Abstract
La terapia genica, utilizzato per realizzare il recupero funzionale di sordità neurosensoriale, promette di concedere una migliore comprensione dei meccanismi molecolari e genetici alla base che contribuiscono alla perdita dell'udito. Introduzione di vettori nell'orecchio interno deve essere fatto in modo che l'agente ampiamente distribuisce tutta la coclea minimizzando lesioni alle strutture esistenti. Questo manoscritto descrive un approccio chirurgico post-auricolare che può essere utilizzato per il mouse terapia cocleare usando molecolari, farmacologico, e consegna virale per topi giorno postnatale 10 e anziani attraverso la membrana finestra rotonda (RWM). Questo approccio chirurgico consente la consegna rapida e diretta nella scala timpanica, riducendo al minimo la perdita di sangue ed evitare la mortalità degli animali. Questa tecnica comporta trascurabile o nessun danno alle strutture essenziali dell'orecchio interno e medio nonché muscoli del collo mentre tutto conservando udito. Per dimostrare l'efficacia di questa tecnica chirurgica, la glutam vescicolaremangiato transporter 3 knockout (VGLUT3 KO) topi verrà utilizzato come esempio di un modello murino di sordità congenita che recupera l'udito dopo la consegna del VGLUT3 all'orecchio interno tramite un virus adeno-associato (AAV-1).
Introduction
La terapia genica è stato a lungo suggerito come un potenziale trattamento per la perdita dell'udito genetica, ma il successo in questo settore è rimasta inafferrabile 1. Ad oggi, le metodologie viralmente mediati hanno prevalso grazie alla capacità teorica di indirizzare specifici tipi cellulari all'interno della coclea relativamente inaccessibile. Entrambi adenovirus (AV) e il virus adeno-associato (AAV) sono stati utilizzati per la consegna del gene cocleare. AAV sono vantaggiosi nella coclea per una serie di motivi. Sono virus replica-carenti e possono efficacemente trasferire molecole transgenici a diversi tipi di cellule, tra cui i neuroni, un obiettivo importante per una serie di cause di perdita dell'udito. AAV ingresso nella cellula è mediata da recettori specifici 2; pertanto, la scelta di un particolare sierotipo deve essere compatibile con i tipi cellulari da trasdotte. AAV può efficacemente trasfettare cellule ciliate 3 e incorporare nel genoma dell'ospite, conseguente, espressione stabile a lungo termine del TRAproteine nsgenic e il cambiamento fenotipico nella cella 4. Anche se non necessariamente vantaggioso per applicazioni a breve termine, come la rigenerazione delle cellule ciliate, espressione a lungo termine è molto importante per il salvataggio stabile di difetti genetici. Perché AAV non sono associati a qualsiasi malattia umana o infezione e non mostrano ototossicità 5,6,7, sono un candidato ideale per l'uso in terapia genica per forme ereditarie di perdita dell'udito 8.
Trasferimento di materiale genetico esogeno nell'orecchio interno dei mammiferi utilizzando vettori virali è stata studiata negli ultimi dieci anni e sta emergendo come una tecnica promettente per il trattamento di forme sia genetiche e acquisite di perdita dell'udito 9. La coclea è potenzialmente un bersaglio ideale per la terapia genica per diverse ragioni: 1) la sua piccolo volume richiede una quantità limitata del virus necessaria; 2) il suo relativo isolamento da altri effetti limiti organi laterali; e 3) le sue camere piene di liquido facilitano viraleconsegna in tutto il labirinto 10, 11,12,13,14, 15.
I modelli murini di sordità congenita consentono uso di molti metodi di studio per monitorare lo sviluppo dell'orecchio interno in un modo replicabile sistematica. Mentre le dimensioni ridotte del topo coclee non presenta difficoltà chirurgica, il mouse serve come modello estremamente importante nello studio della sordità genetica, con diversi vantaggi sperimentali su altre specie 16. Modelli murini consentono la valutazione di una serie di caratteristiche, attraverso analisi di linkage genetico, raccolta di osservazioni dettagliate morfologiche, e la simulazione di scenari patogeni; come tali, sono buoni candidati per la terapia genica mediata viralmente. Ampi studi genetici nei topi combinate con i progressi tecnologici hanno permesso di generare topi geneticamente modificati in modo riproducibile attraverso laboratori 17,18, 19, 20,21. Furthermore, esistono numerosi modelli sia per acquisite ed ereditarie udito fenotipi di perdita nei topi, consentendo test rigorosi in questo modello animale 22, 23,24. Così, correggendo l'udito con la terapia genica virale mediato in un modello di topo è un primo passo opportuno nella ricerca di una cura per le malattie umane.
