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Neuroscience

Méthode chirurgicale pour Virally Mediated Gene livraison à l'oreille de la souris intérieure à travers la membrane de fenêtre ronde

Published: March 16, 2015 doi: 10.3791/52187
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Otolaryngology-Head and Neck Surgery, University of California, San Francisco

Abstract

La thérapie génique, utilisé pour réaliser la récupération fonctionnelle de surdité neurosensorielle, promet d'accorder une meilleure compréhension des mécanismes moléculaires et génétiques sous-jacents qui contribuent à la perte d'audition. Introduction de vecteurs dans l'oreille interne doit être fait d'une manière qui distribue largement l'agent tout au long de la cochlée, tout en minimisant les blessures aux structures existantes. Ce manuscrit décrit une approche chirurgicale post-auriculaire qui peut être utilisé pour la thérapie cochléaire de la souris en utilisant moléculaire, pharmacologique, et la livraison virale à des souris de jour postnatal 10 ans et plus par l'intermédiaire de la membrane de la fenêtre ronde (MLE). Cette approche chirurgicale permet la livraison rapide et directe dans la rampe tympanique tout en minimisant la perte de sang et d'éviter la mortalité animale. Cette technique consiste négligeable ou pas de dommages aux structures essentielles de l'oreille interne et moyenne ainsi que les muscles du cou tout en préservant totalement audience. Pour démontrer l'efficacité de cette technique chirurgicale, la glutam vésiculairetransporteur mangé trois KO (VGLUT3 KO) chez la souris sera utilisé comme un exemple d'un modèle de souris de la surdité congénitale qui récupère entendu après la livraison de VGLUT3 à l'oreille interne en utilisant un virus adéno-associé (AAV-1).

Introduction

La thérapie génique a longtemps été suggérée comme un traitement potentiel pour la perte auditive génétique, mais le succès dans ce domaine est resté inaccessible 1. À ce jour, les méthodologies viralement médiation ont prédominé en raison de la capacité théorique de cibler des types cellulaires spécifiques dans la cochlée relativement inaccessible. Les deux adénovirus (AV) et le virus adéno-associé (AAV) ont été utilisés pour la livraison de gènes cochléaire. AAV sont avantageux dans la cochlée d'un certain nombre de raisons. Ils sont des virus à réplication déficiente et peuvent transférer efficacement molécules transgéniques pour différents types de cellules, y compris les neurones, une cible importante pour un certain nombre de causes de la perte auditive. AAV entrée dans la cellule est médiée par des récepteurs spécifiques 2; Ainsi, le choix d'un serotype particulier doit être compatible avec les types de cellules à une transduction. AAV peut effectivement transfection de cellules de cheveux 3 et intégrer dans le génome de l'hôte, entraînant stable, expression à long terme de la transgenic protéines et le changement phénotypique dans la cellule 4. Bien que pas nécessairement avantageux pour des applications à court terme tels que la régénération des cheveux-cellulaire, l'expression à long terme est très important pour le sauvetage stable de défauts génétiques. Parce que les AAV ne sont pas associés à une maladie humaine ou l'infection et ne démontrent aucune ototoxicité 5,6,7, ils sont un candidat idéal pour une utilisation en thérapie génique pour les formes héréditaires de perte de 8 entendre.

Transfert de matériel génétique exogène dans l'oreille interne des mammifères en utilisant des vecteurs viraux a été étudié au cours de la dernière décennie et est en train de devenir une technique prometteuse pour le traitement des formes à la fois génétiques et acquis de la perte auditive neuf. La cochlée est potentiellement une cible idéale pour la thérapie génique pour plusieurs raisons: 1) son petit volume nécessite un nombre limité de virus nécessaire; 2) son isolement relatif des autres effets des limites des systèmes d'organes secondaires; et 3) les chambres remplies de liquide faciliter viraleenvoi dans toute le labyrinthe 10, 11,12,13,14, 15.

