Abstract
Reestenose intra-stent apresenta uma das principais complicações de procedimentos de revascularização à base de stents utilizados para restabelecer o fluxo de sangue através de segmentos criticamente estreitados de artérias coronárias e periféricas. Stents endovasculares capazes de liberação ajustável de genes com atividade anti-reestenose pode apresentar uma estratégia alternativa para actualmente utilizado stents farmacológicos. A fim de atingir tradução clínico que os stents de genes deve apresentar uma cinética previsível de libertação do gene vector imobilizada-stent e transdução específica do local da vasculatura, evitando ao mesmo tempo uma resposta inflamatória excessiva normalmente associado com os revestimentos de polímero utilizados para a retenção física do vector. Este artigo descreve uma metodologia detalhada para tethering sem casaco de vetores de genes de adenovírus para stents com base em uma ligação reversível das partículas de adenovírus para polialilamina bifosfonato (PABT) -Modified superfície de aço inoxidável via reticulantes hidrolisáveis (HC). Uma família debifuncional HC (aminas e tiol-reactivo) com uma média de t 1/2 de hidrólise do éster em cadeia que varia entre 5 e 50 dias foram utilizados para ligar o vector com o stent. O procedimento de imobilização vector é tipicamente levada a cabo a cerca de 9 horas e consiste em várias etapas: 1) a incubação das amostras de metal numa solução aquosa de PABT (4 horas); 2) desprotecção de grupos tiol instalados em PABT com tris (2-carboxietil) fosfina (20 min); 3) aumento da capacidade de tiol reactivo da superfície do metal por reacção das amostras com polietilenoimina derivatizados com grupos piridilditio) (PDT (2 h); 4) a conversão dos grupos tióis a PDT com ditiotreitol (10 min); 5) alteração de adenovírus com HC (1 hora); 6) purificação de partículas de adenovírus modificados por meio de cromatografia de exclusão de tamanho da coluna (15 min) e 7) a imobilização de partículas adenovirais tiol-reactivo na superfície de aço tiolada (1 hr). Esta técnica tem uma ampla aplicabilidade potencial além stentsfacilitando a engenharia de superfícies de dispositivos bioprostéticas para melhorar sua biocompatibilidade com a entrega de genes mediada por substrato para as células de interface do material estranho implantado.
Introduction
A eficácia da terapia do gene como uma modalidade terapêutica é dificultada pela capacidade de direccionamento pobre de vectores de terapia génica 1,2. A falta de segmentação resultados adequados nos níveis sub-terapêuticos de expressão do transgene no local de destino e leva a uma ampla disseminação de vetores de órgãos não-alvo 3, incluindo os responsáveis pela montagem respostas imunes contra tanto o vetor e codificado produto terapêutico 4, 5. Um potencial significa para compensar a promiscuidade de transdução e promover a segmentação é introduzir vetores de genes no local desejado de uma forma que impede a sua disseminação através do sangue e da linfa. Tipicamente, esses esforços contar com um sistema de entrega localmente injectáveis compreendendo quer de vectores virais ou não virais misturados com fibrina, colagénio ou matrizes de hidrogel de ácido hialurónico 6-10, que são capazes de sustentar transitoriamente vectores de genes no local de injecção por aprisionamento físico thin em uma rede polimérica.
Outro paradigma geralmente aceite para terapia génica localizada utiliza imobilização de vectores de genes para a superfície de próteses implantadas 11,12. Implantes médicos permanentes (endovasculares, brônquios, os stents urológicas e gastrointestinais, pacemakers, juntas artificiais, malhas cirúrgicas e ginecológicas, etc.) São utilizados anualmente em dezenas de milhões de pacientes 13. Embora geralmente eficaz, estes dispositivos são propensas a complicações que são inadequadamente controlados pelo práticas médicas atuais 14-17. Próteses implantáveis apresentam uma oportunidade única para servir de plataforma de proxy para tratamento de terapia genética localizada. Do ponto de vista farmacocinético, derivatização da superfície dos implantes médicos com doses relativamente baixas de entrada dos vectores de genes resulta na obtenção de ambas as concentrações locais elevadas de vectores de genes para a interface do implante / tecido e reduzindo a cinética de their eliminação desta localidade. Como conseqüência de residência prolongada e aumento da captação pela população de células alvo, vetor imobilização minimiza propagação do vetor gene. Assim, a inoculação acidental de tecidos não-alvo é reduzida.
Superfície tethering de vetores de genes em biomateriais implantáveis (também denominado como a entrega do gene mediada por substrato ou entrega gene fase sólida) foi implementado em cultura de células animais e experimentos utilizando ambos específica (antígeno-anticorpo 18-20, avidina-biotina 21,22) e não-específico (23-26 carga, van der Waals) interações. A ligação covalente de vectores para a superfície do dispositivo implantado tem sido anteriormente considerado como não funcional uma vez que demasiado fortes ligações com a superfície exclui vector internalização pelas células alvo. Recentemente foi demonstrado que esta limitação pode ser superada através da utilização de espontaneamente hidrolisável reticulante utilizado como o tetdela entre a superfície metálica modificada das proteínas da cápside de stent e o vector adenoviral de 27,28. Além disso, a taxa de libertação do vetor e naturalmente o tempo de expressão do transgene in vitro e in vivo, pode ser modulada, com o uso de agentes de ligação cruzada hidrolizáveis que exibem diferentes cinéticas de hidrólise 28.
O presente documento fornece um protocolo detalhado para a ligação covalente reversível de vectores adenovirais para a superfície do metal activado e apresenta uma configuração experimental útil para estudar os eventos subsequentes de transdução in vitro de músculo liso e células endoteliais em cultura e in vivo no modelo da carótida de rato de angioplastia de stent .
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Protocol
1 Preparação de Cy3 marcado adenovírus para as experiências de libertação
- Suspender 2 x 10 12 partículas de anúncio vazio (aproximadamente 2 x 10 11 unidades infecciosas) em 650 mL de tampão de carbonato / bicarbonato (CBB; pH 9,3).
- Dissolve-se o conteúdo de um frasco (0,2 mg) de corante fluorescente reactivo com amina (Cy3 (NHS) 2) em 1 ml de BC a uma concentração final de 0,2 mg / ml.
