Protocol
1. إخراج تمايز الخلايا الجذعية المشتقة من خلية RPE
ملاحظة: يتم تنفيذ جميع الخطوات حضانة بها في 37 درجة مئوية في 5٪ CO 2
- الحفاظ على حس أو الوركين خطوط (إطعام يوميا) في وسائل الإعلام الصيانة (MM، الجدول 1). مرة واحدة وقد وصلت خطوط معايير كافية من مراقبة الجودة، والمحافظة عليها على طبقة من الفأر الجنينية الخلايا المغذية (MEFS) المصنف في مناطق ذات كثافة من 250،000 / بئر من لوحة جيدا ستة. ويمكن أيضا أن تتولد الثقافات خالية من كره بعد بروتوكول التي وضعتها تاكر وآخرون. 40.
- السماح للمستعمرات الخلايا الجذعية للوصول إلى confluency.
- التحول إلى وسائل الإعلام التمايز مع نيكوتيناميد (DM / NIC، الجدول 1)؛ تغذية يوميا.
- بعد ثلاثة أسابيع في الثقافة، والتحول إلى وسائل الإعلام التمايز مع نيكوتيناميد وإما Activin-A أو IDE-1 (DM / NIC / AA أو DM / NIC / IDE1، الجدول 1) لتعزيز RPE التمايز. بعد خمسة أسابيع في الثقافة، والتبديل إلى DM / NIC. الوجبات اليومية لم تعد ضرورية مرة واحدة المؤشرات درجة الحموضة في توقف وسائل الإعلام تحول الأصفر اليوم بعد الرضاعة.
- انتظر الجزر الخلايا الصباغية للمثول التي تكون كبيرة بما يكفي لخفض وإزالة (انظر الشكلين 2D-F و3A).
2. عزل الصباغي الفشوت
- معطف الآبار من 24 لوحة جيدا مع مصفوفة الذي يحاكي البيئة الطبيعية خلية (خالية من كره هو الأفضل).
ملاحظة: شفرات القرنية وحادة، ملقط غرامة ذات الرؤوس هي مفيدة جدا للاختيار. ورقة كاملة من خلايا متمايزة يمكن فصل بينما نقطف. تجنب ذلك من خلال العمل بعناية والبداية اختيار المستعمرات في وسط الطبق. - شغل العديد من الآبار من لوحة 24-جيدا مع وسائل الإعلام التمايز (DM، الجدول 1) حسب الحاجة. هذا القرار سيعتمد على عدد من المستعمرات المصطبغةالتي تم جمعها.
- في غطاء ثقافة الخلية مع نطاق تشريح، وقطع يدويا من الجزر المصطبغة. تقطيع كل جزيرة في الجزء السفلي من لوحة أصلية باستخدام مشرط في حوالي 2-6 قطع والاستيلاء على أجزاء مصطبغة مع ملقط حادة.
- نقل 1-2 قطعة المصطبغة في كل 24 عاما أيضا.
- لا تغيير وسائل الاعلام لمدة 3-5 أيام حتى خلايا تلتزم، ثم البدء في تغيير وسائل الإعلام ثلاث مرات في الأسبوع. (اذا لم تلتزم بعد هذا الوقت، واحتمال جيد بأنهم سوف أبدا).
- توسيع الخلايا لمدة 3-4 أسابيع في وسائل الإعلام التمايز (DM، الجدول 1) - يتم عرض صورة للثقافة نموذجية في الشكل 3B. الخلايا قد لا يزال غير ملء البئر كله ولكن الانتظار لفترة أطول لا يبدو للمساعدة. تغذية خلايا ثلاث مرات في الأسبوع.
- بعد حوالي 3 أسابيع، يدويا إزالة مجموعات من الخلايا البيضاء في كتل إذا لزم الأمر مع ملقط حادة. لا تفعل هذه الخطوة إلا عند الضرورة - فمن السهل أن إدخال الملوثات. وهو مثالي لمحاولة للحصول على أنقى سكان RPE من المستعمرات المصطبغة الأصلية في الخطوة 1.6.
