Abstract
In-Stent-Restenose stellt eine wesentliche Komplikation der Stentbasis Revaskularisierungsverfahren weithin verwendet, um die Wiederherstellung des Blutflusses durch kritisch verengter Segmente der koronaren und peripheren Arterien. Endovaskulären Stents in der Lage, abstimmbaren Freisetzung von Genen, die mit Anti-Restenose-Aktivität kann eine alternative Strategie präsentieren, um derzeit verwendeten Medikamenten-freisetzenden Stents. Um klinische Umsetzung zu erreichen, müssen Gen-freisetzenden Stents vorhersehbar Kinetik der Stent-immobilisiert Genvektor Mitteilung und ortsspezifische Transduktion von Gefäßsystem aufweisen, während eine übermäßige Entzündungsreaktion in der Regel mit den Polymerbeschichtungen für physikalischen Einschluß des verwendeten Vektors verbunden. Dieser Beitrag beschreibt eine detaillierte Methode, ohne Mantel Tethering adenoviraler Genvektoren, Stents basierend auf einer reversiblen Bindung der adenoviralen Partikel Polyallylamin Bisphosphonat (PABT) modifizierte Edelstahl-Oberfläche über hydrolysierbarer Vernetzer (HC). Eine Familie vonbifunktionelle (Amin-und Thiol-reaktive) HC mit einer durchschnittlichen t 1/2 der in der Kette Esterhydrolyse im Bereich zwischen 5 und 50 Tage waren verwendet, um den Vektor mit dem Stent zu verbinden. Der Vektor Immobilisierungsverfahren wird typischerweise innerhalb von 9 h durchgeführt und besteht aus mehreren Schritten: 1) Inkubation der Metallproben in einer wässrigen Lösung von PABT (4 h); 2) Entschützen von Thiolgruppen in PABT mit Tris (2-carboxyethyl) phosphin (20 min) installiert ist; 3) Expansion von Thiol reaktiven Leistung von der Metalloberfläche durch Reaktion der Proben mit Polyethylenimin mit pyridyldithio (PDT) Gruppen (2 h) derivatisiert; 4) Umsetzung von PDT Gruppen Thiole mit Dithiothreitol (10 min); 5) Änderung von Adenoviren mit HC (1 Stunde); 6) Reinigung von modifizierten adenoviralen Partikel durch Größenausschluss-Säulenchromatographie (15 min) und 7) Immobilisierung von Thiol-reaktiven adenoviralen Partikel auf dem thiolierten Stahlfläche (1 h). Diese Technik hat breite potentielle Anwendbarkeit über Stents,durch die Erleichterung der Oberflächentechnik bioprothetischer Geräte ihrer Biokompatibilität durch das Substrat-vermittelte Gen-Lieferung an den Zellen Anbindung des implantierten Fremdmaterials zu verbessern.
Introduction
Die Wirksamkeit der Gentherapie als ein therapeutisches Mittel wird durch die schlechte Zielkapazität von Gentherapievektoren 1,2 behindert. Der Mangel an geeigneten Ziel Ergebnisse zu sub-therapeutischen Ebenen der Expression des Transgens am Zielort und führt zu einer weiten Verbreitung von Vektoren für Nichtzielorgane 3, auch die für die Montage Immunantwort sowohl gegen den Vektor und codiert therapeutisches Produkt verantwortlich 4, 5. Eine mögliche Mittel, um die Promiskuität der Transduktion Offset und zur Förderung der Ausrichtung ist es, Gen-Vektoren an der gewünschten Stelle in einer Form, die ihre freie Verbreitung über Blut und Lymphe schließt einzuführen. Typischerweise auf einem lokal injizierbares Abgabesysteme mit entweder viralen oder nicht-viralen Vektoren mit Fibrin, Kollagen oder Hyaluronsäure Hydrogelmatrices 6-10, die durch physikalisches Einschließen th fähig vorübergehend erhalt Genvektoren an der Injektionsstelle zugemischt verlassen diese Bemühungenem in einem polymeren Netzwerk.
Ein weiteres allgemein akzeptierte Paradigma für lokalisierte Gentherapie verwendet Immobilisierung von Genvektoren auf der Oberfläche der implantierten Prothesen 11,12. Dauerhafte medizinische Implantate (endovaskuläre, Bronchial-, urologische und Magen-Darm-Stents, Herzschrittmacher, künstliche Gelenke, chirurgische und gynäkologische Maschen, etc.) Werden jährlich in Millionen von Patienten 13 verwendet. Während sie im Allgemeinen wirksam sind diese Geräte anfällig für Komplikationen, die unzureichend für die durch Strom Arztpraxen 14-17 gesteuert werden. Implantierbaren Prothesen bieten eine einzigartige Gelegenheit, als Proxy-Plattformen für die lokale Gentherapie Behandlung dienen. Von der pharmakokinetischen Sicht Oberflächenderivatisierung von medizinischen Implantaten mit relativ niedrigen Eingangs Dosen von Genvektoren Ergebnisse bei der Erreichung sowohl hohe lokale Konzentrationen von Genvektoren auf das Implantat / Gewebe-Grenzfläche und eine Verlangsamung der Kinetik der their Elimination aus diesem Ort. Als Folge längerer Verweilzeit und verbesserte Aufnahme durch die Zielzellpopulation, Immobilisierung Vektor minimiert Ausbreitung der Gen-Vektor. Damit die unbeabsichtigte Inokulation von Nicht-Zielgeweben verringert.
Oberfläche Anbindehaltung von Genvektoren auf implantierbare Biomaterialien (auch als Substrat-vermittelte Gen Lieferung oder Festphasengentransfer bezeichnet) hat in der Zellkultur und Tierversuchen mit implementiert sowohl spezifische (Antigen-Antikörper 18-20, Avidin-Biotin 21,22) und nicht-spezifischen 23-26 (Ladung, van-der-Waals) Wechselwirkungen. Die kovalente Bindung von Vektoren an die Oberfläche der implantierten Vorrichtung zuvor als nicht-funktionell betrachtet worden, da zu starke Bindungen mit der Oberfläche entgegen Vektor Internalisierung durch die Zielzellen. Kürzlich wurde gezeigt, dass diese Begrenzung kann durch die Verwendung von spontan hydrolysierbaren Vernetzer als Tet verwendet überwindenihr zwischen dem modifizierten Metalloberfläche des Stents und Kapsidproteine des adenoviralen Vektors 27,28. Darüber hinaus kann der Vektor Freisetzungsrate und Zeitverlauf der Expression des Transgens in vitro und in vivo unter Verwendung von hydrolysierbaren Vernetzern, die unterschiedliche Kinetik der Hydrolyse 28 moduliert werden.
Die vorliegende Arbeit stellt ein detailliertes Protokoll für die reversible kovalente Bindung von adenoviralen Vektoren an aktivierte Metalloberfläche und stellt eine nützliche experimentellen Aufbau zur Untersuchung der folgenden Ereignisse Transduktion in vitro kultivierten glatten Muskelzellen und Endothelzellen und in vivo in der Rattenhalsschlagmodell Stentangioplastie .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Herstellung der Cy3-markierten Adenovirus für den Release Experimente
- Suspend 2 x 10 12 Teilchen von Ad leer (ca. 2 x 10 11 infektiöse Einheiten) in 650 ul / Bicarbonat-Puffer (CBB, pH 9.3).
- Den Inhalt des Fläschchens 1 (0,2 mg) der Amin-reaktiven Fluoreszenzfarbstoff (Cy3 (NHS) 2) in 1 ml CBB bis zu einer Endkonzentration von 0,2 mg / ml.
- 100 ul der Farbstofflösung zu Virussuspension Rührers 5 Sekunden und Inkubation für 1 h bei 28 ° C unter Schütteln (100-200 UpM).
- Ins Gleichgewicht eine 20 ml Sepharose 6B-Säule mit PBS. Fügen Sie 750 ul von Cy3-markierten Ad Suspension tropfenweise zu der Mitte des Gel-Bett.
- Nach Virussuspension das Harz durchdringt, mit 5 ml PBS. Entsorgen Sie die Eluat.
