il vettore di tethering (come da 2,1-2,11 e 3,1-3,9) e posizionare individualmente le maglie dei pozzetti di una piastra a 96 pozzetti con 60-80% confluenti cellule endoteliali aortiche bovine (BAEC ).
- Analizzare trasduzione di coltura BAEC con maglia-immobilizzato annuncio eGFP a 1 e 2 giorni di collocamento post-maglia con microscopia a fluorescenza e fluorometria (come da 6,4-6,5).
- 48 ore dopo l'inizio della trasduzione lavare i pozzetti a maglia contenenti due volte con PBS.
- Aggiungere 200 ml di 0,25% tripsina / EDTA in ciascun pozzetto e incubare per 15 minuti a 37 ° C con agitazione (100 rpm). Lavare 3x con PBS.
- Utilizzare microscopia a fluorescenza e fluorometria per accertare la completa rimozione di tutte le cellule eGFP-positivi associati alle maglie.
- Seme fresco diversi passaggi BAEC nei pozzetti con maglie parzialmente rilasciato ad una densità di semina iniziale 60-80% (2-2,7 x 10 4 cellule / pozzetto).
- Incubare la piastra a 37 ° C e 5% di CO
8 Ad-stent a eluizione di distribuzione nel ratto carotideo Modello di stent per angioplastica
- Tutte le procedure sugli animali descritti in questo protocollo sono conformi alle normative federali sull'uso animali da laboratorio e sono stati approvati dal IACUC dell'Ospedale dei Bambini di Philadelphia. Per aderire alle condizioni chirurgiche asettiche tutti gli strumenti sono sterilizzati in autoclave. Per assicurare la sterilità continua uno sterilizzatore tallone è impiegato tra l'uso degli strumenti in un massimo di cinque animali consecutivi.
- Preparare Ad Luc -eluting stent secondo 2,1-2,11 e 3,1-3,9. Conservare gli stent virus-derivatizzati in PBS sterile a 4 ° C per non più di 24 ore prima dell'uso.
- Anestetizzare ratti maschi Sprague-Dawley (400-450 g) con iniezione ip di ketamina (100 mg / kg) e xilazina (5 mg / kg). DeTermine della profondità dell'anestesia da zampa risposta pizzico e tono muscolare. Applicare una pomata oftalmica veterinario per prevenire la secchezza della cornea e nella sclera. Nota: L'anestesia inalatoria con il 4% e il 2% isoflurano (1 L / min) per l'induzione e il mantenimento dell'anestesia, rispettivamente, è possibile, ma impedisce il libero accesso alla regione del collo dell'animale e quindi non è raccomandato per un utente inesperto.
- Rivalutare la profondità di anestesia pizzico punta. Shave e il collo in modo asettico preparazione e della regione superiore del torace. Somministrare antibiotico (cefazolina; 20 mg / kg IM), analgesici (meloxicam, 0,5 mg / kg; SC) e soluzione salina (10 ml / kg SC). Cateterizzarla la vena della coda con un catetere di 24 G e somministrare eparina (200 UI / kg IV). Nota: Una dose di 10 mg / kg (IM) enrofloxacina (Baytril) può essere usato al posto di cefazolina. Evitare l'uso di antibiotici privi di significativa attività contro i batteri Gram-positivi. 10-15 mg / kg carprofen (Rimadyl) può essere utilizzato al posto di meloxicam come un analgesico preventivo. Analgesici narcotici (e.g., morfina, buprenorfina) deve essere evitato a causa delle loro proprietà-respirazione deprimente.
- Eseguire un'incisione mediana attraverso la fascia pelle e del collo. Utilizzare tecniche di dissezione smussa per isolare sinistra arteria carotide esterna. Tie-off carotide esterna presso il sito accessibile più distale. Applicare una legatura temporanea scorrevole all'origine della carotide interna.
- Fare un'incisione arteriotomia 2 mm nella sinistra arteria carotide esterna.
