Abstract
In-stent restenose er en stor komplikation af stent-baserede revaskulariseringsprocedurer udbredte at genetablere blodstrømmen gennem kritisk indsnævret segmenter af koronare og perifere arterier. Endovaskulære stenter stand tunable frigivelse af gener med anti-restenotiske aktivitet kan udgøre en alternativ strategi for øjeblikket anvendte stof-stents. For at opnå klinisk oversættelsen skal gen-stents udviser forudsigelige kinetikker af stent-immobiliserede genvektor frigivelse og stedspecifik transduktion af vaskulatur, og samtidig undgå en overdreven inflammatorisk reaktion typisk er forbundet med de polymere belægninger, der anvendes til fysisk indfangning af vektoren. Dette papir beskriver en detaljeret metode til coatless opbinding af adenovirale genvektorer til stenter baseret på en reversibel binding af adenoviruspartikler polyallylamin bisphosphonat (PABT) -modificeret rustfrit stål overflade via hydrolyserbare krydsbindere (HC). En familie afbifunktionelt (amin- og thiol-reaktive) HC med en gennemsnitlig t 1/2 af den i kæde esterhydrolyse spænder mellem 5 og 50 dage blev anvendt til at forbinde vektor med stenten. Vektoren immobilisering procedure udføres typisk inden for 9 timer, og består af flere trin: 1) inkubation af metalprøver i en vandig opløsning af PABT (4 timer); 2) afbeskyttelse af thiolgrupper installeret i PABT med tris (2-carboxyethyl) phosphin (20 min); 3) udvidelse af thiolreaktiv kapacitet metaloverfladen ved omsætning af prøverne med polyethylenimin derivatiseret med pyridyldithiogrupper (PDT) grupper (2 timer); 4) omdannelse af PDT grupper thioler med dithiothreitol (10 min); 5) ændring af adenovirusser med HC (1 time); 6) oprensning af modificerede adenovirale partikler med stør-søjlekromatografi (15 min) og 7) immobilisering af thiolreaktive adenovirale partikler på thiolerede ståloverflade (1 time). Denne teknik har bred potentiel anvendelighed over stenter,ved at lette overflade manipulation af bioprotetiske enheder for at forbedre deres biokompatibilitet gennem substratet-gentilførsel til cellerne grænseflade implanterede fremmed materiale.
Introduction
Effektiviteten af genterapi som en terapeutisk modalitet er hæmmet af den dårlig målretning kapacitet genterapivektorer 1,2. Manglen på ordentlig målretning resulterer i sub-terapeutiske niveauer af transgen ekspression på målet placering og fører til en bred formidling af vektorer til ikke-målorganer 3, herunder de ansvarlige for montering af immunreaktioner mod både vektor og kodet terapeutisk produkt 4, 5. Et potentielt middel til at udligne promiskuitet af transduktion og fremme målretning er at indføre genvektorer på det ønskede sted i en form, der udelukker deres frie udbredelse via blod og lymfe. Typisk sådanne bestræbelser stole på en lokalt injicerbare afgivelsessystemer bestående af enten virale eller ikke-virale vektorer blandet med fibrin, collagen eller hyaluronsyre hydrogelmatricer 6-10, der er i stand til transient sustaining genvektorer på injektionsstedet ved fysisk at indeslutte them i et polymert netværk.
Et andet generelt accepteret paradigme for lokaliseret genterapi udnytter immobilisering af genvektorer på overfladen af implanterede proteser 11,12. Permanente medicinske implantater (endovaskulære, bronkier, urologiske og gastrointestinale stents, pacemakere, kunstige led, kirurgiske og gynækologiske masker mv.) Anvendes årligt i snesevis af millioner af patienter 13. Mens generelt effektive, disse enheder er tilbøjelige til at komplikationer, der ikke er tilstrækkeligt kontrolleret for de nuværende lægepraksis 14-17. Implanterbare proteseindretninger præsentere en unik mulighed for at fungere som proxy platforme for lokaliseret genterapi behandling. Fra farmakokinetisk synspunkt overflade derivatisering af medicinske implantater med relativt lave doser input af genvektorer resulterer i at nå begge høje lokale koncentrationer af genvektorer på implantatet / vævsgrænsefladen og langsommere kinetik their elimination fra denne placering. Som følge af langvarig ophold og forbedret optagelse af den målrettede cellepopulation, vektor immobilisering minimerer spredning af genet vektor. Således utilsigtet inokulation af ikke-målvæv reduceres.
Overflade opbinde genvektorer på implanterbare biomaterialer (som også benævnes som substrat-gentilførsel eller fast fase genlevering) er blevet gennemført i celle kultur og dyreforsøg ved hjælp af både specifikke (antigen-antistof 18-20, avidin- biotin 21,22) og ikke-specifik 23-26 (charge, van der Waals-interaktioner). Den kovalente binding af vektorer til overfladen af den implanterede enhed er tidligere blevet betragtet som ikke-funktionelle, eftersom overdrevent stærke bindinger med overfladen hinder vektor internalisering af målceller. For nylig blev det påvist, at denne begrænsning kan overvindes ved anvendelse af spontant hydrolyserbar krydsbinder anvendes som tethendes mellem den modificerede metaloverflade stenten og capsidproteiner af adenovirusvektoren 27,28. Endvidere kan vektoren frigivelseshastighed og tidsforløbet af transgenekspression in vitro og in vivo, moduleres med anvendelse af hydrolyserbare tværbindere udviser forskellige kinetik hydrolyse 28.
Nærværende dokument indeholder en detaljeret protokol for reversibel kovalent binding af adenovirusvektorer til aktiveret metaloverflade og indfører en nyttig forsøgsopstilling for at studere efterfølgende transduktion begivenheder in vitro i dyrkede glatte muskulatur og endotelceller og in vivo i rotter carotis model af stent angioplastik .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Fremstilling af Cy3-mærket adenovirus for frigivelse Eksperimenter
- Suspender 2 x 10 12 partikler af Ad tomme (ca. 2 x 10 11 infektiøse enheder) i 650 pi af carbonat / bicarbonatbuffer (CBB, pH 9,3).
- Opløs indholdet af 1 hætteglas (0,2 mg) af amin-reaktive fluorescerende farvestof (Cy3 (NHS) 2) i 1 ml CBB til en endelig koncentration på 0,2 mg / ml.
- Tilsæt 100 ul af farveopløsning til virussuspension, vortex i 5 sekunder og inkuberes i 1 time ved 28 ° C med omrystning (100-200 rpm).
- Ækvilibrer en 20 ml Sepharose 6B-søjle med PBS. Tilføj 750 pi Cy3-mærket Ad suspensionen dråbevis til centrum af gellejet.
- Efter virussuspension gennemsyrer harpiks, tilsættes 5 ml PBS. Kassér eluatet.
- Tilsæt 0,5 ml PBS, og eluatet opsamles i en mærket glasbeholder. Gentag dette trin 10x indsamle alt ti 0,5 ml fraktioner.
- Assay the indsamlede fraktioner ved spektrofotometri (260 og 280 nm) for viral DNA-indhold.