- 0,5 ml PBS und sammeln das Eluat in einem markierten Glas-Container. Wiederholen Sie diesen Schritt 10x in einer Gesamtmenge von zehn 0,5-ml-Fraktionen.
- Assay the gesammelten Fraktionen durch Spektrophotometrie (260 und 280 nm) für die virale DNA-Gehalt.
- Bündeln die Fraktionen, die mehr als 10% der gesamten (Summe von F1 bis F10) optische Dichte (OD) bei 260 nm auf. Anmerkung: Typischerweise werden die Fraktionen F3, F4, F5, F6 und werden vereinigt und gemischt.
- Re-Assay die gemischten vereinigten Fraktionen durch Spektrophotometrie (260 und 280 nm) und Assays durch Fluorometrie (550 ex / em 570 nm) für die virale DNA-Gehalt und Cy3 markiert Capsid Protein. Hinweis: Ein Cy3 (NHS) 2 Kalibrierungskurve abdecken die 10 -9 -10 -13 mol / L-Bereich vorbereitet und fluorimetrisch auf der gleichen Platte wie die vereinigten Fraktionen untersucht.
- Berechnen Sie die markierten Virusausbeute und Kennzeichnung Dichte. Es sei angenommen, daß 1,19 x 10 12 Viruspartikel / ml entspricht 1 OD-Einheit für eine Weglänge von 1 cm 29. Verwenden Sie die Formel: Ertrag = [(OD 260 nm /1.19)*10 12 * V / Eingangs Ad Menge] * 100, wobei, OD 260 nm ist die optische density der vereinigten Formulierung bei 260 nm und V das Volumen der vereinigten Formulierung (ml) bis Ad Gewinnungsausbeute (%) zu berechnen. Verwenden Sie die Formel: Beschriftung Dichte = C * 6,02 * 10 23 / (OD 260 nm /1.19)*10 12, wobei C Cy3 Konzentration der gepoolten Formulierung (Mol / ml) und OD 260 nm ist die optische Dichte der gepoolten Formulierung bei 260 nm bis mittlere Cy3 Markierungsdichte berechnen. HINWEIS: Eine typische Erholung von markierten Virus ist> 70% des Eingangs Dosis. Die Kennzeichnung Dichte 600-800 Fluorophor-Moleküle pro Einzelviruspartikel.
- Aliquoten Cy3-markierten Ad leer in kleinere Teile (in der Regel 5 x 10 11 Teilchen) geeignet für den einzelnen Freisetzungsversuche. HINWEIS: Aktuelle Protokoll legt die Verwendung von Cy3-markierten Ad ausschließlich in dem Freisetzungsversuch. Alle Transduktionsuntersuchungen werden mit nicht-markierten Vektoren durchgeführt.
2. Aktivierung von Metal Samples
- Waschen Sie die rost steel Netzplatten oder Edelstahlstents nacheinander in Isopropanol (5 × 2 min) und Chloroform (5 x 2 min) bei 55 ° C unter Schütteln (100 rpm). Entfernen des Lösungsmittels.
- Erhitzen Sie die Proben für 30 min bei 200 ° C.
- Auflösen Polyallylamin mit Bisphosphonat installiert latenten Thiolgruppen (PABT 27,28,30) in Wasser (1-2% w / v) bei 72 ° C unter Schütteln (100 rpm). PH-Wert auf 4,5-5 mit KHCO 3.
- Metallproben inkubieren im PABT Lösung für 2-4 Stunden bei 72 ° C unter Schütteln (100-200 UpM). HINWEIS: Die Vorgehensweise sei an dieser Stelle angehalten werden. Die Proben werden 3 Tage bei 4 ° C stabil.
- Dreimal mit doppelt destilliertem Wasser (DDW) Spülen der Proben.
- Setzen Sie die Proben auf Tris (2-carboxyethyl) phosphin (TCEP, 15 mg / ml in 0,1 M Essigsäure-Puffer) für 15 min bei 28 ° C unter Schütteln (100-200 UpM).
- Spülen Sie 5x in entgastem DDW.
- Setzen die Proben bis 2% Polyethylenimin mit installiert pyridyldithio Gruppen (PEI
- Dreimal mit DDW spülen den Proben.
- Expose der Proben auf 10 mg / ml Dithiothreitol / DDW zu pyridyldithio Gruppen zu Thiolen konvertieren.
- 5x spülen wieder in entgastem DDW.
3. Adenovirus Aktivierung und Metalloberfläche Immobilisierung
- Suspend 5 x 10 11 Teilchen entweder Ad eGFP oder Ad Luc (ca. 5 x 10 10 infektiöse Einheiten) in 487,5 bis 495 ul / Bicarbonat-Puffer (CBB, pH 9.3). Hinweis: Bei den Freisetzungsstudien, verwenden Sie 5 x 10 11 von Cy3 markierten Ad leer Teilchen (die Lautstärke auf 487,5 bis 495 ul mit CBB).
- Auflösen HC mit unterschiedlichen Hydrolyseraten 28 [(schnell (t 1/2 = 5 d), zwischen (t 1 /2 = 12 d) und langsam (t 1/2 = 50 d) HC, dh RHC, IHC oder SHC Abbildung 1] oder nicht hydrolysierbaren Vernetzer (NHC), Sulfo-LC-SPDP in CBB bei 20 mM.
- Sofort im 5-12,5 ul-Vernetzungslösung der Virussuspension mit einem Gesamtvolumen von 500 ul (200-500 uM Endkonzentration von Vernetzer), Vortex und Inkubation für 1 h bei 28 ° C unter Schütteln (100- 200 rpm).
- Ins Gleichgewicht eine 20 ml Sepharose 6B-Säule mit entgastem 5 mM EDTA / PBS (EPBS). Tropfenweise 500 ul Vernetzer-modifizierte Ad-Suspension in den Mittelpunkt des Harzbettes.
- 5 ml entgastem EPBS. Entsorgen Sie die Eluat.
- 0,5 ml entgastem EPBS und sammeln das Eluat in einem markierten Glas-Container. Wiederholen Sie diesen Schritt 10 Mal in einer Gesamtmenge von zehn 0,5-ml-Fraktionen.
- Bestimmen OD der gesammelten Fraktionen mit Spektrophotometrie bei 260 und 280 nm und wandeln OD Virustiter (1,19 x 10 12 / ml entspricht 1 OD) 29.
- Bündeln die Fraktionen, die> 10% der eluierten Virus (Hinweis: In der Regel die Fraktionen F3-F6). Wiederholen Sie den Test zur spektrophotometrischen Titer der gepoolten Suspension.
- Übertragen Virussuspension in die Ampulle mit der aktivierten Metallproben (nach 2,11). Inkubieren in einer Argonatmosphäre für 1 h bei 28 ° C unter Schütteln (100-200 UpM). Hinweis: Die in diesem Schritt erhalten Ad-gebundenen Metallproben werden in den in den Abschnitten 7.5 beschriebenen Protokoll anschließende Freisetzung und Transduktion Experimente verwendet.
4. Quantifizierung der Oberflächen-assoziierten Ad-Vektor mittels PCR
- Bereiten Sie kämmt mit oberflächenimmobilisierten Ad eGFP über NHC, SHC, IHC und RHC (n = 3 für jeden Typ), wie in den Abschnitten 2 und 3 beschrieben, angebunden formuliert.
- Verwenden Sie eine QIAamp DNA Micro Kit, um die virale DNA zu isolieren. Zeigen die Maschen einzeln in 1,5-ml-Kunststoffröhrchen, die 200 ul einer Mischung von 180 ul von ATL b zusammenUffer und 20 ul Proteinase K (beide aus dem Kit). Fügen bekannte Menge Ad eGFP Teilchen (als Standards für die Eichkurve) in die einzelnen Röhrchen mit dem gleichen Gemisch. Inkubation bei 56 ° C über Nacht ohne Schütteln.
- Fügen Sie 200 ul AL-Puffer (aus dem Kit), durch Vortexen mischen, 200 ul 100% Ethanol, und bei Raumtemperatur für 5 min.