3. الركض الخلايا الجذعية المستمدة RPE
- فصل الخلايا مع 200 ميكرولتر مع الحل تفارق الخلية (ويفضل أن لا التربسين-كاشف التي يمكن المعطل من خلال التخفيف هو الأفضل) لمدة 5-8 دقائق عند 37 درجة مئوية، وتعطيل من قبل تمييع مع DM. استخدام ماصة 200 ميكرولتر ليغسل كل الخلايا ول resuspend لهم (إذا كان اختيار جيد يحتوي سوى عدد قليل من الخلايا، والنظر في تجميع الخلايا من اثنين من 24 بئرا).
- الطرد المركزي (800 x ج لمدة 5 دقائق)، ونبذ طاف، و resuspend في 3 مل سائل الإعلام DM.
- خلايا إعادة لوحة من واحد (أو اثنين) 24 آبار في مصفوفة واحدة المغلفة 6 جيدا في 3 مل من DM لكل بئر (1: 5 التوسع).
- توسيع لمدة 1-2 أسابيع حتى كانت الخلايا ~ 90٪ متموجة. ويظهر صورة لثقافة نقية متباينة تماما في الشكل 3C.
- فصل الخلايا مع 1 مل خلية دحل issociation لمدة 5-8 دقائق عند 37 درجة مئوية، على تعطيل من قبل التخفيف مع DM، استخدم 1،000 ماصة ميكرولتر ليغسل كل الخلايا، و resuspend لهم.
- تدور باستمرار (800 x ج لمدة 5 دقائق)، ونبذ طاف، و resuspend في 18 مل سائل الإعلام DM.
- خلايا إعادة لوحة واحدة من 6 جيدا كل في ستة مصفوفة المغلفة 6 آبار في 3 مل من DM لكل بئر (1: 6 التوسع) أو المغلفة واحد 75CM 2 قارورة (1: 7.5 التوسع).
- كرر الخطوات من 3،4-3،8 حسب الضرورة حتى يتم الحصول على ما يكفي من الخلايا.
ملاحظة: في محاولة لجمع أكبر عدد ممكن من المستعمرات ممكن للتوسع بدلا من التخطيط لتضخيم الثقافات عبر الركض لأن كل مرور يدفع RPE فقد التمايز.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
الخطوات الموضحة في هذه المخطوطة، كما هو مبين في الشكل رقم 1، ويمكن استخدامها لتوليد بسهولة RPE من الخلايا الجذعية كما ذكرت سابقا 10،12. بعد الحفاظ على خطوط المحفزة لعدة أسابيع، المستعمرات الصباغية تبدأ في الظهور في المستعمرات بعد 5-7 أسابيع (وترد الثقافات القديمة 7 الأسبوع في الشكل 2A-C). ويمكن لهذه المستعمرات تستمر في النمو لعدة أسابيع حيث يتم الحفاظ على الثقافات. مرة واحدة تصل إلى أحجام كافية، كما هو مبين في الشكل 2D-F (8 الاسبوع الثقافات القديمة)، ويمكن رفعه يدويا كما هو موضح في الشكل 3A. الختان الحذر لتجنب التلوث مع الخلايا غير RPE-سيسهل كثيرا على جيل من الثقافات RPE نقية بما فيه الكفاية (الشكل 3B-C).
