Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

שיטה ניתוחית למשלוח באופן ויראלי המתווכת Gene לאוזן הפנימית באמצעות עכבר העגול חלון ממברנה

Published: March 16, 2015 doi: 10.3791/52187
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Otolaryngology-Head and Neck Surgery, University of California, San Francisco

Abstract

ריפוי גנטי, המשמש להשגת החלמה תפקודית מחירשות חושית, מבטיח להעניק הבנה טובה יותר של מנגנונים המולקולריים וגנטיים הבסיסיים שתורמים לירידה בשמיעה. מבוא של וקטורים לאוזן הפנימית חייב להיעשות באופן שמפיץ את הסוכן נרחב ברחבי השבלול תוך מזעור פגיעה במבנים הקיימים. כתב יד זה מתאר גישה ניתוחית פוסט-אוזן שיכולים לשמש לטיפול בשבלול עכבר באמצעות מולקולרי, תרופתי, ומשלוח נגיפי לעכברים לאחר הלידה יום 10 ומעלה באמצעות הקרום העגול החלון (RWM). גישה ניתוחית זו מאפשרת אספקה ​​מהירה וישירה להלמות scala תוך מזעור אובדן דם והימנעות תמותת בעלי חיים. טכניקה זו כרוכה נזק זניח או לא למבנים חיוניים של האוזן הפנימית ואמצע, כמו גם שרירי צוואר, תוך שמירה על דיון מלא. כדי להדגים את היעילות של טכניקה ניתוחית זו, glutam לפוחיאכלתי טרנספורטר 3 נוקאאוט עכברים (VGLUT3 KO) ישמשו כדוגמא למודל עכבר של חירשות מולדת שמשחזר שמיעה לאחר הלידה של VGLUT3 לאוזן הפנימית באמצעות וירוס adeno הקשורים (AAV-1).

Introduction

ריפוי גנטי כבר הציע ארוך כטיפול פוטנציאלי לאובדן שמיעה גנטי, אבל הצלחה בתחום זה נותרת חמקמקה 1. עד כה, מתודולוגיות תיווך באופן ויראלי גברו בשל היכולת התיאורטית למקד סוגי תאים מסוימים בתוך השבלול יחסית נגיש. אדנווירוס שניהם (AV) ונגיף adeno הקשורים (AAV) היה בשימוש למסירת גן שבלול. AAVs הוא יתרון בשבלול למספר הסיבות. הם וירוסים כפולים מחסרת וביעילות יכולים להעביר מולקולות מהונדסים לתאים מסוגים שונים, כולל נוירונים, יעד חשוב למספר הסיבות לירידה בשמיעה. כניסת AAV לתוך התא מתווכת על ידי קולטנים ספציפיים 2; כך, הבחירה של סרוטיפ מסוים חייבת להיות תואמת לסוגי התאים להיות transduced. AAVs יכול למעשה transfect תאי שיער 3 ולשלב לתוך הגנום המארח, וכתוצאה מכך הביטוי של tra יציב, לטווח ארוךחלבון nsgenic ושינוי פנוטיפי בתא 4. אמנם לא בהכרח יתרון עבור יישומים לטווח קצר, כגון התחדשות שיער תאים, ביטוי לטווח ארוך הוא מאוד חשוב עבור הצלה יציבה של פגמים גנטיים. בגלל AAVs אינם משויך לשום מחלה או הדבקת בני אדם ולהפגין לא ototoxicity 5,6,7, הם מועמד אידיאלי לשימוש בריפוי גנטי לצורות ירושה של אובדן שמיעת 8.

העברה של חומר גנטי אקסוגניים לאוזן הפנימית היונקים באמצעות וקטורים ויראליים נחקרה בעשור האחרון ומסתמנת כטכניקה מבטיחה לטיפול צורות שניהם גנטיות ונרכשות של אובדן שמיעת 9. השבלול הוא פוטנציאל יעד אידיאלי לריפוי גנטי מכמה סיבות: 1) הנפח הקטן שלה מחייב כמות מוגבלת של נגיף צורך; 2) הבידוד היחסי שלה מצד מגבלות מערכות איברי אפקטים אחרים; ו 3) התאים מלא הנוזל להקל נגיפייםמשלוח ברחבי המבוך 10, 11,12,13,14, 15.