- Übertragen der Mischung aus jedem Röhrchen auf eine einzelne MinElite Säule (aus dem Kit) und Schleudern bei 8000 UpM 1 min. Mit 180 ml frisches ALT-Puffer spülen Sie die Mesh-enthaltenden Röhrchen, fügen Sie auf die entsprechenden Spalten und drehen sich mit 8.000 Umdrehungen pro Minute für 1 min. Entsorgen Sie die Eluate.
- Gib 500 ul Puffer AW1 (aus dem Kit) in die Spalten und Schleudern bei 8000 UpM 1 min. Entsorgen Sie die Eluate.
- Gib 500 ul Puffer AW2 (aus dem Kit) in die Spalten und Schleudern bei 8000 UpM 1 min.
- Entsorgen Sie die Eluate.
- Spin bei 14.000 rpm für weitere 3 min until die Spalten vollständig trocken sind. Entsorgen Sie die Eluate.
- Fügen Sie 50 ul MilliQ-grade Wasser in die Spalten. Spin bei 14.000 rpm für 5 min. Sammle 50 ul Eluat aus jeder Säule in einzelne Sammelrohr (aus dem Kit).
- Vorbereitung PCR Master Mix Lösung durch Kombination der folgenden multipliziert (12,5 ul Netz SYBR Green PCR Master Mix, 0,63 ul 10 uM eGFP Sense-Primer [5'-ACG ACG GCC TAA ACA AGT TC-3 '], 0,63 ul 10 uM eGFP Anti-Sense-Primer [5'-AAG TCG TGC TGC TTC ATG TG-3 '], 6.3 ul MilliQ-grade Wasser). Multiplizieren Sie diese Volumen durch die Anzahl der geplanten Reaktionen, einschließlich "keine DNA" Kontrollen.
- Last 5 ul Ad eGFP DNA (aus Schritt 4.8) und 20 ul PCR Master Mix in drei Vertiefungen einer MicroAmp Optical 96-Well-Platte Reaktion. Verschließen Sie die Platte mit MicroAmp Optical Adhesive Film. Drehen Sie die Platte bei 1000 rpm für 1 min, um Luftblasen zu beseitigen.
- Die Platte in die Aufnahme eines 7500 Real-Time PCR-Engine. Im Hauptmenü des System-7500 SDS Software (v1.4 oder höher) wählen Sie "neues Experiment". Klicken Sie auf "Weiter". In der "New Experiment Wizard" wählen SYBR Green von einem Scroll-Down-Menü und klicken Sie auf "Hinzufügen". Klicken Sie auf "Weiter", um ein Layout der Platte zu bekommen. Markieren Sie alle Vertiefungen zu analysieren, wählen Sie SYBR Green. Markieren Sie nacheinander keine DNA-Kontrollvertiefungen, Anzeige eGFP DNA-Standards und Unbekannten, und markieren Sie diese mit entsprechenden Bezeichnungen aus dem Scroll-Down-Menü.
- Wechseln Sie auf die Registerkarte Gerät. Wählen Sie "Add Dissoziation Phase", ändern Sie die Lautstärke auch von Standard 50 ul 25 ul. Klicken Sie auf Start.
- Analysieren PCR-Ergebnisse mit nach Überprüfung der Zusammenfassung QC für Ausreißer und Unregelmäßigkeiten.
5. Lassen Kinetik der Hydrolysierbare Kreuz-Linker-bunden Vector Teilchen aus dem Modell Stahlgitter
- Unter Schütteln (100-200 rpm) Waschen Sie die Mesh-Proben mit Cy3-markierten Ad über RHC, IHC, SHC und NHC derivatisiert (nach 3.9) in 1% BSA / PBS (1 Std x 3).
- Mit sterilen feinen Pinzette, legen die Maschen in einzelne Vertiefungen einer Platte mit 96 Vertiefungen mit 200 ul Elutionspuffer vorgefüllt (0,1% BSA / 0,1% Tween-20 / PBS).
- Nehmen Fluoreszenzbilder von einem mittleren Teil jeder Masche. Erfassen die Einstellungen des Mikroskops und der CCD-Kamera zur Bildaufnahme verwendet.
- Assay die Platte fluorimetrisch (550 ex / 570 em) in gut-Scan-Modus mit maximaler Reduktion. Verwenden Sie die Vertiefungen mit nicht-derivatisierten Maschen als Hintergrundkontrolle.
- Inkubieren der Platte bei 37 ° C unter Schütteln (50 rpm).
- Zu vorbestimmten Zeiten (1-30 Tage Bereich) absaugen Elutionspuffer ohne die Maschen zu stören und mit 200 ml frisches Elutionspuffer. Wiederholen Sie die Schritte 4.3-4.5 nach dem Austausch der Puffer.
6. Transduktion von Cultured Cells von Mesh-immobilisiert Ad Vektoren
- Waschen Sie die Anzeige eGFP - oder Ad Luc -derivatized Maschen dreimal mit sterilem PBS für 5 min unter Schütteln (100 UpM).
- Mit feinen sterilen Pinzette entfernen die Maschenplatten eine nach der anderen und legen Sie sie einzeln in die Vertiefungen einer 96-Well-Platte mit dem Zelltyp von Interesse in der log-Phase des Wachstums.
- Die Zellen für 24 Stunden bei 37 ° C in 5% CO 2.
- Verwenden Sie den entsprechenden Nicht-Terminal-Endpunkt-Assays (Fluoreszenz-Mikroskopie, Fluorometrie für eGFP oder Biolumineszenz-Bildgebung für Luciferase), um das Ausmaß und die räumliche Verteilung der Genexpression in den Brunnen zu bestimmen.
- Optional Ersatzmedium für PBS, um die Empfindlichkeit der Fluorometrie Test (485/535 nm), wenn geringe eGFP-Expression wird erwartet, zu erhöhen. Hinweis: Wenn ein Fluorometer wird mit gut Scan-Fähigkeit ausgestattet ist, lesen Sie die Platte in einem gut-Scan-Modus, um die räumliche Verteilung von eGFP-exprimierenden Zellen in den Vertiefungen zu bewerten. Austausch PBS für mittel nach Abschluss Fluorometrie.
- Bild die transduzierten Zellen in den Vertiefungen mit Ad eGFP -eluting Maschen (beide zugrunde liegende und in abgelegenen das Netz) mit dem FITC-Filtersatz. Nehmen sie repräsentative Bilder bei 40-200X Vergrößerung. Erfassen die genauen Einstellungen des Fluoreszenzmikroskops und der CCD-Kamera für die Aufnahme von Bildern verwendet wird.
- Werden 5 ul Luciferin Lager in PBS (10 mg / ml), die direkt in die Vertiefungen mit Ad Luc -eluting Maschen zu einer Endkonzentration von 500 ug / ml und bei 37 ° C und 5% CO 2 für 10 min vor der Biolumineszenz-Bildgebung . Absaugen Medien und ersetzen mit Luciferin-freien Medien nach der Bebilderung.
- Wiederholen Endpunkt-Assays zu vorbestimmten Zeiten (bis zu 2 Wochen), um die Kinetik der Reportergenexpression folgende Substrat-vermittelter Gentransfer zu studieren.
7. Überprüfung der Einge Transduktionsfähigkeit bei Verzögerungszeit Punkte
- Bereiten Sie die Ad-eGFP derivatized Maschen mit RHC, IHC, SHC und NHC für Vektor Tethering (nach 2,1 bis 2,11 und 3,1 bis 3,9) und individuell platzieren Sie die Maschen in die Vertiefungen einer 96-Well-Platte mit 60-80% konfluenten Endothelzellen der Rinderaorta (BAEC ).
- Analysieren Übertragung von kultivierten BAEC mit Mesh-immobilisiert Ad eGFP bei 1 und 2 Tage nach der Maschen Platzierung mittels Fluoreszenzmikroskopie und Fluorometrie (nach 6,4 bis 6,5).
- 48 Stunden nach Beginn der Transduktion waschen die Mesh-enthaltenden Vertiefungen mit PBS zweimal.
