Abstract
Resténose intra-stent présente une complication majeure des procédures de revascularisation base d'endoprothèse largement utilisés pour rétablir le flux sanguin dans les segments rétrécies de manière critique des artères coronaires et périphériques. Stents endovasculaires capables de libérer accordable de gènes ayant une activité anti-resténose peut présenter une stratégie alternative à l'heure actuelle utilisés stents à élution médicamenteuse. Afin de réaliser l'application clinique, les stents de gènes élution doivent présenter une cinétique prévisibles de gène libération de vecteur de stent immobilisé et la transduction spécifique de site de la vascularisation, tout en évitant une réponse inflammatoire excessive typiquement associé aux revêtements polymères utilisés pour le piégeage physique du vecteur. Cet article décrit une méthodologie détaillée pour tethering sans manteau de vecteurs de gènes adénoviraux de stents basé sur une liaison réversible des particules adénoviraux à polyallylamines bisphosphonate (PABT) -Modified surface en acier inoxydable par des agents de réticulation hydrolysables (HC). Une famille deHC bifonctionnel (amine et thiol-réactif) avec un t 1/2 moyenne de l'hydrolyse de l'ester dans la chaîne comprise entre 5 et 50 jours ont été utilisés pour lier le vecteur avec le stent. La procédure d'immobilisation vecteur est typiquement réalisée à l'intérieur de 9 h et se compose de plusieurs étapes: 1) l'incubation des échantillons de métal dans une solution aqueuse de PABT (4 h); 2) la déprotection des groupes thiol installés dans PABT avec le tris (2-carboxyéthyl) phosphine (20 min); 3) augmentation de la capacité réactif thiol de la surface métallique en faisant réagir les échantillons avec de la polyéthylèneimine pyridyldithio dérivés avec des groupes (PDT) (2 heures); 4) la conversion des groupes thiols de PDT avec du dithiothréitol (10 min); 5) la modification des adénovirus avec HC (1 h); 6) la purification de particules d'adénovirus modifiés par chromatographie d'exclusion stérique colonne (15 min) et 7) l'immobilisation des particules adénovirales thiol réactif sur la surface de l'acier thiolé (1 h). Cette technique a une large applicabilité potentielle au-delà des stents,en facilitant l'ingénierie de surface des dispositifs bioprothèses pour améliorer leur biocompatibilité grâce à la prestation de gène substrat médiée par les cellules d'interfaçage matériel étranger implanté.
Introduction
L'efficacité de la thérapie génique en tant que modalité thérapeutique est entravée par la capacité de ciblage de mauvais vecteurs de thérapie génique 1,2. L'absence de résultats de ciblage appropriés dans les niveaux sous-thérapeutiques de l'expression du transgène à l'emplacement cible et conduit à une large diffusion des vecteurs aux organes non ciblés 3, y compris ceux qui sont responsables pour le montage des réponses immunitaires à la fois contre le vecteur et produit thérapeutique codé 4, 5. Un potentiel signifie pour compenser la promiscuité de transduction et de promouvoir le ciblage est d'introduire des vecteurs de gènes à l'endroit désiré dans une forme qui empêche leur diffusion gratuite par le sang et la lymphe. Typiquement, de tels efforts sont tributaires de systèmes d'administration locale injectables comprenant soit des vecteurs viraux ou non viraux mêlé de fibrine, collagène ou un hydrogel d'acide hyaluronique matrices 10.6 qui sont capables de soutenir de manière transitoire des vecteurs de gène au niveau du site d'injection en piégeant physiquement èmeem dans un réseau polymère.
Un autre modèle généralement accepté pour la thérapie génique localisée immobilisation utilise des vecteurs de gènes à la surface des prothèses implantées 11,12. Implants médicaux permanents (endovasculaires, bronchiques, urologiques et gastro-intestinaux stents, stimulateurs cardiaques, articulations artificielles, des filets chirurgicaux et gynécologiques, etc.) Sont utilisés chaque année des dizaines de millions de patients 13. Bien que généralement efficaces, ces dispositifs sont sujettes à des complications qui sont insuffisamment contrôlés par les pratiques médicales actuelles 14-17. Prothèses implantables présentent une occasion unique de servir de plates-formes de substitution pour le traitement localisé de la thérapie génique. Du point de vue pharmacocinétique, la dérivatisation de la surface d'implants médicaux avec des doses relativement faibles d'entrée de vecteurs de gènes conduit à la réalisation de deux des concentrations locales élevées de vecteurs de gènes de l'interface implant / tissu et le ralentissement de la cinétique de their élimination de ce lieu. En conséquence de séjour prolongée et améliorée par l'absorption de la population cellulaire ciblée, l'immobilisation vecteur minimise la propagation du vecteur de gène. Ainsi, l'inoculation par inadvertance des tissus non cibles est réduite.
attache de surface des vecteurs de gènes sur les biomatériaux implantables (appelées également que la livraison de gène substrat médiation ou la livraison de gènes en phase solide) a été mis en œuvre dans la culture de cellules animales et des expériences utilisant à la fois spécifique (antigène-anticorps 18-20, avidine-biotine 21,22) et non spécifique 23-26 (charge, de van der Waals) interactions. La fixation covalente de vecteurs à la surface du dispositif implanté a été précédemment considéré comme non fonctionnel car excessivement fortes liaisons avec la surface empêchent vecteur internalisation par les cellules cibles. Récemment, il a été démontré que cette limitation peut être surmontée par l'utilisation d'hydrolysable spontanément agent de réticulation utilisé comme tetsienne entre la surface métallique mise à jour de l'endoprothèse et les protéines de capside du vecteur adénoviral 27,28. En outre, la vitesse de libération de vecteur et évolution dans le temps de l'expression du transgène in vitro et in vivo peuvent être modulées à l'aide d'agents de reticulation hydrolysables présentant des cinétiques d'hydrolyse 28.
Le présent document présente un protocole détaillé pour la fixation covalente réversible des vecteurs adénoviraux à la surface de métal actif et présente un dispositif expérimental utile pour l'étude qui ont suivi les événements de transduction in vitro dans le muscle lisse de culture et les cellules endotheliales et in vivo dans le modèle de la carotide de rat de stent d'angioplastie .
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Protocol
1 Préparation de l'adénovirus marqué au Cy3 pour les expériences de libération
- Suspendre 2 x 10 12 particules de Ad vide (environ 2 x 10 11 unités infectieuses) dans 650 ul de tampon carbonate / bicarbonate (CBB; pH 9,3).