Des modèles murins de la surdité congénitale permettent une utilisation de plusieurs méthodes d'étude pour suivre le développement de l'oreille interne d'une manière reproductible systématique. Alors que la petite taille de cochlée de souris ne présente une certaine difficulté chirurgicale, la souris sert un modèle extrêmement important dans l'étude de la perte auditive génétique, avec plusieurs avantages expérimentaux sur les autres espèces 16. Des modèles de souris permettent d'évaluer un éventail de caractéristiques à travers l'analyse de liaison génétique, la collecte d'observations morphologiques détaillées, et la simulation de scénarios pathogènes; en tant que tels, ils sont de bons candidats pour la thérapie génique à médiation virale. De vastes études génétiques chez les souris combinées avec les avancées technologiques ont permis de générer des souris génétiquement modifiées de façon reproductible dans les laboratoires 17,18, 19, 20,21. AILLEURSe, il existe de nombreux modèles à la fois pour acquises et héréditaires auditives phénotypes de perte chez la souris, ce qui permet des tests rigoureux dans ce modèle animal 22, 23,24. Ainsi, la correction auditive en utilisant la thérapie génique virale médiation dans un modèle de souris est une première étape appropriée dans la recherche d'un remède pour la maladie humaine.

Nous avons précédemment montré que les souris transgéniques dépourvues de glutamate transporteur vésiculaire 3 (VGLUT3) naissent sourds en raison du manque de la libération de glutamate à l'IHC ruban synapse 25. Étant donné que cette mutation ne conduit pas à une dégénérescence primaire des cellules ciliées sensorielles, ces souris mutantes sont potentiellement un excellent modèle pour tester dans laquelle la thérapie génique pour cochléaire surdité congénitale.

A ce jour, un certain nombre de techniques de délivrance viraux pour la thérapie génique cochléaire ont été décrites, y compris autour de diffusion de la membrane de fenêtre, l'injection de la membrane de fenêtre ronde et la livraison via une cochléostomie. Il ya puissanteial avantages et les inconvénients de chacune de ces approches neuf.

Nous rapportons ici une méthode chirurgicale pour la livraison de gènes à médiation virale de l'oreille interne VGLUT3 KO souris à travers la membrane de la fenêtre ronde (MLE). La méthode d'injection RWM post-auriculaire est peu invasive avec une excellente conservation de l'audience, et est relativement rapide. Comme nous l'avons déjà publié, dans un effort pour restaurer l'audition dans ce modèle de souris, un vecteur AAV1 portant le gène de VGLUT3 (AAV1-VGLUT3) a été introduit dans la cochlée de ces souris sourds au jour postnatal 12 (P! @), Résultant en la restauration de l'audition 26. Audience chez les souris KO VGLUT3 a été vérifiée par la réponse du tronc cérébral (ABR), tandis que l'expression de la protéine transgénique a été vérifiée par immunofluorescence (IF). Cette méthodologie démontre ainsi que la thérapie génique à médiation virale peut corriger un défaut génétique qui serait sinon résultats de la surdité.

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Protocol

NOTE: Toutes les procédures et la manipulation des animaux respecté les lignes directrices en matière d'éthique du NIH et exigences du protocole approuvées du soin et l'utilisation des animaux Commission institutionnelle de l'Université de Californie, San Francisco.

