Abstract
Генная терапия, используются для достижения функционального восстановления от нейросенсорной глухотой, обещает предоставить лучшее понимание основных молекулярных и генетических механизмов, которые способствуют потере слуха. Введение векторов во внутреннее ухо должно быть сделано таким образом, что широко распределяет агента в улитке при сведении к минимуму повреждение к существующим структурам. Эта рукопись описывает пост-предсердного хирургического подхода, который может быть использован для мыши кохлеарного терапии с использованием молекулярного, фармакологические, и вирусную доставку в постнатальный день мышей 10 лет и старше через мембрану круглого окна (РВМ). Это хирургический подход позволяет быстро и прямую доставку в барабанную лестницу, минимизируя потерю крови и избежать гибели животных. Этот метод включает незначительное или никакое повреждение к основным структур внутреннего и среднего уха, а также мышц шеи, а полностью сохраняя слух. Чтобы продемонстрировать эффективность этой хирургической техники, везикулярного glutamели транспортер 3 нокаутом (VGLUT3 КО) мышей будет использоваться в качестве примера модели мыши врожденной глухотой, что восстанавливает слуха после доставки VGLUT3 во внутреннее ухо с помощью аденоассоциированный вирус (AAV-1).
Introduction
Генная терапия уже давно было предложено в качестве потенциального лечения для генетического потери слуха, но успех в этой области остается неуловимым 1. На сегодняшний день, вирусно опосредованные методики преобладали из-за теоретической возможности ориентироваться на конкретные типы клеток в относительно недоступном улитки. Оба аденовируса (AV) и аденоассоциированный вирус (AAV) были использованы для доставки генов кохлеарного. AAVs имеют то преимущество, улитки для целого ряда причин. Они репликации с дефицитом вирусы и могут эффективно передавать трансгенных молекулы различных типов клеток, включая нейроны, важной мишенью для ряда причин потери слуха. Запись AAV в клетке опосредованы специфическими рецепторами 2; Таким образом, выбор конкретного серотипа должны быть совместимы с типами клеток, чтобы быть трансдуцированных. AAVs может эффективно трансфекции клетки волос 3, и включить в геном хозяина, в результате чего в стабильном, долгосрочном выражения траnsgenic белка и фенотипическая изменение в клетке 4. Хотя это и не обязательно выгодно для краткосрочного применения, таких как регенерация волос клеток, долговременные выражение очень важно для стабильной спасения генетических дефектов. Потому что AAVs не связаны с какой-либо человеческой болезни или инфекции и не демонстрируют ототоксичность 5,6,7, они являются идеальным кандидатом для использования в генной терапии для унаследованных форм потери 8 слуха.
Передача экзогенного генетического материала в млекопитающих внутреннее ухо с помощью вирусных векторов изучалась на протяжении последнего десятилетия, и становится перспективным методом лечения и генетических и приобретенных форм потери 9 слуха. Улитка потенциально идеальной мишенью для генной терапии по нескольким причинам: 1) его небольшой объем требует ограниченное количество вируса необходимо; 2) его относительная изоляция от других ограничений системы органов побочных эффектов; и 3) его заполненные жидкостью камеры облегчить вируснойдоставка по всей лабиринта 10, 11,12,13,14, 15.
Мышиные модели врожденной глухоты позволяют использовать многие методы исследования, чтобы следить за развитием внутреннего уха в систематическом, воспроизводимого образом. В то время как небольшой размер мыши cochleae действительно представляет некоторые хирургические трудности, мышь служит чрезвычайно важной моделью в изучении генетического потери слуха, с нескольких экспериментальных преимуществ по сравнению с другими видами 16. Мышиные модели позволяют оценить диапазоне характеристик с помощью генной анализа сцепления, сбор подробных морфологических наблюдений, и, имитирующей патогенные сценарии; как таковые, они являются хорошими кандидатами для вирусно опосредованного генной терапии. Обширные генетические исследования на мышах в сочетании с технологическими достижениями сделали возможным для создания генетически модифицированных мышей в воспроизводимым образом между лабораториями 17,18, 19, 20,21. Furthermorе, существует множество моделей как для приобрел и унаследовал слуха фенотипы потери у мышей, что позволяет тщательное тестирование в этом животной модели 22, 23,24. Таким образом, исправление слух с помощью вирусно-опосредованного генной терапии в мышиной модели является целесообразным первым шагом в поисках лекарства от болезни человека.