- Pool fraktionerne indeholdende mere end 10% af den samlede (summen af F1 til F10) optisk densitet (OD) ved 260 nm. Bemærk: Typisk fraktionerne F3, F4, F5 og F6 samles og blandes.
- Re-assay blandede poolede fraktioner ved spektrofotometri (260 og 280 nm), og analyse ved fluorometri (550 ex / 570 em nm) i virus-DNA-indhold og Cy3-mærkede capsid protein. Bemærk: En Cy3 (NHS) 2 kalibreringskurven dækker 10 -9 -10 -13 mol / L-serien er forberedt og fluorimetrisk analyseret på den samme plade som de samlede fraktioner.
- Beregn mærkede virusudbytte og mærkning tæthed. Antag, at 1,19 x 10 12 viruspartikler / ml svarer til 1 OD enhed til en 1 cm vejlængde 29. Brug formlen: Udbytte = [(OD 260 nm /1.19)*10 12 * V / input Ad beløb] * 100, hvor OD 260 nm er den optiske density af poolede formulering ved 260 nm, og V er rumfanget af den poolede formulering (ml) til at beregne Ad udvindingsudbytte (%). Brug formlen: Mærkning Densitet = C * 6,02 * 10 23 / (OD 260 nm /1.19)*10 12, hvor C er Cy3 koncentration af de fælles formulering (mol / ml) og OD 260 nm er den optiske tæthed af de fælles formulering på 260 nm for at beregne gennemsnittet Cy3 mærkning tæthed. BEMÆRK: En typisk genvinding af mærket virus er> 70% af den tilførte dosis. Mærkningen densitet er 600-800 fluoroforen molekyler pr enkelt viruspartikel.
- Alikvot Cy3-mærket Ad tom i mindre portioner (typisk 5 x 10 11 partikler) er egnede til de enkelte frigivelse eksperimenter. BEMÆRK: Aktuel protokol specificerer brugen af Cy3-mærket Annonce udelukkende i frigivelsen eksperiment. Alle transduktion undersøgelser udføres med umærkede vektorer.
2. Aktivering af metalprøver
- Vask af rustfrit stål mesh diske eller rustfrit stål stenter hinanden i isopropanol (5 min x 2) og chloroform (5 min x 2) ved 55 ° C med rystning (100 rpm). Opløsningsmidlet fjernes.
- Opvarm prøverne i 30 minutter ved 200 ° C.
- Opløs polyallylamin bisphosphonat med installerede latente thiolgrupper (PABT 27,28,30) i vand (1-2% w / v) ved 72 ° C med rystning (100 rpm). Justér pH til 4,5-5 med KHCO3.
- Inkuber metalprøver i PABT opløsning 2-4 timer ved 72 ° C med omrystning (100-200 rpm). BEMÆRK: Proceduren kan sættes på pause på dette punkt. Prøverne er stabile i 3 dage ved 4 ° C.
- Skyl prøverne tre gange med dobbelt destilleret vand (DDW).
- Bring prøverne tris (2-carboxyethyl) phosphin (TCEP, 15 mg / ml i 0,1 M eddikesyre-buffer) i 15 minutter ved 28 ° C med omrystning (100-200 rpm).
- Skyl 5x i afgasset DDW.
- Expose prøverne til 2% polyethylenimin med installerede pyridyldithiogrupper (PEI
- Skyl prøverne tre gange med DDW.
- Expose prøverne til 10 mg / ml ditiotreitol / DDW at konvertere pyridyldithiogrupper til thioler.
- Skyl 5x igen i afgasset DDW.
3. Adenovirus Aktivering og Metaloverflade Immobilization
- Suspender 5 x 10 11 partikler af enten Ad eGFP eller Ad Luc (ca. 5 x 10 10 infektiøse enheder) i 487,5 til 495 ul karbonat / bikarbonat buffer (CBB, pH 9,3). Bemærk: Ved undersøgelserne frigivelse, skal du bruge 5 x 10 11 af Cy3 mærket Ad tomme partikler (justere lydstyrken til 487,5 til 495 pi med CBB).
- Opløs HC med varierende hydrolysehastigheder 28 [(hurtigt (t 1/2 = 5 d), mellemliggende (t 1 /2 = 12 d) og langsomt (t 1/2 = 50 d) HC, dvs RHC IHC eller SHC, figur 1] eller ikke-hydrolyserbare tværbinder (NHC), sulfo-LC-SPDP i CBB 20 mM.
- Tilføje Umiddelbart 5-12.5 pi krydsbinder løsning på virussuspension til et samlet volumen på 500 pi (200-500 pM slutkoncentration af tværbindingsmiddel), vortex, og der inkuberes i 1 time ved 28 ° C med rystning (100- 200 rpm).
- Ækvilibrer en 20 ml Sepharose 6B-søjle med afgasset 5 mM EDTA / PBS (EPBD). Tilsættes dråbevis 500 pi tværbinder-modificerede Ad suspensionen til centrum af harpiks-bed'en.
- Der tilsættes 5 ml afgasset EPBD. Kassér eluatet.
- Tilsæt 0,5 ml afgasset EPBD og eluatet opsamles i en mærket glasbeholder. Gentag dette trin 10 gange indsamler alt ti 0,5 ml fraktioner.
- Bestem OD af de indsamlede fraktioner ved hjælp af spektrofotometri ved 260 og 280 nm og konvertere OD til virustitere (1,19 x 10 12 / ml Correrer til 1 OD) 29.
- Pool fraktionerne indeholdende> 10% af den eluerede virus (Bemærk: Typisk fraktionerne F3-F6). Gentag spektrofotometrisk titer assay for poolede suspension.
- Overførsel viral suspensionen til hætteglasset med de aktiverede metalprøver (som pr 2.11). Inkuber i en argonatmosfære i 1 time ved 28 ° C med omrystning (100-200 rpm). Bemærk: Ad-tøjret metalprøver opnået i dette trin er yderligere anvendt i de efterfølgende frigivelse og transduktion eksperimenter beskrevet i protokollen afsnittene 5-7.
4. Kvantificering af Overflade-associeret Ad Illustrationer ved PCR
- Forbered masker formuleret med overfladeimmobiliseret Ad eGFP tøjret via NHC, SHC, IHC og RHC (n = 3 for hver type) som beskrevet i afsnit 2 og 3.
- Brug et QIAamp DNA Micro kit til at isolere viralt DNA. Placer maskerne individuelt i 1,5 ml plastrør indeholdende 200 pi blanding af 180 pi ATL Buffer og 20 pi proteinase K (begge fra sættet). Tilføj kendt mængde Ad eGFP partikler (som standarder for kalibreringskurven) ind i separate rør, der indeholder den samme blanding. Inkuber ved 56 ° C natten over uden omrystning.
- Tilsæt 200 pi af AL-buffer (fra sættet), vortexes, tilsættes 200 ul 100% ethanol, og der inkuberes ved stuetemperatur i 5 min.
- Overfør blandingen fra hvert rør på en individuel MinElite søjle (fra sættet) og centrifugering ved 8.000 rpm i 1 min. Skyl mesh-holdige rør med 180 ul frisk ALT buffer, tilsættes på de respektive søjler og centrifugering ved 8.000 rpm i 1 min. Kassér eluaterne.