- Inserire un catetere di Fogarty 2-Francese nell'arteria carotide comune attraverso l'incisione nella carotide esterna. Gonfiare la punta del catetere con soluzione salina e passare 3x dall'arco aortico alla biforcazione carotidea per spogliare l'endotelio.
- Far scorrere un pezzo di tubo (1.04 mm di diametro esterno, ID 0,99 millimetri) sopra il catetere di Fogarty e nell'arteria carotide comune. Ritirare il catetere di Fogarty.
- Montare e crimpare un annuncio Luc -derivatized stent sul palloncino di un 1,5mm diametro del catetere per angioplastica. Inserire lo stent attraverso il tubo di Teflon e avanzare nella parte centrale della carotide comune. Evitare di strofinare lo stent contro la parete del tubo o della nave.
- Distribuire lo stent a 12 atm per 30 sec e ritirare il catetere angioplastica.
- Fermatura prossimale carotide esterna al sito arteriotomia e rilasciare la legatura temporanea sulla carotide interna.
- Riparare la ferita operatoria in strati con esecuzione 4.0 Vicryl sutura e fiocco la pelle.
- Recuperare l'animale su un blocco di riscaldamento fino ambulatoriale e tornare alla sua gabbia isolata. Mentre nessun segno di dolore o fastidio sono tipicamente esposti dagli animali post-operatorie oltre il primo 12 ore dopo la procedura, considerare l'estensione della terapia meloxicam (0,5 mg / kg, SC al giorno) per 72 ore.
9 Imaging bioluminescenza delle arteriosa Gene Expression
- A intervalli di tempo prefissati (1 giorno - 3settimane range) dopo la distribuzione stent a eluizione di gene in arteria carotide comune, anestetizzare il topo con isoflurano anestesia per inalazione (2-4% isoflurano in ossigeno).
- Rimuovere i punti chirurgici, asetticamente preparare il sito e riaprire la ferita operatoria. Utilizzando smussato accesso dissezione, ri-guadagno per l'arteria carotide comune sinistra e separarla dal nervo vago e del tessuto connettivo adiacente.
- Preparare una miscela di 50 mg / ml in PBS Luciferin e il 25% Pluronic F-127 in PBS (1: 4 v / v) e memorizzarlo sul ghiaccio. Nota: Questa formulazione presenta come una soluzione viscosa a 4 ° C e si rivolge a gel a contatto con il tessuto a 37 ° C immediatamente.
- Applicare 200 ml di una miscela raffreddata Luciferin / Pluronic direttamente al segmento esposta della carotide comune e verificare gel solidità.
- Mettere l'animale in posizione supina nella camera di imaging dell'apparato IVIS-Spectrum e mantenere l'anestesia isoflurano con una maschera.
- Nel acquisitisulla finestra del pannello di controllo (Immagine vivente, versione 4.2 o superiore) scegliere la posizione "B" (6,6 centimetri telecamera di opporsi distanza) e binning factor "medio" dal menù a tendina intitolato "campo visivo" e di "binning", rispettivamente. Digitare "2,5 centimetri" nella casella altezza soggetto. Scegliere "min" come unità di tempo nella casella "tempo di esposizione", e scegliere un valore numerico di "2".
- Tre minuti dopo l'applicazione del / gel Pluronic Luciferin, avviare l'acquisizione dell'immagine facendo clic sul pulsante "Acquisisci" sullo schermo. NOTA: L'immagine tempo di acquisizione può variare da 1 a 6 min a seconda della potenza del segnale atteso.
- Dopo aver acquisito l'immagine, lavare il gel fuori con soluzione fisiologica e tamponare lo spazio periarterial con garza sterile e cotone applicatori.
- Chiudere la ferita con Vicryl sutura e fiocco la pelle.
- Recuperare l'animale e tornare alla sua gabbia. Ripetere l'imaging a seguito tpunti IME per studiare l'andamento temporale di espressione arteriosa causata da vettori Ad stent-immobilizzato.