- Adicionar 100 ul da solução de corante a uma suspensão de vírus, de vórtice durante 5 segundos e incubar durante 1 hora a 28 ° C com agitação (100-200 rpm).
- Equilibrar uma coluna de 20 ml de Sepharose 6B com PBS. Adicionar 750 ul de Cy3 marcado suspensão Ad gota a gota, para o centro do leito de gel.
- Após a suspensão viral permeia a resina, adicionar 5 ml de PBS. Rejeitar o eluído.
- Adicionar 0,5 ml de PBS e recolher o fluido em um recipiente de vidro escrito. Repita este passo 10x recolher um total de dez fracções de 0,5 ml.
- º Ensaioe coletadas frações por espectrofotometria (260 e 280 nm) para conteúdo de DNA viral.
- Reunir as fracções que continham mais do que 10% do total (soma de F1 a F10) da densidade óptica (DO) a 260 nm. Nota: Normalmente as frações F3, F4, F5, F6 e são agrupados e misturados.
- Re-ensaio das frações agrupadas mistas, por espectrofotometria (260 e 280 nm) e ensaio por fluorimetria (550 ex / 570 los nm) para conteúdo de DNA viral e Cy3 marcado proteína da cápside, respectivamente. Nota: Uma curva de calibração com Cy3 (NHS), que cobre a gama de 2 10 -9 -10 -13 mol / L e é preparado fluorimetricamente ensaiada na mesma placa como as fracções reunidas.
- Calcula-se o rendimento do vírus marcado e densidade de rotulagem. Suponha que as partículas de 1,19 x 10 12 vírus / ml corresponde a uma unidade de OD para um 1 cm de percurso 29. Use a fórmula: Rendimento = [(260 nm /1.19)*10 12 * quantidade V / Ad entrada OD] * 100, onde, OD 260nm é o de ópticansity da formulação reunida a 260 nm, e V é o volume da formulação reunidas (ml) para calcular o rendimento de recuperação de Ad (%). Utilizar a fórmula: Etiquetagem Densidade = C * 6,02 * 10 23 / (OD 260nm /1.19)*10 12, em que C é a concentração da formulação Cy3 agrupada (moles / ml) e OD 260nm é a densidade óptica da formulação no pool 260 nm para calcular média densidade rotulagem Cy3. NOTA: A recuperação típica de vírus marcado é> 70% da dose de entrada. A densidade de rotulagem é 600-800 moléculas fluoróforo por partícula do vírus único.
- Anúncio vazio em porções menores (tipicamente 5 x 10 11 partículas) adequados para as experiências de libertação individuais alíquota Cy3 marcado. NOTA: protocolo atual especifica o uso de Ad Cy3 marcado apenas no experimento de liberação. Todos os estudos são realizados de transdução com vectores não-marcado.
2 Ativação de amostras de metal
- Lave as s inoxidávelteel malha discos ou stents de aço inoxidável consecutivamente em isopropanol (5 min x 2) e clorofórmio (5 x 2 min) a 55 ° C com agitação (100 rpm). Remover o solvente.
- Aquece-se as amostras durante 30 min a 200 ° C.
- Dissolver bisfosfonato polialilamina com grupos tiol latentes instalados (PABT 27,28,30) em água (1-2% w / v) a 72 ° C com agitação (100 rpm). Ajustar o pH para 4,5-5 com KHCO3.
- Incubar as amostras de metal na solução PABT para 2-4 horas a 72 ° C com agitação (100-200 rpm). NOTA: O procedimento pode ser interrompido neste ponto. As amostras são estáveis durante 3 dias a 4 ° C.
- Lavar as amostras três vezes com água duplamente destilada (ADD).
- Expor as amostras de tris (2-carboxietil) fosfina (TCEP, 15 mg / ml em tampão acético 0,1 M) durante 15 min a 28 ° C com agitação (100-200 rpm).
- Enxágüe em 5x desgasado DDW.
- Expor as amostras a 2% polietileneimina com grupos -piridilditio instalados (PEI
- Lavar as amostras três vezes com ADD.
- Expor as amostras até 10 mg / ml de ditiotreitol / DDW para converter grupos piridilditio para tióis.
- Enxágüe novamente em 5x desgasado DDW.
3. Adenovirus Ativação e superfície de metal Imobilização
- Suspender 5 x 10 11 partículas de qualquer anúncio eGFP ou Ad Luc (aproximadamente 5 x 10 10 unidades infecciosas) em 487,5-495 mL de tampão de carbonato / bicarbonato (CBB; pH 9,3). Nota: Para os estudos de liberação, use 5 x 10 11 de Cy3 marcado partículas vazias de anúncios (ajustar o volume para 487,5-495 mL com CBB).
- Dissolver HC com diferentes taxas de hidrólise 28 [(rapidamente (t 1/2 = 5 d), intermediária (t 1 /2 = 12 d) e, lentamente (t 1/2 d = 50) HC, ou seja, RHC, IHC ou SHC; Figura 1] ou não hidrolisável de reticulação (NHC), sulfo-LC-SPDP em CBB a 20 mM.
- Imediatamente adicionar 5-12,5 ul de solução de agente de ligação cruzada para a suspensão de vírus, para um volume total de 500 ul (200-500 uM concentração final de agente de ligação cruzada), vortex e incubar durante 1 hora a 28 ° C com agitação (100 a 200 rpm).
- Equilibrar uma coluna de 20 ml de Sepharose 6B desgaseificado com 5 mM EDTA / PBS (EPBS). Adicionar gota a gota 500 ul de suspensão de trans-Ad-ligante modificadas para o centro do leito de resina.
- Adicionar 5 ml de desgasado EPBS. Rejeitar o eluído.
- Adicionar 0,5 ml de desgasado EPBS e recolher o fluido em um recipiente de vidro escrito. Repita este passo 10 vezes recolhendo um total de dez fracções de 0,5 ml.
- Determinar OD das fracções recolhidas utilizando espectrofotometria a 260 e 280 nm, e converter OD para os títulos de vírus (1,19 x 10 12 / ml Correponde a uma OD) 29.
- Reunir as fracções que continham> 10% do vírus eluídas (Nota: normalmente, as fracções F3-F6). Repetir o ensaio de titulação espectrofotométrica a suspensão reunida.