Ранее мы показали, что трансгенные мыши, лишенные везикулярного глутамата транспортер 3 (VGLUT3) рождаются глухими из-за отсутствия высвобождения глутамата в IHC ленте Synapse 25. Поскольку эта мутация не приводит к первичной дегенерации волосковых клеток, эти мутантные мыши являются потенциально отличный модель, в которой для проверки кохлеарный генной терапии для врожденной потерей слуха.
На сегодняшний день количество вирусных методов доставки для генной терапии кохлеарный были описаны, в том числе круглого окна мембраны диффузии, круглый инъекции окно мембраны и доставки через cochleostomy. Есть мощныйМВЛ преимущества и недостатки каждого из этих подходов 9.
Мы сообщаем хирургический метод вирусом опосредованной доставки генов во внутреннее ухо VGLUT3 КО мышей через мембрану круглого окна (РВМ). После ушной метод РВМ инъекции минимально инвазивной с превосходной сохранности слуха, и относительно быстро. Как мы уже ранее опубликованы, в попытке восстановить слух в этой модели мыши, вектор AAV1, несущий ген VGLUT3 (AAV1-VGLUT3) была введена в улитку этих глухих мышей в постнатальный день 12 (P @), в результате чего восстановление слуха 26. Услышав у мышей VGLUT3 KO была проверена слухового ответа ствола мозга (ABR), в то время как трансгенная экспрессия белка была проверена с помощью иммунофлюоресценции (ИФ). Таким образом, это методология показывает, что вирусно-опосредованного генной терапии может исправить генетический дефект, который бы в противном случае приводит к глухоте.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ПРИМЕЧАНИЕ: Все процедуры и животные обращение соблюдены NIH этических принципов и утвержденных требований Протокола к уходу и использованию комитета Институциональная животных из Университета Калифорнии, Сан-Франциско.
1. Подготовка животных для хирургии
- Проводить хирургические процедуры в чистом, посвященной пространстве. Автоклав все хирургические инструменты, стерилизовать со стеклянной бисера стерилизатор до операции.
ПРИМЕЧАНИЕ: В этом протоколе, используйте день после рождения 10-12 (P10-12) FvB мышей. Разных возрастов и штаммы мышей могут быть использованы для удовлетворения потребностей конкретного проекта. Мыши старше P40 может быть сложным, потому что булла кости становится все труднее. - Обезболить мышей с внутрибрюшинной инъекции смеси кетамина гидрохлорида (100 мг / кг), ксилазина гидрохлорида (10 мг / кг), и ацепромазина (2 мг / кг). Начните Хирургическая подготовка только после животное больше не реагирует на болевые раздражители, такие как большой палец ноги крайнем случае. Если вместить достаточноеу, администрирование дозу вакцины (одна пятая первоначальной дозы) анестезирующего коктейля для восстановления первоначального обезболивающий самолет.
ПРИМЕЧАНИЕ: Будьте осторожны на этом этапе, потому что большинство смертности наблюдается в этом возрасте вызвано передозировки анестезирующего препарата. - Обложка глаза животного с защитной глазной мази держать глаза влажные во время анестезии, подавляя животного рефлекс моргания.
- Наведите указатель мыши с шеи расширенной на грелку на протяжении всей процедуры, пока мышь не полностью проснулся, чтобы предотвратить пост-анестезии гипотермии.
- Бритье левую после ушной области с клипера и дезинфекции 70% этанола и повидон-йода до хирургического вмешательства.
2. Хирургические процедуры и векторные впрыска
- Используйте после ушной подход к предоставлению барабанной буллу. Надрезать подкожной ткани с маленькими ножницами, чтобы разоблачить после ушной мышцы. После втягивания жировой ткани гое задняя сторона разреза, разделяя их мышцы справа и слева перпендикулярно разрез, чтобы обнажить височной кости. Убедитесь, что это разрез достаточно долго, чтобы комфортно работать с адекватной визуализации.
