Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Kirurgisk metode til Viralt gentilførsel til muse Inner Ear gennem det runde vindues membran

Published: March 16, 2015 doi: 10.3791/52187
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Otolaryngology-Head and Neck Surgery, University of California, San Francisco

Abstract

Genterapi, der anvendes til at opnå funktionel genopretning fra sensorineural døvhed, tilsagn om at yde en bedre forståelse af de underliggende molekylære og genetiske mekanismer, der bidrager til høretab. Indførelse af vektorer i det indre øre skal udføres på en måde, der i vid udstrækning fordeler midlet hele cochlea samtidig minimere skade på de eksisterende strukturer. Dette håndskrift beskriver en post-auricular kirurgisk tilgang, der kan anvendes til mus cochlear terapi under anvendelse af molekylære, farmakologiske, og viral levering til mus postnatal dag 10 og ældre via det runde vindues membran (RWM). Denne kirurgiske tilgang muliggør hurtig og direkte levering i scala tympani samtidig minimere blodtab og undgå dyr dødelighed. Denne teknik indebærer ubetydelig eller ingen skade på væsentlige strukturer i det indre øre og mellemøret samt nakkemusklerne, mens helt bevare hørelse. For at demonstrere effekten af ​​denne kirurgisk teknik, den vesikulær glutamspiste transportør 3 knockout (VGLUT3 KO) mus vil blive anvendt som et eksempel på en musemodel af medfødt døvhed, der genvinder høre efter levering af VGLUT3 til det indre øre ved hjælp af en adeno-associeret virus (AAV-1).

Introduction

Genterapi har længe været foreslået som en potentiel behandling af genetisk høretab, men succes på dette område har været undvigende 1. Til dato har viralt medierede metoder dominerede grund den teoretiske mulighed for at målrette specifikke celletyper inden for forholdsvis utilgængelige cochlea. Begge adenovirus (AV) og adeno-associeret virus (AAV) er blevet anvendt til cochlear genafgivelse. AAV'er er fordelagtige i cochlea for en række årsager. De er replikationsdeficiente vira og effektivt kan overføre transgene molekyler til forskellige celletyper, herunder neuroner, et vigtigt mål for en række årsager til høretab. AAV indtræden i cellen medieres af specifikke receptorer 2; Således skal valget af en bestemt serotype være forenelig med de celletyper, der skal transduceres. AAV'er kan effektivt transficere hårceller 3 og inkorporere i værtsgenomet, hvilket resulterer i en stabil, langsigtet ekspression af transgenic protein og fænotypiske ændringer i cellen 4. Mens ikke nødvendigvis fordelagtige for kortsigtede applikationer såsom hår-celle regenerering, langsigtet ekspression er meget vigtigt for stabil redning af genetiske defekter. Fordi AAV'er ikke er forbundet med nogen menneskelig sygdom eller infektion og demonstrere ingen ototoksicitet 5,6,7, de er en ideel kandidat til anvendelse i genterapi for nedarvede former for høretab 8.

Overførsel af fremmed genetisk materiale i pattedyrs indre øre ved hjælp af virale vektorer er blevet undersøgt i det seneste årti, og fremstår som en lovende teknik til behandling både genetiske og erhvervede former for høretab 9. Den cochlea er potentielt et ideelt mål for genterapi af flere grunde: 1) dens lille volumen kræver en begrænset mængde af virus nødvendigt; 2) dens relative isolation fra andre organsystemer grænser bivirkninger; og 3) dets væskefyldte kamre lette virallevering i hele labyrint 10, 11,12,13,14, 15.

Musemodeller for medfødt døvhed tillader anvendelse af mange metoder til undersøgelse for at overvåge udviklingen i det indre øre på en systematisk, replikerbar måde. Mens den lille størrelse af muse cochleae frembyder nogle kirurgisk vanskelighed musen tjener som en yderst vigtig model i studiet af genetisk høretab, med flere eksperimentelle fordele i forhold til andre arter 16. Musemodeller muliggøre vurdering af en række karakteristika ved genetisk kobling analyse, indsamling af detaljerede morfologiske observationer, og simulering patogene scenarier; som sådan, de er gode kandidater til viralt medieret genterapi. Omfattende genetiske undersøgelser af mus kombineret med den teknologiske udvikling har gjort det muligt at generere genetisk modificerede mus på en reproducerbar måde på tværs laboratorier 17,18, 19, 20,21. Furthermore, findes der talrige modeller for både erhvervet og arvet høretab fænotyper i mus, så grundig afprøvning i denne dyremodel 22, 23,24. Således korrigere hørelse ved hjælp viralt medieret genterapi i en musemodel er et passende første skridt i at finde en kur mod sygdom hos mennesker.