- Tilsæt 500 pi AW1 puffer (fra sættet) i kolonnerne og centrifugering ved 8.000 rpm i 1 min. Kassér eluaterne.
- Tilsæt 500 pi AW2 puffer (fra sættet) i kolonnerne og centrifugering ved 8.000 rpm i 1 min.
- Kassér eluaterne.
- Centrifugering ved 14.000 rpm i yderligere 3 minutter until søjlerne er helt tørre. Kassér eluaterne.
- Der tilsættes 50 ul af MilliQ-kvalitet vand i kolonnerne. Spin ved 14.000 rpm i 5 minutter. Collect 50 pi af eluatet fra hver kolonne i individuelle opsamlingsrør (fra sættet).
- Forbered PCR Master Mix løsning ved at kombinere ganger af følgende (12,5 ul Power Sybr Green PCR Master Mix, 0,63 pi 10 pM eGFP senseprimer [5'ACG TAA ACG GCC ACA AGT TC -3 '], 0,63 pi 10 uM eGFP anti-sense-primer [5'-AAG TCG TGC TGC TTC ATG TG -3 '], 6,3 ul af MilliQ-kvalitet vand). Formere disse mængder med antallet af planlagte reaktioner inklusive "ingen DNA" kontroller.
- Belastning 5 ul Ad eGFP DNA (fra trin 4.8) og 20 ul PCR Master Mix til tredobbelte brønde i en MicroAmpTM Optical 96 brønde Reaktion plade. Forsegle skiltet med MicroAmpTM optisk selvklæbende film. Spin pladen ved 1.000 rpm i 1 min for at fjerne luftbobler.
- Pladen anbringes i beholderen i en 7500 Real-Time PCR motor. I hovedmenuen i 7500 System SDS Software (v1.4 eller højere) skal du vælge "Opret nyt eksperiment". Klik på "Næste". I "Ny eksperiment guiden" skærm vælge Sybr Green fra en rulle-down menuen og klik på "Tilføj". Klik på "Næste" for at få et layout af pladen. Fremhæv alle brønde, der skal analyseres, skal du vælge Sybr Green. Fremhæv fortløbende ingen DNA-kontrol brønde, Ad eGFP DNA standarder og ubekendte, og markere dem ved hjælp af de respektive betegnelser fra scroll-down menuen.
- Skift til fanen instrumentet. Vælg "tilføj dissociation fase", ændre såvel volumen fra standard 50 ul til 25 ul. Klik på Start.
- Analyser PCR-resultater ved hjælp af efter kontrol QC sammendrag for afvigere og andre uregelmæssigheder.
5. Frigivelse Kinetik af hydrolyserbare tværbindingsmiddel-tøjret Vector Partikler fra Model Stålnet
- Vask masken prøverne derivatiseret med Cy3-mærket annonce via RHC, IHC, SHC og NHC (som pr 3.9) i 1% BSA / PBS (1 time x 3) med rystning (100-200 rpm).
- Brug sterile fin pincet placere maskerne i individuelle brønde i en 96-brønds plade udfyldt med 200 pi elueringspuffer (0,1% BSA / 0,1% Tween-20 / PBS).
- Tag fluorescerende billeder af en central del af hver maske. Optag indstillingerne for mikroskop og CCD-kameraet bruges til billedbehandling erhvervelse.
- Analysere pladen fluorimetrisk (550 ex / 570 em) i godt scanning med maksimal reduktion. Brug brøndene med ikke-derivatiserede masker som baggrund kontrol.
- Inkubér pladen ved 37 ° C med omrystning (50 rpm).
- På forudbestemte tidspunkter (1-30 dage interval) aspirere elueringsbufferen uden at forstyrre de masker og der tilsættes 200 ul frisk elueringsbuffer. Gentag trin 4,3-4,5 efter udskiftning af buffer.
6. transduktion af kulturperler Cells af Mesh-immobiliserede Ad-vektorer
- Vask Ad eGFP - eller Ad Luc -derivatized masker tre gange med sterilt PBS i 5 minutter med rystning (100 rpm).
- Brug fine steril pincet fjerne mesh diske én efter én og individuelt placere dem i brøndene på en 96-brønds plade med celletypen af interesse i log-fase af vækst.
- Inkubér cellerne i 24 timer ved 37 ° C i 5% CO2.
- Brug det respektive ikke-terminale endpoint assay (fluorescerende mikroskopi, fluorometri til eGFP eller bioluminescens billeddannelse til luciferase) for at fastslå omfanget og den geografiske fordeling af genekspression i brøndene.
- Eventuelt til erstatning medium til PBS øge følsomheden af fluorometriassay assay (485/535 nm), såfremt der forventes lav eGFP udtryk. Bemærk: Hvis et fluorometer er udstyret med godt scan kapacitet, læse pladen i et godt scanning for at vurdere den rumlige fordeling af eGFP-udtrykkende celler i brøndene. Exchange PBS til medium efter endt fluorometri.
- Billede de transducerede celler i brøndene med Ad eGFP -eluting masker (både underliggende og randområder den mesh) under anvendelse af FITC-filter sæt. Tag repræsentative billeder på 40-200X forstørrelse. Optag de nøjagtige indstillinger af fluorescerende mikroskop og CCD kamera, der anvendes til erhvervelse af billeder.
- Der tilsættes 5 ul luciferin lager i PBS (10 mg / ml) direkte til brønde med Ad Luc -eluting masker til en slutkoncentration på 500 ug / ml og inkuberes ved 37 ° C og 5% CO2 i 10 minutter forud for bioluminescens billeddannelse . Aspirer medier og erstatte med luciferin-frie medier efter billedbehandling.
- Gentag endpoint analyser på forudbestemte tidspunkter (op til 2 uger) til at studere kinetik reporter genekspression efter substrat-medieret genoverførsel.
7. Validering af konserverede transduktionsevne ved udskydelse af tid Points
- Forbered Ad eGFP derivatized maskerne med RHC, IHC, SHC og NHC til vektor tethering (som pr 2,1-2,11 og 3,1-3,9) og individuelt placere maskerne i brøndene i en 96-brønds plade med 60-80% sammenflydende bovine aortaendotelceller (BAEC ).
- Analyser transduktion af dyrket BAEC med mesh-immobiliserede Ad eGFP ved 1 og 2 dage efter mesh placering ved hjælp af fluorescensmikroskopi og fluorometri (som pr 6,4-6,5).
- 48 timer efter påbegyndelsen af transduktion vaske mesh-holdige brønde med PBS to gange.
- Tilsæt 200 pi af 0,25% trypsin / EDTA til hver brønd og inkuberes i 15 minutter ved 37 ° C med rystning (100 rpm). Vask 3 x med PBS.
- Brug fluorescerende mikroskopi og fluorometri at fastslå fuldstændig fjernelse af alle eGFP-positive celler i forbindelse med maskerne.
- Frø frisk passeret BAEC i brøndene med delvist frigivet masker på en 60-80% indledende podningstæthed (2-2,7 x 10 4 celler / brønd).