Abbiamo precedentemente dimostrato che i topi transgenici privi di glutammato vescicolare Transporter 3 (VGLUT3) nascono sordi a causa della mancanza di rilascio di glutammato a nastro sinapsi IHC 25. Poiché questa mutazione non porta ad una degenerazione primaria delle cellule ciliate sensorie, questi topi mutanti sono potenzialmente un ottimo modello in cui sperimentare la terapia genica per cocleare sordità congenita.
Fino ad oggi, una serie di tecniche di consegna virali per la terapia genica cocleare sono stati descritti, tra andata diffusione membrana finestra, rotondo iniezione membrana finestra e distribuirla su cocleostomia. Ci sono potentivantaggi ial e svantaggi di ciascuno di questi approcci 9.
Qui riportiamo un metodo chirurgico per la consegna del gene virale mediata all'orecchio interno VGLUT3 KO mouse attraverso la membrana della finestra rotonda (RWM). Il metodo di iniezione RWM post-auricolare è minimamente invasiva con ottima conservazione dell'udito, ed è relativamente veloce. Come precedentemente pubblicato, nel tentativo di ripristinare dell'udito in questo modello di topo, un vettore che porta il gene AAV1 VGLUT3 (AAV1-VGLUT3) è stato introdotto nella coclea di questi topi sordi al giorno postnatale 12 (P! @), Con conseguente il restauro di sentire 26. Audizione in topi VGLUT3 KO è stato verificato dai uditivo risposta tronco encefalico (ABR), mentre l'espressione della proteina transgene è stata verificata mediante immunofluorescenza (IF). Questa metodologia dimostra quindi che la terapia genica mediata viralmente può correggere un difetto genetico che altrimenti provoca sordità.
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Protocol
NOTA: tutte le procedure e la gestione degli animali rispettate le linee guida etiche NIH e requisiti del protocollo approvati Care and Use Committee della University of California Animal Istituzionale, San Francisco.
1. Preparare la Animal di Chirurgia
- Eseguire interventi chirurgici in un ambiente pulito, spazio dedicato. Autoclave tutti gli strumenti chirurgici, sterilizzare con una sterilizzatrice vetro tallone prima dell'intervento.
NOTA: In questo protocollo, utilizzare giorno postnatale 10-12 (P10-12) topi FVB. Età diverse e ceppi di topi possono essere utilizzati per soddisfare le esigenze di uno specifico progetto. I topi di età superiore a P40 può essere impegnativo, perché l'osso bulla diventa più difficile. - Anestetizzare topi con iniezione intraperitoneale di una miscela di ketamina cloridrato (100 mg / kg), xilazina cloridrato (10 mg / kg), e acepromazina (2 mg / kg). Inizia la preparazione chirurgica solo dopo che l'animale non risponde più agli stimoli dolorosi, come pinch punta. Se necessary, somministrare una dose di richiamo (un quinto della dose originale) del cocktail anestetico per ripristinare il piano anestetico originale.
NOTA: Fare attenzione a questo passaggio perché la maggior parte della mortalità osservata a questa età è causata da overdose di anestetico. - Coprire gli occhi dell'animale con una pomata oftalmica protettiva per mantenere gli occhi umidi durante l'anestesia, sopprimendo riflesso corneale dell'animale.
- Posizionare il mouse con il collo esteso su una piastra elettrica per tutta la procedura fino a quando il mouse è completamente sveglio, per evitare post-anestesia ipotermia.
- Radere la regione post-auricolare sinistro con un clipper e disinfettare con il 70% di etanolo e iodopovidone prima manipolazione chirurgica.
2. La procedura chirurgica e Vector Injection
- Utilizzare un approccio post-auricolare per esporre la bolla timpanica. Incidere il tessuto sottocutaneo con piccole forbici per esporre il muscolo post-auricolare. Dopo ritrarre il tessuto adiposo in Oce lato posteriore dell'incisione, separare i muscoli a destra ea sinistra perpendicolare alla incisione per esporre l'osso temporale. Assicurarsi che questa incisione è abbastanza a lungo per lavorare comodamente con visualizzazione adeguata.