מודלים עכבר של חירשות מולדת מאפשרים שימוש בשיטות רבות של מחקר לעקוב אחר התפתחות של האוזן הפנימית באופן שיטתי, לשכפול. בעוד גודלו הקטן של cochleae עכבר זה אכן מציג קושי כירורגית, העכבר משמש כמודל חשוב ביותר במחקר של אובדן שמיעה גנטי, עם כמה יתרונות ניסיוניים על מינים אחרים 16. מודלים עכבר מאפשרים הערכה של מגוון רחב של מאפיינים באמצעות ניתוח הצמדה גנטי, אוסף של תצפיות מורפולוגיים מפורטות, ומדמת תרחישים פתוגניים; ככזה, הם מועמדים טובים לטיפול גנטי בתיווך באופן ויראלי. מחקרים גנטיים נרחבים בעכברים בשילוב עם התקדמות טכנולוגית אפשרו ליצור עכברים מהונדסים גנטי בדרך לשחזור בכל מעבדות 17,18, 19, 20,21. Furthermorדואר, קיימים מודלים רבים לרכשו שני וירשו פנוטיפים אובדן שמיעה בעכברים, המאפשרים בדיקות מחמירות במודל זה של בעלי החיים 22, 23,24. לפיכך, תיקון שמיעה באמצעות ריפוי גנטי בתיווך באופן ויראלי במודל של עכברים הוא צעד ראשון מתאים בחיפוש אחר תרופה למחלה אנושית.

הראינו בעבר כי עכברים הטרנסגניים חסרי גלוטמט שלפוחי טרנספורטר 3 (VGLUT3) נולדים חירשים בשל חוסר שחרור גלוטמט בסינפסה סרט IHC 25. בגלל מוטציה זו אינה מובילה לניוון עיקרי של תאי שיער החושיים, עכברים שעברו מוטציה אלה הם פוטנציאל מודל מצוין שבו לבחון את הטיפול גנטי שבלול לאובדן שמיעת מולד.

נכון להיום, מספר טכניקות מסירה נגיפיות לריפוי גנטי שבלול תוארו, כולל דיפוזיה עגולה חלון קרום, הזרקת חלון קרום עגולה, ומשלוח באמצעות cochleostomy. יש עוצמהיתרונות ial וחסרונות של כל אחת מהגישות האלה 9.

כאן אנו מדווחים שיטה כירורגית למסירת גן בתיווך באופן ויראלי לאוזן הפנימית VGLUT3 KO העכבר דרך הקרום העגול החלון (RWM). שיטת הזרקת RWM פוסט-אוזן היא פולשנית עם שימור שמיעה מצוין, והוא מהיר יחסית. כפי שפורסמנו בעבר, בניסיון לשחזר את השמיעה במודל עכבר זה, וקטור AAV1 נושא את גן VGLUT3 (AAV1-VGLUT3) הוכנס לשבלול האוזן של עכברים החירשים אלה ביום הלידה 12 (P! @), וכתוצאה מכך שיקום שמיעת 26. שמיעה בעכברי VGLUT3 KO אומתה על ידי הבדיקה ABR (ABR), ואילו ביטוי חלבון transgene אומת באמצעות immunofluorescence (IF). מתודולוגיה זו ובכך מוכיחה כי טיפול גנטי באופן ויראלי בתיווך יכול לתקן פגם גנטי שאחרת היה גורם לחירשות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

הערה: כל טיפול הנהלים ובעלי חיים עמד בהנחיות האתיקה NIH ודרישות פרוטוקול שאושרו בוועדה המוסדית הטיפול בבעלי חיים ושימוש באוניברסיטת קליפורניה, סן פרנסיסקו.

1. הכנת בעלי החיים לכירורגיה

  1. לבצע ניתוחים בחלל נקי, מסור. החיטוי כל מכשירי הניתוח, לעקר עם מעקר חרוזי זכוכית לפני הניתוח.
    הערה: בפרוטוקול זה, להשתמש ביום לידה 10-12 עכברי FVB (P10-12). גילים וזנים של עכברים שונים יכולים לשמש כדי לענות על הצרכים של פרויקט ספציפי. עכברים מבוגרים יותר מP40 יכולים להיות מאתגרים, כי עצם הבולה נהיה קשה יותר.
  2. להרדים את העכברים עם זריקת intraperitoneal של תערובת של קטמין הידרוכלוריד (100 מ"ג / קילוגרם), hydrochloride xylazine (10 מ"ג / קילוגרם), וacepromazine (2 מ"ג / קילוגרם). בגין הכנה כירורגית רק לאחר החיה כבר לא מגיבה לגירויים מכאיבים, כגון צביטת הבוהן. אם necessary, לנהל מנת דחף (חמישית במינון המקורי) של קוקטייל ההרדמה כדי לשחזר את המטוס המקורי ההרדמה.
    הערה: הקפד בשלב זה משום שרוב התמותה שנצפתה בגיל זה נגרם על ידי מנת יתר הרדמה.
  3. מכסה את עיניו של בעל החיים עם משחת עיני מגן כדי לשמור על העיניים לחות במהלך הרדמה, דיכוי רפלקס המצמוץ של החיה.
  4. מקם את העכבר עם הצוואר המורחב על כרית חימום לאורך כל ההליך עד לעכבר הוא ער לחלוטין, כדי למנוע היפותרמיה לאחר הרדמה.
  5. לגלח את אזור פוסט-אוזן השמאל עם קליפר ולחטא עם אתנול 70% וpovidone- יוד לפני מניפולציה כירורגית.