Vi har tidligere vist, at transgene mus, der manglede vesikulær glutamat transportør 3 (VGLUT3) fødes døve på grund af manglende glutamatfrigørelse ved IHC bånd synapse 25. Fordi denne mutation ikke fører til en primær degeneration af sansehårceller disse mutante mus er potentielt en fremragende model til at teste cochlear genterapi til medfødt høretab.

Til dato er der blevet beskrevet en række virale levering teknikker til cochlear genterapi, herunder runde vindues membran diffusion, runde vindues membran injektion og levering via en cochleostomy. Der er potenteial fordele og ulemper ved hver af disse fremgangsmåder 9.

Her rapporterer vi en kirurgisk metode til viralt gentilførsel til VGLUT3 KO mus indre øre gennem det runde vindues membran (RWM). Den post-auricular RWM injektion metode er minimalt invasiv med fremragende hørelse konservering, og er relativt hurtig. Som vi tidligere har offentliggjort, i et forsøg på at genskabe hørelsen i denne musemodel blev en AAV1 vektor bærer VGLUT3 genet (AAV1-VGLUT3) indført i cochlea af disse døve mus ved postnatal dag 12 (P! @), Hvilket resulterer i genoprettelse af at høre 26. Høring i VGLUT3 KO mus blev bekræftet ved auditiv hjernestammen respons (ABR), mens transgen proteinekspression blev verificeret ved hjælp af immunofluorescens (IF). Denne metode viser således, viralt-medieret genterapi kan korrigere en genetisk defekt, der ellers ville resulterer i døvhed.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

BEMÆRK: Alle procedurer og dyr håndtering overholdes NIH etiske retningslinjer og godkendt protokol krav i Institutional Animal Care og brug Udvalg fra University of California, San Francisco.

1. Forberedelse af Animal for Kirurgi

  1. Udfør kirurgiske procedurer i en ren, dedikeret rum. Autoklaver alle kirurgiske instrumenter, steriliseres med en glas-perle sterilisator inden operationen.
    BEMÆRK: I denne protokol, anvender postnatal dag 10-12 (P10-12) FVB mus. Forskellige aldre og stammer af mus kan bruges til at opfylde behovene i et konkret projekt. Mus ældre end P40 kan være udfordrende, fordi bulla knogle bliver sværere.
  2. Bedøve musene med intraperitoneal injektion af en blanding af ketamin-hydrochlorid (100 mg / kg), xylazin-hydrochlorid (10 mg / kg) og acepromazin (2 mg / kg). Begynd kirurgisk forberedelse, efter at dyret ikke længere reagerer på smertefulde stimuli, såsom tå knivspids. Hvis necessary, administrere en booster-dosis (en femtedel den oprindelige dosis) af den anæstetiske cocktail at genoprette den oprindelige bedøvelsesmiddel plan.
    BEMÆRK: Pas på dette trin, fordi det meste af dødelighed observeret ved denne alder er forårsaget af bedøvelsesmiddel overdosis.
  3. Dæk dyrets øjne med en beskyttende oftalmisk salve til at holde øjnene fugtige under anæstesi, undertrykke dyrets blink refleks.
  4. Placer musen med halsen forlænget på en varmepude under hele proceduren, indtil musen er helt vågen, for at forhindre post-anæstesi hypotermi.
  5. Barber venstre post-auricular region med en klipper og desinficere med 70% ethanol og povidon-iod inden kirurgisk manipulation.