1. Préparation de l'animal pour la chirurgie

  1. Effectuer des procédures chirurgicales dans un espace propre dédié. Autoclave tous les instruments de chirurgie, stériliser avec un stérilisateur de billes de verre avant la chirurgie.
    NOTE: Dans ce protocole, utilisez jour postnatal (10-12) P10-12 souris FVB. Différents âges et souches de souris peuvent être utilisés pour répondre aux besoins d'un projet spécifique. Souris âgés de plus de P40 peut être difficile parce que l'os de bulle devient plus difficile.
  2. Anesthésier les souris avec une injection intraperitoneale d'un mélange de chlorhydrate de kétamine (100 mg / kg), le chlorhydrate de xylazine (10 mg / kg) et d'acépromazine (2 mg / kg). Commencer la préparation chirurgicale seulement après que l'animal ne répond plus aux stimuli douloureux, tels que pincement de l'orteil. Si nécessay, administrer une dose de rappel (un cinquième de la dose initiale) du cocktail anesthésiant pour restaurer le plan anesthésique d'origine.
    REMARQUE: Prenez soin à cette étape parce que la plupart de la mortalité observée à cet âge est causée par surdose d'anesthésique.
  3. Couvrir les yeux de l'animal avec une pommade ophtalmique de protection pour garder les yeux humides pendant l'anesthésie, la suppression clin réflexe de l'animal.
  4. Placez la souris avec le cou étendu sur un coussin chauffant toute la procédure jusqu'à ce que la souris est totalement éveillé, pour éviter post-anesthésie hypothermie.
  5. Rasez la région post-auriculaire gauche avec un clipper et désinfecter avec 70% d'éthanol et povidone-iode avant manipulation chirurgicale.

2. La procédure chirurgicale et Vector Injection

  1. Utiliser une approche post-auriculaire pour exposer la bulle tympanique. Incisez le tissu sous-cutané avec de petits ciseaux pour exposer le muscle post-auriculaire. Après la rétraction du tissu adipeux de the côté postérieur de l'incision, séparer les muscles à droite et gauche perpendiculaire à l'incision pour exposer l'os temporal. Assurez-vous que cette incision est assez long pour travailler confortablement avec visualisation adéquate.
  2. Perforer la bulle tympanique avec une aiguille G 25 et d'élargir le trou si nécessaire avec une pince en pelant l'épine dorsale pour permettre l'accès à la tour basal de la cochlée, puis creuser suffisamment pour visualiser l'artère stapédienne et la membrane de la fenêtre ronde (MLE) .
  3. Piquer la gestion des déchets radioactifs doucement dans le centre avec une pipette borosilicate capillaire. Observez efflux fluide à travers la gestion des déchets radioactifs à ce point; ce est normal. Attendre jusqu'à ce que l'écoulement se est stabilisée (le fluide effluxed de la cochlée est séchée avec un papier filtre stérile).
    REMARQUE: Prenez soin lors de la tenue et de faire progresser l'aiguille de verre afin que la perforation RWM est aussi faible que possible. Selon le microscope utilisé, détiennent les pipettes en utilisant un micromanipulateur ou à la main en utilisant une pipettetitulaire.
  4. Préparer les pipettes d'injection à l'aide d'une pipette extracteur de la même façon pipettes de patch-clamp sont préparés. Assurez-vous que le diamètre de la pointe est grande (environ 15 pm de diamètre) de sorte que le pipetage de virus et arrière se fait aisément.
  5. Dresser 1-2 pi de AAV1-VGLUT3, AAV1-GFP ou AAV2-GFP dans une pipette d'injection. Après l'efflux est stabilisé (5-10 min), micro-injection de ce volume fixe dans la rampe tympanique par le même trou préalablement faite dans RWM.
  6. Sceller la niche RW rapidement après avoir retiré la pipette avec un petit bouchon de muscle et le fixer avec une petite goutte de colle de tissu placé sur le muscle pour éviter les fuites de la fenêtre ronde.
    REMARQUE: Sceller ce trou très bien après que l'aiguille est enlevée avec un petit bouchon de muscle pour empêcher toute fuite de périlymphe de la cochlée-cette étape est essentielle pour préserver l'audition. Le défaut de sceller complètement le MLE se traduira par la perte d'audition au fil du temps.
  7. Après l'injection, couvrir letrou dans la bulle auditive avec le tissu adipeux, les muscles revenir post-auriculaires et les tissus adipeux à leur position normale et suturer la plaie en couches avec une suture absorbable chromique 6-0 ou plus petit.
  8. Désinfectez la plaie avec de la povidone-iode.