- Transferir suspensão viral para o frasco com as amostras de metal activados (como por 2,11). Incubar numa atmosfera de árgon durante 1 hora a 28 ° C com agitação (100-200 rpm). Nota: As amostras de metal Ad-tethered obtidos neste passo são mais utilizados nas experiências de libertação e de transdução subsequentes descritos nas secções 5-7 do protocolo.
4 Quantificação de Ad Vector associado a superfícies por PCR
- Prepare malhas formulados com imobilizada na superfície Ad eGFP tethered via NHC, SHC, IHC e RHC (n = 3 para cada tipo), conforme descrito nas seções 2 e 3.
- Use um kit QIAamp DNA Micro para isolar DNA viral. Coloque as malhas individualmente em tubos de plástico de 1,5 ml contendo 200 ul de mistura composta de 180 ul de ATL bpode ser prejudicado e 20 ul de proteinase K (ambos a partir do kit). Adicionar uma quantidade conhecida de partículas Ad eGFP (como padrões para a curva de calibração) nos tubos separados contendo a mesma mistura. Incubar a 56 ° C durante a noite, sem tremer.
- Adicionar 200 ul de tampão de AL (do kit), mistura por vortex, adicionar 200 ul de etanol a 100%, e incuba-se à temperatura ambiente durante 5 min.
- Transferir a mistura de cada tubo sobre uma coluna individual MinElite (do kit) e centrifugação a 8000 rpm durante 1 min. Lavar os tubos contendo malha com 180 ul de tampão fresco ALT, adicionar sobre as respectivas colunas e centrifugação a 8000 rpm durante 1 min. Descarte os eluatos.
- Adicionar 500 ul de tampão AW1 (do kit) para as colunas e centrifugação a 8000 rpm durante 1 min. Descarte os eluatos.
- Adicionar 500 ul de tampão AW2 (do kit) para as colunas e centrifugação a 8000 rpm durante 1 min.
- Descarte os eluatos.
- Girar a 14.000 rpm durante mais 3 minutos until as colunas estão completamente secos. Descarte os eluatos.
- Adicionar 50 ul de água MilliQ grau nas colunas. Girar a 14.000 rpm por 5 min. Recolha de 50 mL de eluído de coluna em cada tubo de recolha individuais (do kit).
- Preparar a solução de PCR Master Mix combinando multiplica do seguinte (12,5 ul de Potência Sybr Green PCR Master Mix, 0,63 mL de 10 mM eGFP sentido iniciador [5 'ACG TAA CCG ACG ACA AGT TC -3'], 0,63 mL de 10 mM eGFP anti-sense cartilha [5'-AAG TCG TGC TGC TTC ATG TG -3 '], 6,3 mL de água MilliQ-grade). Multiplique esses volumes pelo número de reações previstas, acompanhada de controles "nenhum DNA".
- Carga de 5 mL de eGFP DNA anúncio (do passo 4.8) e 20 l de PCR Master Mix em três cavidades de uma placa de reação de 96 poços Optical MicroAmp. Selar a placa com MicroAmp Optical Adhesive Film. Girar a placa a 1000 rpm durante 1 min para eliminar as bolhas de ar.
- Colocar a placa para dentro do receptáculo de uma máquina de PCR 7500 Real-Time. No menu principal do 7500 Sistema SDS Software (v1.4 ou superior), selecione "Criar nova experiência". Clique em "Next". Na tela "Assistente de Novo experimento" escolher Sybr Verde a partir de um menu de rolagem e clique em "adicionar". Clique em "Next" para obter um layout da placa. Destaque todos os poços a serem analisados, selecione Sybr Verde. Destaque consecutivamente há poços de controlo DNA, padrões e amostras de DNA Ad eGFP, e marcá-los usando respectivas designações do menu de rolagem.
- Alterne para a guia instrumento. Selecione "Adicionar a fase de dissociação", alterar o volume bem da inadimplência 50 ll a 25 mL. Clique em Iniciar.
- Analisar os resultados de PCR utilizando depois de verificar o resumo QC para outliers e outras irregularidades.
5. Lançamento Cinética de hidrolisável Cruz-tethered-vinculador Partículas vetor do modelo de malha de aço
- Lavam-se as amostras de malha derivatizados com Ad Cy3 marcado através RHC, IHC, SHC e NHC (como por 3,9) em 1% de BSA / PBS (1 hr x 3) com agitação (100-200 rpm).
- Utilizando fórceps estéreis finas, colocar as malhas em poços individuais de uma placa de 96 poços previamente cheio com 200 ul de tampão de eluição (0,1% de BSA / 0,1% de Tween-20 / PBS).
- Tome imagens fluorescentes de uma parte central de cada malha. Anote as configurações do microscópio e da câmera CCD utilizado para aquisição de imagem.
- Proceder ao ensaio da placa fluorimétricamente (550 ex / 570 em) no modo bem-scan com redução máxima. Usar os poços com malhas não derivatizadas como um controlo de fundo.
- Incubar a placa a 37 ° C com agitação (50 rpm).
- Em tempos predeterminados (intervalo 1-30 dias) aspirar o tampão de eluição, sem perturbar as malhas e adicionar 200 ul de tampão de eluição de fresco. Repita os passos de 4,3-4,5 após substituir o buffer.
6. Transdução de Cultivadas Cells por Mesh-imobilizadas Vetores de anúncios
- Lavar o eGFP Ad - ou Ad Luc -derivatized malhas três vezes com PBS estéril durante 5 minutos com agitação (100 rpm).
- Utilizando fórceps estéreis finas remover os discos de malha, um por um e colocá-los individualmente em poços de uma placa de 96 poços com o tipo de células de interesse na fase log de crescimento.
- Incubar as células durante 24 horas a 37 ° C, em 5% de CO 2.
- Use o respectivo ensaio não-terminal endpoint (microscopia de fluorescência, fluorimetria para eGFP ou imagem de bioluminescência para luciferase) para determinar a extensão ea distribuição espacial da expressão do gene nos poços.
- Opcionalmente, o meio substituto para PBS para aumentar a sensibilidade do ensaio de fluorimetria (485/535 nm), se for baixa expressão eGFP é esperado. Nota: Se um fluorómetro está equipado com capacidade de bem-scan, ler a placa de um modo bem-verificação para avaliar a distribuição espacial de células nos poços que expressam eGFP. Taxas PBS para o meio após a conclusão de fluorimetria.