- On dissout le contenu d'une fiole (0,2 mg) d'un colorant fluorescent réactif amine (Cy3 (NHS) 2) dans 1 ml CBB à une concentration finale de 0,2 mg / ml.
- Ajouter 100 ul de la solution de colorant à la suspension de virus, vortex pendant 5 secondes et incuber pendant 1 heure à 28 ° C sous agitation (100 à 200 rpm).
- Equilibrer une colonne de 20 ml de Sépharose 6B avec du PBS. Ajouter 750 ul de suspension marqué au Cy3 Ad goutte à goutte au centre du lit de gel.
- Après la suspension virale imprègne la résine, ajouter 5 ml de PBS. Jeter l'éluat.
- Ajouter 0,5 ml de PBS et recueillir l'éluat dans un récipient en verre étiqueté. Répétez cette étape 10x recueillir un total de dix fractions de 0,5 ml.
- E teste fractions collectées par spectrophotométrie (260 nm et 280) pour la teneur en ADN viral.
- Rassembler les fractions contenant plus de 10% du total (somme de F1 à F10) de la densité optique (DO) à 260 nm. Note: Généralement, les fractions F3, F4, F5, F6 et sont réunies et mélangées.
- Re-dosage, les fractions rassemblées mixtes par spectrophotométrie (260 nm et 280) et le dosage par fluorimétrie (550 ex / em 570 nm) pour la teneur en ADN viral et marquées Cy3 protéine de capside, respectivement. Remarque: Une courbe d'étalonnage Cy3 (NHS) 2 couvrant la gamme 10 -9 -10 -13 mol / L est préparé et dosé par fluorimétrie sur la même plaque que les fractions regroupées.
- Calculer le rendement de virus marqué et de la densité de marquage. Supposons que les particules de 1,19 x 10 12 virus / ml correspond à 1 unité DO pour un 1 cm de trajet 29. Utilisez la formule suivante: Rendement = [(DO 260nm /1.19)*10 12 * quantité V / entrée Ad] * 100, où, DO 260 nm est la de optiquensity de la formulation mise en commun à 260 nm et V est le volume de la formulation mise en commun (ml) pour calculer un rendement de récupération de l'annonce (en%). Utilisez la formule: densité = Etiquetage C * 6.02 * 10 23 / (DO 260nm /1.19)*10 12, où C est la concentration Cy3 de la formulation groupé (mole / ml) et OD 260 nm est la densité optique de la formulation mis en commun à 260 nm pour calculer la densité moyenne de l'étiquetage Cy3. NOTE: Une reprise typique des virus marqué est> 70% de la dose d'entrée. La densité de marquage est 600-800 molécules fluorophores par une seule particule virale.
- Ad vide en portions plus petites (généralement 5 x 10 11 particules) appropriés pour les expériences de libération individuels aliquote Cy3 marqué. REMARQUE: protocole actuel prévoit l'utilisation d'Ad marqué au Cy3 uniquement dans l'expérience de libération. Toutes les études de transduction sont effectuées avec des vecteurs non marquées.
2 Activation des échantillons métalliques
- Laver les s inoxydableACIER mesh disques ou des stents en acier inoxydable de façon consécutive dans de l'isopropanol (2 x 5 min) et du chloroforme (5 x 2 min) à 55 ° C sous agitation (100 rpm). Eliminer le solvant.
- Chauffer les échantillons pendant 30 min à 200 ° C.
- Dissoudre polyallylamine bisphosphonate avec des groupes thiol latents installés (PABT 27,28,30) dans l'eau (1-2% w / v) à 72 ° C sous agitation (100 rpm). Ajuster le pH à 4,5-5 avec KHCO3.
- Incuber les échantillons de métal dans la solution de PABT pour 2-4 heures à 72 ° C sous agitation (100 à 200 rpm). NOTE: La procédure peut être interrompue à ce point. Les échantillons sont stables pendant 3 jours à 4 ° C.
- Rincer les échantillons trois fois avec de l'eau distillée deux fois (DDW).
- Exposer les échantillons de tris (2-carboxyéthyl) phosphine (TCEP, 15 mg / ml dans 0,1 M de tampon acétique) pendant 15 min à 28 ° C sous agitation (100 à 200 rpm).
- Rincer 5x dans dégazé DDW.
- Exposer les échantillons à 2% de polyéthylèneimine avec des groupes pyridyldithio installés (PEI
- Rincer les échantillons trois fois avec GFI.
- Exposer les échantillons à 10 mg / ml dithiothréitol / DDW pour convertir les groupes pyridyldithio de thiols.
- Rincer 5x nouveau dans dégazé DDW.
3. adénovirus activation et métal immobilisation de surface
- Suspendre 5 x 10 11 particules de l'annonce soit eGFP ou Ad Luc (environ 5 x 10 10 unités infectieuses) à 487,5 à 495 ul de tampon carbonate / bicarbonate (CBB; pH 9,3). Remarque: Pour les études de libération, utiliser 5 x 10 11 de Cy3 marqué particules vides de l'annonce (régler le volume de 487,5 à 495 ul avec du CBB).
- Dissoudre HC avec divers taux d'hydrolyse 28 [(rapidement (t 1/2 = 5 d), intermédiaire (t 1 /2 = 12 d) et lentement (t 1/2 = 50 d) HC, c'est à dire RHC, IHC ou SHC; Figure 1] ou non hydrolysable de réticulation (NHC), sulfo-LC-SPDP dans CBB à 20 mM.
- Immédiatement ajouter 5-12,5 ul de solution de réticulation à la suspension de virus pour un volume total de 500 pi (200-500 pM de concentration finale de l'agent de réticulation), vortex et incuber pendant 1 heure à 28 ° C sous agitation (100 à 200 tours par minute).
- Equilibrer une colonne de 20 ml de Sepharose 6B avec dégazé mM EDTA / PBS 5 (ce relevé). Ajouter goutte à goutte 500 ul de suspension de l'annonce de réticulation modifié au centre du lit de résine.
- Ajouter 5 ml de dégazé ce relevé. Jeter l'éluat.
- Ajouter 0,5 ml de ce relevé dégazé et recueillir l'éluat dans un récipient en verre étiqueté. Répétez cette étape 10 fois la collecte d'un total de dix fractions de 0,5 ml.
- Déterminer la DO des fractions collectées en utilisant la spectrophotométrie à 260 et 280 nm et à convertir OD titres de virus (1,19 x 10 12 / ml correpond à 1 OD) 29.