- In alternativa, effettuare l'imaging a seguito di una somministrazione sistemica di luciferina. Anestetizzare e preparare l'animale come da 9.1-9.2. Cateterizzarla la vena della coda con un catetere di G 24 e il catetere sicuro con nastro adesivo chirurgico.
- Preparare una soluzione di luciferina in PBS (50 mg / ml) e iniettare 1 ml della soluzione attraverso il catetere in un intervallo di 10 secondi. Un minuto dopo l'iniezione avviare l'acquisizione dell'immagine come da 9,7-9,8. Nota: Una velocità di iniezione più veloce (<10 sec) può provocare l'attività di sequestro e arresto respiratorio. L'animale deve essere eutanasia se convulsioni o arresto respiratorio si verificano durante l'imaging.
- Seguire passo 9.10.
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Representative Results
Esperimenti di vettore di uscita
Tethering di vettori adenovirali alla superficie degli impianti, compresi i dispositivi interventistici, come gli stent endovascolari, approssima il vettore al sito di malattia, in parte ovviando alla mancanza di mirati fisica vettori. Tuttavia, per poter ottenere effetti terapeutici attraverso la trasduzione del tessuto bersaglio, il vettore deve essere rilasciato dalla superficie (Figura 2). L'uso di idrolizzabili reticolanti stato ipotizzato per consentire 1) efficace attacco di vettori per polybisphosphonate modificati, protesi metalliche tiolo-installato e 2) rilascio prolungato mediati dalla idrolisi del cross-linker.
Il numero di copie genomiche di Ad eGFP vettoriale connessi con i dischi maglie dalla fine della procedura di derivatizzazione viene determinata mediante PCR del DNA virale con primer specifici per eGFP (Figura 3). A seconda dellaspecifico cross-linker usato, la quantità di annuncio legato vettore dovrebbe variare tra 3,5 x 10 9 e 5,7 x 10 9 particelle / mesh. Tale importo è in corrispondenza fiera con la capacità stimata massima (2,5 x 10 9) di un singolo disco in rete con una superficie totale pari a 0,25 cm 2 per accogliere le particelle AD 100-nm in una disposizione monostrato. Dal momento che l'importo iniziale di Ad vettore nella fase di modifica cross-linker è di 5 x 10 11 particelle, solo ~ 1% del vettore modificato è poi immobilizzato sulla PABT / PEI PDT -derivatized superficie in acciaio inossidabile.
Sia il tasso di in-catena idrolisi e il numero di legami tra il vettore e il biomateriale dovrebbero influenzare la cinetica complessiva del rilascio di vettore annuncio dalla superficie.
Per facilitare gli esperimenti di rilascio, le particelle di adenovirus possono essere pre-etichettati con Cy3 fluoroforo (protocollo; sezione 1) prima del cross-linker MODIFICAzione e immobilizzazione di superficie (protocollo; sezione 3). La diminuzione della fluorescenza superficie associata nel tempo valutato contemporaneamente da fluorometria (Figura 4A) e microscopia a fluorescenza (Figura 4B) può quindi essere utilizzata come un metodo indiretto per monitorare liberatoria vettoriale in tampone fisiologico. Vettori di annunci collegati attraverso RHC e IHC collegamenti devono dimostrare di rilascio molto più veloce rispetto alla loro SHC- e controparti NHC iscritti. Nell'esempio riportato, il 45% e una perdita del 39% del vettore-superficie associata è stata osservata con RHC e IHC-tethered vettore di giorno 30, rispettivamente, mentre è stata osservata meno del 20% del tethered vettore per essere rilasciato in SHC e NHC -immobilized campioni (Figura 4A).