- Inkubér pladen ved 37 ° C og 5% CO
8. Ad-eluering Stent Deployment i Rat carotis Model of Stent Angioplasti
- Alle dyr, der er beskrevet i denne protokol i overensstemmelse med føderale regler for brugen af forsøgsdyr, og blev godkendt af IACUC af Børnenes Hospital i Philadelphia. At holde sig til aseptiske kirurgiske betingelser alle instrumenter er autoklave steriliseret. For at sikre kontinuerlig sterilitet en perle sterilisator er ansat mellem brug af de instrumenter i op til fem på hinanden følgende dyr.
- Forbered Ad Luc -eluting stenter ifølge 2,1-2,11 og 3,1-3,9. Opbevar virus-derivatiserede stenter i sterilt PBS ved 4 ° C ikke længere end 24 timer før brug.
- Bedøver Sprague-Dawley rotter (400-450 g) med IP-injektion af ketamin (100 mg / kg) og xylazin (5 mg / kg). DeTermine anæstesidybden ved pote knivspids respons og muskeltonus. Påfør oftalmologiske dyrlæge salve for at forhindre tørhed af hornhinden og sclera. Bemærk: Det inhalationsanæstesi med 4% og 2% isofluran (1 l / min) til induktion og vedligeholdelse af anæstesi, henholdsvis er mulig, men hindrer fri adgang til halsregionen af dyret og derfor anbefales ikke til en uerfaren bruger.
- Revurdere anæstesidybden ved tå knivspids. Shave og aseptisk prep hals og øvre bryst-regionen. Indgives antibiotikum (cefazolin, 20 mg / kg, IM) analgetikum (meloxicam, 0,5 mg / kg, SC) og saltvand (10 ml / kg, SC). Selvkaterisation halevenen med en 24 G kateter og administrere heparin (200 IE / kg; IV). Bemærk: En dosis på 10 mg / kg (IM) enrofloxacin (Baytril) kan anvendes i stedet for cefazolin. Undgå anvendelse af antibiotika, der mangler væsentlig aktivitet mod Gram-positive bakterier. 10-15 mg / kg carprofen (Rimadyl), kan anvendes i stedet for meloxicam som et forebyggende analgetisk. Narkotiske analgetika (e.eks. bør morfin, buprenorphin) undgås på grund af deres åndedræt-deprimerende egenskaber.
- Udfør en midtlinjeincision gennem huden og halsen fascia. Brug stump dissektion teknikker til at isolere den venstre ydre carotidarterie. Tie-off den ydre halspulsåre på det mest distale ubureaukratiske site. Påfør en glidende midlertidig ligatur til oprindelsen af det indre halspulsåre.
- Lav en 2 mm arteriotomi snit i venstre ydre carotidarterie.
- Sæt et 2-French Fogarty kateter i arteria carotis communis gennem snittet i den ydre halspulsåre. Pump spidsen af kateteret med saltvand og videregive 3x fra aortabuen til carotis forgreningen med henblik på at denude endotelet.
- Skub et stykke slange (1.04 mm OD, 0,99 mm indvendig diameter) over Fogarty kateteret og ind i den fælles halspulsåre. Træk Fogarty kateter.
- Mount og krympe en annonce Luc -derivatized stent over ballonen af en 1,5mm angioplastik kateter. Indsæt stenten gennem teflonrør og fremme det i midtersektionen af den fælles halspulsåre. Undgå gnide stenten mod røret eller karvæggen.
- Implementer stenten ved 12 atm i 30 sek og trække angioplastik kateter.
- Tie-off ydre carotidarterie proximalt til arteriotomistedet og slip midlertidig ligatur på den indre halspulsåre.
- Reparer operationssår i lag med at køre 4.0 Vicryl sutur og hæfte huden.
- Recover dyret på en opvarmning pad indtil ambulant og vende tilbage til sin isolerede bur. Mens ingen tegn på smerte eller ubehag typisk udstillet af postoperative dyr ud over den første 12 timer efter indgrebet, overveje en udvidelse af meloxicam behandling (0,5 mg / kg, SC dagligt) i 72 timer.
9. Bioluminescens Imaging af Arteriel Gene Expression
- På forudbestemte tidspunkter (1 dag - 3uger interval) efter gen sk stent indsættelse i den fælles halspulsåre, bedøver rotten anvendes isofluran inhalation anæstesi (2-4% isofluran i oxygen).
- Fjern de kirurgiske hæfteklammer, aseptisk forberede sitet og genåbne det operationssår. Ved stump dissektion, re-få adgang til den venstre, fælles carotidarterie og adskille den fra vagusnerven og tilstødende bindevæv.
- Klargør en blanding af 50 mg / ml Luciferin i PBS og 25% Pluronic F-127 i PBS (1: 4 v / v) og gemme den på is. Bemærk: Denne formulering viser sig som en viskos opløsning ved 4 ° C og straks bliver til gel ved kontakt med væv ved 37 ° C.
- Påfør 200 pi af en kølet Luciferin / Pluronic blanding direkte til den eksponerede del af den fælles carotidarterie og kontrollere gel soliditet.
- Placer dyret i liggende position i imaging kammer IVIS-Spektrum-apparatet og opretholde isofluran anæstesi med en ansigtsmaske.
- I acquisitipå kontrolpanelet vindue (Living Image, version 4.2 eller højere) vælge position "B" (6,6 cm kamera til at gøre indsigelse afstand) og udsmidningen faktor "medium" fra dropdown menuerne titlen "synsfelt" og "Binning" hhv. Indtast "2,5 cm" i emne højde kassen. Vælg "Min" som en enhed af tid i "eksponeringstid" boksen, og vælg en numerisk værdi på "2".
- Tre minutter efter anvendelse af Luciferin / Pluronic gel, start billede erhvervelse ved at klikke på knappen "Acquire" på skærmen. BEMÆRK: Billede erhvervelse tid kan variere fra 1 til 6 minutter, afhængigt af den forventede signalstyrke.
- Efter modtagelsen af billedet, vaskes gelen af med saltvand og dup periarterial rum med steril gaze og bomuld applikatorer.
- Lukke såret med Vicryl sutur og hæfte huden.
- Recover dyret og vende tilbage til sit bur. Gentag billeddannelse på senere time punkter for at studere tidsforløbet af arteriel ekspression fremkaldt af stent-immobiliseret Ad-vektorer.
- Alternativt udføre billedbehandling efter en systemisk administration af luciferin. Anesthetize og prep dyret pr 9.1-9.2. Selvkaterisation halevenen med en 24 G kateter og sikker kateter med hæfteplaster.
- Der fremstilles en opløsning af luciferin i PBS (50 mg / ml) og injicere 1 ml af opløsningen gennem katetret over en 10 sek interval. Et min efter injektion startbillede køb pr 9,7-9,8. Bemærk: En hurtigere injektion sats (<10 sek) kan fremprovokere anfald og respirationsstop. Dyret skal aflives, hvis anfald eller respirationsstop forekomme under billedbehandling.