- Rassembler les fractions contenant> 10% de virus éluée (Note: en général, les fractions F3-F6). Répéter le dosage du titre spectrophotométrique pour la suspension commun.
- Transfert suspension virale dans le flacon avec les échantillons métalliques activés (comme par 2.11). Incuber dans une atmosphère d'argon pendant 1 heure à 28 ° C sous agitation (100 à 200 rpm). Remarque: Les échantillons de métal Ad-captif obtenus dans cette étape sont encore utilisés dans les rejets et de transduction des expériences ultérieures décrites dans les sections de protocole 5-7.
4 Quantification de surface associée à l'annonce Vecteur par PCR
- Préparer mailles formulés avec surface immobilisée annonce eGFP attaché par NHC, SHC, IHC et RHC (n = 3 pour chaque type) tel que décrit dans les sections 2 et 3.
- Utilisez un kit QIAamp DNA Micro pour isoler l'ADN viral. Placez les mailles individuellement dans des tubes en plastique de 1,5 ml contenant 200 ul d'un mélange composé de 180 pi de ATL buffer et 20 ul de proteinase K (à la fois dans le kit). Ajouter la quantité connue de particules Ad eGFP (comme normes pour la courbe d'étalonnage) dans les tubes séparés contenant le même mélange. Incuber à 56 ° C pendant la nuit sans agitation.
- Ajouter 200 ul de tampon AL (du kit), mélanger au vortex, ajouter 200 ul d'éthanol à 100%, et incuber à température ambiante pendant 5 min.
- Transférer le mélange de chaque tube sur une colonne individuelle de MinElite (du kit) et centrifugation à 8000 rpm pendant 1 min. Rincer les tubes contenant de 180 mailles-pi de tampon d'ALT fraîche, ajouter sur les colonnes respectives et essorage à 8000 tours par minute pendant 1 minute. Jeter les éluats.
- Ajouter 500 ul de tampon AW1 (du kit) dans les colonnes et essorage à 8000 tours par minute pendant 1 minute. Jeter les éluats.
- Ajouter 500 ul de tampon AW2 (du kit) dans les colonnes et essorage à 8000 tours par minute pendant 1 minute.
- Jeter les éluats.
- Spin à 14000 rpm pendant 3 minutes supplémentaires until les colonnes sont complètement secs. Jeter les éluats.
- Ajouter 50 ul d'eau MilliQ de qualité dans les colonnes. Tourner à 14 000 tours par minute pendant 5 min. Récupérer 50 ul de l'éluat de la colonne dans chaque tube individuel de collecte (du kit).
- Préparer la solution PCR Master Mix en combinant multiplie de ce qui suit (12,5 pi de puissance Sybr Green PCR Master Mix, 0,63 ul de 10 uM eGFP amorce sens [5 'ACG ACG TAA GCC ACA AGT TC -3'], 0,63 ul de 10 iM eGFP anti-amorce sens [5 'AAG TCG TGC TGC TTC ATG TG -3'], 6,3 pi de l'eau MilliQ-grade). Multipliez ces volumes par le nombre de réactions prévues, y compris les contrôles "pas d'ADN".
- Charge 5 ul de l'ADN Ad eGFP (de l'étape 4.8) et 20 ul de PCR Master Mix dans des puits en triple d'une plaque de réaction à 96 puits MicroAmp Optical. Sceller la plaque avec MicroAmp Optical Adhesive Film. Faites tourner la plaque à 1000 rpm pendant 1 min pour éliminer les bulles d'air.
- Placer la plaque dans le réceptacle d'un moteur de PCR en temps réel 7500. Dans le menu principal du système SDS 7500 Software (v1.4 ou ultérieure) sélectionnez "Créer nouvelle expérience". Cliquez sur "suivant". Dans l'écran «Assistant Nouvelle expérience" choisir Sybr vert à partir d'un menu déroulant, puis cliquez sur "ajouter". Cliquez sur "suivant" pour obtenir une présentation de la plaque. Mettez en surbrillance tous les puits à analyser, sélectionnez Sybr vert. Mettez en surbrillance consécutivement aucun puits de contrôle de l'ADN, annonce eGFP normes et inconnues ADN, et les marquer à l'aide désignations respectives dans le menu déroulant.
- Passez à l'onglet de l'instrument. Sélectionnez "ajouter la phase de dissociation», modifier le volume du puits de défaut 50 pi à 25 pi. Cliquez sur Démarrer.
- Analyser les résultats de PCR utilisant après avoir vérifié le résumé QC aberrantes et autres irrégularités.
5: Cinétique de libération de hydrolysables de la Croix-lieur attaché particules vectorielle du modèle en acier de maille
- Laver les échantillons de maille dérivés avec Ad Cy3 marqué par RHC, IHC, SHC et NHC (comme par 3,9) à 1% de BSA / PBS (1 h x 3) avec agitation (100-200 rpm).
- En utilisant des pinces fines stériles, placer les mailles dans des puits individuels d'une plaque à 96 puits pré-remplie avec 200 pi de tampon d'élution (0,1% de BSA / 0,1% de Tween-20 / PBS).
- Prenez des images fluorescentes d'une partie centrale de chaque maille. Enregistrer les réglages du microscope et la caméra CCD utilisée pour l'acquisition de l'image.
- Doser la plaque fluorimétriquement (550 ex / 570 em) en mode bien-scan en réduisant au maximum. Utilisez les puits avec des maillages non-dérivés comme un contrôle de fond.
- Incuber la plaque à 37 ° C sous agitation (50 rpm).
- A des moments prédéterminés (gamme de 1 à 30 jours) aspirer le tampon d'élution, sans déranger les mailles et ajouter 200 ul de tampon d'élution frais. Répétez les étapes 4.3-4.5 après le remplacement de la mémoire tampon.
6. transduction de culture d'Cells par des vecteurs Ad Mesh immobilisés
- Laver ad eGFP - ou Ad Luc -derivatized mailles trois fois avec du PBS stérile pendant 5 min sous agitation (100 rpm).
- En utilisant des pinces stériles fines retirer les disques de maillage, un par un et de les placer individuellement dans les puits d'une plaque à 96 puits avec le type d'intérêt dans la phase logarithmique de croissance de la cellule.
- Incuber les cellules pendant 24 heures à 37 ° C, sous 5% de CO 2.
- Utiliser le dosage respectif non terminal point de terminaison (microscopie à fluorescence, de fluorimétrie eGFP ou imagerie par bioluminescence pour la luciférase) pour déterminer l'étendue et la répartition spatiale de l'expression des gènes dans les puits.