- Imagem das células transduzidas nos poços com malhas Ad eGFP -eluting (ambos subjacentes e periféricas da malha), utilizando o conjunto de filtros FITC. Tome imagens representativas em 40-200X ampliação. Registe as definições exatas do microscópio de fluorescência ea câmera CCD utilizado para a aquisição de imagens.
- Adicionam-se 5 ul de estoque luciferina em PBS (10 mg / mL) directamente aos poços com Ad Luc -eluting malhas para uma concentração final de 500 ug / ml e incuba-se a 37 ° C e 5% de CO 2 durante 10 minutos antes da imagiologia bioluminescência . Aspirar mídia e substituir por meios livres de luciferina após imagem.
- Ensaios de ponto de extremidade de repetição em horários predeterminados (até 2 semanas) para estudar a cinética de expressão do gene repórter seguintes transferência de genes mediada por substrato.
7 Validação de Preservada Capacidade Transdução A lento momentos
- Prepare o anúncio de eGFPmalhas rivatized usando RHC, IHC, SHC e NHC para vector tethering (como por 2,1-2,11 e 3,1-3,9) e coloque individualmente as malhas em poços de uma placa de 96 poços com 60-80% de células endoteliais aórticas bovinas confluentes (BAEC ).
- Analisar transdução de cultura BAEC com imobilizado de malha Ad eGFP em 1 e 2 dias de colocação pós-mesh usando microscopia de fluorescência e de fluorimetria (como por 6,4-6,5).
- 48 horas após o início da transdução de lavar os poços contendo malha com PBS, duas vezes.
- Adicionar 200 ul de tripsina a 0,25% / EDTA a cada poço e incubar durante 15 min a 37 ° C com agitação (100 rpm). Lavar 3x com PBS.
- Use microscopia fluorescente e fluorometria para determinar a completa remoção de todas as células-eGFP positivas associadas com as malhas.
- Semente recentemente passadas BAEC nas cavidades com malhas parcialmente libertados a uma densidade de sementeira inicial de 60-80% (2-2,7 x 10 4 células / cavidade).
- Incubar a placa a 37 ° C e 5% de CO
Implantação de stent na carótida modelo de Stent Angioplastia Rato 8 eluição Ad-
- Todos os procedimentos com animais descritos neste protocolo estão em conformidade com os regulamentos federais sobre o uso de animais de laboratório e foram aprovados pelo IACUC do Hospital Infantil da Filadélfia. Para aderir a condições cirúrgicas assépticas todos os instrumentos são esterilizados em autoclave. Para garantir a esterilidade contínua um esterilizador talão é empregado entre o uso dos instrumentos em até cinco animais consecutivos.
- Prepare Ad Luc -eluting stents de acordo com a 2,1-2,11 e 3,1-3,9. Armazenar os stents derivado de vírus e em PBS estéril, a 4 ° C durante não mais do que 24 horas antes de usar.
- Anestesiar ratos machos Sprague-Dawley (400-450 g) com injecção IP de cetamina (100 mg / kg) e xilazina (5 mg / kg). DeTermine a profundidade da anestesia por pata resposta pitada e tônus muscular. Aplicar pomada oftálmica veterinário para prevenir o ressecamento da córnea e esclera. Nota: A anestesia por inalação, com 4% e 2% de isoflurano (1 L / min) para a indução e manutenção de anestesia, respectivamente, é possível, mas impede o acesso livre à região do pescoço do animal e, assim, não é recomendado para um utilizador inexperiente.
- Reavaliar profundidade da anestesia por toe pitada. Raspar e assepticamente prep pescoço e região superior do tórax. Administrar antibiótico (cefazolina, 20 mg / kg; IM), analgésico (meloxicam, 0,5 mg / kg; SC) e solução salina (10 ml / kg; SC). Cateterizar a veia da cauda, com um cateter de 24 G e administrar heparina (200 IU / kg, IV). Nota: Uma dose de 10 mg / kg (IM) enrofloxacina (Baytril) pode ser usado em vez de cefazolina. Evite o uso de antibióticos que faltam atividade significativa contra bactérias Gram-positivas. 10-15 mg / kg, o carprofeno (Rimadyl) pode ser usado em vez de meloxicam como um analgésico de preferência. Analgésicos narcóticos (e.g., morfina, buprenorfina) devem ser evitados por causa das suas propriedades de deprimir a respiração.
- Realize uma incisão na linha média através da pele e pescoço fascia. Use técnicas de dissecção romba para isolar a artéria carótida externa esquerda. Amarre-off da artéria carótida externa no local acessível mais distal. Aplicar uma ligadura temporária deslizante para a origem da artéria carótida interna.
- Faça uma incisão arteriotomia 2 mm na artéria carótida externa esquerda.
- Inserir um cateter 2 French Fogarty, para dentro da artéria carótida comum, através da incisão na artéria carótida externa. Inflar a ponta do cateter com soro fisiológico e passar 3x a partir do arco da aorta até à bifurcação da carótida, para desnudar o endotélio.
- Deslize um pedaço de tubo (1,04 mm de diâmetro externo, 0,99 mm de diâmetro) sobre o cateter Fogarty e na artéria carótida comum. Retirar o cateter de Fogarty.
- Montagem e cravar uma Luc Ad -derivatized stent sobre o balão de um 1.5mm cateter de angioplastia de diâmetro. Inserir o stent através da tubagem de Teflon e fazê-la avançar para a secção média da artéria carótida comum. Evitar esfregar o stent contra a parede do tubo ou vaso.
- Implantar o stent com 12 atm por 30 segundos e retirar o cateter de angioplastia.
- Amarre-off da proximal da artéria carótida externa ao site arteriotomia e solte a ligadura temporária sobre a artéria carótida interna.
- Reparação da ferida operatória em camadas com o funcionamento de 4.0 Vicryl sutura e grampear a pele.
- Recuperar o animal em uma almofada de aquecimento até ambulatório e voltar para sua gaiola isolado. Embora sem sinais de dor ou desconforto são tipicamente exibida pelos animais pós-operatórias após o primeiro 12 horas após o procedimento, considerar a extensão da terapia de meloxicam (0,5 mg / kg, SC diária) durante 72 horas.