- Проколите барабанной буллу с 25 г иглу и расширить отверстие, как надо с пинцетом, так как отойдет кость назад, чтобы обеспечить доступ к базальной свою очередь улитки, а затем расширить настолько, чтобы визуализировать stapedial артерии и круглое окно мембраны (РВМ) ,
- Прокол RWm мягко в центре с боросиликатного капиллярного пипетки. Заметим, отток жидкости через РВМ в этой точке; это нормально. Подождите, пока отток не стабилизируется (effluxed жидкость из улитки сушат с стерильную фильтровальную бумагу).
ПРИМЕЧАНИЕ: Будьте осторожны при проведении и продвижении стекла иглу так, чтобы перфорация РВМ настолько мал, насколько это возможно. В зависимости от используемого микроскопа, удерживая пипетки с использованием микроманипулятора или вручную с помощью пипеткиДержатель. - Подготовка пипетки для инъекции с помощью пипетки съемник такой же путь исправления зажим пипетки готовы. Убедитесь, что диаметр наконечника является большим (около 15 мкм в диаметре), так что вирус пипетки в и из это легко сделать.
- Составьте 1 до 2 мкл AAV1-VGLUT3, AAV1-GFP или AAV2-GFP в инъекционной пипетки. После истечение стабилизируется (от 5 до 10 мин), microinject это фиксированный объем в барабанную лестницу через то же отверстие, ранее сделанные в РУО.
- Печать нишу RW быстро после вытаскивания пипетки с небольшой плагин мышц и закрепите его с небольшой каплей клея ткани, размещенной на мышцы, чтобы избежать утечки из круглого окна.
ПРИМЕЧАНИЕ: Печать эту дыру очень хорошо после удаления иглы с небольшой плагин мышц, чтобы предотвратить любую утечку перилимфу от улитки-этом этапе важно сохранить слух. Несоблюдение печать полностью РВМ приведет к потере слуха с течением времени. - После инъекции, охватываютОтверстие в слуховой буллы с жировой ткани, вернуть после Ушные мышцы и жировую ткань в нормальное положение и зашить рану послойно с 6-0 или меньшей рассасывающиеся хромовой нити.
- Лечить раны повидон-йода.
3. Послеоперационный период
- Место мышей в теплой клетке и не оставляйте их без присмотра, пока они не будут полностью восстановлены затем переместить их обратно с матерью. Рекомендуется удалить мужчина из клетки, прежде чем положить щенков обратно с матерью.
- Администрирование подкожной Carprofen (2 мг / кг) для обезболивания после операции и каждые 24 ч после этого в течение 3 дней, чтобы управлять воспаление и боль. Daily Monitor животных на наличие признаков дистресса, аномальная потеря веса, боли или инфекции. Вообще по 3-й день после операции у всех мышей должны действовать нормально. Если какие-либо признаки дистресса или болезни появляются у мышей после 3-й день, считают эвтаназии тон мышь в соответствии с ведомственным руководящим принципам.
4. Оценка кохлеарной функции после вирусного поставку используя слуховой Ответ головного мозга (ABR) записей
ПРИМЕЧАНИЕ: слуховая реакция ствола мозга (ABR) является слуховой вызванный потенциал, извлеченный из текущей электрической активности в головном мозге и записанный с помощью электродов, помещенных под кожу. Животное стимулируют звука. В результате записи состоит из пяти волн, которые отражают электрическую активность последовательных точек в слухового пути в первые 10 мс после начала слуховой раздражитель.
- Обезболить мышей путем внутрибрюшинной инъекции смеси кетамина гидрохлорида и гидрохлорида ксилазина, как описано в разделе 1.2 данного протокола, но без ацепромазина.
- Наведите на грелку на протяжении всего испытания слуха до мышь не полностью проснулся, чтобы предотвратить пост-анестезии гипотермии.
ПРИМЕЧАНИЕ: ИспользованиеСледующие звуковые раздражители в этом эксперименте: нажмите кнопку (5 мсек; 31 Гц скорость презентация). - Поместите подкожных электродов игла на вершине, ниже ушной раковины левого уха (ссылка) и ниже противоположном ухе (земля) и начните запись ОБРС как описано ранее в звуконепроницаемой камере 27,28. Запись ABR сигналов в интервалах 5 дБ уровня звукового давления вниз от максимальной амплитуды.