الشكل 1: التي تصور تخطيطي IPS-RPE الاشتقاق الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: Activin A لد المستعمرات المصطبغة الصغيرة IDE-1 تعزيز العائد من IPS-RPE. (A) تبدأ في الظهور بعد سبعة أسابيع في الثقافة بشكل عفوي بين الخلايا غير RPE في ورقة واحدة وهذا هو تمسكا الجزء السفلي من لوحة 6 جيدا (بعض يتم وضع علامة مع السهام). (B و C) مكملات مع النتائج IDE-1 أو Activin ألف في ظهور المستعمرات حتى أكثر المصطبغة (يتم وضع علامة مع بعض السهام في AC) مما يدل على أن مكملات مع أي Activin A أو IDE-1 يعزز RPE التمايز. (DF) بعد 8 أسابيع من آثار مكملات مع IDE-1 أو Activin A، بل هي أكثر وضوحا. كل من الأرقام والأحجام من الجزر الصباغية هي أكبر بعد التمايز توجيهات. شريط مقياس = 5 ملم
الشكل 3: توسيع والتمايز النهائي منIPS-RPE مصطبغة. (A) صورة الممثل من المصطبغة مستعمرة IPS-RPE التي هي كبيرة بما يكفي لالمكوس. خلايا غير RPE تحيط مستعمرة في الجزء السفلي من لوحة 6 جيدا. ويمثل المخطط الأزرق المنطقة التي سيتم رفعه. (ب) صورة من خلايا غير ناضجة IPS-RPE بعد متكدسة في الثقافة بعد خطوة التوسع الأولى. (C) خلايا الجذع-RPE متباينة عضال اثنين من الشهر القديمة. لاحظ وجود حدود واضحة خلية ومستويات متجانسة من تصبغ يدل التمايز المتقدم. الحانات النطاق = 100 ميكرومتر
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
في هذه المخطوطة نحن الخطوط العريضة الخطوات لتوليد بكفاءة أعداد كبيرة من الذهب الخالص الثقافات IPS-RPE. لقد أظهرنا سابقا باستخدام هذا البروتوكول التمايز الموجهة مع Activin A أننا يمكن أن تولد IPS-RPE التي تشبه بقوة hRPE على أساس transcriptomics، البروتينات، الايض، وظائف، وأنها تؤخر تنكس الشبكية عند زرعها في الفئران RCS 12،31،32 . عملية توليد IPS-RPE هي مضيعة للوقت، ولكن ليس شاقة (الشكل 1). وبمجرد أن الثقافات الجذع تصل confluency يجب أن يكون الطعام مع وسائل الإعلام التمايز على أساس يومي. نحن استكمال وسائل الإعلام مع أي Activin A أو أقل تكلفة جزيء صغير IDE-1، ومواصلة الرضاعة لمدة أسبوعين في حين رصد الثقافات لالمصطبغة المستعمرات IPS-RPE التي تظهر عادة بعد 5-7 أسابيع (الشكل 2A-C). مرة واحدة تصل إلى أحجام كافية (أرقام 2D-F و3A)، وcoloniتتم إزالة يدويا وفاق وتحويلها إلى لوحات جديدة للتوسع. يحدث هذا تقريبا بعد 8 أسابيع وهي الخطوة الأكثر شاقة للبروتوكول بأكمله.
الجانب الأكثر تحديا هو تجنب التلوث مع الخلايا غير RPE في الثقافات التوسع من خلال جمع بطريق الخطأ خلايا المجاورة غير المرغوب فيها في أو حول المستعمرات المصطبغة. اعتمادا على درجة من التلوث، والجزر من خلايا غير RPE-يمكن إزالتها يدويا أثناء التوسع، على الرغم من أن في كل مرة يتم التعامل مع الثقافات مخاطر إضافية لإدخال الملوثات البكتيرية أو الفطرية وزيادة. ومن الجدير بالذكر أنه في تجربتنا IPS-RPE يمكن في الواقع "تكومبيتي" عدد صغير من الخلايا تلويث خلال الخطوات الركض. ولكن نحن نوصي بشدة اتخاذ الحذر الشديد عند اختيار المستعمرات لضمان أن تكون نقية بقدر الإمكان لتجنب الاضطرار إلى اللجوء إلى هذه الخطوات. قبل مرور الثاني أو الثالث على الثقافات IPS-RPE هي محض وsuffi بما فيه الكفايةتتوفر لتوصيف وغرس أرقام cient من الخلايا.