- Geben Sie 200 ul von 0,25% Trypsin / EDTA in jede Vertiefung und Inkubation für 15 min bei 37 ° C unter Schütteln (100 rpm). Wasch 3x mit PBS.
- Verwenden Fluoreszenzmikroskopie und Fluorometrie zur vollständigen Entfernung aller eGFP-positive Zellen mit den Maschen zugeordnet ermitteln.
- Saatgut frisch agiert BAEC in die Vertiefungen mit teilweise freigegeben Maschen bei einer 60-80% anfängliche Aussaatdichte (2-2,7 x 10 4 Zellen / well).
- Inkubieren der Platte bei 37 ° C und 5% CO
8. Ad-Eluting Stent Deployment in der Rattenhals Modell der Stent-Angioplastie
- Alle in diesem Protokoll beschriebenen Tierverfahren entsprechen der Bundesvorschriften auf Labortiernutzung und wurden von der IACUC von der Kinderklinik in Philadelphia genehmigt. Um zum aseptischen chirurgischen Bedingungen alle Instrumente Autoklaven sterilisiert halten. Um sicherzustellen, kontinuierliche Sterilität eine Perle Sterilisator zwischen Einsatz der Instrumente in bis zu fünf aufeinander folgenden Tieren beschäftigt.
- Bereiten Ad Luc -eluting Stents nach 2,1 bis 2,11 und 3,1 bis 3,9. Speichern der Virus-derivatisierten Stents in sterilem PBS bei 4 ° C für nicht länger als 24 Stunden vor der Verwendung.
- Betäuben männliche Sprague-Dawley-Ratten (400-450 g) mit IP-Injektion von Ketamin (100 mg / kg) und Xylazin (5 mg / kg). Determine der Narkosetiefe durch Pfote Prise Antwort und Muskeltonus. Bewerben Augen Tierarzt Salbe auf Trockenheit der Hornhaut und Lederhaut zu verhindern. Hinweis: Das Inhalationsanästhesie mit 4% und 2% Isofluran (1 l / min) zur Einleitung und Aufrechterhaltung einer Narkose, jeweils möglich, aber behindert den freien Zugang zum Halsbereich des Tieres und ist somit nicht für einen unerfahrenen Benutzer empfohlen.
- Neubewertung der Narkosetiefe durch toe Prise. Rasur und aseptisch prep Hals und oberen Brustbereich. Antibiotikum zu verabreichen (Cefazolin, 20 mg / kg, IM), analgetische (Meloxicam, 0,5 mg / kg, SC) und Salzlösung (10 ml / kg, SC). Katheterisierung der Schwanzvene mit einer 24 G-Katheter und verwalten Heparin (200 IE / kg; IV). Hinweis: Eine Dosis von 10 mg / kg (IM) Enrofloxacin (Baytril) kann anstelle von Cefazolin verwendet werden. Zu vermeiden Verwendung von Antibiotika ohne signifikante Aktivität gegen Gram-positive Bakterien. 10-15 mg / kg Carprofen (Rimadyl) anstelle von Meloxicam als Bezugs Analgetikum verwendet werden. Analgetika (e.B. sollte Morphin, Buprenorphin) aufgrund ihrer atem Drücken Eigenschaften vermieden werden.
- Führen Sie einen Mittelschnitt durch die Haut und Halsbinde. Verwenden stumpf Techniken, um die linke A. carotis externa zu isolieren. Tie-off der A. carotis externa am meisten distalen ansprechbar Ort. Tragen Sie einen Schiebe temporäre Ligatur der Herkunft der inneren Halsschlagader.
- Einen 2-mm-Einschnitt Arteriotomie in die linke Arteria carotis externa.
- Legen Sie eine 2-Französisch Fogarty Katheter in die Halsschlagader durch den Einschnitt in der A. carotis externa. Pumpen Sie die Spitze des Katheters mit Kochsalzlösung und übergeben 3x aus dem Aortenbogen in die Karotisbifurkation um die Endothel entblößen.
- Schieben Sie ein Stück Schlauch (1,04 mm Außendurchmesser, 0,99 mm ID) über den Fogarty Katheter in der Arteria carotis communis. Ziehen Sie den Fogarty-Katheter.
- Berg-und Crimp eines Ad-Luc -derivatized Stent über dem Ballon von einem 1,5mm-Angioplastie-Katheter. Legen Sie den Stent durch den Teflonschlauch und voran es in den mittleren Teil der Arteria carotis communis. Reiben Sie den Stent gegen das Rohr oder Behälterwand.
- Den Stent bei 12 atm für 30 Sekunden und zieht die Angioplastie-Katheter.
- Tie-off der A. carotis externa proximal der Arteriotomiestelle und lassen Sie die temporäre Ligatur auf der inneren Halsschlagader.
- Reparatur der Operationswunde in Schichten mit fließendem 4.0 Vicrylnaht und heften die Haut.
- Recover das Tier auf eine wärmende Unterlage, bis die ambulante und zu seiner isolierten Käfig. Obwohl es keine Anzeichen von Schmerzen oder Beschwerden werden typischerweise durch die post-operative Tiere über die ersten 12 Stunden nach der Behandlung zeigte, sollten Verlängerungs Meloxicam Therapie (0,5 mg / kg, sc täglich) für 72 Stunden.
9. Biolumineszenz-Imaging von Arterielle Gene Expression
- Zu vorbestimmten Zeitpunkten (1 Tag - 3Wochen-Bereich) nach Gen-eluting Stent Einsatz in der A. carotis communis, betäuben die Ratte mit Isofluran Inhalationsnarkose (2-4% Isofluran in Sauerstoff).
- Entfernen Sie die chirurgische Klammern, aseptisch vorbereiten die Website und öffnen Sie die Operationswunde. Mit stumpf, re-gain Zugriff auf der linken Arteria carotis communis und trennen sie vom Nervus vagus und den angrenzenden Bindegewebe.
- Ein Gemisch von 50 mg / ml in PBS Luciferin und 25% Pluronic F-127 in PBS (1: 4 v / v) und speichert sie auf Eis. Anmerkung: Diese Formulierung stellt eine viskose Lösung bei 4 ° C und dreht sich sofort bei Kontakt mit dem Gewebe bei 37 ° C gelieren.
- Gelten 200 ul einer gekühlten Luciferin / Pluronic Mischung direkt auf die freiliegende Segment der A. carotis communis und überprüfen Gel Solidität.
- Legen Sie das Tier in Rückenlage in der bildgebenden Kammer des IVIS Spectrum-Gerät und pflegen Isofluran-Narkose mit einer Gesichtsmaske.
- In der acquisitiauf Steuerfenster (Wohnzimmer Bild, Version 4.2 oder höher) wählen Sie die Position "B" (6.6 cm Kamera auf Abstand Objekt) und Binning-Faktor "Medium" aus dem Dropdown-Menüs mit dem Titel "Sichtfeld" und "Binning" bezeichnet. Geben Sie "2,5 cm" in der Betrefffeld Höhe. Wählen Sie "min" als Einheit der Zeit in der "Belichtungszeit" ein, und wählen Sie einen Zahlenwert von "2".
- Drei Minuten nach der Anwendung des Luciferin / Pluronic Gel, starten Sie die Bildaufnahme durch Klicken auf die Schaltfläche "Aufnahme" auf dem Bildschirm. HINWEIS: Die Bildaufnahmezeit kann von 1 bis 6 min je nach der zu erwartenden Signalstärke.
- Nach dem Erwerb des Bildes, waschen das Gel mit Kochsalzlösung und tupfen Sie den periarterielle Raum mit steriler Gaze und Baumwolle Applikatoren.
- Schließen Sie die Wunde mit Vicrylnaht und heften die Haut.
- Recover das Tier und zurück in seinen Käfig. Wiederholen Sie die Bildgebung bei später time Punkte auf den Zeitverlauf von arteriellen Expression durch den Stent immobilisiert Ad Vektoren gebracht studieren.
- Alternativ führen Bildgebung nach einer systemischen Verabreichung von Luciferin. Betäuben und prep das Tier als pro 9.1-9.2. Katheterisierung der Schwanzvene mit einer 24 G-Katheter und sichere Katheter mit chirurgischen Band.