2. Den kirurgiske procedure og Vector Injection

  1. Brug en post-auricular tilgang at eksponere tympanisk bulla. Incise det subkutane væv med en lille saks til at eksponere den post-auricular muskel. Efter tilbagetrækning af fedtvæv til the posterior side af snittet, adskille musklerne til højre og venstre side vinkelret på snittet at blotlægge tindingebenet. Sikre, at dette indsnit er lang nok til at arbejde komfortabelt med tilstrækkelig visualisering.
  2. Perforere tympaniske bulla med en 25 G nål og udvide hullet nødvendigt med en pincet ved skrælning knoglen tilbage for at give adgang til det basale sving af cochlea, og derefter udvide tilstrækkeligt til at visualisere stapedial arterie og det runde vindues membran (RWM) .
  3. Punktere RWM forsigtigt i midten med en borosilikat kapillær pipette. Overhold væske udstrømning gennem RWM på dette punkt; dette er normalt. Vent udstrømningen har stabiliseret sig (den effluxed væske fra cochlea tørres med et sterilt filtrerpapir).
    BEMÆRK: Vær forsigtig, når du holder og fremme glas nål, så RWM perforering er så lille som muligt. Afhængigt af mikroskop anvendes, indeholde de pipetter hjælp af en mikromanipulator eller i hånden med en pipetteholder.
  4. Forbered pipetter til injektion ved hjælp af en pipette aftrækker på samme måde patch clamp pipetter er forberedt. Kontroller, at spidsen diameter er stor (ca. 15 um i diameter), således at pipettering virus i og ud gøres let.
  5. Udarbejde 1 til 2 pi AAV1-VGLUT3, AAV1-GFP eller AAV2-GFP i en injektion pipette. Efter udstrømningen er stabiliseret (5 til 10 min), microinject denne faste volumen i scala tympani gennem det samme hul tidligere lavet i RWM.
  6. Forsegl RW niche hurtigt efter at trække pipetten med en lille prop af muskler og sikre den med en lille dråbe af væv lim placeret på musklen for at undgå lækage fra det runde vindue.
    BEMÆRK: Seal dette hul meget godt efter nålen fjernes med en lille prop af muskler til at forhindre enhver perilymfe lækage fra cochlea-dette trin er afgørende for at bevare hørelsen. Manglende forsegle fuldstændigt RWM vil resultere i høretab over tid.
  7. Efter injektion, dækkehul i det auditive bulla med fedtvæv, returnere post-auricular muskler og fedtvæv til deres normale position og suturere såret i lag med en 6-0 eller mindre absorberbar chrom sutur.
  8. Desinficer såret med povidon-iod.

3. Postoperativ pleje

  1. Placer mus i en varm bur og ikke efterlade dem uden opsyn, indtil de er fuldt tilbagebetalt derefter flytte dem tilbage med moderen. Det anbefales at fjerne mand fra buret før du sætter hvalpene tilbage med moderen.
  2. Administrere subkutan Carprofen (2 mg / kg) for analgesi postoperativt og hver 24 timer derefter i 3 dage, til at styre inflammation og smerte. Overvåg dyrene dagligt for tegn på angst, unormal vægttab, smerte eller infektion. Generelt med 3. dag efter operationen alle mus bør optræder normalt. Hvis tegn på angst eller sygdom forekommer i en mus efter 3. dag, overveje euthanizing than mus som pr institutionelle retningslinier.

4. Vurdering af Cochlear Funktion Efter Viral Levering Brug Auditory Brainstem Response (ABR) Optagelser

BEMÆRK: auditive hjernestamme respons (ABR) er et auditivt fremkaldt potentiale udvundet igangværende elektrisk aktivitet i hjernen og registreres via elektroder placeret under hovedbunden. Dyret stimuleres med lyd. Den resulterende optagelse består af fem bølger, der afspejler den elektriske aktivitet af på hinanden følgende punkter i den auditive vejen i de første 10 msek efter indtræden af ​​en auditiv stimulus.

  1. Bedøver mus ved intraperitoneal injektion af en blanding af ketaminhydrochlorid og Xylazinhydrochlorid som beskrevet i afsnit 1.2 i denne protokol, undtagen uden acepromazin.
  2. Placer musen på en varmepude i hele høreprøve, indtil musen er helt vågen, for at forhindre post-anæstesi hypotermi.
    BEMÆRK: Brugfølgende lyd stimuli i dette forsøg: klik (5 ms varighed 31 Hz præsentation sats).
  3. Placer subdermale nåleelektroder ved toppunktet, under det ydre øre af det venstre øre (reference), og under den kontralaterale øre (jord) og begynder at optage ABR'er som tidligere beskrevet i en lyd-bevis kammer 27,28. Optag ABR kurver i 5 dB lydtryk niveau intervaller ned fra maksimal amplitude.
  4. Bestem ABR tærskler postoperativt så tidligt som 4 dage efter viral levering
    BEMÆRK: Threshold er defineret som den laveste stimulus niveau, hvor respons toppe for bølger I-V var klart og gentagne gange til stede på visuel inspektion.
  5. Mål Wave I analysere aktivitet fra cochlear nerve. Det laveste niveau af stimulus, der giver et påviseligt ABR bølgeform er defineret som tærskel.