2. הליך כירורגי והזרקת וקטור

  1. השתמש בגישת פוסט-תנוכים לחשוף את הבולה התוף. לחתוך את הרקמה התת עורית עם מספריים קטנים לחשוף את השרירים פוסט-אוזן. לאחר חוזר בי רקמת שומן הצד אחורי דואר של החתך, להפריד את השרירים בצד הימין וצד שמאל ניצב לחתך על מנת לחשוף את העצם הטמפורלית. ודא שחתך זה מספיק זמן כדי לעבוד בנוחות עם הדמיה נאותה.
  2. לנקב הבולה התוף עם מחט 25 G ולהרחיב את החור במידת צורך עם מלקחיים על ידי קילוף העצם אחורי כדי לאפשר גישה לתורו הבסיסי של השבלול, ולאחר מכן להרחיב במידה מספקת כדי להמחיש את עורק stapedial וחלון העגול הקרום (RWM) .
  3. לנקב את RWM בעדינות במרכז עם טפטפת נימי ורוסיליקט. שים לב בזרימת נוזל דרך RWM בשלב זה; זה נורמלי. חכה עד שהזרימה התייצבה (נוזל effluxed מהשבלול הוא מיובש עם נייר סינון סטרילי).
    הערה: היזהר בעת ההחזקה וקידום מחט הזכוכית כך שניקוב RWM הוא קטן ככל האפשר. בהתאם למיקרוסקופ משמש, להחזיק טפטפות באמצעות micromanipulator או ביד בעזרת פיפטהבעל.
  4. הכן את טפטפות להזרקה באמצעות פיפטה חולץ אותו טפטפות מהדק תיקון הדרך מוכנה. ודא שקוטר הקצה הוא גדול (15 מיקרומטר על קוטר), כך שpipetting הווירוס פנימה והחוצה נעשה בקלות.
  5. צייר את 1 עד 2 μl של AAV1-VGLUT3, AAV1-GFP או AAV2-GFP לפיפטה הזרקה. לאחר הזרימה הוא התייצב (5 עד 10 דקות), microinject כרך זה קבוע להלמות scala דרך אותו החור שנעשה בעבר בRWM.
  6. לאטום את הנישה RW מהירות לאחר שהפילה את פיפטה עם תקע קטן של שרירים ולאבטח אותו עם טיפה קטנה של דבק רקמות מונחת על השרירים כדי למנוע דליפה מהחלון העגול.
    הערה: חותם החור הזה היטב לאחר המחט מוסרת עם תקע קטן של שרירים כדי למנוע כל דליפת perilymph מהשבלול זה הצעד חיוני כדי לשמור על שמיעה. הכישלון לאטום לחלוטין RWM יגרום לאובדן שמיעה לאורך זמן.
  7. לאחר הזרקה, לכסותחור בבולה השמיעתית עם רקמת שומן, להחזיר את השרירים שלאחר אוזן ורקמת שומן למצב הרגיל שלהם ותפר את הפצע בשכבות עם תפר נספג כרום 6-0 או קטן יותר.
  8. לחטא את הפצע עם povidone- יוד.

3. לאחר ניתוח טיפול

  1. מניחים עכברים בכלוב חם ולא להשאיר אותם ללא השגחה עד שהם התאוששו באופן מלא ולאחר מכן לחזור עם האמא שלהם. מומלץ להסיר את הזכר מהכלוב לפני שהכניס את הגורים בחזרה עם אמו.
  2. לנהל carprofen תת-עורי (2 מ"ג / קילוגרם) על כאבים לאחר הניתוח ובכל שעה 24 ואילך במשך 3 ימים, כדי לנהל את הדלקת וכאב. לפקח על בעלי החיים מדי יום בחיפוש אחר סימנים של מצוקה, ירידה במשקל נורמלית, כאב, או זיהום. בדרך כלל מהיום ליום 3 rd לאחר הניתוח כל העכברים יש לפעול כרגיל. אם כל סימני מצוקה או מחלה מופיעים בעכבר לאחר יום 3 rd, לשקול הרדמת חסד tהוא העכבר בהתאם להנחיות מוסדיות.

4. הערכה של תפקוד שבלול בעקבות משלוח ויראלי שימוש שמיעתי בגזע מוח תגובת הקלטות (ABR)

הערה: הבדיקה ABR (ABR) היא שמיעתי עורר פוטנציאלי המופק מפעילות חשמלית במוח מתמשכת ונרשמו באמצעות אלקטרודות המונחות מתחת לקרקפת. בעלי החיים מגורה עם קול. ההקלטה וכתוצאה מכך מורכבת מחמישה גלים המשקפים את הפעילות החשמלית של נקודות רצופות במסלול השמיעה בראשונה 10 האלפיות השניים לאחר תחילתה של גירוי שמיעתי.