9 Bioluminescência imagem das Arterial Gene Expression
- Em pontos de tempo pré-determinados (1 dia - 3semanas intervalo) após a implantação de stents revestidos com gene na artéria carótida comum, anestesiar o rato usando anestesia inalatória com isoflurano (2-4% de isoflurano em oxigênio).
- Remova os grampos cirúrgicos, assepticamente preparar o local e reabrir a ferida operatória. Usando o acesso a dissecação, re-ganho contundente à artéria carótida comum esquerda e separá-lo do nervo vago e do tecido conjuntivo adjacente.
- Prepara-se uma mistura de 50 mg / ml em PBS luciferina e 25% de Pluronic F-127 em PBS (1: 4 v / v) e armazená-la em gelo. Nota: Esta formulação apresenta-se como uma solução viscosa, a 4 ° C e transforma-se em gel imediatamente em contacto com o tecido, a 37 ° C.
- Aplicar 200 l de uma luciferina / Pluronic mistura refrigerada directamente exposta ao segmento da artéria carótida comum e verificar a solidez do gel.
- Colocar o animal em decúbito dorsal na câmara de imagem do aparelho IVIS-Spectrum e manter a anestesia isoflurano com uma máscara facial.
- No acquisitina janela do painel de controle (Living Imagem, versão 4.2 ou superior) escolher a posição "B" (6,6 centímetros câmera eo objeto a distância) e binning fator "meio" nos menus suspensos, intitulado "campo de visão" e "binning", respectivamente. Digite "2,5 centímetros" na caixa de altura assunto. Escolha "min" como uma unidade de tempo na caixa de "tempo de exposição", e escolher um valor numérico de "2".
- Três minutos após a aplicação do gel / Pluronic Luciferin, comece a aquisição da imagem, clicando no botão "Adquirir" na tela. NOTA: Imagem tempo de aquisição pode variar de 1 a 6 minutos dependendo da potência do sinal previsto.
- Depois de adquirir a imagem, lavar o gel off com soro fisiológico e aplique o espaço periarterial com gaze e algodão aplicadores estéreis.
- Feche o ferimento com sutura Vicryl e grampear a pele.
- Recuperar o animal e regressar à sua gaiola. Repita a imagem mais tarde tOs pontos de ime para estudar a evolução temporal de expressão arterial provocada pelos vectores Ad imobilizada-stent.
- Alternativamente, realizar imagem após a administração sistêmica da luciferina. Anestesiar e preparar o animal como por 9,1-9,2. Cateterizar a veia da cauda, com um cateter de 24 G e cateter seguro com fita adesiva cirúrgica.
- Prepara-se uma solução de luciferina, em PBS (50 mg / ml) e injectar 1 ml da solução através do cateter ao longo de um intervalo de 10 segundos. Um minuto após a injeção de iniciar a aquisição de imagens como por 9,7-9,8. Nota: A taxa de injeção mais rápido (<10 seg) pode provocar a atividade de apreensão e parada respiratória. O animal deve ser sacrificado se convulsões ou parada respiratória ocorrer durante o exame.
- Siga o passo 9.10.
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Representative Results
Experimentos Vector lançamento
Ancoragem de vectores adenovirais para a superfície dos implantes, incluindo dispositivos de intervenção, tais como stents, aproxima-se o vector para o local da doença, evitando parcialmente a falta de orientação física dos vectores. No entanto, para ser capaz de atingir os efeitos terapêuticos através da transdução de tecido alvo, o vector tem de ser libertado a partir da superfície (Figura 2). A utilização de agentes de ligação cruzada hidrolizáveis foi levantada a hipótese de permitir uma) ligação eficaz de vectores para polybisphosphonate-modificados, implantes de metal instalados-tiol e 2) libertação sustentada mediadas por hidrólise do agente de ligação cruzada.
O número de cópias genómicas de Ad eGFP vector associados com os discos de malha até ao final do processo de derivação é determinada por PCR de DNA viral com os iniciadores específicos do eGFP (Figura 3). Dependendo dareticulador específico utilizado, a quantidade de vector Ad ligado deve variar entre 3,5 x 10 9 e 5,7 x 10 9 partículas / malha. Esta quantidade é, em correspondência com a feira capacidade máxima estimada (2,5 x 10 9) de um único disco de malha com uma área total de 0,25 cm 2, para acomodar as partículas Ad 100 nm em um arranjo de monocamada. Uma vez que a quantidade a partir de vector de Ad com o passo de modificação do agente de reticulação é de 5 x 10 11 partículas, apenas ~ 1% do vector modificado, eventualmente, é imobilizado na PABT / PEI PDT -derivatized superfície de aço inoxidável.
Tanto a velocidade de hidrólise do éster em cadeia e o número de ligações entre o vector e o biomaterial se espera que afectem a cinética total de libertação vector Ad a partir da superfície.
Para facilitar as experiências de libertação, as partículas de adenovírus podem ser pré-marcada com Cy3 fluoróforo (Protocolo; secção 1) antes de reticulante modifição e imobilização de superfície (Protocolo; seção 3). A diminuição da fluorescência associada à superfície ao longo do tempo avaliado simultaneamente por fluorometria (Figura 4A) e de microscopia de fluorescência (Figura 4B) pode, então, ser utilizada como um método para o controlo de libertação indirecta do vetor em tampão fisiológico. Vetores de anúncios ligados através RHC e IHC ligações deve demonstrar liberação significativamente mais rápido em comparação com o seu SHC- e colegas NHC-inscritos. No exemplo dado, a 45% e uma perda de 39% do vector associado à superfície foi observada com RHC e IHC-tethered vector no dia 30, respectivamente, enquanto que menos de 20% de presa vector foi observada a ser lançado no SHC e NHC -immobilized amostras (Figura 4A).