5. Cochlear transgen Protein Expression Brug Immunofluorescens

  1. Bedøver mus ved en overdosis af intraperitoneal injektion af en blanding af ketaminhydrochlorid og Xylazinhydrochlorid som beskrevet i afsnit 1.2 i denne protokol, undtagen uden acepromazin.
  2. Halshugge hovedet først efter, at dyret ikke længere reagerer på smertefulde stimuli, såsom tå knivspids.
  3. Dissekere cochleae ud og proces til hel-mount immunfluorescens som beskrevet 26. En detaljeret protokol for cochlear hel-mount immunfluorescens under anvendelse af anti-VGLUT3 og anti-myosin 7a antistoffer er beskrevet i Akil et al. 2013 29.
  4. For GFP mærkning inkuber cochlear hel-mounts natten over ved 4 ° C med en kanin-anti-GFP-antistof ved 1: 250 fortynding.
  5. Skyl cochleae to gange i 10 minutter med PBS og derefter inkuberet i 2 timer i gede-anti-kanin-IgG konjugeret til Cy2 fortyndet 1: 4.000 i PBS.
  6. Skyl cochleae med PBS to gange i 10 minutter og inkubere dem med DAPI for 15 min.
  7. Monter cochleae på objektglas og observere undER et mikroskop med konfokal immunofluorescens.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

For at kontrollere de tekniske egenskaber og anvendeligheden af ​​den post-øret fremgangsmåde for cochlear molekylær terapi blev AAV1-VGLUT3, AAV1-GFP og AAV2-GFP leveret i P10-12 mus indre øre via RWM. Denne fremgangsmåde demonstrerer succesfuld transgenekspression inden indre hårceller (IHC) (VGLUT3 Figur 1 og GFP figur 2 og GFP figur 3A), ydre hårceller (OHC) (GFP Figur 2) og tilhørende celler (GFP figur 2 og figur 3A) 26 uden signifikant organ Corti skade. Observation af forskellige celletyper, der udtrykker GFP ses i Cochlear hel-mount immunofluorescens billeder (figur 2 og figur 3A) viser, at valget af AAV-serotype, skal være forenelige med de celletyper, der skal transduceres. Figur 1, figur 2 og figur 3A 26 viser meget god transfection både IHCs og OHCs, samt fordelingen af ​​transgen protein (GFP / VGLUT3) i hele cochlea efter AAV1 eller AAV2-GFP eller AAV1-VGLUT3 transfektion. Fordelingen af IHCs udtrykker VGLUT3 efter AAV1-VGLUT3 transfektion (figur 3B) 26 antyder, at transfektion via RWM er mere effektiv og ensartet gennem hele cochlea end andre metoder, der har indberettet højere transfektion satser tættere til stedet for viral levering. Vi har fundet, at transfektion satser kan gøres mere effektiv ved at forøge mængden af virus injiceret ind i det indre øre (figur 1) 26.

Vores observation af succesfulde VGLUT3 udtryk i VGLUT3 KO mus IHCs uden cochlear skade førte os til at teste hørelse ved at måle ABR'er i de reddede KO-mus. Figur 4A og 4B 26 dokument evne post-auricular RWM levering af AAV1-VGLUT3 til indre ear af VGLUT3 KO-mus til at producere høre redning i denne musemodel af medfødt høretab. Auditiv hjernestamme respons (ABR) spor blev restaureret i VGLUT3 reddet KO (figur 4A) og ABR tærskler var målbare og sammenlignelige med dem, der ses i vildtypemus (figur 4B).