  1. להרדים עכברים בזריקת intraperitoneal של תערובת של קטמין הידרוכלוריד וhydrochloride xylazine כאמור בסעיף 1.2 של פרוטוקול זה, למעט ללא acepromazine.
  2. הנח את העכבר על כרית חימום לאורך כל בדיקת השמיעה עד העכבר הוא ער לחלוטין, כדי למנוע היפותרמיה לאחר הרדמה.
    הערה: שימוש בגירויי הקול הבאים בניסוי זה: לחצו (5 אלפיות שני משך; מצגת שיעור Hz 31).
  3. מניחים אלקטרודות מחט subdermal בקודקוד, מתחת לאפרכסת אוזן השמאל (הפניה), ומתחת לאוזן הנגדית (קרקע) ולהתחיל ABRs הקלטה כפי שתואר לעיל בתא אטום לרעש 27,28. גל ABR שיא ב 5 מרווחי רמת לחץ קול dB למטה ממשרעת המרבית.
  4. לקבוע ספי ABR לאחר הניתוח מוקדם ככל 4 ימים לאחר לידה נגיפית
    הערה: סף מוגדר כרמת הגירוי הנמוכה ביותר שבי תגובת פסגות לגלים I-V היו ברור ובהווה שוב ושוב על בדיקה ויזואלית.
  5. למדוד Wave אני לנתח את הפעילות מעצב השבלול. רמת הגירוי הנמוכה ביותר שמניבה צורת גל ABR לזיהוי מוגדרת כסף.

5. ביטוי חלבון השבלול transgene שימוש Immunofluorescence

  1. להרדים עכברים על ידי מינון יתר של intrapהזרקת eritoneal מתערובת של קטמין הידרוכלוריד וhydrochloride xylazine כאמור בסעיף 1.2 של פרוטוקול זה, למעט ללא acepromazine.
  2. לערוף את הראש רק לאחר החיה כבר לא מגיבה לגירויים מכאיבים, כגון צביטת הבוהן.
  3. לנתח את cochleae החוצה ותהליך לimmunofluorescence הר-שלם, כמתואר 26. פרוטוקול מפורט של immunofluorescence-הר השלם שבלול באמצעות אנטי VGLUT3 ונוגדני 7 א אנטי-שרירן מתואר בעקיל et al., 2013 29.
  4. לתיוג GFP, דגירה כל-mounts שבלול הלילה ב 4 ° C עם נוגדן אנטי GFP ארנבת ב 1: 250 דילול.
  5. יש לשטוף את cochleae פעמיים במשך 10 דקות עם PBS ולאחר מכן דגירה של 2 שעות בIgG נגד הארנב העז המוצמד לCy2 בדילול 1: 4,000 ב PBS.
  6. יש לשטוף את cochleae עם PBS פעמיים במשך 10 דקות ודגירתם עם DAPI במשך 15 דקות.
  7. הר cochleae בשקופיות זכוכית ולהתבונן undאה מיקרוסקופ עם immunofluorescence confocal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

כדי לאמת את התכונות ותועלת של גישת פוסט-אוזן לטיפול מולקולרי שבלול הטכניים, AAV1-VGLUT3, AAV1-GFP וAAV2-GFP נמסרו לאוזן פנימית עכברי P10-12 באמצעות RWM. גישה זו מדגימה ביטוי transgene מוצלח בתוך תאי שיער פנימיים (IHC) (VGLUT3 איור 1 וGFP איור 2 וGFP איור 3 א), תאי שיער חיצוניים (OHC) (איור 2 GFP) ותאי תומכים (GFP איור 2 ואיור 3 א) 26 ללא איבר משמעותי של פגיעת קורטי. תצפית סוגי תאים שונים המבטאים GFP של לראות בתמונות השבלול כל הר immunofluorescence (איור 2 ואיור 3 א) מוכיחה כי הבחירה של סוג AAV חייבת להיות תואמת לסוגי התאים להיות transduced. איור 1, איור 2 ואיור 3A 26 להראות tr טוב מאודansfection בשני IHCs וOHCs, כמו גם הפצה של חלבון transgene (GFP / VGLUT3) לאורך השבלול לאחר transfection AAV1 או AAV2-GFP או AAV1-VGLUT3. חלוקת IHCs להביע VGLUT3 לאחר transfection AAV1-VGLUT3 (איור 3) 26 מצביעה על כך שtransfection באמצעות RWM הוא יותר יעיל ואחיד לאורך כל השבלול מאשר שיטות אחרות שדיווחו על שיעורים גבוהים יותר transfection קרוב יותר לאתר של משלוח ויראלי. מצאנו כי שיעורי transfection יכולים להתבצע יעילים יותר על ידי הגדלת נפח הווירוס שהוחדר לתוך האוזן הפנימית (איור 1) 26.