- Определить ABR пороговые значения после операции уже как 4 дня после вирусной доставки
Примечание: Порог определяется как самый низкий уровень стимула, при которой ответ пики волн I-V были четко и многократно при визуальной проверке. - Измерьте волновую проанализировать деятельность с нерву улитки. Самый низкий уровень стимул, который дает детектируемый сигнал ABR определяется как порог.
5. Cochlear Transgene Экспрессия белка с помощью иммунофлюоресценции
- Обезболить мышей путем передозировки intraperitoneal инъекции смеси кетамина гидрохлорида и гидрохлорида ксилазина, как описано в разделе 1.2 данного протокола, но без ацепромазина.
- Обезглавить голову только после животное больше не реагирует на болевые раздражители, такие как большой палец ноги крайнем случае.
- Рассеките cochleae, и процесс целом монтажа иммунофлюоресценции, как описано 26. Подробный протокол из кохлеарного целом монтажа иммунофлуоресценции с использованием анти-VGLUT3 и анти-миозина 7а антитела описано в Akil и др., 2013 29.
- Для GFP маркировки, инкубировать кохлеарные цельного крепления в течение ночи при 4 ° С с кроличьей анти-GFP антитела в 1: 250 разбавлении.
- Промыть cochleae два раза в течение 10 мин с PBS, а затем инкубировали в течение 2 часов в козьего анти-кроличьего IgG, конъюгированного с су2 разводили 1: 4000 в PBS.
- Промыть cochleae с PBS в два раза в течение 10 минут и инкубируют их при DAPI в течение 15 мин.
- Установите cochleae на стеклах и наблюдать ундэ микроскоп с конфокальной иммунофлюоресценции.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Для проверки технических характеристик и полезность пост-ушной подхода к кохлеарной молекулярной терапии, AAV1-VGLUT3, AAV1-GFP и AAV2-GFP были доставлены в P10-12 мышей внутреннего уха через РВМ. Такой подход демонстрирует успешную экспрессию трансгена во внутренних волосковых клеток (IHC) (VGLUT3 Рисунок 1 и GFP Рисунок 2 и GFP 3А), наружные волосковые клетки (OHC) (GFP Рисунок 2) и поддерживающие клетки (GFP Рисунок 2 и Рисунок 3A) 26 без существенных органа Корти травмы. Наблюдение различных типов клеток, экспрессирующих GFP показано на улитки целом монтажа иммунофлюоресценции изображений (фиг.2 и фиг 3а) показывает, что выбор AAV серотипа должны быть совместимы с типами клеток, чтобы быть трансдуцированных. Фиг.1, фиг.2 и 3А 26 показывают очень хорошую TRansfection в обоих IHCs и OHCs, а также распределение трансгена белка (GFP / VGLUT3) на протяжении улитки после AAV1 или AAV2-GFP или AAV1-VGLUT3 трансфекции. Распределение IHCs выражения VGLUT3 после AAV1-VGLUT3 трансфекции (фиг.3В) 26 показывает, что трансфекция с помощью РВМ является более эффективным и равномерным по всей улитки, чем другие методы, которые представили более высокие показатели трансфекции ближе к месту вирусной доставки. Мы обнаружили, что уровень трансфекции может быть более эффективным за счет увеличения объема впрыскиваемого вируса во внутреннее ухо (фиг.1) 26.
Наше наблюдение успешного выражения VGLUT3 в VGLUT3 KO мыши IHCs без каких-либо кохлеарного повреждения привели нас к слуховой тест путем измерения ОБРС в спасенных мышей KO. 4А и 4Б 26 документ способность после ушной доставки РВМ в AAV1-VGLUT3 в Внутренний адресАР мышей VGLUT3 KO производить слуха спасение в этой мыши модели врожденной потерей слуха. Слуховые ответа ствола мозга (ABR) следы были восстановлены в VGLUT3 спас KO (4А), и пороги ABR были измеримы и сопоставимы с видели у мышей дикого типа (Рисунок 4б).