Figur 1
Figur 1:. VGLUT3 IHC transfektion efter RWM viral levering til P10-P12 KO-mus Den transficerede cochleae blev undersøgt på P30 ved immunfluorescens anvendelse af anti-Myo7a antistof, et hår-celle markør, og et antistof mod VGLUT3. Myo7a og VGLUT3 blev udtrykt i alle IHCs kun i WT, mens IHCs fra KO mus kun udtrykkes Myo7a. Den reddede mus cochleae viste nogle IHCs udtrykker VGLUT3, og alle IHCs udtrykte Myo7a (række 3) IHC:. Indre hårceller. Genudskrivning med tilladelse fra26. Klik her for at se en større udgave af dette tal.

Figur 2
Figur 2: Mouse cochlear hel-mount immunofluorescens efter RWM AAV2-GFP levering til vild-type P10-P12-mus AAV2-GFP blev anvendt til at vurdere viral levering ved hjælp af post-auricular tilgang til mus cochlea.. AAV2-GFP levering blev udført på P10-12 og transgen GFP-ekspression blev undersøgt i cochlea ved P21 anvendelse af et anti-GFP antistof. GFP-ekspression (grøn) i WT mus cochlear hel-mount viser stærkere GFP-ekspression i ydre hårceller (OHC) end indre hårceller (IHC).

Figur 3
Figur 3: Mouse CoC hlear hel-mount immunofluorescens efter RWM AAV1-GFP levering til vild-type P10-P12-mus. Efter AAV1-GFP levering til cochlea ekspression af GFP ses i indre hårceller (IHC) og tilhørende celler (A), men ikke OHCs , hvorimod AAV1-VGLUT3 levering til cochlea af VGLUT3 KO mus (B) resulterede i VGLUT3 udtryk kun i IHCs. Antallet af IHCs udtrykker VGLUT3 i VGLUT3 KO mus cochlea efter AAV1-VGLUT3 levering afhænger af mængden af ​​virus leveres til det indre øre; for eksempel 40% af IHCs udtrykt VGLUT3 når 0,6 pi af virus blev injiceret, mens 100% af IHCs udtrykt VGLUT3 efter 1 pi af virus blev leveret. Der var ingen forskel i VGLUT3 udtryk mellem toppunktet, mid-turn, eller base, når 0,6 pi virus blev injiceret. Genudskrivning med tilladelse fra 26.

g "/>
. Figur 4: Auditiv hjernestamme respons (ABR) vurdering Repræsentative ABR kurver efter AAV1-VGLUT3 levering var ens mellem reddet og vildtypemus; I modsætning hertil blev der ikke ABR bølgeformer ses i KO-mus (A). Reddet KO-mus viste også målbare ABR tærskler. Disse ABR tærskler var sammenlignelige med dem, der ses i WT mus for alle frekvenser målt (B). I:. ABR bølge I. Genoptryk med tilladelse fra 26 Klik her for at se en større udgave af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I dette arbejde, vi beskriver i detaljer en teknik, der kan anvendes til cochlear genterapi, med det mål at genoprette eller redning normal auditive funktion, der kompromitteres af en genetisk defekt. Som det er typisk atraumatisk, denne fremgangsmåde er sikker for cochlear genoverførsel eller andre potentielle molekylære behandlinger 30. Andre metoder til cochlear terapi er blevet beskrevet, herunder en ventral tilgang 24, cochleostomy 31,32 og endolymfatiske sæk levering 33 i mus og marsvin. Det er vores erfaring, post-øret tilgang er hurtigere, enklere, og forbundet med reduceret skade og dyr dødelighed. Endvidere post-øret tilgang giver forbedret visualisering af RWM med mindre chance for traumer og deraf følgende tab af hørelse 34,35,36. Denne rapport dokumenterer de tekniske aspekter og anvendeligheden af ​​den post-øret fremgangsmåde for cochlear molekylær terapi ved at demonstrere levering af AAV1-VGLUT3 i the indre øre via RWM, hvilket resulterer i transgen ekspression af både VGLUT3 og GFP (figur 1 og figur 2 og figur 3A) og høre redning i denne musemodel af medfødt høretab. Tidligere undersøgelser, der beskriver metoder til genlevering viste kun begrænset transgen ekspression i kritiske områder af organ Corti 12,37,38,39,40,41. Disse forskelle kan skyldes kvaliteten af ​​det virale præparat, titeren af ​​den virale vektor, serotype anvendes, eller simpelthen utilstrækkelig viral levering i cochlea. I modsætning hertil ved hjælp af denne post-auricular tilgang kunne vi opnå meget gode transfektion satser på både indre og ydre hårceller og distribution af et reportergen (GFP) efter AAV2-GFP transfektion (figur 2 og figur 3A) i hele cochlea. Baseret på andelen af IHCs transficeret med AAV1-VGLUT3 (figur 3B), foreslår vi, at transfektion via RWM er mere effektiv og ensartet gennem hele cochlea end andre metoder, herunder at der er beskrevet i marsvin, som rapporterede højere transfektion satser i den basale tur, tæt på det sted, viral ansøgning 42. Den langsigtede ekspression af GFP / VGLUT3 i cochlea, i mindst et år og en halv, er i overensstemmelse med oplysninger fra andre dyremodeller og forskellige organsystemer 38,43.