- Eventuellement, le milieu de substitution pour PBS pour augmenter la sensibilité du dosage par fluorimétrie (485/535 nm) si la faible expression de eGFP est attendue. Remarque: Si un fluorimètre est équipé d'une capacité bien-scan, de lire la plaque dans un mode bien-scan pour évaluer la distribution spatiale des cellules dans les puits exprimant EGFP. Bourse PBS pour le milieu après avoir terminé fluorimétrie.
- Image les cellules transduites dans les puits à mailles annonce eGFP -eluting (à la fois sous-jacents et périphériques du mesh) en utilisant le jeu de filtre FITC. Prenez des photos représentatives à 40-200X grossissement. Enregistrer les paramètres exacts du microscope fluorescent et la caméra CCD utilisée pour l'acquisition des images.
- Ajouter 5 pl de luciférine magasin dans du PBS (10 mg / ml) dans les puits directement avec Ad Luc -eluting s'engrène à une concentration finale de 500 ug / ml et incuber à 37 ° C et 5% de CO 2 pendant 10 minutes avant l'imagerie par bioluminescence . Aspirer le milieu et les remplacer par des médias libres luciférine-après imagerie.
- Essais finaux Répéter à des moments prédéterminés (jusqu'à 2 semaines) pour étudier la cinétique d'expression du gène rapporteur suite du transfert de gène substrat médiation.
7 Validation des préservée capacité de transduction à Points temporisés
- Préparer l'annonce de eGFPmailles rivatized utilisant RHC, IHC, SHC et NHC pour le vecteur tethering (comme par 02.01 à 02.11 et de 03.01 à 03.09) et placer individuellement les mailles dans les puits d'une plaque de 96 puits avec 60-80% de cellules endothéliales aortiques bovines confluentes (BAEC ).
- Analyser la transduction de culture BAEC avec filet immobilisé annonce eGFP à 1 et 2 jours de placement post-maille en utilisant la microscopie par fluorescence et fluorimétrie (comme par 6.4 à 6.5).
- 48 heures après le début de la transduction laver deux fois les puits contenant de maille-avec PBS.
- Ajouter 200 ul de 0,25% de trypsine / EDTA à chaque puits et incuber pendant 15 min à 37 ° C sous agitation (100 rpm). Laver 3 fois avec PBS.
- Utiliser la microscopie à fluorescence et la fluorométrie pour déterminer l'élimination complète de toutes les cellules EGFP-positives associées à des mailles.
- Semences fraîchement des passages BAEC dans les puits à mailles partiellement dégagées à une densité d'ensemencement initiale de 60-80% (de 2 à 2,7 x 10 4 cellules / puits).
- Incuber la plaque à 37 ° C et 5% de CO
8 Ad-stent à élution de déploiement dans la carotide Modèle Rat de stent angioplastie
- Toutes les procédures sur les animaux décrits dans le présent protocole sont conformes aux règlements fédéraux sur l'utilisation des animaux de laboratoire et ont été approuvés par le IACUC de l'Hôpital pour enfants de Philadelphie. Pour adhérer à des conditions chirurgicales aseptiques tous les instruments sont stérilisés autoclave. Pour assurer la stérilité continue un stérilisateur à billes est utilisé entre l'utilisation des instruments jusqu'à cinq animaux consécutifs.
- Préparez annonce Luc -eluting stents selon 02.01 à 02.11 et de 03.01 à 03.09. Stocker les stents en dérivé de virus dans du PBS stérile à 4 ° C pendant une durée n'excédant pas 24 h avant utilisation.
- Anesthésier des rats mâles Sprague-Dawley (400-450 g) avec injection IP de kétamine (100 mg / kg) et de xylazine (5 mg / kg). DeTermine la profondeur de l'anesthésie par la réaction au pincement de la patte et du tonus musculaire. Appliquer une pommade ophtalmique vétérinaire pour prévenir la sécheresse de la cornée et la sclérotique. Remarque: L'anesthésie par inhalation avec 4% et 2% d'isoflurane (1 L / min) pour induire et maintenir une anesthésie, respectivement, est possible, mais empêche le libre accès à la région du cou de l'animal et n'est donc pas recommandé pour un utilisateur inexpérimenté.
- Réévaluer profondeur de l'anesthésie par pincement de l'orteil. Raser et le cou de façon aseptique de préparation et de la région de la poitrine. Administrer des antibiotiques (céfazoline, 20 mg / kg; IM), analgésique (méloxicam; 0,5 mg / kg; SC) et une solution saline (10 ml / kg; SC). Sonder la veine de la queue avec un cathéter 24 G et administrer l'héparine (200 UI / kg; IV). Remarque: Une dose de 10 mg / kg (IM) enrofloxacine (Baytril) peut être utilisé à la place de la céfazoline. Eviter l'utilisation des antibiotiques qui n'ont pas une activité significative contre les bactéries Gram-positives. 10-15 mg / kg carprofène (Rimadyl) peut être utilisé à la place de méloxicam comme un analgésique préventif. Les analgésiques narcotiques (eex., la morphine, la buprénorphine) doit être évitée en raison de leurs propriétés de respiration abaisseur.
- Effectuer une incision médiane à travers la peau et du cou fascia. Utiliser des techniques de dissection d'isoler la gauche artère carotide externe. Nouez l'artère carotide externe sur le site accessible la plus distale. Appliquer une ligature temporaire coulissante à l'origine de l'artère carotide interne.
- Faire une incision de 2 mm artériotomie gauche dans l'artère carotide externe.
- Insérer un cathéter Fogarty 2-français dans l'artère carotide commune à travers l'incision dans l'artère carotide externe. Gonflez la pointe du cathéter avec une solution saline et passer 3 de la crosse aortique à la bifurcation carotidienne pour dénuder l'endothélium.
- Faites glisser un morceau de tube (1,04 mm de diamètre extérieur, 0,99 mm de diamètre) sur le cathéter Fogarty et dans l'artère carotide commune. Retirer le cathéter Fogarty.
- Mont et sertir une annonce Luc -derivatized stent sur le ballonnet de 1,5mm diamètre cathéter d'angioplastie. Insérez le stent à travers le tube de Téflon et l'avancer dans la mi-section de l'artère carotide commune. Évitez de frotter le stent contre la paroi du tube ou d'un navire.
- Déployer le stent à 12 atm pendant 30 secondes et retirer le cathéter d'angioplastie.
- Nouez l'extrémité proximale de l'artère carotide externe au site artériotomie et libérer la ligature temporaire sur l'artère carotide interne.