- Følg trin 9.10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vektor frigivelsesforsøg
Deling af adenovirusvektorer til overfladen af implantater, herunder interventionelle enheder såsom endovaskulære stenter, tilnærmer vektoren sygdomsstedet delvis overflødiggøre manglende vektorer fysiske målretning. For at være i stand til at opnå terapeutiske effekter via transduktion af målvævet skal vektoren frigives fra overfladen (figur 2). Anvendelse af hydrolyserbare tværbindere Hypotesen var at muliggøre en) effektiv fastgørelse af vektorer til polybisphosphonate modificerede, thiol installeret metalimplantater og 2) sustained release medieres ved hydrolyse af tværbinderen.
Antallet af genomiske kopier af Ad eGFP vektor forbundet med mesh diske ved udgangen af derivatisering procedure bestemmes ved PCR af virus-DNA med eGFP-specifikke primere (figur 3). Afhængigt afspecifik tværbinder anvendes, mængden af bundet Ad vektor bør variere mellem 3,5 x 10 9 og 5.7 x 10 9 partikler / mesh. Dette beløb er i rimelig korrespondance med den estimerede maksimale kapacitet (2,5 x 10 9) af en enkelt maskestørrelse skive med et samlet areal på 0,25 cm2 til at rumme 100 nm Ad-partikler i et monolag arrangement. Da grundbeløbet af Ad-vektor på trin af krydsbinder modifikation er 5 x 10 11 partikler er kun ~ 1% af den modificerede vektor sidst immobiliseret på PABT / PEI PDT -derivatized rustfrit stål overflade.
Både antallet af in-kæde ester hydrolyse og antallet af links mellem vektor og biomateriale forventes at påvirke de overordnede kinetik af Ad vektor frigørelse fra overfladen.
For at lette frigivelsen eksperimenter adenoviruspartikler kan præ-mærket med Cy3 fluorophor (protokol afsnit 1) forud for krydsbinder ændringer udvition og overflade immobilisering (protokol afsnit 3). Faldet i overflade-associeret fluorescens over tid vurderes samtidig ved fluorometri (figur 4A) og fluorescensmikroskopi (Figur 4B), kan derefter anvendes som en indirekte metode til overvågning vektor frigivelse i fysiologisk buffer. Ad-vektorer knyttet gennem RHC og IHC bindinger bør udvise betydeligt hurtigere frigivelse i sammenligning med deres SHC- og NHC-vedhæftede modstykker. I det givne eksempel blev en 45% og et tab 39% af overflade-associeret vektor observeret med RHC og IHC-tøjret vektor ved dag 30, henholdsvis mens mindre end 20% af tøjret vektor blev observeret til at blive frigivet i SHC og NHC -immobilized prøver (figur 4a).
Derudover Ad-vektorer immobiliseres ved anvendelse af forskellige koncentrationer af den samme HC og dermed formodentlig have forskellige antal tøjr mellem vektoren og metalsubstratet skal haveuens kinetik for vektor frigivelse. Faktisk vektor ændringen med 0,1 mM RHC resulterede i signifikant hurtigere frigivelse satser end observeret for vektor immobiliseret med 0,5 mM RHC (figur 4A). Fluorescens mikroskopi data (figur 4B) korrelerer godt med den kvantitative vektor frigivelse analyse fluorometri-baseret, hvilket viser en hurtigere og mere dybtgående fald på overfladen-associeret fluorescens med mesh prøver formuleret ved hjælp IHC-, RHC- og især lav koncentrationslejre RHC-forankrede vektorer i sammenligning med deres NHC- og SHC-tøjret modstykker.
In vitro Transduktion med Mesh immobiliseret Ad-vektorer
Ved at være kompatibel med både kvantitativt udtryk analyse (fluorometri) og rumlige observationer (fluorescensmikroskopi), Ad eGFP er den foretrukne reporter vektor til at overvåge transduktion i SMC og endotelcellekulturer behandlet med både gratis og mesh-immobiliserede Ad-vektorer. Kemisk modifikation af Ad capsidet med RHC (figur 5) samt med andre krydsbindere (ikke vist) i koncentrationer på over 75 uM væsentlig grad svækker transduktion effektivitet af vektor ikke-immobiliserede in vitro, sandsynligvis på grund af maskering og omkonfigurere fiber knop domæner udnyttes af Ad for binding til cellerne gennem Coxsackie-Adenovirus-receptorer (bil). Imidlertid rolle knop-CAR interaktioner er mindre afgørende for transduktion med substrat immobiliseret vektor eftersom vektoren tilbageholdes i nærheden af målrettede celler ved tethering til substrat. I cellekultur forsøg uanset HC type mesh-associerede Ad-vektorer er konsekvent i stand til rumligt begrænse transduktion begivenheder til celler beliggende inden for 300-500 um fra mesh grænser (6a og 6c). Typisk peak niveauer af transgene udtryk opnås 3-5 dage efter anbringelsen af Ad eGFP -loaded masker ind i SMC (figur 6A og 6B) eller BAEC (figur 6C og 6D) kulturer. På samme vektor belastning, peak eGFP ekspressionsniveauer øges i følgende rækkefølge: NHC-, SHC-, IHC- og RHC-tøjret vektor, hvilket afspejler forskellene i deres respektive frigivelseskinetik profiler (Figur 4). Endvidere observeres mere holdbare transgen ekspression i celler behandlet med IHC formulerede masker i sammenligning med celler behandlet med RHC formulerede modstykker (figur 6D).
Det udnyttede celledyrkningssystem præsenterer en bekvem opsætning for undersøgelse af forsinkede transduktion begivenheder fremkaldt af vektor partikler frigivet fra metaloverfladen på eller senere end 48 timer efter mesh placering. I denne ansøgning, efter at bestemme eGFP udtryk ved fluorometry og fluorescens mikroskopi ved 48 timer efter påbegyndelsen af transduktion er BAEC trypsiniseres og suget ud af brøndene uden at forstyrre maskerne. Frisk passeret ikke-transduceret BAEC derefter igen forgyldt på de delvist frigivet masker. "Nye" transduktion begivenheder forårsaget af viruspartikler frigives fra masken luftfartsselskab efter 2 dages tidspunktet vurderes derefter ved fluorescens mikroskopi og fluorometri (7A og 7B). Robust eGFP udtryk demonstrerer den karakteristiske rumlige begrænsning til en maske locale typisk observeret i disse "nye" kulturer (Figur 7), bekræfter en velbevaret transduktionsevne af mesh-bundne Ad-vektorer, selv efter 48 timers udsættelse for at fuldføre cellekulturmedium ved 37 ° C.
In vivo-undersøgelser
For at undersøge de potentielle virkninger i forbindelse med uSE forskellige HC på arteriel transduktion, dyr implanteret med Ad Luc -eluting stenter tilberedt med RHC-, IHC-, SHC- og NHC-modificerede vektor undergik bioluminiscerende billeddannelse 1 og 8 dage efter stent indsættelse (figur 8). Den billeddannelse blev udført efter lokal perivaskulær indgift af luciferin (2 mg) co-formuleret med Pluronic gel. Denne formulering er en viskos væske, når afkølet på is, men undergår øjeblikkelig faseovergang til gel, når de bringes i kontakt med væv ved 37 ° C. Indledende forsøg (ikke vist) viste, at perivaskulær levering af luciferin resulterer i mere stabile og reproducerbare luminescens-signaler i Ad Luc -transduced karvæv sammenlignet med systemisk (intraperitoneal eller intravenøs) luciferin administration.