3. Soins postopératoires

  1. Placez la souris dans une cage chaud et ne les laissez pas sans surveillance jusqu'à ce qu'ils soient complètement rétablis, puis replacez-les avec la mère. Il est recommandé de retirer le mâle de la cage avant de mettre les chiots de retour avec la mère.
  2. Administrer sous-cutanée Carprofène (2 mg / kg) pour l'analgésie postopératoire et toutes les 24 heures par la suite pour trois jours, pour gérer l'inflammation et la douleur. Surveiller les animaux quotidiennement les signes de détresse, la perte de poids anormale, la douleur, ou une infection. Généralement par le 3 e jour après la chirurgie toutes les souris doivent agir normalement. Si des signes de détresse ou de maladie apparaissent dans une souris après la 3 e jour, envisager l'euthanasie til la souris selon les directives institutionnelles.

4. L'évaluation de la fonction cochléaire Après livraison viral en utilisant auditif du tronc cérébral (ABR) Recordings

NOTE: La réponse du tronc cérébral (ABR) est un auditoire potentiel extrait de l'activité électrique dans le cerveau continue et enregistré par l'intermédiaire d'électrodes placées sous le cuir chevelu évoquée. L'animal est stimulé avec du son. L'enregistrement résultant est constitué de cinq vagues qui reflètent l'activité électrique des points successifs dans la voie auditive dans les 10 premières millisecondes après l'apparition d'un stimulus auditif.

  1. Anesthésier la souris par injection intrapéritonéale d'un mélange de chlorhydrate de kétamine et de chlorhydrate de xylazine comme décrit à la section 1.2 de ce protocole, à l'exception sans acépromazine.
  2. Placez la souris sur un coussin chauffant à travers le test d'audition jusqu'à ce que la souris est totalement éveillé, pour éviter post-anesthésie hypothermie.
    REMARQUE: Utilisezles stimuli sonores suivants dans cette expérience: cliquez (5 ms durée; 31 Hz taux de présentation).
  3. Placez électrodes aiguilles sous-cutanés au sommet, au-dessous du pavillon de l'oreille gauche (de référence), et en dessous de l'oreille controlatérale (sol) et commencer ABRs enregistrement comme décrit précédemment dans une chambre insonorisée 27,28. Enregistrez formes d'onde ABR dans cinq intervalles dB de niveau de pression sonore en baisse par rapport amplitude maximale.
  4. Déterminer les seuils ABR postopératoire dès que quatre jours après l'accouchement virale
    REMARQUE: Le seuil est définie comme le niveau de stimulation le plus bas auquel Réponse de pics pour les ondes I-V ont été clairement et de façon répétée présente sur une inspection visuelle.
  5. Mesurer la vague I pour analyser l'activité du nerf cochléaire. Le niveau de stimulation le plus bas qui produit un signal détectable ABR est défini comme le seuil.

5. Cochlear Transgene expression des protéines par immunofluorescence

  1. Anesthésier la souris par une surdose de intraperitoneal injection d'un mélange de chlorhydrate de kétamine et de chlorhydrate de xylazine tel que décrit à la section 1.2 de ce protocole, à l'exception sans acépromazine.
  2. Décapiter la tête seulement après que l'animal ne répond plus aux stimuli douloureux, tels que pincement de l'orteil.
  3. Disséquer la cochlée et le processus sur l'ensemble de montage immunofluorescence comme décrit 26. Un protocole détaillé de l'ensemble du montage cochléaire immunofluorescence en utilisant des anticorps anti-myosine 7a anti-VGLUT3 et est décrite dans Akil et al., 2013 29.
  4. Pour l'étiquetage des GFP, incuber les entiers montures cochléaires nuit à 4 ° C avec un anticorps de lapin anti-GFP au 1: 250 dilution.
  5. Rincer la cochlée deux fois pendant 10 min avec du PBS et ensuite incuber pendant 2 heures à l'anticorps de chèvre anti-IgG de lapin conjugué à Cy2 dilué à 1: 4000 dans du PBS.
  6. Rincer la cochlée deux fois avec du PBS pendant 10 minutes et les incuber avec du DAPI pendant 15 min.
  7. Monter la cochlée sur des lames de verre et observer under un microscope avec immunofluorescence confocale.