- Es wird eine Lösung von Luciferin in PBS (50 mg / ml) und Injizieren von 1 ml der Lösung durch den Katheter über eine 10 Sekunden-Intervall. Eine Minute nach der Injektion beginnen Bildaufnahme nach 9,7 bis 9,8. Hinweis: Ein schneller Injektionsrate (<10 sec) kann die Anfallsaktivität und Atemstillstand zu provozieren. Das Tier muss eingeschläfert werden, wenn während der Bildgebung Anfällen oder Atemstillstand auftreten.
- Folgen Sie Schritt 9.10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vektor-Freisetzungsversuche
Anbinden von adenoviralen Vektoren in der Oberfläche von Implantaten, einschließlich interventionelle Vorrichtungen wie endovaskulären Stents, etwa der Vektor an die erkrankte Stelle, die teilweise Beseitigung der mangelnden physikalischen Zielvektoren. Jedoch um therapeutische Wirkungen über die Transduktion der Zielgewebe zu erreichen, muss der Vektor von der Oberfläche (2) freigegeben werden. Der Einsatz von hydrolysierbaren Vernetzer wurde die Hypothese 1) wirksame Befestigung Vektoren polybisphosphonate modifizierten, Thiol eingebaut Metallimplantaten und 2) mit verzögerter Freisetzung durch Hydrolyse des Vernetzungs vermittelte ermöglichen.
Die Anzahl der Kopien von genomischer Ad eGFP-Vektor mit den Gitterplatten nach dem Ende der Derivatisierung Prozedur zugeordnet ist, durch PCR der viralen DNA mit eGFP-spezifischen Primern (Figur 3) bestimmt. Abhängig von derspezifische Vernetzer eingesetzt, die Menge an gebundenem Ad Vektor sollte variieren zwischen 3,5 x 10 9 bis 5,7 x 10 9 Teilchen / mesh. Dieser Betrag ist in gutem Korrespondenz mit dem geschätzten maximalen Kapazität (2,5 x 10 9) einer einzigen Maschenplatte mit einer Fläche von 0,25 cm 2 bis 100-nm-Partikel in einer Ad-Monoschicht-Anordnung unterzubringen. Da der Ausgangsbetrag der Ad-Vektor in der Stufe der Vernetzer Modifikation ist 5 x 10 11 Teilchen, nur ~ 1% des modifizierten Vektor wird schließlich auf der PABT immobilisiert / PEI PDT -derivatized Edelstahl-Oberfläche.
Sowohl die Rate der in der Kette Esterhydrolyse und die Anzahl der Verbindungen zwischen dem Vektor und dem Biomaterial erwartet, dass die gesamte Kinetik der Ad-Vektor Freisetzung von der Oberfläche beeinflussen.
Vor Vernetzer modifica; die Freisetzungsversuche zu erleichtern, Adenovirus-Partikel können mit Cy3-Fluorophor (§ 1 Protocol) vor, gekennzeichnet werdention und Oberflächen Immobilisierung (Protokoll, Abschnitt 3). Die Abnahme der Oberfläche assoziierten Fluoreszenz über die Zeit gleichzeitig durch Fluorometrie (4A) und der Fluoreszenzmikroskopie (4B) beurteilt dann als ein indirektes Verfahren zur Überwachung Vektor Freisetzung in physiologischen Puffer verwendet werden. Ad-Vektoren durch RHC und IHC-Bindungen verbunden sind, sollten deutlich schneller Freisetzung im Vergleich zu ihren SHC und NHC-Attached Kollegen zu demonstrieren. In dem gegebenen Beispiel wurde eine 45% ige und eine 39% Verlust der oberflächenassoziierten Vektor mit RHC und IHC-gebundenen Vektor nach Tag 30 beobachtet, jeweils, während weniger als 20% der gebundenen Vektor beobachtet in SHC und NHC veröffentlicht -immobilisierten Proben (4A).
Zusätzlich Ad-Vektoren unter Verwendung verschiedener Konzentrationen des gleichen HC und daher vermutlich mit einer unterschiedlichen Anzahl von Halteseilen zwischen dem Vektor und das Metallsubstrat sollte immobilisiertunähnlich Kinetik der Vektor-Release. In der Tat, Vektor-Modifikation unter Verwendung von 0,1 mM RHC führte zu deutlich schneller Freisetzungsraten als für Vektor mit 0,5 mM RHC (4A) immobilisiert beobachtet. Die Fluoreszenzmikroskopie Daten (4B) korreliert gut mit der Fluorometrie-basierte quantitative Analyse Vektor-Release, was auf eine schnellere und tiefgreifende Abnahme der oberflächenassoziierten Fluoreszenz mit Maschenproben formuliert mit IHC-, RHC- und vor allem niedrige Konzentration RHC-gebundenen Vektoren im Vergleich zu ihren NHC und SHC-bunden Kollegen.
In-vitro-Transduktion mit Netz immobilisierter Ad Vektoren
Durch die sowohl mit quantitativen Expressionsanalyse (Fluorometrie) und räumliche Beobachtungen (Fluoreszenzmikroskopie) kompatibel ist, ist die bevorzugte Ad eGFP Reportervektor zu Übertragung in SMC und Endothelzellen überwachenZellkulturen mit sowohl kostenlose als auch Mesh-immobilisiert Ad Vektoren behandelt. Chemische Modifikation von Ad-Kapsid mit RHC (Figur 5) als auch mit anderen Vernetzern (nicht gezeigt) in Konzentrationen von mehr als 75 um wesentlich beeinträchtigt Transduktion Wirksamkeit der nicht-immobilisierten Vektor in vitro, wahrscheinlich wegen Maskierung und Umgestaltung des Fiber-Knob Domänen für die Bindung an den Zellen durch die Coxsackie-Adenovirus-Rezeptoren (CAR) genutzt von Ad. Jedoch ist die Rolle der Regler-CAR-Wechselwirkungen für die Transduktion mit Substrat immobilisiert Vektor weniger wichtig, da der Vektor in der Nähe der Zielzellen durch Anbinden auf das Substrat erhalten. In Zellkulturexperimenten unabhängig von der HC-Typ sind mesh-assoziierten Ad Vektoren konsequent fähig räumlich einzuschränken Transduktion Ereignisse Zellen in 300-500 um von den Maschengrenzen (6A und 6C) angeordnet sind. Typischerweise sind die Spitzenwerte von transgene Ausdrucks 3-5 Tagen erreicht nach der Platzierung der Anzeige eGFP -beladene Maschen in SMC (6A und 6B) oder BAEC (6C und 6D) Kulturen. Gleichzeitig Vektorlade erhöhen Spitzen eGFP-Expressionsniveaus in der folgenden Reihenfolge: NHC, SHC, IHC- und RHC-gebundenen Vektor, was die Unterschiede in ihren jeweiligen Freisetzungskinetiken Profile (Abbildung 4). Weiterhin ist haltbarer Transgen-Expression in Zellen, die mit IHC formulierten Maschen im Vergleich zu Zellen, die mit den RHC-formuliert Gegen (6D) behandelt wurden, beobachtet.
Das verwendete Zellkultursystem stellt eine praktische Anordnung für die Untersuchung von verzögert Übertragungsereignisse, die durch Vektorpartikel aus der Metalloberfläche bei oder höher als 48 h nach der Maschen Platzierung freigegeben. Bei dieser Anwendung wird nach dem Bestimmen eGFP-Expression durch fluorometry und Fluoreszenzmikroskopie bei 48 Stunden nach Beginn der Transduktion, BAEC Trypsin behandelt und abgesaugt aus den Brunnen ohne die Maschen zu stören. Frisch passagierten nicht-transduzierten BAEC werden dann über die teilweise frei Maschen erneut plattiert. "Neu" Transduktion Ereignisse von den Viruspartikeln nach der 2-Tageszeitpunkt von der Maschenträger Freigabe verursacht werden dann durch Fluoreszenzmikroskopie beurteilt und Fluorometrie (7A und 7B). Robust eGFP-Expression zeigen die charakteristische räumliche Beschränkung auf eine Mesh-Gebietsschema wird in der Regel in diesen "neuen" Kulturen auch nach 48 h Exposition beobachtet (Abbildung 7) und bestätigte damit einen gut erhaltenen Übertragungskapazität der maschen gebunden Ad Vektoren zu Zellkulturmedium vervollständigen bei 37 ° C aufweist.