Hvis virus tøjring til stenten og stentudvidelsesindretning kirurgi var teknisk lyd, et veldefineret signal, der svarer til den stentbehandlede segment afrotte carotidarterie udsendes og registreres. En dag efter stent implantering dyr behandlet med RHC formulerede Ad Luc stents udviser typisk den højeste luminescens signal efterfulgt af de rotter, der modtog IHC- og SHC- formulerede stenter (figur 8A og 8B). Der observeres ingen mærkbar signal i gruppen af rotter implanteret med stents fremstillet under anvendelse NHC-tøjret Ad Luc, hvilket understreger betydningen af uhindret vektor frigivelse fra stenten for effektiv transduktion af karvæv (figur 8A og 8B). Ved dag 8 var den gennemsnitlige intensitet af luciferase ekspression med RHC formulerede stenter dråber adskillige gange, mens det øger 1,4-og 1,8-fold med IHC- og SHC formulerede stenter, henholdsvis (figur 8A og 8B). Dette resultat er i overensstemmelse med hypotesen om mere holdbare vaskulær transduktion med gen-stents udviser en langsommere pårørendeETICS af vektor frigivelse fra stenten overfladen.
Figur 1. Strukturelle formler af krydsbindere (NHC, SHC, IHC og RHC), der anvendes i hele de beskrevne undersøgelser (modificeret med tilladelse 28).
Figur 2. En ordning, der repræsenterer Ad vektor tethering til en PABT / PEI PDT -modificeret rustfrit stål overflade via en HC og efterfølgende frigivelse af vektoren ved krydsbinder hydrolyse (modificeret med tilladelse 28).
Figur 3. PCR-baseret Quantverifikationsprogrammet Ad eGFP immobiliseret via tværbindingsmiddel tethering på overfladen af PABT / PEI PDT -modificeret rustfrit stål masker. De rustfrie masker blev formuleret med Ad eGFP immobiliseret via RHC IHC, SHC eller NHC (n = 3 for hver tilstand ). Efter proteinase K-behandling, blev viralt DNA elueret og oprenset ved anvendelse MinElute kolonner. Amplifikation af viral DNA under anvendelse eGFP-specifikke primere blev udført i en 7500 Real-Time PCR motor og blev påvist med Sybr Green. Data normalisering var baseret på en kalibreringskurve fremstillet med en kendt mængde af ikke-immobiliserede Ad eGFP (modificeret med tilladelse 28).
Figur 4. frigivelseskinetikken af Ad-vektor tøjret til metalsubstrater med HC. Stainless stål masker blev derivatiseret med ~ 2 x 10 9 Cy3-mærkede Ad partikler knyttet til PABT / PEI PDT -modificeret overflade efter modifikation med 500 uM NHC, SHC, IHC, RHC og 100 um RHC (betegnet som RHC-L). Frigivelsen af fluorescensmærket Ad-partikler blev undersøgt ved de angivne tidspunkter ved (A) godt-scan fluorometri ved 550/570 nm og (B) fluorescerende mikroskopi (rhodaminfilteret sæt, original forstørrelse 200X). Fluorometri Resultaterne er præsenteret som middelværdi ± SEM, n = 8-10; p <0,001 for alle sammenligninger mellem NHC og SHC vs IHC, RHC og RHC-L-grupper blev bestemt ved ANOVA med en post-hoc Tukey-test (modificeret med tilladelse 28).
Figur 5. Transduktion effektiviteten af ikke-immobiliserede Ad eGFP følgende ændring med RHC. Rotte embryonale aorta-afledte SMC (A10 linje) blev transduceret ved en MOI på 1,000 med enten umodificeret Ad eGFP eller vektor modificeret med RHC som angivet. En reporter ekspression blev bestemt fluorometrisk (485/535 nm) 48 timer efter transduktion (modificeret med tilladelse 27).
Figur 6. transduktion af dyrket SMC og BAEC med Ad vektor immobiliseret til rustfrit stål masker med HC. Masker blev derivatiseret med ~ 2 x 10 9 Ad eGFP partikler vedhæftede via NHC, SHC, IHC, og RHC. Masker blev derefter anbragt individuelt oven af sub-sammenflydende A10 (A, B) og BAEC (C, D) monolag. Transduktion (udtrykt som eGFP ekspressionsniveauer) af celler behandlet med Ad vektor-forankrede masker blev vurderet ved fluorescence mikroskopi (A, C, FITC-filter sæt, original forstørrelse 100X) og godt-scan fluorometri (B, D). Fluorometriassay Resultaterne er præsenteret som betyder ± SEM, n = 4 (modificeret med tilladelse 28). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 7. Transduktion kompetence substrat immobiliseret Ad-vektorer ved forsinkede tidspunkter. Ad eGFP blev immobiliseret på stål masker gennem NHC, SHC, IHC eller RHC bindsler. Maskerne blev placeret på subkonfluente baec monolag. To dage efter placering blev BAEC trypsineret og fjernes uden at forstyrre maskerne. Ny, ikke-transducerede BAEC blev derefter podet over masker. AdeGFP transduktion kompetence blev målt ved eGFP ekspression under anvendelse af fluorescensmikroskopi (A FITC-filter sæt; oprindelige forstørrelse 100X) og fluorometri (B). Målinger blev taget ved angivne dage blev repræsentative billeder, brugt og fluorometriassay resultater er middel ± SEM, n = 4 (ændret fra med tilladelse 28). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 8. transduktionseffektivitet af stent-immobiliseret Ad Luc in vivo. Ad Luc (1,3 x 10 10 partikler) blev tøjret til endovaskulære stenter via NHC, SHC, IHC eller RHC (n = 3-4 for alle grupper). Transduktionseffektivitet af Ad Luc </ Sub> elueres fra stenter blev målt ved bioluminescens imaging (IVIS Spectrum) 1 og 8 dage efter stent indsættelse (A), og plottet ved hjælp af en logaritmisk skala (B) (modificeret fra med tilladelse 28). Klik her for at se et større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den præsenterede protokol beskriver en operationel metode til substrat gentilførsel opnås gennem reversibel fastgørelse af adenovirusvektorer at coatless overflader i rustfrit stål. Mens der er udviklet til det specifikke formål at stent-baserede genterapi af vaskulær restenose, denne teknik har meget bredere anvendelser inden for områderne biomaterialer, biomedicinske implantater og genterapi.
Selvom præsenteret undersøgelser udelukkende har udnyttet rustfrit stål som et prototypisk metalsubstrat PABT binder andre metallegeringer, såsom kobolt / krom og nitinol med sammenlignelig affinitet (ikke offentliggjort). Den indiscriminant vekselvirkning PABT med metaller udvider markant antallet af potentielle biomedicinske anvendelser for denne teknologi 31. Endvidere er anvendelsen af HC-tøjret genvektorer, omend kræve andre metoder thiol montering på materialeoverfladen, er muligt med andre typer af biomaterialer.