Рисунок 1:. VGLUT3 IHC трансфекции после РВМ вирусной доставки в P10-P12 KO мышей трансфецировали cochleae были рассмотрены на P30 с помощью иммунофлуоресценции с использованием анти-Myo7a антитело, волосы клеток маркер, и антитела против VGLUT3. Были высказаны Myo7a и VGLUT3 во всех IHCs только в WT, а IHCS от KO мышей выражается только Myo7a. Спас cochleae мыши показали некоторые IHCS, выражающие VGLUT3, и все IHCS выразил Myo7a (строка 3) IHC:. Внутренние волосковые клетки. Перепечатка с разрешения26. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.
Рисунок 2: Мышь кохлеарной весь монтажа иммунофлюоресценции после родов РВМ AAV2-GFP дикого типа P10-P12 мышей AAV2-GFP был использован для оценки вирусной доставку с помощью пост-ушной подход к улитке мыши.. Доставка AAV2-GFP было сделано в P10-12 и трансгенные выражение GFP был рассмотрен в улитке на P21, используя анти-GFP антитела. GFP выражение (зеленый) у мышей дикого типа кохлеарной весь монтажа показать сильное выражение GFP в наружных волосковых клеток (OHC), чем внутренних волосковых клеток (IHC).
Рисунок 3: Мышь сос hlear весь монтажа иммунофлюоресценции после родов РВМ AAV1-GFP дикого типа P10-P12 мышей. После сдачи AAV1-GFP в улитку выражения GFP видно во внутренних волосковых клеток (IHC) и поддерживающих клеток (А), но не OHCs , в то время как AAV1-VGLUT3 доставка в улитке VGLUT3 KO мышей (В) приводит к экспрессии VGLUT3 только в IHCs. Количество IHCs выражения VGLUT3 в VGLUT3 KO мышей улитки после родов AAV1-VGLUT3 зависит от количества вируса доставлены к внутреннему уху; Например, 40% IHCs выразил VGLUT3, когда 0,6 мкл вируса вводили, в то время как 100% от IHCs выразил VGLUT3 после 1 мкл вируса был доставлен. Там не было никакой разницы в VGLUT3 выражения между вершиной, середина свою очередь, или основания, когда 0,6 мкл вируса вводили. Перепечатка с разрешения 26.
г "/>
Рис. 4: Слуховые ответ ствола мозга (ABR) оценка Представительства сигналов ABR после AAV1-VGLUT3 доставки были похожи между спасенными и дикого типа мышей; В отличие от этого, не ABR сигналов не наблюдалось у мышей KO (А). Спасено мышей KO также показали, измеримые пороги ABR. Эти пороговые ABR были сопоставимы с теми видно на WT мышей для всех частот измеренных (B). I:. ABR волна I. Перепечатка с разрешения 26 Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В этой работе, мы подробно описать метод, который может быть использован для генной терапии кохлеарный, с целью восстановления нормального или спасение слуховой функции, которая снижена в результате генетического дефекта. Как правило атравматической, этот подход является безопасным для кохлеарного переноса генов или других потенциальных молекулярных терапии 30. Другие подходы к кохлеарного терапии были описаны, в том числе в брюшной подход 24, cochleostomy 31,32 и эндолимфатическая мешка доставки 33 в мыши и морской свинки. По нашему опыту, после ушной подход быстрее, проще и связано со снижением травм и гибели животных. Кроме того, после ушной подход обеспечивает повышенную визуализацию РВМ с меньшей вероятностью травмы и потеря слуха 34,35,36. Этот доклад документирует технические аспекты и полезность пост-ушной подхода к кохлеарной молекулярной терапии, демонстрируя доставку AAV1-VGLUT3 в гое внутреннее ухо через РВМ, в результате трансгенной экспрессии гена, как VGLUT3 и GFP (рис 1 и рис 2 и рис 3а) и слуха спасение в этой мыши модели врожденной потерей слуха. Предыдущие исследования, описывающие методы доставки генов показал лишь ограниченный трансгенной экспрессии в критических областях органа Корти 12,37,38,39,40,41. Эти различия могут быть связаны с качеством вирусного препарата, титр вирусного вектора, используемого серотипа, или просто недостаточной вирусной доставки в улитку. В отличие от этого, с помощью этой пост-предсердного подход, мы смогли получить очень хорошие цены трансфекции с обеих внутренних и наружных волосковых клеток и распределения репортерного гена (GFP) после AAV2-GFP трансфекции (фиг 2 и фиг 3A) в течение улитки. Основываясь на процент IHCs трансфицированной AAV1-VGLUT3 (рис 3b), мы предполагаем, что для трансфекции с помощью РВМ более эффective и равномерное по всей улитки, чем другие методы, в том числе той, что описана у морской свинки, которые зарегистрированы более высокие показатели трансфекции в базисной свою очередь, близко к месту вирусной применения 42. Долгосрочная выражение GFP / VGLUT3 внутри улитки, по крайней мере, на год-полтора, согласуется с данными, полученными от других моделей на животных и различных органов и систем 38,43.