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Representative Results

Pour vérifier les caractéristiques techniques et l'utilité de l'approche post-auriculaire pour la thérapie moléculaire cochléaire, AAV1-VGLUT3, AAV1-GFP et AAV2-GFP ont été livrés à des souris P10-12 oreille interne via le MLE. Cette approche démontre l'expression du transgène avec succès dans les cellules ciliées internes (IHC) (VGLUT3 Figure 1 et la GFP Figure 2 et la GFP figure 3A), les cellules ciliées externes (CCE) (GFP Figure 2) et des cellules de support (GFP figure 2 et la figure 3A) 26 sans organe important de blessure Corti. L'observation des différents types de cellules exprimant la GFP montrent les images d'immunofluorescence entiers montage cochléaires (figure 2 et la figure 3A) montre que le choix de l'AAV de sérotype doit être compatible avec les types de cellules à une transduction. La figure 1, la figure 2 et la figure 3A 26 montrent très bon transfection dans les deux CSI et CCEs, ainsi que la distribution de la protéine transgénique (GFP / VGLUT3) tout au long de la cochlée après AAV1 ou AAV2-GFP ou AAV1-VGLUT3 transfection. La distribution de CSI exprimant VGLUT3 après AAV1-VGLUT3 transfection (figure 3B) 26 suggère que la transfection par le RWM est plus efficace et plus uniforme à travers toute la cochlée que d'autres méthodes qui ont signalé des taux plus élevés de transfection plus près du site de livraison virale. Nous avons trouvé que les taux de transfection peuvent être rendus plus efficaces en augmentant le volume du virus injecté dans l'oreille interne (Figure 1) 26.

Notre observation de l'expression VGLUT3 réussi à VGLUT3 KO CSI souris sans dommage cochléaire nous a conduit à tester l'audition par la mesure ABRs chez les souris KO sauvés. Figure 4A et la figure 4B 26 documents de la capacité de livraison de RWM post-auriculaire AAV1-VGLUT3 dans le e intérieurear des souris KO pour produire VGLUT3 sauvetage entendre dans ce modèle de souris de la surdité congénitale. Réponse du tronc cérébral (ABR) traces ont été restaurés dans le VGLUT3 sauvé KO (figure 4A), et les seuils ABR étaient mesurables et comparables à ceux observés chez les souris de type sauvage (figure 4B).

Figure 1
Figure 1:. VGLUT3 IHC transfection après RWM livraison virale à des souris KO P10-P12 La cochlée transfectées ont été examinés à P30 par immunofluorescence utilisant un anticorps anti-MYO7A, un marqueur cheveux cellule et un anticorps contre VGLUT3. MYO7A et VGLUT3 ont été exprimées dans tous les CSI que dans le WT, tandis que CSI de souris KO exprimé uniquement MYO7A. La cochlée de souris sauvé montré quelques CSI exprimant VGLUT3, et tous les CSI a exprimé MYO7A (ligne 3) IHC:. Cellules ciliées internes. Réimpression avec la permission de26. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2
Figure 2: Souris cochléaire entier monter immunofluorescence après la livraison RWM AAV2-GFP aux souris P10-P12 de type sauvage AAV2-GFP a été utilisé pour évaluer la prestation virale en utilisant l'approche post-auriculaire à la cochlée de souris.. Livraison AAV2-GFP a été effectué à P10-12 et expression transgénique de la GFP a été examinée dans la cochlée à P21 en utilisant un anticorps anti-GFP. expression de la GFP (vert) chez les souris WT cochléaire l'ensemble du montage montrer plus forte expression de la GFP dans les cellules ciliées externes (OHC) que les cellules ciliées internes (IHC).