Além disso, os vectores Ad imobilizada por meio de diferentes concentrações do mesmo e, assim, presumivelmente, HC com números de pelas diferentes entre o vector e o substrato metálico deve tercinética diferentes de liberação vetor. Com efeito, a modificação do vetor usando RHC 0,1 mM resultou em taxas de libertação significativamente mais rápidas dos que as observadas para o vetor imobilizada com RHC 0,5 mM (Figura 4A). Os dados de microscopia de fluorescência (Figura 4B) se correlaciona bem com a análise quantitativa de libertação de vectores baseado em fluorometria, demonstrando um decréscimo mais rápido e mais profunda da fluorescência associada à superfície com amostras formuladas usando malha IHC-, RHC- e especialmente baixa concentração vectores RHC-cativos em comparação com os seus homólogos NHC- e SHC-tethered.
Em Transdução vitro com malha Imobilizados anúncios Vetores
Por ser compatível com análise quantitativa de expressão (fluorometria) e observações espaciais (microscopia de fluorescência), Ad eGFP é o vetor repórter preferido para monitorar transdução em SMC e endotelialculturas de células tratadas com ambos os vetores de anúncios gratuitos e imobilizado de malha. A modificação química de Ad cápside com RHC (Figura 5), bem como com outros agentes de ligação cruzadas (não mostrado), em concentrações superiores a 75 uM prejudica significativamente a eficácia de transdução de vector não imobilizada in vitro, mais provavelmente devido a mascaramento e reconfiguração das fibras botão domínios utilizada para a ligação de ad para as células através dos receptores-adenovirus Coxsackie (CAR). No entanto, o papel das interacções botão de CAR é menos importante para a transdução com o vector de substrato imobilizadas vez que o vector seja mantido na vizinhança de células alvo amarrados ao substrato. Em experimentos de cultura celular, independentemente do tipo HC, vetores de anúncios associados a malha são consistentemente capazes de restringir espacialmente eventos de transdução de células localizadas dentro de 300-500 mM a partir das fronteiras de malha (Figuras 6A e 6C). Normalmente os níveis máximos de transgénicae expressão são alcançadas 3-5 dias após a colocação do anúncio eGFP -Inseridas malhas em SMC (Figuras 6A e 6B) ou BAEC (Figuras 6C e 6D) culturas. Na mesma carga do vetor, os níveis máximos de expressão eGFP aumentar na seguinte seqüência: NHC-, SHC-, IHC- e RHC-tethered vetor, refletindo as diferenças em seus respectivos perfis de cinética de liberação (Figura 4). Além disso, a expressão do transgene mais durável é observado em células tratadas com malhas IHQ formulados em comparação com as células tratadas com os homólogos RHC-formulados (Figura 6D).
O sistema de cultura celular utilizada apresenta uma conveniente set-up para a investigação de eventos de transdução de atraso provocado por partículas liberadas vetor da superfície do metal iguais ou até 48 horas após a colocação da tela. Nesta aplicação, após a determinação da expressão eGFP por fluorometry e microscopia de fluorescência às 48 horas após o início da transdução, BAEC são tripsinizadas e aspirado para fora dos poços, sem perturbar as malhas. Recém passadas não transduzidas BAEC são então re-chapeado sobre as malhas parcialmente liberados. "Novo" eventos de transdução causadas pelas partículas de vírus libertadas a partir do transportador de malha após o ponto de tempo de 2 dia, são em seguida analisadas por microscopia de fluorescência e de fluorimetria (Figuras 7A e 7B). Expressão eGFP robusta demonstrando a restrição espacial característica para um local de rede é tipicamente observado nestas "novas" culturas (Figura 7), confirmando a capacidade de transdução bem preservado dos vetores de anúncios ligados a malha, mesmo após 48 h de exposição para completar meio de cultura celular a 37 ° C.
Os estudos in vivo
Para examinar os efeitos potenciais relacionados com o uvector se de HC diferente em transdução arterial, animais implantados com Ad Luc -eluting stents preparados com RHC-, IHC-, SHC- e NHC modificado passou por uma imagem de bioluminescência e 8 dias após a implantação do stent (Figura 8). A imagiologia foi realizada a seguir à administração local de perivascular de luciferina (2 mg) de co-formulado com gel 'Pluronic'. Esta formulação é um líquido viscoso quando arrefecidas em gelo, mas sofre uma transição de fase de gel de imediato quando trazido em contacto com o tecido, a 37 ° C. As experiências preliminares (não mostrados) demonstraram que a entrega perivascular de resultados em sinais de luminescência luciferina mais estáveis e reprodutíveis no Ad Luc -transduced tecido vascular quando comparados com sistémica (intraperitoneal ou intravenosa) luciferina.
Se tethering vírus para o stent ea cirurgia de implantação de stent foram tecnicamente sólida, um sinal bem definido correspondente ao segmento com stent deartéria carótida de rato é emitida e registada. Um dia após a implantação do stent, os animais tratados com RHC-formulados stents Ad Luc apresentam tipicamente o maior sinal de luminescência, seguido dos ratos que receberam IHC- e SHC- formulado stents (Figuras 8A e 8B). Nenhum sinal perceptível é observado no grupo de ratos implantados com stents preparados utilizando-NHC tethered Ad Luc, ressaltando a importância de libertação sem impedimentos a partir do vector de stent para a transdução eficiente de tecido vascular (Figuras 8A e 8B). Ao dia 8, a intensidade média de expressão de luciferase com os stents RHC-formuladas gotas de várias vezes, ao mesmo tempo que aumenta a 1,4 e de 1,8 vezes, e stents com IHC- SHC-formuladas, respectivamente (Figuras 8A e 8B). Este resultado é consistente com a hipótese de transdução vascular mais durável com stents de genes que apresentam um parente mais lentoETICS de lançamento do vetor da superfície do stent.
Figura 1 fórmulas estruturais dos agentes de ligação cruzada (NHC, SHC, IHC e RHC) utilizados ao longo dos estudos descritos (modificado com permissão 28).
Figura 2 Um esquema representando Ad vector tethering de um PABT / PEI PDT -Modified superfície de aço inoxidável através de um HC e posterior liberação do vetor após hidrólise de reticulação (modificado com permissão 28).