- Perforare bolla timpanica con un ago 25 G ed espandere il foro come necessario con pinze staccando la spina dorsale per consentire l'accesso al giro basale della coclea, e quindi allargare sufficientemente visualizzare l'arteria stapediale e la membrana della finestra rotonda (RWM) .
- Forare la RWM delicatamente al centro con una pipetta borosilicato capillare. Osservare efflusso fluido attraverso il RWM a questo punto; questo è normale. Attendere che l'efflusso è stabilizzata (il fluido effluxed dalla coclea viene asciugata con carta da filtro sterile).
NOTA: Fare attenzione quando si tiene e avanza l'ago di vetro in modo che la perforazione RWM è il più piccolo possibile. A seconda del microscopio utilizzato, detengono le pipette con un micromanipolatore oa mano con una pipettatitolare. - Preparare le pipette per l'iniezione con una pipetta estrattore lo stesso senso pipette patch clamp sono preparati. Assicurarsi che il diametro della punta è di grandi dimensioni (circa 15 micron di diametro) in modo che il virus pipettando dentro e fuori è fatto facilmente.
- Elaborare 1 a 2 ml di AAV1-VGLUT3, AAV1-GFP o AAV2-GFP in una pipetta di iniezione. Dopo l'efflusso è stabilizzato (da 5 a 10 min), microinject questo volume fisso nella scala timpanica attraverso lo stesso foro precedentemente realizzato in RWM.
- Sigillare la nicchia RW subito dopo aver estratto la pipetta con un piccolo tampone di muscoli e fissarlo con una piccola goccia di tessuto adesivo posto sul muscolo per evitare perdite dalla finestra rotonda.
NOTA: Seal questo buco molto bene dopo l'ago viene rimosso con un piccolo tappo di muscoli per evitare qualsiasi perdita perilymph dalla coclea-questo passaggio è fondamentale per preservare l'udito. La mancata sigillare completamente il RWM comporterà la perdita dell'udito nel corso del tempo. - Dopo l'iniezione, coprire ilbuco nella bolla uditiva con tessuto adiposo, restituire i muscoli post-auricolari e tessuto adiposo alla loro posizione normale e suturare la ferita a strati con un assorbibile sutura cromico 6-0 o più piccolo.
- Disinfettare la ferita con povidone-iodio.
3. postoperatoria Cura
- Mettere i topi in una gabbia calda e non lasciarli incustoditi fino a quando non sono completamente recuperati poi spostarli nuovamente con la madre. Si consiglia di rimuovere il maschio dalla gabbia prima di mettere i cuccioli di nuovo con la madre.
- Somministrare per via sottocutanea Carprofen (2 mg / kg) per l'analgesia dopo l'intervento e ogni 24 ore in seguito per 3 giorni, per gestire l'infiammazione e il dolore. Monitorare gli animali ogni giorno per i segni di disagio, perdita di peso anormale, dolore, o infezione. Generalmente dal 3 ° giorno dopo l'intervento chirurgico tutti i topi vanno agiscono normalmente. Se i sintomi di disagio o di malattia appaiono in un mouse dopo il 3 ° giorno, in considerazione eutanasia tegli mouse come da linee guida istituzionali.
4. Valutazione della funzione cocleare dopo la consegna Viral Utilizzando uditiva del tronco encefalico (ABR) Risposta Recordings
NOTA: La risposta del tronco encefalico uditivo (ABR) è un Potenziali evocati uditivi estratto da attività elettrica in corso nel cervello e registrato attraverso elettrodi posti sotto il cuoio capelluto. L'animale viene stimolato con il suono. La registrazione risultante consiste di cinque onde che riflettono l'attività elettrica dei punti successivi nel percorso uditivo nei primi 10 msec dopo l'insorgenza di uno stimolo uditivo.
- Anestetizzare topi mediante iniezione intraperitoneale di una miscela di ketamina cloridrato e xilazina cloridrato come descritto nella sezione 1.2 del presente protocollo, salvo non acepromazina.
- Posizionare il mouse su una piastra elettrica per tutto il test dell'udito fino a quando il mouse è completamente sveglio, per evitare post-anestesia ipotermia.