Indholdsproduktion "> Mens Ad genvektorer opnå solid transduktion i mange humane celletyper og væv, deres kliniske betydning er begrænset af stærke inflammatoriske og immunreaktioner af Adenoviridae 4. Til dette formål forlænget (4 måneder) arteriel udtryk med gen stents formuleret ved hjælp af HC modifikation af luciferase-udtrykkende adenoassocierede virale vektorer er for nylig blevet vist (ikke offentliggjort).Metodikken er robust. Små afvigelser fra den vigtigste protokol generelt ikke føre til betydelige ændringer i genekspression in vitro og in vivo. Alligevel blev flere kritiske spørgsmål, der kan påvirke resultaterne identificeret.
Først, som navnet antyder, hydrolyserbare tværbindere er spaltelig ved reaktion med vand på grund af hydrolyse af i-kæde-ester. Desuden amin-reaktive del, N -sulfosuccinimidyl er hydrolyserbar samt. Krydskoblere skal opbevares under en argonatmosfære ved -20 ° C for at bevare deres aktivitet. Af de samme grunde, efter forberedelsen opløsninger af HC (protokol afsnit 3.2) fortsætter straks med tilsætning af HC løsninger på virus preps.
For det andet er thiolgrupper, der dannes på metaloverfladen i adskillige mellemliggende trin af præsenterede bioconjugation sekvens hurtigt oxideres af luftens ilt. For at forhindre dette, skal de sårbare metalprøver nedsænket i afgasset vand på alle tidspunkter.
For det tredje er en perfekt tilpasning af indgreb med bunden af brønden kræves for en vellykket transduktion. Du må ikke bøje mesh diske under håndteringen.
For det fjerde, undgå overdreven gnidning af gen-stents mod teflon kappe og karvæggen under stentindsætning at forhindre løsner af overflade-associerede Ad-vektorer.
Kovalent binding af genvektor til overfladen af implanterbare biomaterials har en tilsyneladende fordel af en bedre kontrol over vektor frigivelseskinetik end realiseres med ikke-kovalent tøjring af vektorerne. Ved fastsættelsen af gen-levering fra stent platform fleste undersøgelser indberette fuldstændige frigivelse af virale og ikke-virale vektorer indenfor 1-7 dage efter stent indsættelse 32-34. På den anden side, Ad vektor immobilisering via HC demonstreret frigivelse af kun 20-45% af vektoren belastning i den første måned (figur 4A og 4B). Desuden er en delvis modulering af frigivelse og transduktion kinetik er opnåeligt med brug af forskellige HC udviser uens hydrolysesituationer kinetik eller ved at variere koncentrationen af HC ansat til virus overflade modifikation. Derudover en samtidig co-modifikation af vektoren med forskellige tværbindingsmolekyler, men ikke udforsket i nærværende undersøgelse, giver endnu en mulighed for finjustering vektor frigivelse og transduktion.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 316 stainless steel mesh disks | Electon Microscopy Sciences | E200-SS | |
| Generic 304-grade stainless steel stents | Laserage | custom order | |
| AdeGFP | University of Pennsylvania Vector Core | AD-5-PV0504 | |
| AdLuc | University of Pennsylvania Vector Core | AD-5-PV1028 | |
| AdEMPTY | University of Pennsylvania Vector Core | A858 | |
| Cy3(NHS)2 | GE Healthcare | PA23000 | |
| Sepharose 6B | Sigma-Aldrich | 6B100-500ML | |
| UV 96-well plates | Costar | 3635 | |
| Fluorometry 96-well plates | Costar | 3915 | |
| Cell culture 96-well plates | Falcon | 353072 | |
| Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride (TCEP) | Pierce Thermo Scientific | 20490 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Pierce Thermo Scientific | 20290 | |
| sulfo-LC-SPDP | Pierce Thermo Scientific | 21650 | |
| Spectrophotometer | Molecular Devices | SpectraMax 190 | |
| Spectrofluorometer | Molecular Devices | SpectraMax Gemini EM | |
| Orbital shaker incubator | VWR | 1575R | |
| Horizontal airflow oven | Shel Lab | 1350 FM | |
| Centra-CL2 centrifuge | International Equipment Company | 426 | |
| Digital vortex mixerer | Fisher Thermo Scientific | 02-215-370 | |
| Eclipse TE300 fluorescence microscope | Nikon | TE300 | |
| DC 500 CCD camera | Leica | DC-500 | |
| 7500 Real-Time PCR system | Applied Biosystems | not available | |
| IVIS Spectrum bioluminescence station | Perkins-Elmer | not available | |
| EDTA dipotassium salt | Sigma-Aldrich | ED2P | |
| Bovine serum albumin fraction V (BSA) | Fisher Thermo Scientific | BP1600-100 | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P1379 | |
| Dumont forceps | Fine Science Tools | 11255-20 | |
| A10 cell line | ATCC | CRL-1476 | |
| Bovine aortic endothelial cells | Lonza | BW-6002 | |
| Luciferin, potassium salt | Gold Biotechnology | LUCK-1Ge | |
| Pluronic F-127 | Sigma-Aldrich | P2443-250G | |
| PBS without calcium and magnesium | Gibco | 14190-136 | |
| Fetal bovine serum | Gemini Bio-Products | 100-106 | |
| Penicillin/Streptomycin solution | Gibco | 11540-122 | |
| DMEM, high glucose | Corning cellgro | 10-013-CV | |
| 0.25% Trypsin/EDTA | Gibco | 25200-056 | |
| QIAamp DNA micro kit | Qiagen | 56304 | |
| Power Sybr Green PCR Master Mix | Applied Biosystems | 4367659 | |
| MicroAmp Optical 96-well Reaction Plate | Applied Biosystems | N8010560 | |
| MicroAmp Optical Adhesive Film | Applied Biosystems | 4360954 | |
| Cephazolin | Apotex | not available | |
| Loxicom (Meloxicam) | Norbrook | not available | |
| Heparin sodium | APP Pharmaceuticals | not available | |
| Ketavet (Ketamine) | VEDCO | not available | |
| Anased (Xylazine) | Lloid | not available | |
| Forane (Isoflurane) | Baxter | not available | |
| Curved Moria iris forceps | Fine Science tools | 11370-31 | |
| Curved extra-fine Graefe forceps | Fine Science Tools | 11152-10 | |
| Dumont #5 forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| Vannas spring scissors | Fine Science Tools | 15018-10 | |
| Fine scissors - ToughCut | Fine Science Tools | 14058-09 | |
| Surgical scissors | Fine Science Tools | 14101-14 | |
| Vicryl suture (5-0) | Ethicon | J385 | |
| Suture thread (4/0 silk) | Fine Science Tools | 18020-40 | |
| Michel suture clips | Fine Science Tools | 12040-02 | |
| Wound dilator (Lancaster eye specula) | KLS Martin | 34-149-07 | |
| Hot bead sterilizer | Fine Science Tools | 18000-45 | |
| Michel suture clip applicator | Fine Science Tools | 112028-12 | |
| Insyte Autoguard 24 G IV catheter | Beckton-Dickinson | 381412 | |
| 2F Fogarty catheter | Edwards Lifesciences | 120602F | |
| Teflon tubing | Vention | 041100BST | |
| PTA catheter | NuMed | custom order | |
| Gauze pads | Kendall Healthcare | 9024 | |
| Cotton applicators | Solon Manufacturing | WOD1003 | |
| Saline | Baxter | 281321 | |
| 10 ml syringe (Luer-Lok) | Beckton-Dickinson | 309604 | |
| 1 ml syringe (Luer-Lok) | Beckton-Dickinson | 309628 | |
| Clippers with #40 blade | Oster | 78005-314 | |
| Transpore surgical tape | 3M | MM 15271 | |
| Puralube vet ointment | Pharmaderm | not available |
References
- Boeckle, S., Wagner, E. Optimizing targeted gene delivery: chemical modification of viral vectors and synthesis of artificial virus vector systems. AAPS J. 8, E731-E742 (2006).