Кроме того, гистологический анализ трансфицированной улитки не продемонстрировали никаких признаков воспалительной реакции, с отличной сохранности цитоархитектуры органа Корти, в том числе сосудистой полоски и спирального ганглия нейронов 26. Кроме того, в отличие от методов, которые использовали cochleostomy, РВМ трансфекции, используемый в настоящем исследовании, не вызывают повреждение улитки, и более высокие объемы может быть введен 31,32. Отсутствие травмы с помощью этой техники была проверена путем демонстрации эквивалентный ABR threshoLDS между управлением и контроля уши, найти схоже с Ся и др. 4 Наконец, AAV-VGLUT3 доставка через РВМ в результате ABR пороговые сопоставимы с видели в мышей дикого типа (Рисунок 4а и рис 4б) 26. Мы использовали эту технику во все времена мышей, но это технически сложно мышей старше P40, потому что булла кость становится труднее для перфорирования и сломанная кость от буллы острее в старых, чем у молодых мышей. В более старшем возрасте, если осторожность не принимается кровотечение может произойти, если кусок Булла кости терзает шеи ткани.
В заключение, в настоящем докладе успешный перенос гена в нескольких типов клеток улитки у мышей с использованием вектора AAV основе, как это было показано ранее. Этот метод доставки генов минимизирует травму, не приводит к потере слуха, и может привести к широко распространенной трансфекции различных типов клеток в улитке, IncЛУДИНГ волосковые клетки и спиральные нейроны ганглиев. Она имеет большое потенциальное применение для других типов врожденных и приобретенных форм потери слуха, а также может быть применена к различным молекулярных методов лечения в мышиных моделях потери слуха.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ketamine | Butler Schein | ||
| Xylazine | AnaSed | ||
| Acepromazine | Provided by UCSF LARC | ||
| Carprofen analgesia | Provided by UCSF LARC | ||
| Betadine | Betadine Puredue Pharma | ||
| dexamethasone ophthalmic ointment (TobraDex) | Alcon | ||
| Heating pad | Braintree scientific, inc. | ||
| 25G needle | BD | 305127 | |
| Borosilicate capillary pipette | World precision instruments, inc. | 1B100F-4 | |
| Suture PDS*plus Antibacterial | Ethicon | PDP149 | |
| Tissue glue (Vetcode) | Butler Schein | 31477 | |
| Rabbit Anti-GFP antibody | Invitrogen | A11122 | |
| Dissecting microscope | Leica | MZ95 | |
| Flaming/ Brown Micropipette | Sutter Instrument Co | ||
| Puller Model P-97 | |||
| TDT BioSig III System | Tucker-Davis Technologies |
References
- Jero, J., et al. Cochlear gene delivery through an intact round window membrane in mouse. Hum. Gene Ther. 12 (5), 539-548 (2001).
- Nam, H. J., et al. Structure of adeno-associated virus serotype 8, a gene therapy vector. J. Virol. 81 (22), 12260-12271 (2007).
- Ryan, A. F., Mullen, L. M., Doherty, J. K. Cellular targeting for cochlear gene therapy. Adv Otorhinolaryngol. 66, 99-115 (2009).