In-vivo-Studien
Um mögliche Auswirkungen auf die u Zusammenhang untersuchense der verschiedenen HC auf die arterielle Transduktion, Tiere mit Ad Luc -eluting Stents mit RHC-, IHC-, SHC und vorbereitet implantiert NHC-modifizierten Vektor unterzog Biolumineszenz-Imaging-1 und 8 Tage nach Stent-Einsatz (Abbildung 8). Die Abbildungs wurde nach lokaler Verabreichung der perivaskulären Luciferin durch (2 mg) mit Pluronic-Gel co-formuliert ist. Diese Formulierung ist eine, wenn sie auf Eis gekühlt viskose Flüssigkeit, sondern erfährt sofort Phasenübergang zu gelieren, wenn es in Kontakt mit dem Gewebe bei 37 ° C gebracht. Vorläufige Experimente (nicht gezeigt) zeigten, dass perivaskuläre Lieferung von Luciferin Ergebnisse in stabiler und reproduzierbarer Lumineszenzsignale in Ad Luc -transduced verglichen mit systemischen (intraperitonealen oder intravenösen) Verabreichung Luciferin Gefäßgewebe.
Wenn Virus Anbinden an dem Stent und dem Stententfaltungsoperation technisch einwand waren, ein gut definiertes Signal an den Stent-Segment entsprechendeRattenhalsschlagader wird ausgegeben und aufgezeichnet. Einen Tag nach der Stent-Implantation, Tiere mit RHC formulierten Ad Luc Stents behandelt typischerweise die höchsten Lumineszenz-Signal, gefolgt von den Ratten IHC- und SHC formuliert Stents (8A und 8B). Keine wahrnehmbare Signal wird in der Gruppe der Ratten mit implantierten Stents beobachtet, die unter Verwendung NHC-bunden Ad Luc, unterstreicht die Bedeutung der ungehinderten Vektor-Freisetzung aus dem Stent für eine effektive Transduktion von Gefäßgewebe (8A und 8B). Am Tag 8, fällt die Durchschnittsintensität des Luciferase-Expression mit RHC-Stents formuliert Faches, während sie erhöht das 1,4 bis 1,8-fach mit IHC- und SHC-Stents formuliert, bzw. (8A und 8B). Dieser Befund ist im Einklang mit der Hypothese von der haltbarer Gefäß Transduktion mit Gen-freisetzende Stents zeigen eine langsamere kinWDVS von Vektor-Freisetzung aus der Stentoberfläche.
Abbildung 1. Strukturformeln der Vernetzer (NHC, SHC, IHC und RHC) in den beschriebenen Studien verwendet (modifiziert mit Genehmigung 28).
Abbildung 2. Eine Regelung, die Ad-Vektor-Tethering zu einer PABT / PEI PDT -modifiziertes Edelstahl-Oberfläche über eine HC und anschließende Freisetzung des Vektors auf Vernetzer Hydrolyse (modifiziert mit Genehmigung 28).
Abbildung 3. PCR-basierte quantkation von Ad eGFP über Vernetzer Tethering auf der Oberfläche der PABT / PEI PDT immobilisiert -modifiziertes Edelstahl Maschen. Die Metallgeweben wurden mit Ad eGFP über RHC, IHC, SHC, oder NHC (n = 3 für jede Bedingung formuliert immobilisiert ). Nach Proteinase K-Behandlung wurde die virale DNA eluiert und mit MinElute Säulen gereinigt. Amplifikation von viraler DNA unter Verwendung von eGFP-spezifischen Primern wurde in einem 7500 Real-Time PCR-Motor durchgeführt und wurde mit SYBR Green detektiert. Datennormalisierung auf einer Kalibrierungskurve mit einer bekannten Menge an nicht-immobilisierten Ad eGFP hergestellt basieren (modifiziert mit Genehmigung 28).
Abbildung 4. Lassen Kinetik der Ad-Vektor auf Metallsubstrate angebunden mit HC. StAHL Stahl Maschen wurden mit ~ 2 x 10 9 Cy3-markierten Ad Partikel an die PABT angebracht derivatisiert / PEI PDT -modifiziertes Oberfläche nach der Modifikation mit 500 uM NHC, SHC, IHC, RHC und 100 uM RHC (als RHC-L bezeichnet). Die Freigabe Ad-Partikel von fluoreszenzmarkierten wurde zu den angegebenen Zeitpunkten durch (A) studierte gut Fluorometrie Scan bei 550/570 nm und (B) Fluoreszenzmikroskopie (Rhodamin-Filtersatz, Originalvergrößerung 200X). Fluorometrie Ergebnisse werden als Mittel ± SEM, n = 8-10; p <0,001 für alle Vergleiche zwischen dem NHC und SHC vs IHC, RHC und RHC-L-Gruppen wurden durch Anova mit einer Post-hoc Tukey-Test (mit Genehmigung 28 geändert) bestimmt.
Abbildung 5. Transduction Wirksamkeit der nicht-immobilisierten Ad eGFP folgende Modifikation mit RHC. Ratte embryonalen Aorta stamm SMC (A10 Linie) wurden bei einer MOI von 1000 entweder mit unmodifizierten Ad eGFP oder Vektor mit RHC geändert transduzierten wie angegeben. Ein Reporter-Expression wurde fluorimetrisch bestimmt (485/535 nm) 48 Stunden nach der Transduktion (modifiziert mit Genehmigung 27).
Abbildung 6. Transduktion von kultivierten SMC und BAEC mit Ad-Vektor zu Edelstahl immobilisiert kämmt mit HC. Meshes wurden mit ~ 2 x 10 9 Ad eGFP Partikel über NHC, SHC, IHC, und RHC hängt derivatisiert. Gitter wurden dann einzeln auf der Oberseite der Unter konfluenten A10 (A, B) und BAEC (C, D) Monoschichten gegeben. Übertragung (als eGFP-Expressionsniveaus ausgedrückt) von Zellen mit Ad-Vektor-gebundenen Maschen behandelt wurde von f beurteiltluorescence Mikroskopie (A, C; FITC-Filtersatz, Originalvergrößerung 100x) und gut Scan Fluorometrie (B, D). Fluorometrie Ergebnisse präsentiert als Mittelwert ± SEM, n = 4 (mit Genehmigung 28 modifiziert). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 7. Transduction Kompetenz Substrat immobilisiert Ad Vektoren bei verzögerter Zeitpunkten. Ad eGFP wurde auf Stahl immobilisiert Maschen durch NHC, SHC, IHC oder RHC Anbindehaltung. Die Maschen wurden auf den subkonfluente BAEC Monolagen gelegt. Zwei Tage nach der Platzierung, BAEC wurden mit Trypsin behandelt und entfernt werden, ohne die Maschen zu stören. Neue, nicht-transduzierten BAEC wurden dann über die Maschen ausgesät. Anzeige(; FITC-Filtersatz, Originalvergrößerung 100X A) und Fluorometrie (B) eGFP Übertragung Kompetenz wurde von eGFP-Expression mittels Fluoreszenzmikroskopie gemessen. Die Messungen wurden in den angegebenen Tagen genommen wurden repräsentative Bilder verwendet und Fluorometrie Ergebnisse sind Mittelwerte ± SEM, n = 4 (von 28 mit Genehmigung geändert). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 8. Transduktionseffizienz Stent-immobilisiert Ad Luc in vivo. Ad Luc (1,3 x 10 10 Teilchen) wurde über NHC, SHC, IHC oder RHC (n = 3-4 für alle Gruppen) zu endovaskulären Stents angebunden. Transduktionseffizienz von Ad Luc </ Sub> von Stents eluiert wurde von Biolumineszenz-Imaging (IVIS Spectrum) 1 und 8 Tage nach der Stententfaltung (A) gemessen, und aufgezeichnet über eine logarithmische Skala (B) (mit Genehmigung von 28 modifiziert). Bitte klicken Sie hier ein, um zu vergrößern Version dieser Figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Das vorgestellte Protokoll beschreibt eine operative Methode zur Substrat vermittelt durch reversible Bindung von Adenovirus-Vektoren erreicht werden, um Oberflächen aus Edelstahl ohne Mantel Gen Lieferung. Während für den spezifischen Zweck der Stent-basierten Gentherapie von vaskulärer Restenose entwickelt hat diese Technik viel breitere Anwendungen auf den Gebieten der Biomaterialien, biomedizinische Implantate und Gentherapie.