- Réparer la plaie opératoire en couches avec l'exécution 4.0 Vicryl suture et agrafes de la peau.
- Récupérer l'animal sur un coussin chauffant jusqu'à ambulatoire et revenir à sa cage isolée. Même si aucun signe de douleur ou d'inconfort sont généralement exposées par les animaux post-opératoires au-delà les 12 premières heures après la procédure, étudier l'extension de la thérapie de meloxicam (0,5 mg / kg, SC par jour) pendant 72 heures.
9 bioluminescence imagerie de l'expression génique artérielle
- A des moments prédéterminés (1 jour - 3gamme semaines) après le déploiement du stent à élution de gène dans l'artère carotide commune, anesthésier le rat sous anesthésie par inhalation d'isoflurane (2-4% d'isoflurane dans de l'oxygène).
- Retirez les agrafes chirurgicales, préparer de façon aseptique le site et rouvrir la plaie opératoire. Utilisation accès dissection émoussé, re-prise de l'artère carotide commune gauche et le séparer du nerf vague et le tissu conjonctif adjacent.
- Préparer un mélange de 50 mg / ml dans du PBS Luciferin et 25% de Pluronic F-127 dans du PBS (1: 4 v / v) et le stocker sur la glace. Remarque: cette formulation se présente comme une solution visqueuse à 4 ° C et se transforme en gel au contact avec le tissu à 37 ° C immédiatement.
- Appliquer 200 ul d'une Luciferin / mélange Pluronic frais directement au segment exposé de l'artère carotide commune et de vérifier la solidité du gel.
- Placez l'animal dans la position couchée sur le dos dans la chambre de l'imagerie de l'appareil SIIV-Spectrum et maintenir une anesthésie isoflurane avec un masque.
- Dans le acquisitisur la fenêtre du panneau de commande (image vivante, version 4.2 ou ultérieure) choisir la position "B" (6,6 cm caméra à distance de l'objet) et binning facteur «moyen» dans les menus déroulants intitulé «champ de vision» et «catégories», respectivement. Tapez «2,5 cm» dans la case objet en hauteur. Choisissez "min", une unité de temps dans la case "temps d'exposition", et choisissez une valeur numérique de "2".
- Trois minutes après l'application de la / gel Pluronic Luciferin, lancer l'acquisition d'image en cliquant sur le bouton "Acquérir" sur l'écran. Note: l'image le temps d'acquisition peut varier de 1 à 6 min en fonction de l'intensité du signal attendu.
- Après l'acquisition de l'image, laver le gel hors avec une solution saline et tamponnez l'espace périartériel avec de la gaze et coton applicateurs stériles.
- Fermer la plaie avec Vicryl suture et agrafes de la peau.
- Récupérer l'animal et retourner dans sa cage. Répétez l'imagerie à plus tard tdes points ime d'étudier l'évolution temporelle de l'expression des artériel provoqué par les vecteurs Ad-stent immobilisé.
- Sinon, effectuer l'imagerie suite d'une administration systémique de la luciférine. Anesthésier et prep l'animal par 9.1-9.2. Sonder la veine de la queue avec un cathéter 24 G et le cathéter sécurisé avec du ruban adhésif chirurgical.
- Préparer une solution de luciférine dans du PBS (50 mg / ml) et injecter 1 ml de la solution à travers le cathéter sur un intervalle de 10 secondes. Une minute après l'injection de commencer l'acquisition d'images selon 9.7 à 9.8. Remarque: Un taux d'injection rapide (<10 s) peut provoquer l'activité de saisie et un arrêt respiratoire. L'animal doit être euthanasié si les crises ou arrêt respiratoire se produisent lors de l'imagerie.
- Suivez l'étape 9.10.
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Representative Results
Expériences vecteur de sortie
Attache des vecteurs adénoviraux à la surface des implants, y compris les dispositifs d'intervention tels que des stents endovasculaires, se rapproche du vecteur au site de la maladie, ce qui évite en partie l'absence de vecteurs de ciblage physique. Cependant, pour pouvoir obtenir des effets thérapeutiques via la transduction du tissu cible, le vecteur doit être libéré à partir de la surface (figure 2). L'utilisation d'agents de reticulation hydrolysables a émis l'hypothèse de permettre une) fixation efficace des vecteurs de polybisphosphonate modifiés, des implants métalliques thiol-installé et 2) à libération prolongée médiées par hydrolyse de l'agent de réticulation.
Le nombre de copies génomiques de vecteur Ad eGFP associés avec les disques de mailles à la fin de la procédure de transformation en dérivé est déterminé par PCR de l'ADN viral avec des amorces spécifiques de eGFP (figure 3). Selon l'agent de réticulation spécifique utilisé, la quantité de vecteur Ad lié devrait varier entre 3,5 x 10 9 et 5,7 x 10 9 particules / maille. Ce montant est en correspondance avec juste la capacité estimée maximale (2,5 x 10 9) d'un seul disque de maille avec une superficie totale de 0,25 cm 2 pour accueillir particules d'annonce 100 nm dans un arrangement monocouche. Depuis le montant de départ de vecteur Ad à l'étape de modification de réticulation est de 5 x 10 11 particules, seul environ 1% du vecteur modifié est finalement immobilisés sur la PABT / PEI PDT -derivatized surface en acier inoxydable.
Les deux sont attendus le taux d'hydrolyse en ester à chaîne et le nombre de liens entre le vecteur et le biomatériau à affecter la cinétique globale de vecteur Ad libération de la surface.
Afin de faciliter les expériences de libération, les particules d'adénovirus peuvent être pré-étiquetées avec fluorophore Cy3 (Protocole; section 1) avant de réticulation adaptationstion et l'immobilisation de surface (Protocole; section 3). La diminution de la fluorescence de la surface associée dans le temps simultanément évalués par fluorimétrie (figure 4A) et la microscopie à fluorescence (Figure 4B) peut alors être utilisé comme une méthode indirecte pour surveiller vecteur mise en tampon physiologique. Les vecteurs Ad attachés par des CHR et IHC liens devraient démontrer la libération nettement plus rapide en comparaison avec leur SHC- et homologues NHC inscrits. Dans l'exemple donné, à 45% et une perte de vecteur associé à la surface de 39% a été observée avec RHC et IHC-captif vecteur par jour 30, respectivement, alors que moins de 20% de vecteur captif a été observée à être libérés dans SHC et NHC échantillons -immobilized (figure 4A).