Figure 3
Figure 3: coc souris hlear immunofluorescence entier monter après la livraison RWM AAV1-GFP aux souris P10-P12 de type sauvage. Après l'accouchement AAV1-GFP à l'expression de la cochlée de la GFP est observée dans les cellules ciliées internes (IHC) et des cellules de soutien (A), mais pas CCEs , alors que la livraison AAV1-VGLUT3 à la cochlée de l'VGLUT3 KO souris (B) a donné lieu à l'expression de VGLUT3 seulement dans CSI. Le nombre de CSI exprimant VGLUT3 dans le VGLUT3 KO souris cochlée après la livraison AAV1-VGLUT3 dépend de la quantité de virus livré à l'oreille interne; par exemple, 40% des CSI a exprimé VGLUT3 lorsque 0,6 ul du virus a été injecté, alors que 100% des CSI a exprimé VGLUT3 après une ul du virus a été livré. Il n'y avait pas de différence dans l'expression de VGLUT3 entre le sommet, à mi-tour, ou la base où 0,6 ul de virus ont été injectés. Réimpression avec la permission de 26.

g "/>
. Figure 4: réponse du tronc cérébral (ABR) l'évaluation des formes d'onde représentatives ABR après l'accouchement AAV1-VGLUT3 étaient similaires entre les souris sauvées et de type sauvage; En revanche, aucune des formes d'onde ABR ont été observés chez les souris KO (A). Rescued souris KO ont également montré seuils ABR mesurables. Ces seuils ABR étaient comparables à ceux observés chez les souris WT pour toutes les fréquences mesurées (B). I:. ABR vague I. Réimpression avec la permission de 26 Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

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Discussion

Dans ce travail, nous décrivons en détail une technique qui peut être utilisé pour la thérapie génique cochléaire, dans le but de rétablir ou sauvetage fonction auditive normale qui est compromise par un défaut génétique. Comme il est généralement atraumatique, cette approche est sans danger pour le transfert de gènes cochléaire ou d'autres thérapies moléculaires potentielles 30. D'autres approches pour la thérapie cochléaire ont été décrits, y compris une approche ventrale 24, 31,32 et cochléostomie sac endolymphatique livraison 33 chez la souris et Guinée porc. Dans notre expérience, l'approche post-auriculaire est plus rapide, plus simple, et associée à une lésion réduite et la mortalité des animaux. En outre, l'approche post-auriculaire offre une meilleure visualisation de la gestion des déchets radioactifs avec moins de chance de traumatisme et de perte de l'ouïe 34,35,36 associé. Ce rapport documente les aspects techniques et l'utilité de l'approche post-auriculaire pour la thérapie moléculaire cochléaire en démontrant livraison de AAV1-VGLUT3 en ee oreille interne via le RWM, résultant dans l'expression transgénique de deux VGLUT3 et GFP (Figure 1 et Figure 2 et la figure 3A) et de sauvetage entendre dans ce modèle de souris de la surdité congénitale. Des études antérieures décrivant les méthodes pour la livraison de gènes ont montré que l'expression transgénique limitée dans les zones critiques de l'organe de Corti 12,37,38,39,40,41. Ces différences peuvent être dues à la qualité de la préparation virale, le titre du vecteur viral, serotype utilisé, ou tout simplement insuffisants livraison viral dans la cochlée. En revanche, en utilisant cette approche post-auriculaire, nous avons pu obtenir de très bons taux de transfection à la fois aux cellules ciliées internes et externes et de la distribution d'un gène rapporteur (GFP) après AAV2-GFP transfection (figure 2 et figure 3A) tout au long de la cochlée. Basé sur le pourcentage de CSI transfectées avec AAV1-VGLUT3 (figure 3B), nous suggérons que la transfection par RWM est plus effcace et uniforme à travers toute la cochlée que d'autres méthodes, y compris celle décrite dans le cochon de Guinée, qui a enregistré des taux plus élevés de transfection dans le tour basal, à proximité du site d'application virale 42. L'expression à long terme de la GFP / VGLUT3 dans la cochlée, pendant au moins un an et demi, est compatible avec les données obtenues à partir d'autres modèles animaux et des systèmes 38,43 différents organes.

En outre, l'analyse histologique de la cochlée transfectées démontré aucune preuve d'une réponse inflammatoire, avec une excellente préservation de l'cytoarchitecture de l'organe de Corti, y compris la strie vasculaire et les neurones du ganglion spiral 26. En outre, contrairement aux méthodes qui employaient un cochléostomie, la transfection de gestion des déchets radioactifs utilisés dans la présente étude n'a pas causé de dommages cochléaires, et la hausse des volumes pourrait être injecté 31,32. Manque de traumatisme en utilisant cette technique a été vérifiée en démontrant thresho ABR équivalentlds entre les oreilles exploités et de contrôle, une conclusion similaire à celle observée par Xia et al. 4 Enfin, la prestation de l'AAV-VGLUT3 par la gestion des déchets radioactifs a entraîné ABR seuils comparables à ceux observés chez les souris WT (figure 4A et la figure 4B) 26. Nous avons utilisé cette technique dans tous les âges de la souris, mais il est techniquement difficile de souris âgés de plus de P40 parce que l'os de bulle devient plus difficile à perforer et l'os cassé de la bulle est plus nette dans les anciens que chez les souris plus jeunes. Chez les personnes âgées, des saignements si la prudence ne est pas prise peut se produire si un morceau de l'os de la bulle déchire les tissus du cou.

En conclusion, ce rapport documente le transfert de gènes avec succès dans plusieurs types de cellules cochléaires chez la souris en utilisant un vecteur à base d'AAV-comme l'a déjà montré. Cette technique de délivrance de gène minimise le traumatisme, ne conduit pas à une perte auditive, et peut se traduire par transfection généralisée d'une variété de types de cellules à l'intérieur de la cochlée, incLUDING cellules ciliées et neurones du ganglion spiral. Il a une grande application potentielle pour d'autres types de formes congénitales et acquises de la perte auditive, et pourrait également être appliqué à une variété de thérapies moléculaires dans des modèles murins de la perte auditive.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ketamine Butler Schein
Xylazine AnaSed
Acepromazine Provided by UCSF LARC
Carprofen analgesia Provided by UCSF LARC
Betadine Betadine Puredue Pharma
dexamethasone ophthalmic ointment (TobraDex) Alcon
Heating pad Braintree scientific, inc.
25G needle BD 305127
Borosilicate capillary pipette World precision instruments, inc. 1B100F-4
Suture PDS*plus Antibacterial Ethicon PDP149
Tissue glue (Vetcode) Butler Schein 31477
Rabbit Anti-GFP antibody Invitrogen A11122
Dissecting microscope      Leica MZ95
Flaming/ Brown Micropipette      Sutter Instrument Co
Puller Model P-97  
TDT BioSig III System                 Tucker-Davis Technologies

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References

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Méthode chirurgicale pour Virally Mediated Gene livraison à l'oreille de la souris intérieure à travers la membrane de fenêtre ronde
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Akil, O., Rouse, S. L., Chan, D. K., … More

Akil, O., Rouse, S. L., Chan, D. K., Lustig, L. R. Surgical Method for Virally Mediated Gene Delivery to the Mouse Inner Ear through the Round Window Membrane. J. Vis. Exp. (97), e52187, doi:10.3791/52187 (2015).

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