- Xia, L., Yin, S., Wang, J. Inner ear gene trasfection in neonatal mice using adeno-associate viral vwctor: a comparison of two approaches. PLoS One. 7 (8), e43218 (2012).
- Husseman, J., Raphael, Y. Gene therapy in the inner ear using adenovirus vectors. AdvOtorhinolaryngol. 66, 37-51 (2009).
- Ballana, E., et al. Efficient and specific transduction of cochlear supporting cells by adeno-associated virus serotype 5. Neurosci. Lett. 442 (2), 134-139 (2008).
- Praetorius, M., et al. Adenoviral vectors for improved gene delivery to the inner ear. Hear. Re. 248 (1-2), 31-38 (2009).
- Kay, M. A., Glorioso, C. G., Naldini, L. Viral vectors for gene therapy: the art of turning infectious agents into vehicles of therapeutics. Nature Medicine. 7 (1), 33-40 (2001).
- Ryan, A. F. Gene Therapy and Stem Cell Transplantation: Strategies for Hearing Restoration. Adv Otorhinolaryngol. 66, Karger. Basel. 64-86 (2009).
- Cooper, L. B., et al. AAV-mediated delivery of the caspase inhibitor XIAP protects against cisplatin ototoxicity. Otol. Neurotol. 27 (4), 484-490 (2006).
- Gratton, M. A., Salvi, R. J., Kamen, B. A., Saunders, S. S. Interaction of cisplatin and noise on the peripheral auditory system. Hear. Res. 50 (1-2), 211-223 (1990).
- Lalwani, A. K., Walsh, B. J., Reilly, P. G., Muzyczka, N., Mhatre, A. N. Development of in vivo gene therapy for hearing disorders: introduction of adeno-associated virus into the cochlea of the guinea pig. Gene Ther. 3 (7), 588-592 (1996).
- Kesser, B. W., Hashisaki, G. T., Holt, J. R. Gene Transfer in Human Vestibular Epithelia and the Prospects for Inner Ear Gene Therapy. Laryngoscope. 118 (5), 821-831 (2008).
- Izumikawa, M., et al. Auditory hair cell replacement and hearing improvement by Atoh1 gene therapy in deaf mammals. Nat. Med. 11 (3), 271-276 (2005).
- Praetorius, M., et al. Adenovector-mediated hair cell regeneration is affected. Acta Otolaryngol. 130 (2), 215-222 (2009).
- Friedman, L. M., Dror, A. A., Avraham, K. B. Mouse models to study inner ear development and hereditary hearing loss. Int. J. Dev. Biol. 51 (6-7), 609-631 (2007).
- Chang, E. H., Van Camp, G., Smith, R. J. The role of connexins in human disease. Ear Hear. 24 (4), 314-323 (2003).
- Cohen-Salmon, M., et al. Targeted ablation of connexin26 in the inner ear epithelial gap junction network causes hearing impairment and cell death. Curr. Biol. 12 (13), 1106-1111 (2002).
- Nickel, R., Forge, A. Gap junctions and connexins in the inner ear: their roles in homeostasis and deafness. Curr. Opin. Otolaryngol. Head Neck Surg. 16 (5), 452-457 (2008).
- Lv, P., Wei, D., Yamoah, E. N. Kv7-type channel currents in spiral ganglion neurons: involvement in sensorineural hearing loss. J. Biol. Chem. 285 (45), 34699-34707 (2010).
- Leibovici, M., Safieddine, S., Petit, C. Mouse models for human hereditary deafness. Curr. Top. Dev. Biol. 84, 385-429 (2008).
- Dror, A. A., Avraham, K. B. Hearing loss: mechanisms revealed by genetics and cell biology. Annu. Rev. Genet. 43, 411-437 (2009).
- Richardson, G. P., de Monvel, J. B., Petit, C. How the genetics of deafness illuminates auditory physiology. Annu. Rev. Physiol. 73, 311-334 (2011).
- Jero, J., Tseng, C. J., Mhatre, A. N., Lalwani, A. K. A surgical approach appropriate for targeted cochlear gene therapy in the mouse. Hearing Research. 151 (1-2), 106-114 (2001).