En outre, les vecteurs Ad immobilisées à l'aide de différentes concentrations de la même HC et donc probablement avoir un nombre différent d'attaches entre le vecteur et le substrat métallique doit avoircinétique différents de vecteur de presse. En effet, la modification de vecteur à l'aide mM RHC 0,1 a entraîné des taux de libération beaucoup plus rapidement que ceux observés pour le vecteur immobilisé avec mM RHC 0,5 (figure 4A). Les données de microscopie par fluorescence (figure 4B) corrèle bien avec l'analyse vecteur libération quantitative basée fluorimétrie, démontrant une diminution plus rapide et plus profonde de la fluorescence de surface associés avec des échantillons de maille formulé en utilisant IHC-, RHC- et surtout à faible concentration vecteurs RHC-captifs en comparaison avec leurs homologues NHC- et SHC-attachés.
Dans la transduction in vitro avec Mesh Immobilized annonce Vecteurs
En étant compatible à la fois avec l'analyse quantitative de l'expression (par fluorimétrie) et observations spatiales (microscopie de fluorescence), des annonces eGFP est le vecteur rapporteur préféré pour suivre la transduction de SMC et endothelialescultures de cellules traitées avec les deux vecteurs Ad libres et maille immobilisé. La modification chimique de la capside des annonces avec RHC (Figure 5) ainsi que d'autres agents de réticulation (non représenté) à des concentrations supérieures à 75 uM altère considérablement la transduction efficacité de vecteur non immobilisé in vitro, probablement en raison de masquage et la reconfiguration de tête de la fibre domaines utilisés par l'annonce pour la liaison aux cellules par les récepteurs Coxsackie-adénovirus (CAR). Cependant, le rôle des interactions bouton-CAR est moins vital pour la transduction avec le substrat immobilisé vecteur puisque le vecteur est retenu dans le voisinage des cellules ciblées par attacher au substrat. Dans les expériences de culture cellulaire, indépendamment du type de HC, vecteurs Ad maille associée sont toujours susceptibles de restreindre l'espace des événements de transduction de cellules situées à l'intérieur 300-500 um des frontières de la maille (figures 6A et 6C). Typiquement les niveaux de transgen de pointee expression sont atteints 3-5 jours après le placement de l'annonce eGFP chargé en mailles en SMC (figures 6A et 6B) ou BAEC (figures 6C et 6D) cultures. À la même charge de vecteur, les concentrations maximales d'expression eGFP augmentent dans l'ordre suivant: NHC-, SHC-, IHC- et vecteur RHC-captif, ce qui reflète les différences dans leurs profils libération cinétiques respectives (Figure 4). En outre, l'expression du transgène plus durable est observée dans les cellules traitées avec des mailles IHC formulés par rapport aux cellules traitées avec les homologues CHR formulés (Figure 6D).
Le système de culture de cellules utilisé présente une configuration commode pour l'étude des événements de transduction retardée provoquée par les particules de vecteur libérés de la surface du métal ou au plus tard 48 heures après la pose de treillis. Dans cette application, après détermination de l'expression de eGFP par fluorometmicroscopie ry et fluorescence à 48 heures après le début de la transduction, BAEC sont trypsinisée et aspiré des puits sans déranger les mailles. Fraîchement des passages non transduites BAEC sont ensuite re-plaqué sur les mailles partiellement libérés. Les "nouvelles" événements de transduction provoquées par les particules virales libérées par le transporteur à mailles après le point de temps de deux jours sont ensuite évaluées par microscopie à fluorescence et fluorimétrie (figures 7A et 7B). Expression eGFP robuste démontrant la restriction spatiale caractéristique à un lieu de maillage est généralement observé dans ces «nouvelles» cultures (Figure 7), confirmant une capacité de transduction bien conservé des vecteurs Ad maille lié même après 48 exposition h pour compléter le milieu de culture cellulaire à 37 ° C.
Études in vivo
Pour examiner les effets potentiels liés à l'uvecteur de soi HC différent sur la transduction artérielle, les animaux implantés avec Ad Luc -eluting stents préparés avec RHC-, IHC-, SHC- et NHC-modifié a subi une imagerie bioluminescente et 8 jours après le déploiement du stent (figure 8). L'imagerie a été réalisée suite à l'administration périvasculaire locale de luciférine (2 mg) co-formulé avec du gel Pluronic. Cette formulation est un fluide visqueux lorsque refroidi sur de la glace, mais subit une transition de phase immédiate de gel lorsqu'il est mis en contact avec le tissu à 37 ° C. Des expériences préliminaires (non représentées) ont démontré que l'administration périvasculaire des résultats de la luciférine en signaux de luminescence plus stables et reproductibles en Ad Luc -transduced tissu vasculaire par rapport aux systémique (intrapéritonéale ou intraveineuse) de la luciférine.
Si le virus attacher au stent et la chirurgie de déploiement d'endoprothèse était techniquement valable, un signal bien défini correspondant au segment de stentrat artère carotide est émise et enregistrée. Un jour après l'implantation du stent, les animaux traités avec RHC Ad-Luc formulées stents présentent typiquement le signal de luminescence la plus élevée, suivie par les rats recevant IHC- et SHC- formulé stents (figures 8A et 8B). Aucun signal perceptible est observée dans le groupe de rats implantés avec des stents préparé en utilisant NHC-attaché annonce Luc, soulignant l'importance du vecteur de presse libre du stent pour la transduction efficace de tissu vasculaire (figures 8A et 8B). Le jour 8, l'intensité moyenne de l'expression de la luciférase avec des stents RHC formulées tombe plusieurs fois, tandis qu'elle augmente 1,4 et 1,8 fois avec IHC- et stents SHC-formulées, respectivement (figures 8A et 8B). Ce résultat est cohérent avec l'hypothèse de la transduction vasculaire plus durable avec des stents à élution de gènes présentant une parenté plus lentétique de vecteur libération de la surface du stent.
Figure 1. formules structurelles des agents de réticulation (NHC SHC, IHC et CHR) utilisés dans les études décrites (modifiée avec la permission 28).
Figure 2: Un schéma représentant vecteur Ad attacher à un PABT / PEI PDT -Modified surface en acier inoxydable par un HC et la libération subséquente du vecteur à l'agent de réticulation hydrolyse (modifiée avec la permission 28).