Derudover histologisk analyse af den transficerede cochlea viste ingen tegn på en inflammatorisk reaktion, med fremragende bevarelse af cytoarchitecture af orglet af Corti, herunder stria vascularis og spiral ganglieneuroner 26. Yderligere, i modsætning til metoder, der anvendes en cochleostomy den RWM transfektion anvendes i den foreliggende undersøgelse ikke forårsage cochlear skader, og større mængder kan injiceres 31,32. Mangel på traumer ved hjælp af denne teknik blev verificeret ved at demonstrere tilsvarende ABR threshoLDS mellem drives og kontrollere ører, en finde svarende til den, set af Xia et al. 4. Endelig AAV-VGLUT3 levering via RWM resulterede i ABR tærskler sammenlignes med dem, der ses i WT mus (Figur 4A og figur 4B) 26. Vi har anvendt denne teknik i alle aldre af mus, men det er teknisk udfordrende i mus ældre end P40 fordi bulla knogle bliver sværere at perforere og den brækkede knogle fra bulla er skarpere i ældre end hos yngre mus. Med alderen, kan hvis forsigtighed ikke er taget blødning forekomme, hvis et stykke af bulla knogle sønderriver hals væv.

Afslutningsvis denne rapport dokumenterer vellykkede genoverførsel til flere typer af cochleære celler i mus under anvendelse af en AAV-baseret vektor som tidligere vist. Denne teknik til genlevering minimerer traume, ikke fører til tab af hørelse, og kan resultere i omfattende transfektion af en række celletyper i cochlea, including hårceller og spiralganglieceller neuroner. Det har stor potentiel anvendelse til andre former for medfødte og erhvervede former for høretab, og kan også anvendes til en række molekylære behandlinger i musemodeller af høretab.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ketamine Butler Schein
Xylazine AnaSed
Acepromazine Provided by UCSF LARC
Carprofen analgesia Provided by UCSF LARC
Betadine Betadine Puredue Pharma
dexamethasone ophthalmic ointment (TobraDex) Alcon
Heating pad Braintree scientific, inc.
25G needle BD 305127
Borosilicate capillary pipette World precision instruments, inc. 1B100F-4
Suture PDS*plus Antibacterial Ethicon PDP149
Tissue glue (Vetcode) Butler Schein 31477
Rabbit Anti-GFP antibody Invitrogen A11122
Dissecting microscope      Leica MZ95
Flaming/ Brown Micropipette      Sutter Instrument Co
Puller Model P-97  
TDT BioSig III System                 Tucker-Davis Technologies