Obwohl vorgestellten Studien wurden nur verwendet Edelstahl als protoMetallSubstrat bindet PABT anderen Metalllegierungen wie Kobalt / Chrom und Nitinol mit vergleichbarer Affinität (nicht veröffentlicht). Die wahllose Interaktion von PABT mit Metallen die Anzahl der potentiellen biomedizinische Anwendungen deutlich erweitert diese Technologie 31. Darüber hinaus ist die Verwendung von HC-gebundenen Genvektoren, allerdings erfordern andere Verfahren der Thiol Montage auf Materialoberfläche möglich ist mit anderen Arten von Biomaterialien.
NHALT "> Während Ad-Gen-Vektoren zu erreichen robust Übertragung in vielen menschlichen Zelltypen und Geweben, ihre klinische Bedeutung wird durch starke entzündliche und Immunreaktionen durch Adenoviridae 4 ausgelöst beschränkt. Dazu verlängert (4 Monate) arteriellen Ausdruck mit Gen freisetzenden Stents formuliert Verwendung HC Modifikation der Luciferase-exprimierenden Adeno-assoziierten viralen Vektoren wurde kürzlich gezeigt (nicht veröffentlicht).Die Methodik ist robust. Kleine Abweichungen von der Hauptprotokoll der Regel nicht zu signifikanten Veränderungen der Genexpression in vitro und in vivo führen. Dennoch wurden einige kritische Fragen, die Ergebnisse beeinflussen können identifiziert.
Zuerst wird, wie der Name schon sagt, sind hydrolysierbare Vernetzer spaltbare bei Reaktion mit Wasser durch Hydrolyse des in der Kette Ester. Darüber hinaus ist die Amin-reaktive Gruppe ist N -sulfosuccinimidyl sowie hydrolysierbar. Vernetzer sollte u gespeichert werdennder einer Argonatmosphäre bei -20 ° C, um ihre Aktivität zu bewahren. Aus den gleichen Gründen, nach der Herstellung von Lösungen von HC (Protokollabschnitt 3.2) gehen sofort mit der Zugabe von HC Lösungen für die Virus-Präparationen.
Zweitens, Thiolgruppen, die auf der Metalloberfläche während mehrerer Zwischenschritte der dargebotenen Biokonjugation Sequenz gebildet werden schnell von der Umgebungsluftsauerstoff oxidiert. Um dies zu verhindern, halten Sie die gefährdeten Metallproben in entgastem Wasser zu allen Zeiten eingetaucht ist.
Drittens ist eine perfekte Ausrichtung der Eingriff mit dem Boden der Vertiefung für eine erfolgreiche Transduktion benötigt. Mesh-Festplatten bei der Handhabung nicht verbiegen.
Viertens, vermeiden Sie übermäßiges Reiben der Gen-freisetzenden Stents gegen die Teflonmantel und Behälterwand während des Stenteinlage zu lösender Oberfläche-assoziierten Ad Vektoren zu verhindern.
Kovalente Bindung von Gen-Vektor an die Oberfläche des implantierbaren biomaterials hat eine scheinbare Vorteil einer besseren Kontrolle über die Vektor-Freisetzungskinetik als Veräußerungs mit nicht-kovalente Verknüpfung der Vektoren. In der Einstellung der Genübertragung von Stent-Plattform die meisten Studien berichten vollständige Freisetzung von viralen und nicht-viralen Vektoren innerhalb 1-7 Tage nach der Stent-Einsatz 32-34. Auf der anderen Seite, Ad-Vektor Immobilisierung über HC demonstriert Freisetzung von nur 20-45% der Vektorlade im ersten Monat (4A und 4B). Darüber hinaus ist eine teilweise Modulation der Freisetzung und Transduktion Kinetik erzielt mit der Verwendung von verschiedenen HC zeigen unterschiedliche Kinetik der Hydrolyse oder durch Variieren der Konzentration von HC Virusoberflächenmodifizierung eingesetzt wird. Darüber hinaus bietet eine gleichzeitige Co-Modifikation des Vektors mit unterschiedlichen Querlinkermoleküle, die aber nicht in der vorliegenden Studie untersucht, eine weitere Gelegenheit für die Feinabstimmung Vektor Freigabe und Weiterleitung.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 316 stainless steel mesh disks | Electon Microscopy Sciences | E200-SS | |
| Generic 304-grade stainless steel stents | Laserage | custom order | |
| AdeGFP | University of Pennsylvania Vector Core | AD-5-PV0504 | |
| AdLuc | University of Pennsylvania Vector Core | AD-5-PV1028 | |
| AdEMPTY | University of Pennsylvania Vector Core | A858 | |
| Cy3(NHS)2 | GE Healthcare | PA23000 | |
| Sepharose 6B | Sigma-Aldrich | 6B100-500ML | |
| UV 96-well plates | Costar | 3635 | |
| Fluorometry 96-well plates | Costar | 3915 | |
| Cell culture 96-well plates | Falcon | 353072 | |
| Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride (TCEP) | Pierce Thermo Scientific | 20490 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Pierce Thermo Scientific | 20290 | |
| sulfo-LC-SPDP | Pierce Thermo Scientific | 21650 | |
| Spectrophotometer | Molecular Devices | SpectraMax 190 | |
| Spectrofluorometer | Molecular Devices | SpectraMax Gemini EM | |
| Orbital shaker incubator | VWR | 1575R | |
| Horizontal airflow oven | Shel Lab | 1350 FM | |
| Centra-CL2 centrifuge | International Equipment Company | 426 | |
| Digital vortex mixerer | Fisher Thermo Scientific | 02-215-370 | |
| Eclipse TE300 fluorescence microscope | Nikon | TE300 | |
| DC 500 CCD camera | Leica | DC-500 | |
| 7500 Real-Time PCR system | Applied Biosystems | not available | |
| IVIS Spectrum bioluminescence station | Perkins-Elmer | not available | |
| EDTA dipotassium salt | Sigma-Aldrich | ED2P | |
| Bovine serum albumin fraction V (BSA) | Fisher Thermo Scientific | BP1600-100 | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P1379 | |
| Dumont forceps | Fine Science Tools | 11255-20 | |
| A10 cell line | ATCC | CRL-1476 | |
| Bovine aortic endothelial cells | Lonza | BW-6002 | |
| Luciferin, potassium salt | Gold Biotechnology | LUCK-1Ge | |
| Pluronic F-127 | Sigma-Aldrich | P2443-250G | |
| PBS without calcium and magnesium | Gibco | 14190-136 | |
| Fetal bovine serum | Gemini Bio-Products | 100-106 | |
| Penicillin/Streptomycin solution | Gibco | 11540-122 | |
| DMEM, high glucose | Corning cellgro | 10-013-CV | |
| 0.25% Trypsin/EDTA | Gibco | 25200-056 | |
| QIAamp DNA micro kit | Qiagen | 56304 | |
| Power Sybr Green PCR Master Mix | Applied Biosystems | 4367659 | |
| MicroAmp Optical 96-well Reaction Plate | Applied Biosystems | N8010560 | |
| MicroAmp Optical Adhesive Film | Applied Biosystems | 4360954 | |
| Cephazolin | Apotex | not available | |
| Loxicom (Meloxicam) | Norbrook | not available | |
| Heparin sodium | APP Pharmaceuticals | not available | |
| Ketavet (Ketamine) | VEDCO | not available | |
| Anased (Xylazine) | Lloid | not available | |
| Forane (Isoflurane) | Baxter | not available | |
| Curved Moria iris forceps | Fine Science tools | 11370-31 | |
| Curved extra-fine Graefe forceps | Fine Science Tools | 11152-10 | |
| Dumont #5 forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| Vannas spring scissors | Fine Science Tools | 15018-10 | |
| Fine scissors - ToughCut | Fine Science Tools | 14058-09 | |
| Surgical scissors | Fine Science Tools | 14101-14 | |
| Vicryl suture (5-0) | Ethicon | J385 | |
| Suture thread (4/0 silk) | Fine Science Tools | 18020-40 | |
| Michel suture clips | Fine Science Tools | 12040-02 | |
| Wound dilator (Lancaster eye specula) | KLS Martin | 34-149-07 | |
| Hot bead sterilizer | Fine Science Tools | 18000-45 | |
| Michel suture clip applicator | Fine Science Tools | 112028-12 | |
| Insyte Autoguard 24 G IV catheter | Beckton-Dickinson | 381412 | |
| 2F Fogarty catheter | Edwards Lifesciences | 120602F | |
| Teflon tubing | Vention | 041100BST | |
| PTA catheter | NuMed | custom order | |
| Gauze pads | Kendall Healthcare | 9024 | |
| Cotton applicators | Solon Manufacturing | WOD1003 | |
| Saline | Baxter | 281321 | |
| 10 ml syringe (Luer-Lok) | Beckton-Dickinson | 309604 | |
| 1 ml syringe (Luer-Lok) | Beckton-Dickinson | 309628 | |
| Clippers with #40 blade | Oster | 78005-314 | |
| Transpore surgical tape | 3M | MM 15271 | |
| Puralube vet ointment | Pharmaderm | not available |
References
- Boeckle, S., Wagner, E. Optimizing targeted gene delivery: chemical modification of viral vectors and synthesis of artificial virus vector systems. AAPS J. 8, E731-E742 (2006).