Inoltre, vettori Ad immobilizzati utilizzando diverse concentrazioni della stessa HC e quindi presumibilmente aventi differenti numeri di cavezze tra il vettore e il substrato metallico dovrebbe averecinetica di rilascio dissimili vettoriale. Infatti, la modifica vettoriale utilizzando 0,1 RHC mM portato a tassi di dispersione significativamente più veloce rispetto a quella osservata per il vettore immobilizzato con RHC 0,5 mm (Figura 4A). I dati di microscopia a fluorescenza (Figura 4B) correla bene con l'analisi rilascio vettore quantitativa basata fluorometria-, dimostrando una diminuzione più veloce e più profonda di fluorescenza superficie associato con i campioni della maglia formulato utilizzando IHC-, RHC- e soprattutto a bassa concentrazione vettori RHC-tethered in confronto con i loro omologhi NHC- e SHC-legato.
In trasduzione vitro con Mesh immobilizzati Ad Vettori
Essendo compatibile sia con l'analisi di espressione quantitativa (fluorometria) e le osservazioni spaziali (microscopia a fluorescenza), Ad eGFP è il vettore giornalista preferito per monitorare trasduzione in SMC e endotelialecolture cellulari trattate con entrambi i vettori annuncio gratuito e maglia-immobilizzato. Modificazione chimica di Ad capside con RHC (Figura 5), nonché con altre cross-linker (non mostrato) in concentrazioni superiori a 75 micron ostacola seriamente l'efficacia di trasduzione del vettore non immobilizzato in vitro, molto probabilmente a causa di mascheratura e di riconfigurare manopola fibra domini utilizzati da annuncio per il legame alle cellule attraverso i recettori Coxsackie-adenovirus (CAR). Tuttavia, il ruolo delle interazioni manopola-CAR è meno vitale per la trasduzione con substrato immobilizzato vettore in quanto il vettore viene mantenuta in prossimità delle cellule bersaglio da legare al substrato. In esperimenti di coltura cellulare indipendentemente dal tipo HC, vettori Ad maglia-associati sono costantemente in grado di limitare spazialmente eventi di trasduzione di cellule situate nel 300-500 micron dai confini della maglia (Figure 6A e 6C). Tipicamente i livelli di picco di Transgene l'espressione sono raggiunti i 3-5 giorni dopo il posizionamento di Ad eGFP -loaded maglie in SMC (Figure 6A e 6B) o BAEC (figure 6C e 6D) culture. Allo stesso carico vettore, picco livelli di espressione eGFP aumentano nella seguente sequenza: NHC-, SHC-, IHC- e RHC-tethered vettore, riflettendo le differenze nei loro rispettivi profili cinetica di rilascio (Figura 4). Inoltre, l'espressione del transgene più durevoli si osserva nelle cellule trattate con maglie IHC-formulate rispetto alle cellule trattate con le controparti RHC-formulati (Figura 6D).
Il sistema di coltura cellulare utilizzato presenta una comoda set-up per la ricerca di eventi di trasduzione del ritardo causato da particelle vettoriali rilasciate dalla superficie metallica o al più tardi 48 ore dopo il posizionamento della maglia. In questa applicazione, dopo aver determinato l'espressione eGFP da fluorometmicroscopia a fluorescenza e ry a 48 ore dopo l'inizio di trasduzione, BAEC sono tripsinizzate e aspirato fuori dei pozzi senza disturbare le maglie. Appena diversi passaggi non trasdotte BAEC vengono poi ri-placcato negli maglie parzialmente liberati. "I nuovi" eventi di trasduzione causate dalle particelle virali rilasciate dal vettore in rete dopo il punto ora due giorni vengono poi valutati mediante microscopia a fluorescenza e fluorometria (Figure 7A e 7B). Espressione eGFP Robusto dimostrare la caratteristica di limitazione spaziale a una rete locale è tipicamente osservata in queste "nuove" culture (Figura 7), a conferma di una capacità di trasduzione ben conservato dei vettori Ad maglia-bound, anche dopo 48 ore di esposizione per completare mezzo di coltura cellulare a 37 ° C.
Studi in vivo
Per esaminare i potenziali effetti legati alla uvettore SE di HC diversa trasduzione arteriosa, animali impiantati con Ad Luc -eluting stent preparati con RHC-, IHC-, SHC- e NHC-modificato subito l'imaging bioluminescente 1 e 8 giorni dopo il rilascio dello stent (Figura 8). La formazione immagine è stata condotta in seguito alla somministrazione perivascolare locale della luciferina (2 mg) co-formulato con gel Pluronic. Questa formulazione è un fluido viscoso quando raffreddato in ghiaccio, ma subisce transizione di fase immediatamente a gelificare quando portato a contatto con il tessuto a 37 ° C. Esperimenti preliminari (non mostrato) hanno dimostrato che la consegna perivascolare dei risultati luciferina in segnali più stabili e riproducibili luminescenza in Ad Luc -transduced tessuto vascolare rispetto al sistemico (intraperitoneale o endovenosa) la somministrazione luciferina.
Se il virus tethering allo stent e la chirurgia stent erano tecnicamente valido, un segnale ben definito corrispondente al segmento di stentratto carotide viene emesso e registrato. Un giorno dopo l'impianto dello stent, animali trattati con RHC-formulati stent annuncio Luc tipicamente esporre il segnale di luminescenza più alto, seguito dai ratti trattati IHC- e SHC- formulato stent (Figure 8A e 8B). Nessun segnale percettibile è osservato nel gruppo di ratti impiantati con stent preparati usando NHC-legato Ad Luc, sottolineando l'importanza del rilascio vettore senza ostacoli dalla stent per un efficace trasduzione del tessuto vascolare (Figure 8A e 8B). Di giorno 8, l'intensità media di espressione della luciferasi con stent RHC-formulate gocce diverse volte, mentre aumenta 1,4 e 1,8 volte con IHC- e stent SHC-formulati, rispettivamente (Figure 8A e 8B). Questo risultato è coerente con l'ipotesi della trasduzione vascolare più resistente con stent a eluizione di geni che presentano un parente più lentoETICS di rilascio vettore dalla superficie dello stent.
Figura 1 formule strutturali di cross-linker (NHC, SHC, IHC e RHC) utilizzati nel corso degli studi descritti (modificato con autorizzazione 28).
Figura 2 Uno schema che rappresenta annuncio vettoriale tethering ad un PABT / PEI PDT -Modified superficie in acciaio inox con una HC e successivo rilascio del vettore sulla cross-linker idrolisi (modificato con autorizzazione 28).
Figura 3 basato sulla PCR-quantificazione di Ad eGFP immobilizzato tramite cross-linker tethering sulla superficie di PABT / PEI PDT -Modified maglie in acciaio inox. Le maglie in acciaio inox sono stati formulati con Ad eGFP immobilizzato via RHC, IHC, SHC, o NHC (n = 3 per ogni condizione ). Dopo il trattamento proteinasi K, il DNA virale è stato eluito e purificato usando colonne MinElute. L'amplificazione del DNA virale usando i primer eGFP-specifici è stata effettuata in un motore di 7500 Real-Time PCR ed è stato rilevato con SYBR Green. La normalizzazione dei dati si è basata su una curva di calibrazione preparata con una quantità nota di non immobilizzato annuncio eGFP (modificato con autorizzazione 28).
Figura 4 cinetica di rilascio di Ad vettore impastoiati per supporti metallici con HC. Stainless maglie in acciaio sono stati derivatizzati con ~ 2 x 10 particelle AD 9 Cy3-etichettati collegati al PABT / PEI PDT -Modified superficie dopo la modifica con 500 mM NHC, SHC, IHC, RHC e 100 mM RHC (designato come RHC-L). Il rilascio di fluorescente Ad-particelle è stato studiato presso i punti di tempo indicato da (A) fluorometria ben scan-a 550/570 nm e (B) microscopia a fluorescenza (set filtro rodamina, ingrandimento originale 200X). Risultati fluorometria sono presentati come media ± SEM, n = 8-10; p <0,001 per tutti i confronti tra il NHC e SHC vs IHC, RHC e gruppi RHC-L sono stati determinati da Anova con un test post-hoc Tukey (modificato con autorizzazione 28).