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Jero, J., et al. Cochlear gene delivery through an intact round window membrane in mouse. Hum. Gene Ther. 12 (5), 539-548 (2001).
  2. Nam, H. J., et al. Structure of adeno-associated virus serotype 8, a gene therapy vector. J. Virol. 81 (22), 12260-12271 (2007).
  3. Ryan, A. F., Mullen, L. M., Doherty, J. K. Cellular targeting for cochlear gene therapy. Adv Otorhinolaryngol. 66, 99-115 (2009).
  4. Xia, L., Yin, S., Wang, J. Inner ear gene trasfection in neonatal mice using adeno-associate viral vwctor: a comparison of two approaches. PLoS One. 7 (8), e43218 (2012).
  5. Husseman, J., Raphael, Y. Gene therapy in the inner ear using adenovirus vectors. AdvOtorhinolaryngol. 66, 37-51 (2009).
  6. Ballana, E., et al. Efficient and specific transduction of cochlear supporting cells by adeno-associated virus serotype 5. Neurosci. Lett. 442 (2), 134-139 (2008).
  7. Praetorius, M., et al. Adenoviral vectors for improved gene delivery to the inner ear. Hear. Re. 248 (1-2), 31-38 (2009).
  8. Kay, M. A., Glorioso, C. G., Naldini, L. Viral vectors for gene therapy: the art of turning infectious agents into vehicles of therapeutics. Nature Medicine. 7 (1), 33-40 (2001).
  9. Ryan, A. F. Gene Therapy and Stem Cell Transplantation: Strategies for Hearing Restoration. Adv Otorhinolaryngol. 66, Karger. Basel. 64-86 (2009).
  10. Cooper, L. B., et al. AAV-mediated delivery of the caspase inhibitor XIAP protects against cisplatin ototoxicity. Otol. Neurotol. 27 (4), 484-490 (2006).
  11. Gratton, M. A., Salvi, R. J., Kamen, B. A., Saunders, S. S. Interaction of cisplatin and noise on the peripheral auditory system. Hear. Res. 50 (1-2), 211-223 (1990).
  12. Lalwani, A. K., Walsh, B. J., Reilly, P. G., Muzyczka, N., Mhatre, A. N. Development of in vivo gene therapy for hearing disorders: introduction of adeno-associated virus into the cochlea of the guinea pig. Gene Ther. 3 (7), 588-592 (1996).
  13. Kesser, B. W., Hashisaki, G. T., Holt, J. R. Gene Transfer in Human Vestibular Epithelia and the Prospects for Inner Ear Gene Therapy. Laryngoscope. 118 (5), 821-831 (2008).
  14. Izumikawa, M., et al. Auditory hair cell replacement and hearing improvement by Atoh1 gene therapy in deaf mammals. Nat. Med. 11 (3), 271-276 (2005).
  15. Praetorius, M., et al. Adenovector-mediated hair cell regeneration is affected. Acta Otolaryngol. 130 (2), 215-222 (2009).
  16. Friedman, L. M., Dror, A. A., Avraham, K. B. Mouse models to study inner ear development and hereditary hearing loss. Int. J. Dev. Biol. 51 (6-7), 609-631 (2007).
  17. Chang, E. H., Van Camp, G., Smith, R. J. The role of connexins in human disease. Ear Hear. 24 (4), 314-323 (2003).
  18. Cohen-Salmon, M., et al. Targeted ablation of connexin26 in the inner ear epithelial gap junction network causes hearing impairment and cell death. Curr. Biol. 12 (13), 1106-1111 (2002).
  19. Nickel, R., Forge, A. Gap junctions and connexins in the inner ear: their roles in homeostasis and deafness. Curr. Opin. Otolaryngol. Head Neck Surg. 16 (5), 452-457 (2008).
  20. Lv, P., Wei, D., Yamoah, E. N. Kv7-type channel currents in spiral ganglion neurons: involvement in sensorineural hearing loss. J. Biol. Chem. 285 (45), 34699-34707 (2010).
  21. Leibovici, M., Safieddine, S., Petit, C. Mouse models for human hereditary deafness. Curr. Top. Dev. Biol. 84, 385-429 (2008).
  22. Dror, A. A., Avraham, K. B. Hearing loss: mechanisms revealed by genetics and cell biology. Annu. Rev. Genet. 43, 411-437 (2009).
  23. Richardson, G. P., de Monvel, J. B., Petit, C. How the genetics of deafness illuminates auditory physiology. Annu. Rev. Physiol. 73, 311-334 (2011).
  24. Jero, J., Tseng, C. J., Mhatre, A. N., Lalwani, A. K. A surgical approach appropriate for targeted cochlear gene therapy in the mouse. Hearing Research. 151 (1-2), 106-114 (2001).
  25. Seal, R. P., et al. Sensorineural deafness and seizures in mice lacking vesicular glutamate transporter 3. Neuron. 57 (2), 263-275 (2008).