- Seal, R. P., et al. Sensorineural deafness and seizures in mice lacking vesicular glutamate transporter 3. Neuron. 57 (2), 263-275 (2008).
- Akil, O., et al. Restoration of hearing in the VGLUT3 knockout mouse using virally mediated gene therapy. Neuron. 75 (2), 283-293 (2012).
- Akil, O., et al. Progressive deafness and altered cochlear innervation in knock-out mice lacking prosaposin. J. Neurosci. 26 (5), 13076-13088 (2006).
- Fremeau, R. T., et al. Vesicular glutamate transporters 1 and 2 target to functionally distinct synaptic release sites. Science. 304 (5678), 1815-1819 (2004).
- Akil, O., Lustig, L. R. Mouse Cochlear Whole Mount Immunofluorescence. Bio-protocol. , Available from: http://www.bio-protocol.org/wenzhang.aspx?id=332 (2013).
- Kho, S. T., Pettis, R. M., Mhatre, A. N., Lalwani, A. K. Cochlea microinjection and its effects upon auditory function in guinea pig. Eur Arch Otorhinolaryngol. 257 (9), 469-472 (2000).
- Iizuka, T., et al. Noninvasive in vivo delivery of transgene via adeno-associated virus into supporting cells of the neonatal mouse cochlea. Hum. Gene Ther. 19 (4), 384-390 (2008).
- Kilpatrick, L. A., et al. Adeno-associated virus-mediated gene delivery into the scala media of the normal and deafened adult mouse ear. Gene Ther. 18 (6), 569-578 (2011).
- Yamasoba, T., Yagi, M., Roessler, B. J., Miller, J. M., Raphael, Y. Inner Ear Transgene Expressionafter Adenoviral Vector Inoculation in the Endolymphatic Sac Hum. Gene Ther. 10 (5), 769-774 (1999).
- Praetorius, M., Baker, K., Weich, C. M., Plinkert, P. K., Staecker, H. Hearing preservation after inner ear gene therapy: the effect of vector and surgical approach. ORL J. Otorhinolaryngol. Relat. Spec. 65 (4), 211-214 (2003).
- Carvalho, G. J., Lalwani, A. K. The effect of cochleaostomy and intracochlear infusion on auditory brain stem response threshold in the guinea pig. Am. J. Otol. 20 (1), 87-90 (1999).
- Kawamoto, K., Oh, S. H., Kanzaki, S., Brown, N., Raphael, Y. The Functional and Structural Outcome of Inner Ear Gene Transfer via the Vestibular and Cochlear Fluids in Mice. Mol. Ther. 4 (6), 575-585 (2001).
- Lalwani, A. K., Han, J. J., Walsh, B. J., Zolotukhin, S., Muzyczka, N., Mhatre, A. N. Green fluorescent protein as a reporter for gene transfer studies in the cochlea. Hear Res. 114 (1-2), 139-147 (1997).
- Lalwani, A. K., et al. Long-term in vivo cochlear transgene expression mediated by recombinant adeno-associated virus. Gene Ther. 5 (2), 277-281 (1998).
- Raphael, Y., Frisancho, J. C., Roessler, B. J. Adenoviral-mediated gene transfer into guinea pig cochlear cells in vivo. Neurosci. Lett. 207 (2), 137-141 (1996).
- Weiss, M. A., Frisancho, J. C., Roessler, B. J., Raphael, Y. Viral mediated gene transfer in the cochlea. Int. J. Dev. Neurosci. 15 (4=5), 577-583 (1997).
- Pettis, R. M., Han, J. J., Mhatre, A. N., Lalwani, A. K. Intracochlear infusion of recombinant adeno associated virus: Analysis of its dissemination to near and distant tissues. Assoc. Res. Otolaryngol. Abstr. 21, 673 (1998).
- Konish, iM., Kawamoto, K., Izumikawa, M., Kuriyama, H., Yamashita, T. Gene transfer into guinea pig cochlea using adeno-associated virus vectors. J. Gene Med. 10 (6), 610-618 (2008).
- Kaplitt, M. G., et al. Long-term gene expression and phenotypic correction using adeno-associated virus vectors in the mammalian brain. Nature Genetics. 8 (2), 148-154 (1994).