NOTA: Usai seguenti stimoli sonori in questo esperimento: clicca (5 msec durata; 31 Hz tasso presentazione). - Inserire elettrodi sottocutanei aghi al vertice, sotto la pinna dell'orecchio sinistro (riferimento), e sotto l'orecchio controlaterale (massa) e iniziare ABRs registrazione come precedentemente descritto in una camera insonorizzata 27,28. Record ABR forme d'onda a intervalli di 5 dB del livello di pressione sonora giù dal massimo di ampiezza.
- Determinare le soglie ABR dopo l'intervento già a quattro giorni dopo la consegna virale
NOTA: soglia è definita come il livello di stimolo minimo al quale risposta picchi di onde I-V erano chiaramente e ripetutamente presente un controllo visivo. - Misura onda Io per analizzare l'attività del nervo cocleare. Il livello di stimolo più basso che produce una forma d'onda rilevabile ABR è definito come soglia.
5. Cochlear Transgene Protein Expression Usando immunofluorescenza
- Anestetizzare topi da un overdose di intrapiniezione eritoneal di una miscela di ketamina cloridrato e xilazina cloridrato come descritto nella sezione 1.2 del presente protocollo, salvo non acepromazina.
- Decapitare il capo solo dopo che l'animale non risponde più agli stimoli dolorosi, come il pinch punta.
- Sezionare il coclee fuori e di processo per tutto il montaggio immunofluorescenza come descritto 26. Un protocollo dettagliato di cocleare tutto-mount immunofluorescenza utilizzando anti-VGLUT3 e anticorpi anti-miosina 7a è descritto in Akil et al., 2013 29.
- Per l'etichettatura GFP, incubare le cocleari tutto-monti notte a 4 ° C con un coniglio anti-GFP anticorpi a 1: 250 di diluizione.
- Risciacquare la coclee due volte per 10 min con PBS e poi incubare per 2 ore a IgG anti-coniglio di capra coniugata Cy2 diluito 1: 4000 in PBS.
- Sciacquare la coclee con PBS due volte per 10 minuti e incubare con DAPI per 15 min.
- Montare la coclee su vetrini e osservare under un microscopio con immunofluorescenza confocale.
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Representative Results
Per verificare le caratteristiche tecniche e l'utilità di un approccio post-auricolare per la terapia molecolare cocleare, AAV1-VGLUT3, AAV1-GFP e AAV2-GFP sono state consegnate in topi P10-12 all'orecchio interno tramite l'RWM. Questo approccio dimostra espressione del transgene successo all'interno delle cellule ciliate interne (IHC) (VGLUT3 Figura 1 e Figura 2 e GFP GFP figura 3A), le cellule ciliate esterne (OHC) (GFP Figura 2) e cellule di supporto (GFP Figura 2 e Figura 3A) 26 senza significative organo di lesioni Corti. L'osservazione di diversi tipi di cellule esprimenti GFP visto nelle immagini cocleari immunofluorescenza interi montaggio (Figura 2 e Figura 3A) dimostra che la scelta di AAV sierotipo deve essere compatibile con i tipi di cellule da trasdotte. Figura 1, Figura 2 e Figura 3A 26 mostrano molto buona transfection sia cellule ciliate interne e OHC, così come la distribuzione della proteina transgene (GFP / VGLUT3) in tutta la coclea dopo AAV1 o AAV2-GFP o AAV1-VGLUT3 trasfezione. La distribuzione delle cellule ciliate esprimere VGLUT3 dopo AAV1-VGLUT3 trasfezione (Figura 3B) 26 suggerisce che la trasfezione tramite RWM è più efficace ed uniforme attraverso l'intera coclea di altri metodi che hanno riportato tassi di trasfezione superiori vicino al sito di consegna virale. Abbiamo trovato che i tassi di trasfezione possono essere resi più efficaci aumentando il volume del virus iniettato nell'orecchio interno (Figura 1) 26.
La nostra osservazione di espressione VGLUT3 successo in VGLUT3 KO topo cellule ciliate interne senza alcun danno cocleare ci ha portato a testare l'udito misurando ABRs nei topi KO in salvo. 4A e 4B, 26 documento la capacità di consegna RWM post-auricolare di AAV1-VGLUT3 nella interno ear dei topi KO VGLUT3 produrre sentire soccorso in questo modello murino di sordità congenita. Risposta uditiva del tronco encefalico (ABR) tracce sono state restaurate nel VGLUT3 salvato KO (4A), e le soglie ABR erano misurabili e paragonabili a quelli osservati nei topi wild-type (Figura 4B).
Figura 1:. VGLUT3 IHC trasfezione dopo RWM consegna virale a P10-P12 topi KO Il coclee transfettate sono stati esaminati in P30 mediante immunofluorescenza utilizzando anticorpi anti-MYO7A, un marker delle cellule ciliate, e un anticorpo contro VGLUT3. MYO7A e VGLUT3 sono stati espressi in tutte le cellule ciliate interne solo in WT, mentre cellule ciliate interne da KO topi espresso solo MYO7A. Il coclee del mouse salvato mostrato alcuni cellule ciliate interne esprimono VGLUT3, e tutti cellule ciliate interne espresso MYO7A (riga 3) IHC:. Le cellule ciliate interne. Ristampa con il permesso di26. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Mouse cocleare tutto il montaggio immunofluorescenza dopo la consegna RWM AAV2-GFP per topi wild-type P10-P12 AAV2-GFP è stato utilizzato per valutare la consegna virale utilizzando l'approccio post-auricolare alla coclea mouse.. Consegna AAV2-GFP è stato fatto a P10-12 e di espressione GFP transgenico è stato esaminato nella coclea in P21 utilizzando un anticorpo anti-GFP. GFP (green) in topi WT cocleare tutto-mount mostrano espressione GFP forte in cellule ciliate esterne (OHC) che le cellule ciliate interne (IHC).
Figura 3: coc mouse hlear tutto il montaggio immunofluorescenza dopo la consegna RWM AAV1-GFP per topi wild-type P10-P12. Dopo la consegna AAV1-GFP all'espressione coclea di GFP è visto in cellule interne di capelli (IHC) e le cellule di supporto (A), ma non OHC , mentre la consegna AAV1-VGLUT3 alla coclea del VGLUT3 KO topi (B) ha comportato l'espressione VGLUT3 solo in cellule ciliate interne. Il numero di cellule ciliate interne esprimere VGLUT3 nel VGLUT3 KO topi coclea dopo la consegna AAV1-VGLUT3 dipende la quantità di virus consegnato all'orecchio interno; per esempio, il 40% delle cellule ciliate interne espresso VGLUT3 quando 0,6 ml di virus è stato iniettato, mentre il 100% delle cellule ciliate interne espresso VGLUT3 dopo 1 ml di virus è stato consegnato. Non c'era differenza nella espressione VGLUT3 tra l'apice, a metà turno, o la base in cui 0,6 ml di virus è stato iniettato. Ristampa con il permesso di 26.
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. Figura 4: risposta uditiva del tronco encefalico (ABR) valutazione Rappresentante forme d'onda ABR dopo la consegna AAV1-VGLUT3 erano simili tra i topi in salvo e wild-type; al contrario, non ABR forme d'onda sono stati osservati nei topi KO (A). Topi KO Salvati anche mostrato soglie ABR misurabili. Tali soglie ABR erano paragonabili a quelli osservati nei topi WT per tutte le frequenze misurate (B). I:. ABR onda I. Ristampa con il permesso di 26 Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
In questo lavoro, si descrive in dettaglio una tecnica che può essere utilizzato per la terapia genica cocleare, con l'obiettivo di ripristino o salvataggio normale funzione uditiva che viene compromessa da un difetto genetico. Come è tipicamente atraumatica, questo approccio è sicuro per il trasferimento di geni cocleare o altri potenziali terapie molecolari 30. Altri approcci per la terapia cocleare sono stati descritti, tra cui un approccio ventrale 24, cocleostomia 31,32 e sacco endolinfatico consegna 33 in mouse e cavia. Nella nostra esperienza, l'approccio post-auricolare è più veloce, più semplice, e associata a lesioni ridotta e la mortalità degli animali. Inoltre, l'approccio post-auricolare offre una migliore visualizzazione del RWM con meno possibilità di traumi e di conseguente perdita di udito 34,35,36. Questo rapporto documenta gli aspetti tecnici e l'utilità dell'approccio post-auricolare per la terapia molecolare cocleare dimostrando consegna AAV1-VGLUT3 in the orecchio interno attraverso il RWM, con conseguente espressione transgenica sia VGLUT3 e GFP (Figura 1 e Figura 2 e Figura 3A) e dell'udito salvataggio in questo modello murino di sordità congenita. Precedenti studi che descrivono i metodi di consegna del gene hanno mostrato solo limitata espressione transgenica nelle aree critiche del organo del Corti 12,37,38,39,40,41. Queste differenze possono essere dovute alla qualità della preparazione virale, il titolo del vettore virale, sierotipo utilizzato, o la consegna virale semplicemente insufficienti nella coclea. Al contrario, utilizzando questo approccio post-auricolare siamo stati in grado di ottenere ottimi tassi di trasfezione per entrambe le cellule ciliate interne ed esterne e la distribuzione di un gene reporter (GFP) dopo AAV2-GFP trasfezione (Figura 2 e Figura 3A) tutta la coclea. Sulla base della percentuale di cellule ciliate interne transfettate con AAV1-VGLUT3 (figura 3B), vi consigliamo di trasfezione via RWM è più effcace e uniforme per tutta la coclea rispetto ad altri metodi, compreso quello descritto nella cavia, che ha registrato tassi di trasfezione più elevati nel giro basale, vicino al sito di applicazione virale 42. L'espressione a lungo termine della GFP / VGLUT3 all'interno della coclea, per almeno un anno e mezzo, è coerente con i dati ottenuti da altri modelli animali e diversi sistemi di organi 38,43.
Inoltre, l'analisi istologica della coclea transfettate dimostrato alcuna evidenza di una risposta infiammatoria, con ottima conservazione del citoarchitettura dell'organo del Corti, compresa la vascularis stria e spirale neuroni gangliari 26. Inoltre, a differenza di metodi che impiegavano un cocleostomia, la trasfezione RWM utilizzato nel presente studio non ha causato danni cocleare e volumi potrebbe essere iniettato 31,32. La mancanza di un trauma utilizzare questa tecnica è stata verificata, dimostrando equivalente thresho ABRlds tra orecchie gestite e controllo, una ricerca simile a quello visto da Xia et al. 4, infine, la consegna AAV-VGLUT3 attraverso l'RWM comportato ABR soglie paragonabili a quelli osservati nei topi WT (Figura 4A e 4B) Figura 26. Abbiamo usato questa tecnica in tutte le età di topi, ma è tecnicamente impegnativo in topi di età superiore a P40, perché l'osso bulla diventa più difficile per perforare e l'osso rotto dal bulla è più tagliente di età superiore nei topi più giovani. In età più avanzata, sanguinamento se non si fa attenzione si può verificare se un pezzo di osso bulla lacera i tessuti del collo.
In conclusione, questo rapporto documenta riuscita del trasferimento genico in diversi tipi di cellule cocleari nel topo mediante un vettore basato AAV-come precedentemente è stato mostrato. Questa tecnica di consegna del gene minimizza il trauma, non porta a perdita di udito, e può causare diffusa trasfezione di una varietà di tipi di cellule all'interno della coclea, incLuding cellule ciliate e neuroni gangliari a spirale. Essa ha un grande potenziale applicazione per altri tipi di forme congenite ed acquisite di perdita dell'udito, e potrebbe essere applicato anche ad una varietà di terapie molecolari in modelli murini di perdita dell'udito.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ketamine | Butler Schein | ||
| Xylazine | AnaSed | ||
| Acepromazine | Provided by UCSF LARC | ||
| Carprofen analgesia | Provided by UCSF LARC | ||
| Betadine | Betadine Puredue Pharma | ||
| dexamethasone ophthalmic ointment (TobraDex) | Alcon | ||
| Heating pad | Braintree scientific, inc. | ||
| 25G needle | BD | 305127 | |
| Borosilicate capillary pipette | World precision instruments, inc. | 1B100F-4 | |
| Suture PDS*plus Antibacterial | Ethicon | PDP149 | |
| Tissue glue (Vetcode) | Butler Schein | 31477 | |
| Rabbit Anti-GFP antibody | Invitrogen | A11122 | |
| Dissecting microscope | Leica | MZ95 | |
| Flaming/ Brown Micropipette | Sutter Instrument Co | ||
| Puller Model P-97 | |||
| TDT BioSig III System | Tucker-Davis Technologies |
References
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