  26. Akil, O., et al. Restoration of hearing in the VGLUT3 knockout mouse using virally mediated gene therapy. Neuron. 75 (2), 283-293 (2012).
  27. Akil, O., et al. Progressive deafness and altered cochlear innervation in knock-out mice lacking prosaposin. J. Neurosci. 26 (5), 13076-13088 (2006).
  28. Fremeau, R. T., et al. Vesicular glutamate transporters 1 and 2 target to functionally distinct synaptic release sites. Science. 304 (5678), 1815-1819 (2004).
  29. Akil, O., Lustig, L. R. Mouse Cochlear Whole Mount Immunofluorescence. Bio-protocol. , Available from: http://www.bio-protocol.org/wenzhang.aspx?id=332 (2013).
  30. Kho, S. T., Pettis, R. M., Mhatre, A. N., Lalwani, A. K. Cochlea microinjection and its effects upon auditory function in guinea pig. Eur Arch Otorhinolaryngol. 257 (9), 469-472 (2000).
  31. Iizuka, T., et al. Noninvasive in vivo delivery of transgene via adeno-associated virus into supporting cells of the neonatal mouse cochlea. Hum. Gene Ther. 19 (4), 384-390 (2008).
  32. Kilpatrick, L. A., et al. Adeno-associated virus-mediated gene delivery into the scala media of the normal and deafened adult mouse ear. Gene Ther. 18 (6), 569-578 (2011).
  33. Yamasoba, T., Yagi, M., Roessler, B. J., Miller, J. M., Raphael, Y. Inner Ear Transgene Expressionafter Adenoviral Vector Inoculation in the Endolymphatic Sac Hum. Gene Ther. 10 (5), 769-774 (1999).
  34. Praetorius, M., Baker, K., Weich, C. M., Plinkert, P. K., Staecker, H. Hearing preservation after inner ear gene therapy: the effect of vector and surgical approach. ORL J. Otorhinolaryngol. Relat. Spec. 65 (4), 211-214 (2003).
  35. Carvalho, G. J., Lalwani, A. K. The effect of cochleaostomy and intracochlear infusion on auditory brain stem response threshold in the guinea pig. Am. J. Otol. 20 (1), 87-90 (1999).
  36. Kawamoto, K., Oh, S. H., Kanzaki, S., Brown, N., Raphael, Y. The Functional and Structural Outcome of Inner Ear Gene Transfer via the Vestibular and Cochlear Fluids in Mice. Mol. Ther. 4 (6), 575-585 (2001).
  37. Lalwani, A. K., Han, J. J., Walsh, B. J., Zolotukhin, S., Muzyczka, N., Mhatre, A. N. Green fluorescent protein as a reporter for gene transfer studies in the cochlea. Hear Res. 114 (1-2), 139-147 (1997).
  38. Lalwani, A. K., et al. Long-term in vivo cochlear transgene expression mediated by recombinant adeno-associated virus. Gene Ther. 5 (2), 277-281 (1998).
  39. Raphael, Y., Frisancho, J. C., Roessler, B. J. Adenoviral-mediated gene transfer into guinea pig cochlear cells in vivo. Neurosci. Lett. 207 (2), 137-141 (1996).
  40. Weiss, M. A., Frisancho, J. C., Roessler, B. J., Raphael, Y. Viral mediated gene transfer in the cochlea. Int. J. Dev. Neurosci. 15 (4=5), 577-583 (1997).
  41. Pettis, R. M., Han, J. J., Mhatre, A. N., Lalwani, A. K. Intracochlear infusion of recombinant adeno associated virus: Analysis of its dissemination to near and distant tissues. Assoc. Res. Otolaryngol. Abstr. 21, 673 (1998).
  42. Konish, iM., Kawamoto, K., Izumikawa, M., Kuriyama, H., Yamashita, T. Gene transfer into guinea pig cochlea using adeno-associated virus vectors. J. Gene Med. 10 (6), 610-618 (2008).
  43. Kaplitt, M. G., et al. Long-term gene expression and phenotypic correction using adeno-associated virus vectors in the mammalian brain. Nature Genetics. 8 (2), 148-154 (1994).

Tags

Neuroscience Genterapi transfektion Adeno-associeret virus (AAV) mus cochlea indre hårceller (IHC) vesikulær glutamat transportør 3 (VGLUT3).
Kirurgisk metode til Viralt gentilførsel til muse Inner Ear gennem det runde vindues membran
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Akil, O., Rouse, S. L., Chan, D. K., … More

Akil, O., Rouse, S. L., Chan, D. K., Lustig, L. R. Surgical Method for Virally Mediated Gene Delivery to the Mouse Inner Ear through the Round Window Membrane. J. Vis. Exp. (97), e52187, doi:10.3791/52187 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter