Méthode chirurgicale pour Virally Mediated Gene livraison à l'oreille de la souris intérieure à travers la membrane de fenêtre ronde

Résumé

L’approche chirurgicale post-auriculaire décrite permet une administration rapide et directe dans la rampe tympanique cochléaire de souris tout en minimisant la perte de sang et la mortalité animale. Cette méthode peut être utilisée pour la thérapie cochléaire en utilisant l’administration moléculaire, pharmacologique et virale à des souris postnatales à travers la membrane de la fenêtre ronde.

Résumé

La thérapie génique, utilisé pour réaliser la récupération fonctionnelle de surdité neurosensorielle, promet d'accorder une meilleure compréhension des mécanismes moléculaires et génétiques sous-jacents qui contribuent à la perte d'audition. Introduction de vecteurs dans l'oreille interne doit être fait d'une manière qui distribue largement l'agent tout au long de la cochlée, tout en minimisant les blessures aux structures existantes. Ce manuscrit décrit une approche chirurgicale post-auriculaire qui peut être utilisé pour la thérapie cochléaire de la souris en utilisant moléculaire, pharmacologique, et la livraison virale à des souris de jour postnatal 10 ans et plus par l'intermédiaire de la membrane de la fenêtre ronde (MLE). Cette approche chirurgicale permet la livraison rapide et directe dans la rampe tympanique tout en minimisant la perte de sang et d'éviter la mortalité animale. Cette technique consiste négligeable ou pas de dommages aux structures essentielles de l'oreille interne et moyenne ainsi que les muscles du cou tout en préservant totalement audience. Pour démontrer l'efficacité de cette technique chirurgicale, la glutam vésiculairetransporteur mangé trois KO (VGLUT3 KO) chez la souris sera utilisé comme un exemple d'un modèle de souris de la surdité congénitale qui récupère entendu après la livraison de VGLUT3 à l'oreille interne en utilisant un virus adéno-associé (AAV-1).

Introduction

La thérapie génique a longtemps été suggérée comme un traitement potentiel pour la perte auditive génétique, mais le succès dans ce domaine est resté inaccessible ^1. À ce jour, les méthodologies viralement médiation ont prédominé en raison de la capacité théorique de cibler des types cellulaires spécifiques dans la cochlée relativement inaccessible. Les deux adénovirus (AV) et le virus adéno-associé (AAV) ont été utilisés pour la livraison de gènes cochléaire. AAV sont avantageux dans la cochlée d'un certain nombre de raisons. Ils sont des virus à réplication déficiente et peuvent transférer efficacement molécules transgéniques pour différents types de....

Protocole

NOTE: Toutes les procédures et la manipulation des animaux respecté les lignes directrices en matière d'éthique du NIH et exigences du protocole approuvées du soin et l'utilisation des animaux Commission institutionnelle de l'Université de Californie, San Francisco.

1. Préparation de l'animal pour la chirurgie

1. Effectuer des procédures chirurgicales dans un espace propre dédié. Autoclave tous les instruments de chirurgie, stériliser avec un stérilisateur de billes de verre avant la chirurgie.
   NOTE: Dans ce protocole, utilisez jour postnatal (10-12) P10-12 souris FVB. Différents âges et souches de souris pe....

Résultats

Pour vérifier les caractéristiques techniques et l'utilité de l'approche post-auriculaire pour la thérapie moléculaire cochléaire, AAV1-VGLUT3, AAV1-GFP et AAV2-GFP ont été livrés à des souris P10-12 oreille interne via le MLE. Cette approche démontre l'expression du transgène avec succès dans les cellules ciliées internes (IHC) (VGLUT3 Figure 1 et la GFP Figure 2 et la GFP figure 3A), les cellules ciliées externes (CCE) (GFP Figure 2) et des cellules d.......

Discussion

Dans ce travail, nous décrivons en détail une technique qui peut être utilisé pour la thérapie génique cochléaire, dans le but de rétablir ou sauvetage fonction auditive normale qui est compromise par un défaut génétique. Comme il est généralement atraumatique, cette approche est sans danger pour le transfert de gènes cochléaire ou d'autres thérapies moléculaires potentielles ^30. D'autres approches pour la thérapie cochléaire ont été décrits, y compris une approche ventrale ^{24, 31,32} et coc.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Kétamine	Butler Schein
Xylazine	AnaSed
Acépromazine	Fourni par UCSF LARC
Analgésie du carprofène	Fourni par UCSF LARC
Bétadine	Bétadine Puredue Pharma
dexaméthasone pommade ophtalmique (TobraDex)	Alcon
Coussin chauffant	Braintree scientific, inc.
Aiguille 25G	BD	305127
Pipette capillaire en borosilicate	World precision instruments, inc.	1B100F-4
Suture PDS*plus Antibactérien		Ethicon PDP149
Colle tissulaire (Vetcode)	Butler Schein	31477
Lapin Anticorps anti-GFP	Invitrogen	A11122
Microscope de dissection  ;   ;   ;   ;   ;	Leica		MZ95
Flaming/ Marron   ;   ;   ;   ;	Extracteur Sutter Instrument Co
modèle P-97  ;   ;
Système TDT BioSig III  ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;	; Technologies

Micropipette Tucker-Davis