3. quant à base de PCR Figurefication de l'annonce eGFP immobilisé par l'agent de réticulation attache sur la surface de PABT / PEI PDT -Modified mailles en acier inoxydable. Les mailles en acier inoxydable ont été formulés avec l'annonce eGFP immobilisé par RHC, IHC, SHC, ou NHC (n = 3 pour chaque condition ). Après la protéinase K, l'ADN viral a été élue et purifiée en utilisant des colonnes MinElute. L'amplification de l'ADN viral en utilisant des amorces spécifiques eGFP a été réalisée dans un système PCR en temps réel 7500 et a été détectée avec SYBR Green. La normalisation des données était basée sur une courbe d'étalonnage préparée avec une quantité connue d'Ad eGFP non immobilisé (modifié avec autorisation 28).
Figure 4 Cinétique de libération de vecteur Ad attachés à des substrats métalliques avec SC. Stainless mailles d'acier ont été dérivés avec ~ 2 x 10 particules de l'annonce 9 Cy3 marqués attachés à la PABT / PEI PDT -Modified surface après modification avec 500 uM NHC, SHC, IHC, CHR et 100 uM RHC (désigné comme RHC-L). La libération de marquage fluorescent Ad-particules a été étudiée au niveau des points de temps indiqués par (A) fluorimétrie bien-scan à 550/570 nm et (B) de la microscopie à fluorescence (ensemble de filtre rhodamine; 200X de grossissement). Résultats fluoro sont présentés en moyenne ± SEM, n = 8-10; p <0,001 pour toutes les comparaisons entre le NHC et CSS vs IHC, CHR et les groupes RHC-L a été déterminée par un test Anova avec post-hoc de Tukey (modifiée avec la permission 28).
Figure 5 transduction efficacité de non-immobilisé annonce eGFP suite à la modification de RHC. Rat embryonnaire aorte dérivés SMC (A10 ligne) ont été transduites à une MOI de 1000 soit avec l'annonce non modifiée eGFP ou vecteur modifié avec RHC comme indiqué. Une expression de journaliste a été déterminée par fluorimétrie (485/535 nm) de 48 h après transduction (modifiée avec la permission 27).
Figure 6 transduction de culture SMC et BAEC avec le vecteur de l'annonce immobilisé à l'acier inoxydable en prise avec SC. Maillages ont été dérivés avec ~ 2 x 10 9 Annonces particules eGFP annexées par NHC, SHC, IHC, et CHR. Les mailles ont ensuite été placés individuellement sur le dessus du sous-confluentes A10 (A, B) et BAEC (C, D) des monocouches. Transduction (exprimée en niveaux d'expression eGFP) des cellules traitées avec des mailles annonce vecteur captifs a été évaluée par fluorescence microscopie (A, C; ensemble FITC de filtre; 100X de grossissement) et fluorimétrie bien-scan (B, D). Résultats fluoro sont présentées comme moyenne ± SEM, n = 4 (modifiée avec la permission 28). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 7 transduction compétence du substrat immobilisé vecteurs Ad à des moments retardés. Annonce eGFP a été immobilisé sur acier mailles par NHC, SHC, IHC ou CHR attaches. Les mailles ont été placés sur les monocouches BAEC subconfluentes. Deux jours après le placement, BAEC ont été traitées à la trypsine et retiré sans perturber les mailles. Nouveau, non transduites BAEC ont ensuite été ensemencées sur les mailles. AnnonceeGFP compétence transduction a été mesurée par l'expression de eGFP en utilisant la microscopie à fluorescence (A; filtre FITC ensemble; 100X de grossissement d'origine) et fluoro (B). Les mesures ont été prises à jours indiqués, des images représentatives ont été utilisées et les résultats fluoro sont des moyennes ± SEM, n = 4 (modifié d'après avec la permission 28). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 8: efficacité de la transduction du stent immobilisé annonce Luc in vivo. Annonce Luc (1,3 x 10 10 particules) a été attaché à stents endovasculaires par NHC, SHC, IHC ou CHR (n = 3-4 pour tous les groupes). L'efficacité de transduction de l'annonce Luc </ Sub> élue de stents a été mesurée par bioluminescence imagerie (SIIV Spectrum) 1 et 8 jours après le déploiement stent (A), et placés en utilisant une échelle logarithmique (B) (modifié d'après avec la permission 28). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une plus grande version de ce chiffre.
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Discussion
Le protocole présenté décrit un mode opératoire pour la délivrance de gènes à médiation de substrat obtenue par l'attachement réversible de vecteurs adénoviraux pour des surfaces sans manteau en acier inoxydable. Bien que développé dans le but spécifique de traitement de la resténose vasculaire gène à base d'endoprothèse, cette technique a des applications beaucoup plus larges dans les domaines des biomatériaux, des implants biomédicaux et la thérapie génique.
Bien que les études présentées ont utilisé uniquement en acier inoxydable comme substrat de métal prototypique, PABT se lie d'autres alliages de métaux tels que le cobalt / chrome et du nitinol avec une affinité comparable (non publié). L'interaction indiscriminée de PABT avec des métaux élargit considérablement le nombre d'applications biomédicales potentielles de cette technologie 31. De plus, l'utilisation de vecteurs de gènes de HC-attaché, mais nécessitant d'autres méthodes de montage du thiol sur la surface du matériau, est réalisable avec d'autres types de biomatériaux.
ontenu "> Bien que des vecteurs de gènes Ad réaliser la transduction du solide dans de nombreux types et de tissus de cellules humaines, leur signification clinique est limitée par des réponses inflammatoires et immunitaires fortes provoquées par Adenoviridae 4. À cette fin, prolongé (4 mois) expression artériel avec les stents de gènes éluant formulées en utilisant la modification de HC de vecteurs viraux adéno-associés luciférase exprimant a été récemment montré (non publié).La méthodologie est robuste. De faibles écarts par rapport au protocole principal ne conduisent généralement pas de modifications significatives de l'expression des gènes in vitro et in vivo. Néanmoins, plusieurs questions critiques qui peuvent affecter les résultats ont été identifiés.
D'abord, comme son nom l'indique, des agents de reticulation clivables sont hydrolysables après réaction avec de l'eau due à l'hydrolyse de l'ester dans la chaîne. En outre, le groupement amine-réactif, N -sulfosuccinimidyl est hydrolysable aussi. Des agents de réticulation doivent être stockés uelon une atmosphère d'argon à -20 ° C pour conserver leur activité. Pour les mêmes raisons, après la préparation de solutions de HC (section de protocole 3.2) procéder immédiatement à l'ajout de solutions de HC pour les préparations de virus.
Deuxièmement, des groupes thiol qui sont formées sur la surface du métal au cours de plusieurs étapes intermédiaires de la séquence présentée bioconjugaison sont rapidement oxydés par l'oxygène de l'air ambiant. Pour éviter cela, garder les échantillons de métal vulnérables immergés dans de l'eau dégazée à tout moment.
Troisièmement, un parfait alignement de la maille avec le fond du puits est nécessaire pour la transduction réussie. Ne pliez pas les disques de maillage lors de la manipulation.
Quatrièmement, éviter un frottement excessif de stents à élution de gènes contre la gaine en téflon et paroi de la cuve lors de l'insertion d'un stent pour empêcher le délogement des vecteurs Ad surface associé.
La fixation covalente de vecteur de gène à la surface de biomateria implantablels a un avantage évident d'un meilleur contrôle sur la cinétique de libération que vecteur de réalisation avec modem non covalente des vecteurs. Dans le cadre de la livraison de gènes de plate-forme de stent plupart des études rapportent une libération complète de vecteurs viraux et non viraux au sein de 1-7 jours après pose de stent déploiement 32-34. D'autre part, vecteur Ad immobilisation par HC démontré la libération de seulement 20-45% de la charge de vecteur dans le premier mois (figures 4A et 4B). De plus, une libération partielle de modulation et de transduction cinétique est réalisable à l'aide de différents HC présentant une cinétique d'hydrolyse différents ou en faisant varier la concentration de HC utilisé pour la modification de surface du virus. En outre, un co-modification concurrente du vecteur avec différentes molécules d'agent de réticulation, mais pas exploré dans la présente étude, fournit une autre occasion de peaufiner la libération de vecteur et de la transduction.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 316 stainless steel mesh disks | Electon Microscopy Sciences | E200-SS | |
| Generic 304-grade stainless steel stents | Laserage | custom order | |
| AdeGFP | University of Pennsylvania Vector Core | AD-5-PV0504 | |
| AdLuc | University of Pennsylvania Vector Core | AD-5-PV1028 | |
| AdEMPTY | University of Pennsylvania Vector Core | A858 | |
| Cy3(NHS)2 | GE Healthcare | PA23000 | |
| Sepharose 6B | Sigma-Aldrich | 6B100-500ML | |
| UV 96-well plates | Costar | 3635 | |
| Fluorometry 96-well plates | Costar | 3915 | |
| Cell culture 96-well plates | Falcon | 353072 | |
| Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride (TCEP) | Pierce Thermo Scientific | 20490 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Pierce Thermo Scientific | 20290 | |
| sulfo-LC-SPDP | Pierce Thermo Scientific | 21650 | |
| Spectrophotometer | Molecular Devices | SpectraMax 190 | |
| Spectrofluorometer | Molecular Devices | SpectraMax Gemini EM | |
| Orbital shaker incubator | VWR | 1575R | |
| Horizontal airflow oven | Shel Lab | 1350 FM | |
| Centra-CL2 centrifuge | International Equipment Company | 426 | |
| Digital vortex mixerer | Fisher Thermo Scientific | 02-215-370 | |
| Eclipse TE300 fluorescence microscope | Nikon | TE300 | |
| DC 500 CCD camera | Leica | DC-500 | |
| 7500 Real-Time PCR system | Applied Biosystems | not available | |
| IVIS Spectrum bioluminescence station | Perkins-Elmer | not available | |
| EDTA dipotassium salt | Sigma-Aldrich | ED2P | |
| Bovine serum albumin fraction V (BSA) | Fisher Thermo Scientific | BP1600-100 | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P1379 | |
| Dumont forceps | Fine Science Tools | 11255-20 | |
| A10 cell line | ATCC | CRL-1476 | |
| Bovine aortic endothelial cells | Lonza | BW-6002 | |
| Luciferin, potassium salt | Gold Biotechnology | LUCK-1Ge | |
| Pluronic F-127 | Sigma-Aldrich | P2443-250G | |
| PBS without calcium and magnesium | Gibco | 14190-136 | |
| Fetal bovine serum | Gemini Bio-Products | 100-106 | |
| Penicillin/Streptomycin solution | Gibco | 11540-122 | |
| DMEM, high glucose | Corning cellgro | 10-013-CV | |
| 0.25% Trypsin/EDTA | Gibco | 25200-056 | |
| QIAamp DNA micro kit | Qiagen | 56304 | |
| Power Sybr Green PCR Master Mix | Applied Biosystems | 4367659 | |
| MicroAmp Optical 96-well Reaction Plate | Applied Biosystems | N8010560 | |
| MicroAmp Optical Adhesive Film | Applied Biosystems | 4360954 | |
| Cephazolin | Apotex | not available | |
| Loxicom (Meloxicam) | Norbrook | not available | |
| Heparin sodium | APP Pharmaceuticals | not available | |
| Ketavet (Ketamine) | VEDCO | not available | |
| Anased (Xylazine) | Lloid | not available | |
| Forane (Isoflurane) | Baxter | not available | |
| Curved Moria iris forceps | Fine Science tools | 11370-31 | |
| Curved extra-fine Graefe forceps | Fine Science Tools | 11152-10 | |
| Dumont #5 forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| Vannas spring scissors | Fine Science Tools | 15018-10 | |
| Fine scissors - ToughCut | Fine Science Tools | 14058-09 | |
| Surgical scissors | Fine Science Tools | 14101-14 | |
| Vicryl suture (5-0) | Ethicon | J385 | |
| Suture thread (4/0 silk) | Fine Science Tools | 18020-40 | |
| Michel suture clips | Fine Science Tools | 12040-02 | |
| Wound dilator (Lancaster eye specula) | KLS Martin | 34-149-07 | |
| Hot bead sterilizer | Fine Science Tools | 18000-45 | |
| Michel suture clip applicator | Fine Science Tools | 112028-12 | |
| Insyte Autoguard 24 G IV catheter | Beckton-Dickinson | 381412 | |
| 2F Fogarty catheter | Edwards Lifesciences | 120602F | |
| Teflon tubing | Vention | 041100BST | |
| PTA catheter | NuMed | custom order | |
| Gauze pads | Kendall Healthcare | 9024 | |
| Cotton applicators | Solon Manufacturing | WOD1003 | |
| Saline | Baxter | 281321 | |
| 10 ml syringe (Luer-Lok) | Beckton-Dickinson | 309604 | |
| 1 ml syringe (Luer-Lok) | Beckton-Dickinson | 309628 | |
| Clippers with #40 blade | Oster | 78005-314 | |
| Transpore surgical tape | 3M | MM 15271 | |
| Puralube vet ointment | Pharmaderm | not available |
References
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