- Waehler, R., Russell, S. J., Curiel, D. T. Engineering targeted viral vectors for gene therapy. Nat Rev Genet. 8, 573-587 (2007).
- Campos, S. K., Barry, M. A. Current advances and future challenges in Adenoviral vector biology and targeting. Curr Gene Ther. 7, 189-204 (2007).
- Bangari, D. S., Mittal, S. K. Current strategies and future directions for eluding adenoviral vector immunity. Curr Gene Ther. 6, 215-226 (2006).
- Barry, M. A., et al. Systemic delivery of therapeutic viruses. Curr Opin Mol Ther. 11, 411-420 (2009).
- De Laporte, L., Shea, L. D. Matrices and scaffolds for DNA delivery in tissue engineering. Adv Drug Deliv Rev. 59, 292-307 (2007).
- Gustafson, J. A., Price, R. A., Greish, K., Cappello, J., Ghandehari, H. Silk-elastin-like hydrogel improves the safety of adenovirus-mediated gene-directed enzyme-prodrug therapy. Mol Pharm. 7, 1050-1056 (2010).
- Kidd, M. E., Shin, S., Shea, L. D. Fibrin hydrogels for lentiviral gene delivery in vitro and in vivo. J Control Release. 157, 80-85 (2012).
- Lei, Y., et al. Incorporation of active DNA/cationic polymer polyplexes into hydrogel scaffolds. Biomaterials. 31, 9106-9116 (2010).
- Lei, Y., Rahim, M., Ng, Q., Segura, T. Hyaluronic acid and fibrin hydrogels with concentrated DNA/PEI polyplexes for local gene delivery. J Control Release. 153, 255-261 (2011).
- Jang, J. H., Schaffer, D. V., Shea, L. D. Engineering biomaterial systems to enhance viral vector gene delivery. Mol Ther. 19, 1407-1415 (2011).
- Salvay, D. M., Zelivyanskaya, M., Shea, L. D. Gene delivery by surface immobilization of plasmid to tissue-engineering scaffolds. Gene Ther. 17, 1134-1141 (2010).
- Moss, A. J., Hamburger, S., Moore, R. M., Jeng, L. L., Vol Howie, L. J. Advance Data. 191, National Center for Health Statistics Vital and Health Statistics. (1991).
- Gristina, A. G., Naylor, P., Myrvik, Q. Infections from biomaterials and implants: a race for the surface). Med Prog Technol. 14, 205-224 (1988).
- Santerre, J. P., Woodhouse, K., Laroche, G., Labow, R. S. Understanding the biodegradation of polyurethanes: from classical implants to tissue engineering materials. Biomaterials. 26, 7457-7470 (2005).
- Tang, L., Eaton, J. W. Inflammatory responses to biomaterials. Am J Clin Pathol. 103, 466-471 (1995).
- Zimmerli, W., Sendi, P. Pathogenesis of implant-associated infection: the role of the host. Semin Immunopathol. 33, 295-306 (2011).
- Fishbein, I., et al. Bisphosphonate-mediated gene vector delivery from the metal surfaces of stents. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 159-164 (2006).
- Levy, R. J., et al. Localized adenovirus gene delivery using antiviral IgG complexation. Gene Ther. 8, 659-667 (2001).
- Ma, G., et al. Anchoring of self-assembled plasmid DNA/anti-DNA antibody/cationic lipid micelles on bisphosphonate-modified stent for cardiovascular gene delivery. Int J Nanomedicine. 8, 1029-1035 (2013).
- Hu, W. W., Lang, M. W., Krebsbach, P. H. Development of adenovirus immobilization strategies for in situ gene therapy. J Gene Med. 10, 1102-1112 (2008).
- Jang, J. H., et al. Surface immobilization of hexa-histidine-tagged adeno-associated viral vectors for localized gene delivery. Gene Ther. 17, 1384-1389 (2010).
- Bengali, Z., Shea, L. D. Gene Delivery by Immobilization to Cell-Adhesive Substrates. MRS Bull. 30, 659-662 (2005).
- Holmes, C. A., Tabrizian, M. Substrate-mediated gene delivery from glycol-chitosan/hyaluronic acid polyelectrolyte multilayer films. ACS Appl Mater Interfaces. 5, 524-531 (2013).
- Pannier, A. K., Wieland, J. A., Shea, L. D. Surface polyethylene glycol enhances substrate-mediated gene delivery by nonspecifically immobilized complexes. Acta Biomater. 4, 26-39 (2008).
- Wang, C. H., Pun, S. H. Substrate-mediated nucleic acid delivery from self-assembled monolayers. Trends Biotechnol. 29, 119-126 (2011).
- Fishbein, I., et al. Local delivery of gene vectors from bare-metal stents by use of a biodegradable synthetic complex inhibits in-stent restenosis in rat carotid arteries. Circulation. 117, 2096-2103 (2008).
- Fishbein, I., et al. Adenoviral vector tethering to metal surfaces via hydrolyzable cross-linkers for the modulation of vector release and transduction. Biomaterials. 34, 6938-6948 (2013).
- Mittereder, N., March, K. L., Trapnell, B. C. Evaluation of the concentration and bioactivity of adenovirus vectors for gene therapy. J. Virol. 70, 7498-7509 (1996).
- Forbes, S. P., et al. Modulation of NO and ROS production by AdiNOS transduced vascular cells through supplementation with L-Arg and BH4: Implications for gene therapy of restenosis. Atherosclerosis. 230, 23-32 (2013).
- Niinomi, M., Nakai, M., Hieda, J. Development of new metallic alloys for biomedical applications. Acta Biomater. 8, 3888-3903 (2012).
- Brito, L. A., Chandrasekhar, S., Little, S. R., Amiji, M. M. Non-viral eNOS gene delivery and transfection with stents for the treatment of restenosis. Biomed Eng Online. 9, 56 (2010).
- Egashira, K., et al. Local delivery of anti-monocyte chemoattractant protein-1 by gene-eluting stents attenuates in-stent stenosis in rabbits and monkeys. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 27, 2563-2568 (2007).
- Ohtani, K., et al. Stent-based local delivery of nuclear factor-kappaB decoy attenuates in-stent restenosis in hypercholesterolemic rabbits. Circulation. 114, 2773-2779 (2006).