התצפית שלנו ביטוי VGLUT3 המוצלח בVGLUT3 IHCs עכבר KO ללא נזק שבלול הובילה אותנו לבדיקת שמיעה על ידי מדידת ABRs בעכברי KO הצילו. איור 4 א ואיור 4 ב 26 מסמכים יכולת מסירת RWM פוסט-אוזן של AAV1-VGLUT3 ל דואר פנימיar של עכברי VGLUT3 KO לייצר שמיעת הצלה במודל עכבר זה של אובדן שמיעת מולד. בדיקת ABR עקבות (ABR) שוקמו בVGLUT3 הציל KO (איור 4 א), וספי ABR היו מדידים ודומים לאלה שראו בעכברי wild-type (איור 4).

איור 1
איור 1:. Transfection VGLUT3 IHC לאחר לידה נגיפית RWM לעכברי KO P10-P12 cochleae transfected נבדק בP30 על ידי immunofluorescence באמצעות נוגדן אנטי Myo7a, מכילה סימון של תא, ונוגדן נגד VGLUT3. Myo7a וVGLUT3 באו לידי ביטוי בכל IHCs רק בWT, בעוד IHCs מעכברי KO לידי ביטוי רק Myo7a. Cochleae העכבר הציל הראה כמה IHCs להביע VGLUT3, וכל IHCs הביע Myo7a (שורה 3) IHC:. תאי שיער פנימיים. הדפס באישור26. לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2
איור 2: עכבר שבלול כל הר immunofluorescence לאחר לידת RWM AAV2-GFP לעכברי P10-P12 wild-type AAV2-GFP שימש להערכת משלוח נגיפי באמצעות גישת פוסט-תנוכים לשבלול העכבר.. משלוח AAV2-GFP נעשה בP10-12 וביטוי של GFP מהונדס נבדק בשבלול ב p21 באמצעות נוגדן אנטי-GFP. הביטוי של GFP (ירוקה) בעכברי WT שבלול כל ההר להראות ביטוי של GFP חזק יותר בתאים חיצוניים שיער (OHC) מאשר תאי שיער פנימיים (IHC).

איור 3
איור 3: CoC העכבר hlear כל הר immunofluorescence לאחר לידת RWM AAV1-GFP לעכברי P10-P12 wild-type. לאחר לידת AAV1-GFP לביטוי השבלול של GFP נראית בתאי שיער פנימיים (IHC) ותאי תומכים (), אבל לא OHCs , ואילו משלוח AAV1-VGLUT3 לשבלול האוזן של VGLUT3 KO העכברים (B) הביא לביטוי VGLUT3 רק בIHCs. מספר IHCs להביע VGLUT3 בשבלול עכברי VGLUT3 KO לאחר לידת AAV1-VGLUT3 תלוי של כמות הנגיף מועבר לאוזן הפנימית; לדוגמא, 40% מIHCs הביעו VGLUT3 כאשר 0.6 μl של הווירוס שהוזרק, ואילו של IHCs 100% הביעו VGLUT3 לאחר 1 μl של הנגיף נמסר. לא היה הבדל בביטוי VGLUT3 בין הקודקוד, אמצע התור-, או בסיס כאשר 0.6 μl של וירוס שהוזרק. הדפס באישור 26.

ז "/>
. איור 4: בדיקת ABR הערכה (ABR) גל ABR נציג לאחר לידת AAV1-VGLUT3 היו דומה בין עכברים הצילו וwild-type; בניגוד לכך, אין צורות גל ABR נראו בעכברי KO (). עכברי KO הצילו הראו גם ספי ABR למדידה. ספי ABR אלה היו דומים לאלה שראו בעכברי WT לכל התדרים שנמדדו (B). אני:. הדפסה חוזרת I. גל ABR באישור 26 אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