Figura 3.-quant baseado na PCRificação de Ad eGFP imobilizado por via de reticulação amarrar na superfície de PABT / PEI PDT -Modified malhas de aço inoxidável. As malhas de aço inoxidável foram formuladas com Ad eGFP imobilizado por via RHC, IHC, SHC, ou NHC (n = 3 para cada condição ). Após o tratamento com proteinase K, o ADN viral foi eluído e purificado utilizando colunas MinElute. A amplificação de DNA viral usando os iniciadores específicos eGFP-foi realizada num 7500 Real-Time PCR motor e foi detectado com SYBR Green. Normalização dos dados baseou-se numa curva de calibração preparada com uma quantidade conhecida de Ad eGFP não imobilizado (modificado com permissão 28).
Figura 4 cinética de liberação de Ad vector amarrado a substratos metálicos com HC. Stainless malhas de aço foram derivados com ~ 2 x 10 partículas AD 9 Cy3 marcado ligados ao PABT / PEI PDT -Modified superfície após a modificação com 500 mm de NHC, SHC, IHC, RHC e 100 M RHC (designado como RHC-L). A liberação de fluorescente etiquetado partículas anúncio foi estudado nos momentos indicados por (A) fluorometria bem-scan em 550/570 nm e (B) microscopia fluorescente (conjunto de filtros rhodamine; 200X ampliação original). Resultados Fluorometria são apresentados como médias ± SEM, n = 8-10; p <0,001 para todas as comparações entre o NHC e SHC vs IHC, RHC e grupos RHC-L foram determinados por Anova com teste post-hoc de Tukey (modificado com permissão 28).
Figura eficácia 5. Transdução de não imobilizado e AdGFP seguinte modificação com RHC. Rato embrionárias derivadas de aorta SMC (A10 line) foram transduzidas em um MOI de 1000, com ou sem modificações Ad eGFP ou vetor modificado com RHC como indicado. A expressão repórter foi determinada fluorimetricamente (485/535 nm) 48 horas após a transdução (modificado com permissão 27).
Figura 6 Transdução de cultura SMC e BAEC com vector Ad imobilizado ao aço inoxidável malhas com HC. Malhas foram derivados com ~ 2 x 10 partículas eGFP 9 de anúncios anexados via NHC, SHC, IHC, e RHC. As malhas foram então colocados individualmente no topo de sub-confluente A10 (A, B) e BAEC (C, D) monocamadas. Transdução (expressa em níveis de expressão eGFP) de células tratadas com malhas vector Ad-cativos foi avaliada por fmicroscopia luorescence (A, C, conjunto FITC filtro; 100x original) e fluorometria bem-scan (B, D). Resultados Fluorometria são apresentados como médias ± SEM, n = 4 (modificado com permissão 28). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 7 competência Transdução de substrato imobilizado vetores de anúncios em pontos de forma retardada. Anúncio eGFP foi imobilizada em aço malhas através NHC, SHC, IHC ou RHC amarras. As malhas foram colocados nas monocamadas subconfluentes BAEC. Dois dias após a colocação, BAEC tripnização e removido sem perturbar as malhas. Novo, não transduzidas BAEC foram então semeadas sobre as malhas. AnúncioeGFP transdução de competência foi medido pela expressão eGFP usando microscopia de fluorescência (A; conjunto de filtros FITC; 100X ampliação original) e fluorimetria (B). As medidas foram realizadas em dias indicados, imagens representativas foram utilizados e resultados fluorometria são meios ± SEM, n = 4 (modificado a partir com autorização 28). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 8 eficiência de transdução de imobilizado-stent Ad Luc in vivo. Ad Luc (1,3 x 10 10 partículas) foi amarrado a stents endovasculares via NHC, SHC, IHC ou RHC (n = 3-4 para todos os grupos). Eficiência de transdução de Ad Luc </ Sub> eluição de stents foi medida por bioluminescência imagem (IVIS Spectrum) 1 e 8 dias após a implantação do stent (A), e plotados usando uma escala logarítmica (B) (modificado de permissão com 28). Clique aqui para ver uma maior versão desta figura.
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Discussion
O protocolo apresentado descreve um método operacional para a entrega de genes mediada substrato conseguida através de fixação reversível de vectores adenovirais sem casaco para as superfícies de aço inoxidável. Embora desenvolvido para a finalidade específica de terapia genética baseada em stent de reestenose vascular, esta técnica tem aplicações muito mais amplas nas áreas de biomateriais, implantes biomédicos e terapia gênica.
Embora os estudos apresentados têm apenas utilizado aço inoxidável como um substrato de metal prototípico, PABT liga outras ligas de metais tais como cobalto / crómio e de nitinol com afinidade comparável (não publicado). A interação indiscriminado de PABT com metais amplia significativamente o número de potenciais aplicações biomédicas para esta tecnologia 31. Além disso, a utilização de vectores de genes HC-amarrado, embora exigindo outros métodos de instalação tiol sobre a superfície de material, é possível com outros tipos de biomateriais.
EOR "> Enquanto vectores de genes Ad alcançar transdução robusto em muitos tipos de células e tecidos humanos, a sua relevância clínica é limitada por fortes respostas inflamatórias e imunológicas induzidas por Adenoviridae 4. Para este fim, prolongada (4 meses) de expressão de genes com stents arteriais eluindo formulados HC usando modificação de vectores virais adeno-associados que expressam luciferase foi recentemente mostrado (não publicado).A metodologia é robusta. Pequenos desvios do protocolo principal geralmente não levam a alterações significativas de expressão gênica in vitro e in vivo. No entanto, foram identificadas várias questões críticas que podem afetar os resultados.
Em primeiro lugar, como o nome sugere, hidrolisáveis reticulantes são cliváveis após reacção com água, devido à hidrólise do éster em cadeia. Além disso, o grupo amina reactivo, é hidrolisável N -sulfosuccinimidyl bem. Ligantes Cruz deve ser armazenado under uma atmosfera de árgon a -20 ° C para preservar a sua actividade. Pelas mesmas razões, depois de preparar soluções de HC (seção de protocolo 3.2) proceder imediatamente com a adição de soluções de HC para as preparações de vírus.
Em segundo lugar, os grupos tiol que são formados sobre a superfície do metal durante vários passos intermediários da sequência de bioconjugação apresentados são rapidamente oxidados pelo oxigénio do ar ambiente. Para evitar isso, manter as amostras de metal vulneráveis submersas em água desgaseif içada em todos os momentos.