- Waehler, R., Russell, S. J., Curiel, D. T. Engineering targeted viral vectors for gene therapy. Nat Rev Genet. 8, 573-587 (2007).
- Campos, S. K., Barry, M. A. Current advances and future challenges in Adenoviral vector biology and targeting. Curr Gene Ther. 7, 189-204 (2007).
- Bangari, D. S., Mittal, S. K. Current strategies and future directions for eluding adenoviral vector immunity. Curr Gene Ther. 6, 215-226 (2006).
- Barry, M. A., et al. Systemic delivery of therapeutic viruses. Curr Opin Mol Ther. 11, 411-420 (2009).
- De Laporte, L., Shea, L. D. Matrices and scaffolds for DNA delivery in tissue engineering. Adv Drug Deliv Rev. 59, 292-307 (2007).
- Gustafson, J. A., Price, R. A., Greish, K., Cappello, J., Ghandehari, H. Silk-elastin-like hydrogel improves the safety of adenovirus-mediated gene-directed enzyme-prodrug therapy. Mol Pharm. 7, 1050-1056 (2010).
- Kidd, M. E., Shin, S., Shea, L. D. Fibrin hydrogels for lentiviral gene delivery in vitro and in vivo. J Control Release. 157, 80-85 (2012).
- Lei, Y., et al. Incorporation of active DNA/cationic polymer polyplexes into hydrogel scaffolds. Biomaterials. 31, 9106-9116 (2010).
- Lei, Y., Rahim, M., Ng, Q., Segura, T. Hyaluronic acid and fibrin hydrogels with concentrated DNA/PEI polyplexes for local gene delivery. J Control Release. 153, 255-261 (2011).
- Jang, J. H., Schaffer, D. V., Shea, L. D. Engineering biomaterial systems to enhance viral vector gene delivery. Mol Ther. 19, 1407-1415 (2011).
- Salvay, D. M., Zelivyanskaya, M., Shea, L. D. Gene delivery by surface immobilization of plasmid to tissue-engineering scaffolds. Gene Ther. 17, 1134-1141 (2010).
- Moss, A. J., Hamburger, S., Moore, R. M., Jeng, L. L., Vol Howie, L. J. Advance Data. 191, National Center for Health Statistics Vital and Health Statistics. (1991).
- Gristina, A. G., Naylor, P., Myrvik, Q. Infections from biomaterials and implants: a race for the surface). Med Prog Technol. 14, 205-224 (1988).
- Santerre, J. P., Woodhouse, K., Laroche, G., Labow, R. S. Understanding the biodegradation of polyurethanes: from classical implants to tissue engineering materials. Biomaterials. 26, 7457-7470 (2005).
- Tang, L., Eaton, J. W. Inflammatory responses to biomaterials. Am J Clin Pathol. 103, 466-471 (1995).
- Zimmerli, W., Sendi, P. Pathogenesis of implant-associated infection: the role of the host. Semin Immunopathol. 33, 295-306 (2011).
- Fishbein, I., et al. Bisphosphonate-mediated gene vector delivery from the metal surfaces of stents. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 159-164 (2006).
- Levy, R. J., et al. Localized adenovirus gene delivery using antiviral IgG complexation. Gene Ther. 8, 659-667 (2001).
- Ma, G., et al. Anchoring of self-assembled plasmid DNA/anti-DNA antibody/cationic lipid micelles on bisphosphonate-modified stent for cardiovascular gene delivery. Int J Nanomedicine. 8, 1029-1035 (2013).
- Hu, W. W., Lang, M. W., Krebsbach, P. H. Development of adenovirus immobilization strategies for in situ gene therapy. J Gene Med. 10, 1102-1112 (2008).
- Jang, J. H., et al. Surface immobilization of hexa-histidine-tagged adeno-associated viral vectors for localized gene delivery. Gene Ther. 17, 1384-1389 (2010).
- Bengali, Z., Shea, L. D. Gene Delivery by Immobilization to Cell-Adhesive Substrates. MRS Bull. 30, 659-662 (2005).
- Holmes, C. A., Tabrizian, M. Substrate-mediated gene delivery from glycol-chitosan/hyaluronic acid polyelectrolyte multilayer films. ACS Appl Mater Interfaces. 5, 524-531 (2013).
- Pannier, A. K., Wieland, J. A., Shea, L. D. Surface polyethylene glycol enhances substrate-mediated gene delivery by nonspecifically immobilized complexes. Acta Biomater. 4, 26-39 (2008).
- Wang, C. H., Pun, S. H. Substrate-mediated nucleic acid delivery from self-assembled monolayers. Trends Biotechnol. 29, 119-126 (2011).
- Fishbein, I., et al. Local delivery of gene vectors from bare-metal stents by use of a biodegradable synthetic complex inhibits in-stent restenosis in rat carotid arteries. Circulation. 117, 2096-2103 (2008).
- Fishbein, I., et al. Adenoviral vector tethering to metal surfaces via hydrolyzable cross-linkers for the modulation of vector release and transduction. Biomaterials. 34, 6938-6948 (2013).
- Mittereder, N., March, K. L., Trapnell, B. C. Evaluation of the concentration and bioactivity of adenovirus vectors for gene therapy. J. Virol. 70, 7498-7509 (1996).
- Forbes, S. P., et al. Modulation of NO and ROS production by AdiNOS transduced vascular cells through supplementation with L-Arg and BH4: Implications for gene therapy of restenosis. Atherosclerosis. 230, 23-32 (2013).
- Niinomi, M., Nakai, M., Hieda, J. Development of new metallic alloys for biomedical applications. Acta Biomater. 8, 3888-3903 (2012).
- Brito, L. A., Chandrasekhar, S., Little, S. R., Amiji, M. M. Non-viral eNOS gene delivery and transfection with stents for the treatment of restenosis. Biomed Eng Online. 9, 56 (2010).
- Egashira, K., et al. Local delivery of anti-monocyte chemoattractant protein-1 by gene-eluting stents attenuates in-stent stenosis in rabbits and monkeys. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 27, 2563-2568 (2007).
- Ohtani, K., et al. Stent-based local delivery of nuclear factor-kappaB decoy attenuates in-stent restenosis in hypercholesterolemic rabbits. Circulation. 114, 2773-2779 (2006).