בעבודה זו, אנו מתארים בפירוט טכניקה שיכול לשמש לריפוי גנטי שבלול, במטרה להחזיר או הצלת פונקצית שמיעה נורמלית שנפגעה על ידי פגם גנטי. כפי שהוא בדרך כלל atraumatic, גישה זו היא בטוחה להעברת גני שבלול או טיפולים מולקולריים פוטנציאליים אחרים 30. גישות אחרות לטיפול שבלול תוארו, כולל גישת הגחון 24, cochleostomy 31,32 וצק endolymphatic משלוח 33 עכבר וחזיר ים ב. מניסיוננו, גישת פוסט-אוזן היא מהיר יותר, פשוטה יותר, וקשור עם פגיעה מופחתת ותמותה של בעלי חיים. יתר על כן, גישת פוסט-התנוכים מציעה הדמיה משופרת של RWM עם פחות סיכוי לטראומה ואובדן הקשורים לשמיעת 34,35,36. דו"ח זה מתעד את ההיבטים ושירות הטכניים של גישת פוסט-אוזן לטיפול מולקולרי שבלול על ידי הוכחת משלוח של AAV1-VGLUT3 לתוך הדואר האוזן פנימית באמצעות RWM, וכתוצאה מכך הביטוי המהונדס של שני VGLUT3 וGFP (איור 1 ואיור 2 ואיור 3 א) ושמיעת הצלה במודל עכבר זה של אובדן שמיעת מולד. מחקרים קודמים המתארים שיטות למסירת הגן הראו ביטוי מהונדס מוגבל רק בתחומים קריטיים של האיבר של קורטי 12,37,38,39,40,41. הבדלים אלה יכולים להיות בגלל האיכות של התכשיר הנגיפי, כייל של הווקטור הנגיפי, סרוטיפ משמש, או מסירה נגיפית פשוט לא מספיק לשבלול. בניגוד לכך, שימוש בגישת פוסט-אוזן זה היינו יכול להשיג שיעורי transfection טובים מאוד לשני תאים הפנימיים וחיצוניים שיער וההפצה של גן כתב (GFP) לאחר transfection AAV2-GFP (איור 2 ואיור 3 א) לאורך השבלול. בהתבסס על אחוז IHCs transfected עם AAV1-VGLUT3 (איור 3), אנו מציעים שtransfection באמצעות RWM הוא יותר EFFective ואחיד לאורך כל השבלול מאשר שיטות אחרות, ובכלל זה שתואר בפן הניסיונות, שדיווחו על שיעורים גבוהים יותר transfection בתורו הבסיסי, קרובים לאתר של יישום נגיפי 42. הביטוי לטווח הארוך של GFP / VGLUT3 בתוך השבלול, לפחות שנה וחצי, עולה בקנה אחד עם הנתונים המתקבלים ממודלים של בעלי חיים אחרים ומערכות איברים שונות 38,43.

בנוסף, ניתוח היסטולוגית של שבלול transfected הפגין שום עדות לתגובה דלקתית, עם שימור מעולה של cytoarchitecture של האיבר של קורטי, כוללים vascularis stria ונוירונים הגנגליון ספירלה 26. יתר על כן, בניגוד לשיטות שהעסיקו cochleostomy, transfection RWM השתמש במחקר הנוכחי לא גרם לניזק שבלול, ויכול להיות מוזרק כמויות גבוהות יותר 31,32. חוסר הטראומה באמצעות טכניקה זו אומת על ידי הוכחת thresho ABR שווה ערךLDS בין אוזניים פעלו ולשלוט, מציאת דומה לזו שנצפתה על ידי שיה et al. 4 לבסוף, משלוח AAV-VGLUT3 דרך RWM הביאו ABR ספים דומים לאלה שראו בעכברי WT (איור 4 א ואיור 4) 26. יש לנו להשתמש בטכניקה זו בכל הגילים של עכברים, אבל זה מאתגר מבחינה טכנית בעכברים מבוגר מP40 כי עצם הבולה הופך להיות קשה יותר ללנקב והעצם השבור מהבולה הוא חדים יותר במבוגרים מאשר בעכברים צעירים. בגילים מבוגרים יותר, דימום אם לא יינקט זהירות יכול להתרחש אם פיסת עצם הבולה מצליפה ברקמות הצוואר.

לסיכום, דוח זה מתעד העברת גנים מוצלחת למספר סוגים של תאי שבלול בעכבר באמצעות וקטור מבוסס AAV כפי שהראה בעבר. טכניקה זו של מסירת הגן ממזערת טראומה, לא מובילה לירידה בשמיעה, ויכולה לגרום לtransfection הנרחב של מגוון רחב של סוגי תאים בתוך השבלול, including תאי שיער ותאי עצב הגנגליון ספירלה. יש לה יישום פוטנציאל גדול עבור סוגים אחרים של צורות מולדת ונרכשות של אובדן שמיעה, ויכול להיות מיושם גם למגוון טיפולים מולקולריים במודלים של עכברים של אובדן שמיעה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ketamine Butler Schein
Xylazine AnaSed
Acepromazine Provided by UCSF LARC
Carprofen analgesia Provided by UCSF LARC
Betadine Betadine Puredue Pharma
dexamethasone ophthalmic ointment (TobraDex) Alcon
Heating pad Braintree scientific, inc.
25G needle BD 305127
Borosilicate capillary pipette World precision instruments, inc. 1B100F-4
Suture PDS*plus Antibacterial Ethicon PDP149
Tissue glue (Vetcode) Butler Schein 31477
Rabbit Anti-GFP antibody Invitrogen A11122
Dissecting microscope      Leica MZ95
Flaming/ Brown Micropipette      Sutter Instrument Co
Puller Model P-97  
TDT BioSig III System                 Tucker-Davis Technologies