Figura 5 trasduzione efficacia non immobilizzato annuncio eGFP seguito di modifiche apportate con RHC. Ratto embrionale aorta-derivato SMC (A10 linea) sono stati trasdotto in un MOI di 1.000 sia con annuncio non modificato eGFP o vettore modificato con RHC come indicato. Un'espressione giornalista è stato determinato fluorometrically (485/535 nm) 48 ore dopo la trasduzione (modificato con autorizzazione 27).
Figura 6 trasduzione di colta SMC e BAEC con Ad vettore immobilizzato a maglie in acciaio inox con HC. Mesh sono stati derivatizzata con ~ 2 x 10 9 Ad eGFP particelle allegati via NHC, SHC, IHC, e RHC. Maglie sono stati poi collocati singolarmente in cima A10 sub-confluenti (A, B) e BAEC (C, D) monostrati. Trasduzione (espressa come livelli di espressione eGFP) delle cellule trattate con maglie Ad vettore-tethered è stata valutata da fmicroscopia luorescence (A, C; FITC filtro insieme; ingrandimento originale 100X) e fluorometria ben scan-(B, D). Risultati fluorometria sono presentati come media ± SEM, n = 4 (modificato con autorizzazione 28). Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 7 trasduzione competenza del substrato immobilizzato vettori Pubblicità in momenti differiti. EGFP annuncio è stato immobilizzato su acciaio mesh attraverso NHC, SHC, IHC o RHC pastoie. Le maglie sono stati collocati sui monostrati BAEC subconfluenti. Due giorni dopo il posizionamento, BAEC stati tripsinizzate e rimosso senza disturbare le maglie. Nuovo, non trasdotte BAEC sono stati poi seminati sopra le maglie. AnnuncioeGFP trasduzione competenza è stata misurata espressione eGFP mediante microscopia a fluorescenza (A; filtro di serie FITC; ingrandimento originale 100X) e fluorometria (B). Le misure sono state prese a giorni indicati, immagini rappresentative sono stati utilizzati ed i risultati fluorometria sono mezzi ± SEM, n = 4 (modificato da con autorizzazione 28). Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 8 L'efficienza di trasduzione di stent-immobilizzato annuncio Luc in vivo. Ad Luc (1,3 x 10 10 particelle) è stato legato a stent endovascolari via NHC, SHC, IHC o RHC (n = 3-4 per tutti i gruppi). Efficienza di trasduzione di Ad Luc </ Sub> eluito dalla stent è stata misurata mediante bioluminescenza (IVIS Spectrum) 1 e 8 giorni dopo il rilascio dello stent (A), e tracciata utilizzando una scala logaritmica (B) (modificato da con autorizzazione 28). Cliccate qui per vedere una più grande versione di questa figura.
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Discussion
Il protocollo presentato descrive un metodo operativo per substrato mediata consegna genico ottenuto attraverso l'attaccamento reversibile di vettori adenovirali per senza cappotto superfici in acciaio inox. Mentre sviluppato per lo scopo specifico della terapia genica basata stent-di restenosi vascolare, questa tecnica ha applicazioni molto più ampie nei settori dei biomateriali, protesi biomedicali e la terapia genica.
Anche se gli studi presentati sono esclusivamente utilizzato acciaio inossidabile come substrato metallico prototipo, PABT lega altri metalli come il cobalto / cromo e nitinol con affinità paragonabile (non pubblicata). L'interazione indiscriminata di PABT metalli espande in modo significativo il numero di potenziali applicazioni biomediche per questa tecnologia 31. Inoltre, l'uso di vettori genetici HC-legato, pur richiedendo altri metodi di installazione tiolo sulla superficie del materiale, è fattibile con altri tipi di biomateriali.