Em terceiro lugar, um alinhamento perfeito da malha com a parte inferior do poço é necessária para a transdução de sucesso. Não dobre os discos de malha durante o manuseio.
Em quarto lugar, evitar a fricção excessiva de stents com eluição de genes contra a bainha de Teflon e parede do vaso durante a inserção de stent para impedir desalojamento de vetores de anúncios associados à superfície.
A ligação covalente do vector do gene da superfície de biomateria implantávells tem uma aparente vantagem de um melhor controle sobre a cinética de liberação do vetor do que realizável com tethering não-covalente de vetores. No cenário de entrega de genes de plataforma de stent maioria dos estudos relatam liberação completa de vetores virais e não virais dentro de 1-7 dias após a implantação do stent 32-34. Por outro lado, vector Ad imobilização via HC demonstrou libertação de apenas 20-45% da carga do vetor no primeiro mês (Figuras 4A e 4B). Por outro lado, de uma modulação de libertação parcial e cinética de transdução é conseguido com o uso de diferentes HC exibindo diferentes cinéticas de hidrólise ou através da variação da concentração de HC empregado para a modificação da superfície do vírus. Além disso, a co-modificação concorrente do vetor com diferentes moléculas de reticulação, embora não explorado no presente estudo, fornece uma oportunidade para o ajuste fino liberação vetor e transdução.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 316 stainless steel mesh disks | Electon Microscopy Sciences | E200-SS | |
| Generic 304-grade stainless steel stents | Laserage | custom order | |
| AdeGFP | University of Pennsylvania Vector Core | AD-5-PV0504 | |
| AdLuc | University of Pennsylvania Vector Core | AD-5-PV1028 | |
| AdEMPTY | University of Pennsylvania Vector Core | A858 | |
| Cy3(NHS)2 | GE Healthcare | PA23000 | |
| Sepharose 6B | Sigma-Aldrich | 6B100-500ML | |
| UV 96-well plates | Costar | 3635 | |
| Fluorometry 96-well plates | Costar | 3915 | |
| Cell culture 96-well plates | Falcon | 353072 | |
| Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride (TCEP) | Pierce Thermo Scientific | 20490 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Pierce Thermo Scientific | 20290 | |
| sulfo-LC-SPDP | Pierce Thermo Scientific | 21650 | |
| Spectrophotometer | Molecular Devices | SpectraMax 190 | |
| Spectrofluorometer | Molecular Devices | SpectraMax Gemini EM | |
| Orbital shaker incubator | VWR | 1575R | |
| Horizontal airflow oven | Shel Lab | 1350 FM | |
| Centra-CL2 centrifuge | International Equipment Company | 426 | |
| Digital vortex mixerer | Fisher Thermo Scientific | 02-215-370 | |
| Eclipse TE300 fluorescence microscope | Nikon | TE300 | |
| DC 500 CCD camera | Leica | DC-500 | |
| 7500 Real-Time PCR system | Applied Biosystems | not available | |
| IVIS Spectrum bioluminescence station | Perkins-Elmer | not available | |
| EDTA dipotassium salt | Sigma-Aldrich | ED2P | |
| Bovine serum albumin fraction V (BSA) | Fisher Thermo Scientific | BP1600-100 | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P1379 | |
| Dumont forceps | Fine Science Tools | 11255-20 | |
| A10 cell line | ATCC | CRL-1476 | |
| Bovine aortic endothelial cells | Lonza | BW-6002 | |
| Luciferin, potassium salt | Gold Biotechnology | LUCK-1Ge | |
| Pluronic F-127 | Sigma-Aldrich | P2443-250G | |
| PBS without calcium and magnesium | Gibco | 14190-136 | |
| Fetal bovine serum | Gemini Bio-Products | 100-106 | |
| Penicillin/Streptomycin solution | Gibco | 11540-122 | |
| DMEM, high glucose | Corning cellgro | 10-013-CV | |
| 0.25% Trypsin/EDTA | Gibco | 25200-056 | |
| QIAamp DNA micro kit | Qiagen | 56304 | |
| Power Sybr Green PCR Master Mix | Applied Biosystems | 4367659 | |
| MicroAmp Optical 96-well Reaction Plate | Applied Biosystems | N8010560 | |
| MicroAmp Optical Adhesive Film | Applied Biosystems | 4360954 | |
| Cephazolin | Apotex | not available | |
| Loxicom (Meloxicam) | Norbrook | not available | |
| Heparin sodium | APP Pharmaceuticals | not available | |
| Ketavet (Ketamine) | VEDCO | not available | |
| Anased (Xylazine) | Lloid | not available | |
| Forane (Isoflurane) | Baxter | not available | |
| Curved Moria iris forceps | Fine Science tools | 11370-31 | |
| Curved extra-fine Graefe forceps | Fine Science Tools | 11152-10 | |
| Dumont #5 forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| Vannas spring scissors | Fine Science Tools | 15018-10 | |
| Fine scissors - ToughCut | Fine Science Tools | 14058-09 | |
| Surgical scissors | Fine Science Tools | 14101-14 | |
| Vicryl suture (5-0) | Ethicon | J385 | |
| Suture thread (4/0 silk) | Fine Science Tools | 18020-40 | |
| Michel suture clips | Fine Science Tools | 12040-02 | |
| Wound dilator (Lancaster eye specula) | KLS Martin | 34-149-07 | |
| Hot bead sterilizer | Fine Science Tools | 18000-45 | |
| Michel suture clip applicator | Fine Science Tools | 112028-12 | |
| Insyte Autoguard 24 G IV catheter | Beckton-Dickinson | 381412 | |
| 2F Fogarty catheter | Edwards Lifesciences | 120602F | |
| Teflon tubing | Vention | 041100BST | |
| PTA catheter | NuMed | custom order | |
| Gauze pads | Kendall Healthcare | 9024 | |
| Cotton applicators | Solon Manufacturing | WOD1003 | |
| Saline | Baxter | 281321 | |
| 10 ml syringe (Luer-Lok) | Beckton-Dickinson | 309604 | |
| 1 ml syringe (Luer-Lok) | Beckton-Dickinson | 309628 | |
| Clippers with #40 blade | Oster | 78005-314 | |
| Transpore surgical tape | 3M | MM 15271 | |
| Puralube vet ointment | Pharmaderm | not available |
References
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