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Jero, J., et al. Cochlear gene delivery through an intact round window membrane in mouse. Hum. Gene Ther. 12 (5), 539-548 (2001).
  2. Nam, H. J., et al. Structure of adeno-associated virus serotype 8, a gene therapy vector. J. Virol. 81 (22), 12260-12271 (2007).
  3. Ryan, A. F., Mullen, L. M., Doherty, J. K. Cellular targeting for cochlear gene therapy. Adv Otorhinolaryngol. 66, 99-115 (2009).
  4. Xia, L., Yin, S., Wang, J. Inner ear gene trasfection in neonatal mice using adeno-associate viral vwctor: a comparison of two approaches. PLoS One. 7 (8), e43218 (2012).
  5. Husseman, J., Raphael, Y. Gene therapy in the inner ear using adenovirus vectors. AdvOtorhinolaryngol. 66, 37-51 (2009).
  6. Ballana, E., et al. Efficient and specific transduction of cochlear supporting cells by adeno-associated virus serotype 5. Neurosci. Lett. 442 (2), 134-139 (2008).
  7. Praetorius, M., et al. Adenoviral vectors for improved gene delivery to the inner ear. Hear. Re. 248 (1-2), 31-38 (2009).
  8. Kay, M. A., Glorioso, C. G., Naldini, L. Viral vectors for gene therapy: the art of turning infectious agents into vehicles of therapeutics. Nature Medicine. 7 (1), 33-40 (2001).
  9. Ryan, A. F. Gene Therapy and Stem Cell Transplantation: Strategies for Hearing Restoration. Adv Otorhinolaryngol. 66, Karger. Basel. 64-86 (2009).
  10. Cooper, L. B., et al. AAV-mediated delivery of the caspase inhibitor XIAP protects against cisplatin ototoxicity. Otol. Neurotol. 27 (4), 484-490 (2006).
  11. Gratton, M. A., Salvi, R. J., Kamen, B. A., Saunders, S. S. Interaction of cisplatin and noise on the peripheral auditory system. Hear. Res. 50 (1-2), 211-223 (1990).
  12. Lalwani, A. K., Walsh, B. J., Reilly, P. G., Muzyczka, N., Mhatre, A. N. Development of in vivo gene therapy for hearing disorders: introduction of adeno-associated virus into the cochlea of the guinea pig. Gene Ther. 3 (7), 588-592 (1996).
  13. Kesser, B. W., Hashisaki, G. T., Holt, J. R. Gene Transfer in Human Vestibular Epithelia and the Prospects for Inner Ear Gene Therapy. Laryngoscope. 118 (5), 821-831 (2008).
  14. Izumikawa, M., et al. Auditory hair cell replacement and hearing improvement by Atoh1 gene therapy in deaf mammals. Nat. Med. 11 (3), 271-276 (2005).
  15. Praetorius, M., et al. Adenovector-mediated hair cell regeneration is affected. Acta Otolaryngol. 130 (2), 215-222 (2009).
  16. Friedman, L. M., Dror, A. A., Avraham, K. B. Mouse models to study inner ear development and hereditary hearing loss. Int. J. Dev. Biol. 51 (6-7), 609-631 (2007).
  17. Chang, E. H., Van Camp, G., Smith, R. J. The role of connexins in human disease. Ear Hear. 24 (4), 314-323 (2003).
  18. Cohen-Salmon, M., et al. Targeted ablation of connexin26 in the inner ear epithelial gap junction network causes hearing impairment and cell death. Curr. Biol. 12 (13), 1106-1111 (2002).
  19. Nickel, R., Forge, A. Gap junctions and connexins in the inner ear: their roles in homeostasis and deafness. Curr. Opin. Otolaryngol. Head Neck Surg. 16 (5), 452-457 (2008).
  20. Lv, P., Wei, D., Yamoah, E. N. Kv7-type channel currents in spiral ganglion neurons: involvement in sensorineural hearing loss. J. Biol. Chem. 285 (45), 34699-34707 (2010).
  21. Leibovici, M., Safieddine, S., Petit, C. Mouse models for human hereditary deafness. Curr. Top. Dev. Biol. 84, 385-429 (2008).
  22. Dror, A. A., Avraham, K. B. Hearing loss: mechanisms revealed by genetics and cell biology. Annu. Rev. Genet. 43, 411-437 (2009).
  23. Richardson, G. P., de Monvel, J. B., Petit, C. How the genetics of deafness illuminates auditory physiology. Annu. Rev. Physiol. 73, 311-334 (2011).
  24. Jero, J., Tseng, C. J., Mhatre, A. N., Lalwani, A. K. A surgical approach appropriate for targeted cochlear gene therapy in the mouse. Hearing Research. 151 (1-2), 106-114 (2001).
  25. Seal, R. P., et al. Sensorineural deafness and seizures in mice lacking vesicular glutamate transporter 3. Neuron. 57 (2), 263-275 (2008).