ONTENUTO "> Mentre vettori genetici Ad raggiungere robusto trasduzione in molti tipi di cellule e tessuti umani, il loro significato clinico è limitato da forti risposte infiammatorie e immunitarie indotte da Adenoviridae 4. A tal fine, prolungata (4 mesi) espressione genica arteriosa con stent medicati formulati utilizzando HC modifica di vettori virali-luciferasi che esprimono adeno-associati stato recentemente dimostrato (non pubblicata).La metodologia è robusto. Piccole deviazioni dal protocollo principale in genere non portano a significative alterazioni di espressione genica in vitro e in vivo. Tuttavia, diverse criticità che possono influenzare i risultati sono stati identificati.
In primo luogo, come suggerisce il nome, idrolizzabili cross-linker sono cleavable per reazione con l'acqua a causa di idrolisi dell'estere in catena. Inoltre, la frazione ammina-reattiva, N -sulfosuccinimidyl è idrolizzabile pure. Cross-linker devono essere conservati under atmosfera di argon a -20 ° C per preservare la loro attività. Per le stesse ragioni, dopo la preparazione di soluzioni di HC (sezione protocollo 3.2) procedere immediatamente con l'aggiunta di soluzioni HC alle preparazioni di virus.
In secondo luogo, i gruppi tiolo che si formano sulla superficie del metallo durante diverse fasi intermedie della sequenza bioconjugation presentato sono rapidamente ossidati da ambiente di ossigeno dell'aria. Per evitare questo, mantenere i campioni di metallo vulnerabili sommerso in acqua degasata in ogni momento.
In terzo luogo, è necessario un allineamento perfetto della maglia con il fondo del pozzo per la trasduzione di successo. Non piegare i dischi di maglia durante la movimentazione.
In quarto luogo, evitare un eccessivo sfregamento degli stent a eluizione di gene contro la guaina in teflon e la parete dei vasi durante l'inserimento dello stent per evitare sloggiare di vettori Ad-superficie associata.
Covalente attaccamento gene vettore alla superficie di biomateria impiantabilels ha un evidente vantaggio di un migliore controllo della cinetica di rilascio vettore che realizzo con il tethering non-covalente dei vettori. Nella cornice di consegna del gene dalla piattaforma di stent maggior parte degli studi riportano versione completa di vettori virali e non virali entro 1-7 giorni dopo la distribuzione dello stent 32-34. D'altra parte, Annuncio vettore immobilizzazione tramite HC dimostrato rilascio del solo 20-45% del carico vettore nel primo mese (Figure 4A e 4B). Inoltre, una modulazione parziale di rilascio e trasduzione cinetica è realizzabile con l'impiego di differenti HC esporre cinetica di idrolisi dissimili o variando la concentrazione di HC impiegati per la modifica di superficie del virus. Inoltre, un concorrente co-modifica del vettore con diverse molecole cross-linker, anche se non esplorato nel presente studio, offre un'altra opportunità per la messa a punto di vettore di rilascio e trasduzione.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 316 stainless steel mesh disks | Electon Microscopy Sciences | E200-SS | |
| Generic 304-grade stainless steel stents | Laserage | custom order | |
| AdeGFP | University of Pennsylvania Vector Core | AD-5-PV0504 | |
| AdLuc | University of Pennsylvania Vector Core | AD-5-PV1028 | |
| AdEMPTY | University of Pennsylvania Vector Core | A858 | |
| Cy3(NHS)2 | GE Healthcare | PA23000 | |
| Sepharose 6B | Sigma-Aldrich | 6B100-500ML | |
| UV 96-well plates | Costar | 3635 | |
| Fluorometry 96-well plates | Costar | 3915 | |
| Cell culture 96-well plates | Falcon | 353072 | |
| Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride (TCEP) | Pierce Thermo Scientific | 20490 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Pierce Thermo Scientific | 20290 | |
| sulfo-LC-SPDP | Pierce Thermo Scientific | 21650 | |
| Spectrophotometer | Molecular Devices | SpectraMax 190 | |
| Spectrofluorometer | Molecular Devices | SpectraMax Gemini EM | |
| Orbital shaker incubator | VWR | 1575R | |
| Horizontal airflow oven | Shel Lab | 1350 FM | |
| Centra-CL2 centrifuge | International Equipment Company | 426 | |
| Digital vortex mixerer | Fisher Thermo Scientific | 02-215-370 | |
| Eclipse TE300 fluorescence microscope | Nikon | TE300 | |
| DC 500 CCD camera | Leica | DC-500 | |
| 7500 Real-Time PCR system | Applied Biosystems | not available | |
| IVIS Spectrum bioluminescence station | Perkins-Elmer | not available | |
| EDTA dipotassium salt | Sigma-Aldrich | ED2P | |
| Bovine serum albumin fraction V (BSA) | Fisher Thermo Scientific | BP1600-100 | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P1379 | |
| Dumont forceps | Fine Science Tools | 11255-20 | |
| A10 cell line | ATCC | CRL-1476 | |
| Bovine aortic endothelial cells | Lonza | BW-6002 | |
| Luciferin, potassium salt | Gold Biotechnology | LUCK-1Ge | |
| Pluronic F-127 | Sigma-Aldrich | P2443-250G | |
| PBS without calcium and magnesium | Gibco | 14190-136 | |
| Fetal bovine serum | Gemini Bio-Products | 100-106 | |
| Penicillin/Streptomycin solution | Gibco | 11540-122 | |
| DMEM, high glucose | Corning cellgro | 10-013-CV | |
| 0.25% Trypsin/EDTA | Gibco | 25200-056 | |
| QIAamp DNA micro kit | Qiagen | 56304 | |
| Power Sybr Green PCR Master Mix | Applied Biosystems | 4367659 | |
| MicroAmp Optical 96-well Reaction Plate | Applied Biosystems | N8010560 | |
| MicroAmp Optical Adhesive Film | Applied Biosystems | 4360954 | |
| Cephazolin | Apotex | not available | |
| Loxicom (Meloxicam) | Norbrook | not available | |
| Heparin sodium | APP Pharmaceuticals | not available | |
| Ketavet (Ketamine) | VEDCO | not available | |
| Anased (Xylazine) | Lloid | not available | |
| Forane (Isoflurane) | Baxter | not available | |
| Curved Moria iris forceps | Fine Science tools | 11370-31 | |
| Curved extra-fine Graefe forceps | Fine Science Tools | 11152-10 | |
| Dumont #5 forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| Vannas spring scissors | Fine Science Tools | 15018-10 | |
| Fine scissors - ToughCut | Fine Science Tools | 14058-09 | |
| Surgical scissors | Fine Science Tools | 14101-14 | |
| Vicryl suture (5-0) | Ethicon | J385 | |
| Suture thread (4/0 silk) | Fine Science Tools | 18020-40 | |
| Michel suture clips | Fine Science Tools | 12040-02 | |
| Wound dilator (Lancaster eye specula) | KLS Martin | 34-149-07 | |
| Hot bead sterilizer | Fine Science Tools | 18000-45 | |
| Michel suture clip applicator | Fine Science Tools | 112028-12 | |
| Insyte Autoguard 24 G IV catheter | Beckton-Dickinson | 381412 | |
| 2F Fogarty catheter | Edwards Lifesciences | 120602F | |
| Teflon tubing | Vention | 041100BST | |
| PTA catheter | NuMed | custom order | |
| Gauze pads | Kendall Healthcare | 9024 | |
| Cotton applicators | Solon Manufacturing | WOD1003 | |
| Saline | Baxter | 281321 | |
| 10 ml syringe (Luer-Lok) | Beckton-Dickinson | 309604 | |
| 1 ml syringe (Luer-Lok) | Beckton-Dickinson | 309628 | |
| Clippers with #40 blade | Oster | 78005-314 | |
| Transpore surgical tape | 3M | MM 15271 | |
| Puralube vet ointment | Pharmaderm | not available |
References
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