تقنية ذكرت هنا هي بالتأكيد ليست الطريقة الوحيدة لاشتقاق الخلايا الجذعية المستمدة RPE. في واقع الأمر ليست أسهل ولا أسرع. طريقة أسهل وأكثر على نطاق واسع هو استخدام التمايز عفوية. (ومع ذلك، مكملات مع IDE-1 لمدة أسبوعين غير مكلفة ويزيد كثيرا من محصول IPS-RPE.) قد ولدت IPS-RPE أيضا في الهيئات مضغي الشكل أن تفرق في مجالات الخلايا RPE الاستقطاب التي يمكن أن أجبروا على الانضمام إلى سطح لوحات الثقافة وتتوسع كما أحادي الطبقة. الخلايا RPE تولد باستخدام هذه الطريقة تم أيضا تتميز بقوة جدا وتشبه بقوة hRPE 27. RPE يمكن التفريق للغاية بسرعة (في 14 يوما فقط) من الخلايا الجذعية من خلال استكمال وسائل الإعلام مع نيكوتيناميد، IGF1، رأس، Dkk1، وbFGF لتحويلها إلى العصبية مصائر السلف في شبكية العين، ثم إضافة في وقت لاحق المؤيدة للRPE العوامل نيكوتيناميد لالثانية Activin A 37. ويمكن أيضا أن تتولد RPE أكثر بسرعة مباشرة من الخلايا الليفية في ما يقرب من شهر واحد من قبل transducing الخلايا الليفية مع مجموعة صغيرة من عوامل النسخ بما في ذلك cMYC، MITF، OTX2، RAX، وCRX 44. ومع ذلك، في حين أن هذه النتائج مشجعة جدا RPE ولدت هذه التقنيات الماضيين لم يتم تتميز بدقة من قبل زرعها في الجسم الحي. ولذلك، فإننا نقترح أن القارئ النظر في جميع الخيارات RPE الاشتقاق بعناية عند البت فيها لتوظيف في دراستهم.
مزايا استخدام بروتوكول المذكورة هنا هي بساطته وعوائد عالية على الدوام ذات جودة عالية جدا RPE 31. مكملات مع IDE-1 بدلا من Activin ويقلل كثيرا من التكلفة الإجمالية ويقلل من المخاطر التي ينطوي عليها مع استخدام البروتينات المؤتلف. لأنه ليس من الواضح حتى الآن إذا كان الخيار لاستخدام أساليب التفريق مختلفة سيكون لهالها تأثير على المنتج النهائي، ويمكن أن يكون من المفيد للاستفادة من بروتوكولات موحدة، لا سيما إذا مقارنات مباشرة بين RPE ولدت في مختبرات مختلفة سيكون ضروريا (وربما لا سيما في حالة النمذجة المرض). بروتوكول بسيط مثل هذا واحد الذي يتطلب القليل الخبرة والكواشف، والذي يولد عالية الغلة من IPS-RPE، قد يكون مثاليا لهذه الحالات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Corneal knife | Surgipro | SPOI-070 | knife x 1 |
| DMEM/F-12, HEPES | Life Technologies | 11330-032 | 500 ml x 4 |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline, 1X w/out Ca or Mg | VWR | 45000-434 | 500 ml x 6 |
| Fetal Bovine Serum, Regular (Heat Inactivated) | VWR | 45000-736 | 500 ml x 1 |
| FGF-Basic (AA 10-155) Recombinant Human Protein | Life Technologies | PHG0021 | 100 µg x 1 |
| IDE-1 | Stemgent | 04-0026 | 2 mg x 1 |
| Knockout DMEM | Life Technologies | 10829-018 | 500 ml x 1 |
| KnockOut Serum Replacement | Life Technologies | 10828-028 | 500 ml x 1 |
| L-Glutamine 200 mM | Life Technologies | 25030-081 | 100 ml x 1 |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution 100X | Life Technologies | 11140-050 | 100 ml x 1 |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N0636-100G | 100 g x 1 |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml) | Life Technologies | 15140-148 | 20 ml x 1 |
| Recombinant Human/Murine/Rat Activin A | PeproTech | 120-14E | 10 µg x 2 |
| Synthemax-T Surface 6 Well Plates | Corning | 3877 | Case(12) x 1 |
| TrypLE-Express Enzyme (1X), no phenol red | Life Technologies | 12604-021 | 500 ml x 1 |
| Vacuum Filter/Storage Bottle System, 0.1µm pore, 500ml | Corning | 431475 | Case(12) x 1 |
References
- Strauss, O. The retinal pigment epithelium in visual function. Physiol Rev. 85 (3), 845-881 (2005).
- Congdon, N. Causes and prevalence of visual impairment among adults in the United States. Arch Ophthalmol. 122 (4), 477-485 (2004).
- Friedman, D. S. Prevalence of age-related macular degeneration in the United States. Arch Ophthalmol. 122 (4), 564-572 (2004).
- Resnikoff, S. Global data on visual impairment in the year. Bull World Health Organ. 82 (11), 844-851 (2002).
- Bird, A. C. Therapeutic targets in age-related macular disease. The Journal of Clinical Investigation. 120 (9), 3033-3041 (2010).
- Jong, P. T.
- Binder, S., Stanzel, B. V., Krebs, I., Glittenberg, C. Progress In Retinal And Eye Research. Transplantation of the RPE in AMD. 26 (5), 516-554 (2007).
- Cruz, L., Chen, F. K., Ahmado, A., Greenwood, J., Coffey, P. RPE transplantation and its role in retinal disease. Progress In Retinal And Eye Research. 26 (6), 598-635 (2007).
- Carr, A. J. Protective effects of human iPS-derived retinal pigment epithelium cell transplantation in the retinal dystrophic rat. PLoS One. 4 (12), e8152 (2009).
- Idelson, M. Directed differentiation of human embryonic stem cells into functional retinal pigment epithelium cells. Cell Stem Cell. 5 (4), 396-408 (2009).
- Klimanskaya, I. Derivation and comparative assessment of retinal pigment epithelium from human embryonic stem cells using transcriptomics. Cloning Stem Cells. 6 (3), 217-245 (2004).
- Krohne, T. Generation of retinal pigment epithelial cells from small molecules and OCT4-reprogrammed human induced pluripotent stem cells. Stem Cells Translational Medicine. 1 (2), 96-109 (2012).
- Lund, R. D. Human embryonic stem cell-derived cells rescue visual function in dystrophic RCS rats. Cloning Stem Cells. 8, 189-199 (2006).
- Vugler, A. Elucidating the phenomenon of HESC-derived RPE: anatomy of cell genesis, expansion and retinal transplantation. Exp Neurol. 214 (2), 347-361 (2008).
- Algvere, P. V., Berglin, L., Gouras, P., Sheng, Y. Transplantation of fetal retinal pigment epithelium in age-related macular degeneration with subfoveal neovascularization. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 232 (12 ), 707-716 (1994).
- Binder, S. Outcome of transplantation of autologous retinal pigment epithelium in age-related macular degeneration: a prospective trial. Invest Ophthalmol Vis Sci. 45 (11), 4151-4160 (2004).
- Binder, S. Transplantation of autologous retinal pigment epithelium in eyes with foveal neovascularization resulting from age-related macular degeneration: a pilot study. Am J Ophthalmol. 133 (2), 215-225 (2002).
- Falkner-Radler, C. I. Human retinal pigment epithelium (RPE) transplantation: outcome after autologous RPE-choroid sheet and RPE cell-suspension in a randomised clinical study. British Journal of Ophthalmology. 95 (3), 370-375 (2011).
- Li, Y. Long-term safety and efficacy of human-induced pluripotent stem cell (iPS) grafts in a preclinical model of retinitis pigmentosa. Molecular Medicine (Cambridge, Mass). 18, 1312-1319 (2012).
- Lu, B. Long-Term Safety and Function of RPE from Human Embryonic Stem Cells in Preclinical Models of Macular Degeneration). Stem Cells. 27 (9), 2126-2135 (2009).
- Peyman, G. A. A technique for retinal pigment epithelium transplantation for age-related macular degeneration secondary to extensive subfoveal scarring. Ophthalmic Surgery. 22 (2), 102-108 (1991).
- Schwartz, S. D. Embryonic stem cell trials for macular degeneration: a preliminary report. The Lancet. 379 (9817), 713-720 (2012).
- Wang, N. K. Transplantation of reprogrammed embryonic stem cells improves visual function in a mouse model for retinitis pigmentosa. Transplantation. 89 (8), 911-919 (2010).
- Cruz, P. M. Mutation of the receptor tyrosine kinase gene Mertk in the retinal dystrophic RCS rat. Human Molecular Genetics. 9 (4), 645-651 (2000).
- Buchholz, D. E. Derivation of functional retinal pigmented epithelium from induced pluripotent stem cells. Stem Cells. 27 (10), 2427-2434 (2009).
- Hirami, Y. Generation of retinal cells from mouse and human induced pluripotent stem cells. Neurosci Lett. 458 (3), 126-131 (2009).
- Meyer, J. S. Modeling early retinal development with human embryonic and induced pluripotent stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (39), 16698-16703 (2009).
- Osakada, F. In vitro differentiation of retinal cells from human pluripotent stem cells by small-molecule induction. J Cell Sci. 122 (17), 3169-3179 (2009).
- Carr, A. J. Molecular characterization and functional analysis of phagocytosis by human embryonic stem cell-derived RPE cells using a novel human retinal assay. Mol Vis. 15, 283-295 (2009).
- Kokkinaki, M., Sahibzada, N., Golestaneh, N. Human Induced Pluripotent Stem-Derived Retinal Pigment Epithelium (RPE) Cells Exhibit Ion Transport, Membrane Potential, Polarized Vascular Endothelial Growth Factor Secretion, and Gene Expression Pattern Similar to Native RPE. Stem Cells. 29 (5), 825-835 (2011).
- Westenskow, P., Friedlander, M. Ch. 111. The New Visual Neurosciences. Werne, J. S., Chalupa, L. M. , The MIT Press. Cambridge, MA. 1611-1626 (2013).
- Westenskow, P. D. Using flow cytometry to compare the dynamics of photoreceptor outer segment phagocytosis in iPS-derived RPE cells. Invest Ophthalmol Vis Sci. 53 (10), 6282-6290 (2012).
- Algvere, P. V., Gouras, P., Dafgard Kopp,, E, Long-term outcome of RPE allografts in non-immunosuppressed patients with AMD. Eur J Ophthalmol. 9 (3), 217-230 (1999).
- Zhang, X., Bok, D. Transplantation of retinal pigment epithelial cells and immune response in the subretinal space. Invest Ophthalmol Vis Sci. 39 (6), 1021-1027 (1998).
- Gamm, D. M., Phillips, M. J., Singh, R. Modeling retinal degenerative diseases with human iPS-derived cells: current status and future implications. Expert Review Of Ophthalmology. 8, 213-216 (2013).
- Singh, R. iPS cell modeling of Best disease: insights into the pathophysiology of an inherited macular degeneration. Hum Mol Genet. 22 (3), 593-607 (2013).
- Buchholz, D. E. Rapid and efficient directed differentiation of human pluripotent stem cells into retinal pigmented epithelium. Stem Cells Transl Med. 2 (5), 384-393 (2013).
- Fuhrmann, S., Levine, E. M., Reh, T. A. Extraocular mesenchyme patterns the optic vesicle during early eye development in the embryonic chick. Development (Cambridge, England). 127 (21), 4599-4609 (2000).
- Borowiak, M. Small molecules efficiently direct endodermal differentiation of mouse and human embryonic stem cells. Cell Stem Cell. 4 (4), 348-358 (2009).
- Tucker, B. A., Anfinson, K. R., Mullins, R. F., Stone, E. M., Young, M. J. Use of a synthetic xeno-free culture substrate for induced pluripotent stem cell induction and retinal differentiation. Stem Cells Transl Med. 2 (1), 16-24 (2013).
- Ramsden, C. M. Stem cells in retinal regeneration: past, present and future. Development (Cambridge, England). 140 (12), 2576-2585 (2013).
- Zhao, T., Zhang, Z. -N., Rong, Z., Xu, Y. Immunogenicity of induced pluripotent stem cells. Nature. 474 (7350), 212-215 (2011).
- Zhang, K. Direct conversion of human fibroblasts into retinal pigment epithelium-like cells by defined factors. Protei., & Cell. 5 (1), 48-58 (2013).