  26. Akil, O., et al. Restoration of hearing in the VGLUT3 knockout mouse using virally mediated gene therapy. Neuron. 75 (2), 283-293 (2012).
  27. Akil, O., et al. Progressive deafness and altered cochlear innervation in knock-out mice lacking prosaposin. J. Neurosci. 26 (5), 13076-13088 (2006).
  28. Fremeau, R. T., et al. Vesicular glutamate transporters 1 and 2 target to functionally distinct synaptic release sites. Science. 304 (5678), 1815-1819 (2004).
  29. Akil, O., Lustig, L. R. Mouse Cochlear Whole Mount Immunofluorescence. Bio-protocol. , Available from: http://www.bio-protocol.org/wenzhang.aspx?id=332 (2013).
  30. Kho, S. T., Pettis, R. M., Mhatre, A. N., Lalwani, A. K. Cochlea microinjection and its effects upon auditory function in guinea pig. Eur Arch Otorhinolaryngol. 257 (9), 469-472 (2000).
  31. Iizuka, T., et al. Noninvasive in vivo delivery of transgene via adeno-associated virus into supporting cells of the neonatal mouse cochlea. Hum. Gene Ther. 19 (4), 384-390 (2008).
  32. Kilpatrick, L. A., et al. Adeno-associated virus-mediated gene delivery into the scala media of the normal and deafened adult mouse ear. Gene Ther. 18 (6), 569-578 (2011).
  33. Yamasoba, T., Yagi, M., Roessler, B. J., Miller, J. M., Raphael, Y. Inner Ear Transgene Expressionafter Adenoviral Vector Inoculation in the Endolymphatic Sac Hum. Gene Ther. 10 (5), 769-774 (1999).
  34. Praetorius, M., Baker, K., Weich, C. M., Plinkert, P. K., Staecker, H. Hearing preservation after inner ear gene therapy: the effect of vector and surgical approach. ORL J. Otorhinolaryngol. Relat. Spec. 65 (4), 211-214 (2003).
  35. Carvalho, G. J., Lalwani, A. K. The effect of cochleaostomy and intracochlear infusion on auditory brain stem response threshold in the guinea pig. Am. J. Otol. 20 (1), 87-90 (1999).
  36. Kawamoto, K., Oh, S. H., Kanzaki, S., Brown, N., Raphael, Y. The Functional and Structural Outcome of Inner Ear Gene Transfer via the Vestibular and Cochlear Fluids in Mice. Mol. Ther. 4 (6), 575-585 (2001).
  37. Lalwani, A. K., Han, J. J., Walsh, B. J., Zolotukhin, S., Muzyczka, N., Mhatre, A. N. Green fluorescent protein as a reporter for gene transfer studies in the cochlea. Hear Res. 114 (1-2), 139-147 (1997).
  38. Lalwani, A. K., et al. Long-term in vivo cochlear transgene expression mediated by recombinant adeno-associated virus. Gene Ther. 5 (2), 277-281 (1998).
  39. Raphael, Y., Frisancho, J. C., Roessler, B. J. Adenoviral-mediated gene transfer into guinea pig cochlear cells in vivo. Neurosci. Lett. 207 (2), 137-141 (1996).
  40. Weiss, M. A., Frisancho, J. C., Roessler, B. J., Raphael, Y. Viral mediated gene transfer in the cochlea. Int. J. Dev. Neurosci. 15 (4=5), 577-583 (1997).
  41. Pettis, R. M., Han, J. J., Mhatre, A. N., Lalwani, A. K. Intracochlear infusion of recombinant adeno associated virus: Analysis of its dissemination to near and distant tissues. Assoc. Res. Otolaryngol. Abstr. 21, 673 (1998).
  42. Konish, iM., Kawamoto, K., Izumikawa, M., Kuriyama, H., Yamashita, T. Gene transfer into guinea pig cochlea using adeno-associated virus vectors. J. Gene Med. 10 (6), 610-618 (2008).
  43. Kaplitt, M. G., et al. Long-term gene expression and phenotypic correction using adeno-associated virus vectors in the mammalian brain. Nature Genetics. 8 (2), 148-154 (1994).

Tags

Neuroscience גיליון 97 ריפוי גנטי וירוס Transfection Adeno הקשורים (AAV) עכבר שבלול תאי שיער פנימיים (IHC) טרנספורטר גלוטמט שלפוחי 3 (VGLUT3).
שיטה ניתוחית למשלוח באופן ויראלי המתווכת Gene לאוזן הפנימית באמצעות עכבר העגול חלון ממברנה
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Akil, O., Rouse, S. L., Chan, D. K., … More

Akil, O., Rouse, S. L., Chan, D. K., Lustig, L. R. Surgical Method for Virally Mediated Gene Delivery to the Mouse Inner Ear through the Round Window Membrane. J. Vis. Exp. (97), e52187, doi:10.3791/52187 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter