Protocol
1. diferenciación dirigida de Stem Cell-RPE derivados
NOTA: Todos los pasos de la incubación se realizó a 37 ° C en el 5% de CO 2
- Mantener el SUH o caderas líneas (alimentar diariamente) en medio de mantenimiento (MM, Tabla 1). Una vez que las líneas han llegado a las normas suficientes de control de calidad, mantenerlos en una capa de células alimentadoras de ratón embrionario (MEFs) sembradas a una densidad de 250.000 / pocillo de una placa de seis pocillos. Culturas-Xeno libre también pueden ser generados siguiendo el protocolo establecido por Tucker et al. 40.
- Permita que las colonias de células madre para llegar a la confluencia.
- Cambie a medio de diferenciación con nicotinamida (DM / NIC, Tabla 1); alimentar a diario.
- Después de tres semanas en cultivo, cambiar a medio de diferenciación con nicotinamida y, o bien activina-A o IDE-1 (DM / NIC / AA o DM / NIC / IDE1, Tabla 1) para mejorar la diferenciación RPE. Después de cinco semanas en cultivo, volver a DM / NIC. Alimentación diaria ya no son necesarios una vez que los indicadores de pH en la parada de los medios de comunicación se tornan amarillas el día después de la alimentación.
- Espere a islotes de células pigmentadas en aparecer que son lo suficientemente grandes como para ser corta y se retira (Ver Figuras 2D-F y 3A).
2. Aislamiento pigmentadas Islotes
- Cubra los pocillos de una placa de 24 pocillos con una matriz que imita el entorno natural de la célula (es preferible-xeno gratis).
NOTA: cuchillas de córnea y afilados, pinzas de punta fina son muy útiles para el picking. Toda la hoja de células diferenciadas puede separar al recoger. Evitar esto trabajando cuidadosamente y recogiendo inicialmente colonias en el centro del plato. - Rellene tantos pocillos de la placa de 24 pocillos con medio de diferenciación (DM; Tabla 1), según sea necesario. Esta decisión dependerá de la cantidad de colonias pigmentadasrecogido.
- En una campana de cultivo de células con un microscopio de disección, corte manualmente islotes pigmentadas. Picar cada islote en la parte inferior de la placa original utilizando un bisturí en unos 2-6 piezas y agarrar las partes pigmentadas con pinzas cortantes.
- Transferencia 1-2 piezas pigmentadas en cada uno de 24 pocillos.
- No cambie los medios de comunicación durante 3-5 días hasta que las células se adhieran, a continuación, empezar a cambiar los medios de comunicación, tres veces por semana. (Si no se adhieren después de este tiempo, la probabilidad es bueno que ellos nunca lo hará).
- Expandir las células durante 3-4 semanas en medio de diferenciación (DM; Tabla 1) - Una imagen de un cultivo típico se muestra en la Figura 3B. Las células todavía no pueden llenar todo el bien pero espera más largo no parece ayudar. Alimentar a las células tres veces por semana.
- Después de 3 semanas, retire manualmente grupos de células blancas en grupos si es necesario con pinzas cortantes. No hacer este paso a menos que sea necesario - es fácil de introducir contaminantes. Es ideal paratratar de obtener poblaciones puras de RPE de las colonias pigmentadas originales en el paso 1.6.
3. pases de células madre derivadas de RPE
- Separar las células con 200 l con una solución de disociación celular (preferiblemente no tripsina-un reactivo que puede ser inactivado mediante dilución es preferible) durante 5-8 min a 37 ° C, e inactivar por dilución con DM. Usar una pipeta de 200 l para lavar todas las células y resuspender ellos (Si el pozo seleccionado contiene sólo unas pocas células, considere la agrupación de las células a partir de dos 24-pozos).
- Se centrifuga (800 xg durante 5 min), desechar el sobrenadante y resuspender en 3 ml de medio DM.
- Células Re-placa de uno (o dos) 24-pozos en una sola matriz recubierta de 6 pocillos en 3 ml de DM por pocillo (1: 5 de expansión).
- Expandir durante 1-2 semanas hasta que las células son ~ 90% de confluencia; una imagen de cultivo puro totalmente diferenciada se muestra en la Figura 3C.
- Separe las células con 1 ml de células dissociation solución durante aproximadamente 5-8 min a 37 ° C, inactivar por dilución con DM, utilice 1.000 l pipeta para lavar todas las células, y resuspender ellos.
- Centrifugar (800 xg durante 5 min), desechar el sobrenadante y resuspender en 18 ml de medio DM.
- Re células de placa de un 6 pocillos cada uno en seis matriz recubierta 6 pocillos en 3 ml de DM por pocillo (1: 6 de expansión) o uno-recubierto 75cm 2 matraz (1: 7,5 de expansión).
- Repita los pasos 3.4 a 3.8, según sea necesario hasta que se obtengan suficientes células.
NOTA: Trata de recoger la mayor cantidad de colonias como sea posible para la expansión en lugar de planificar para amplificar las culturas a través de pases ya que cada paso induce RPE desdiferenciación.
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Representative Results
Los pasos descritos en este manuscrito, como se representa en la Figura 1, pueden ser utilizados para generar fácilmente RPE partir de células madre como se informó anteriormente 10,12. Después de mantener las líneas iPS para varias semanas, las colonias pigmentadas comienzan a aparecer en las colonias después de 5-7 semanas (7 semanas viejas culturas se muestran en la Figura 2A-C). Estas colonias pueden continuar creciendo durante semanas mientras se mantienen las culturas. Una vez alcanzar tamaños suficientes, como se muestra en la Figura 2D-F (8 semanas de edad culturas), pueden ser extirpados manualmente como se ilustra en la Figura 3A. Extirpación cuidadosa para evitar la contaminación con células no RPE facilitará en gran medida la generación de culturas RPE suficientemente puras (Figura 3B-C).
Figura 1: Representación esquemática iPS-RPE derivación Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: activina A und IDE-1 mejorar el rendimiento de iPS-RPE. (A) colonias pigmentadas pequeñas comienzan a aparecer después de siete semanas en cultivo de forma espontánea entre las células no RPE en una sola hoja que se adhiere a la parte inferior de una placa de 6 pocillos (algunos están marcadas con flechas). (B y C) La suplementación con resultados IDE-1 o activina A en la aparición de colonias incluso más pigmentadas (algunos están marcados con flechas en AC) que demuestra que la suplementación con cualquiera de activina A o IDE-1 mejora la RPE diferenciación. (DF) Después de 8 semanas, los efectos de la suplementación con IDE-1 o activina A son aún más pronunciadas. Tanto el número y tamaño de los islotes pigmentadas son más grandes después de la diferenciación dirigida. La barra de escala = 5 mm
Figura 3: La expansión y diferenciación terminal deiPS-RPE pigmentadas. (A) Imagen de un Representante pigmentada colonia iPS-RPE que es lo suficientemente grande como para el consumo. Las células no RPE rodean la colonia en la parte inferior de una placa de 6 pocillos. El contorno azul marca la región que se extirpó. (B) Imagen de células inmaduras iPS-RPE post-confluentes en la cultura después de la primera etapa de expansión. (C) Dos meses de edad terminales diferenciadas las células iPS-RPE. Cabe destacar la presencia de límites de las celdas obvias y niveles homogéneos de pigmentación que demuestran la diferenciación avanzado. Las barras de escala = 100 micras
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Discussion
En este manuscrito resumimos los pasos para generar eficientemente un gran número de culturas iPS-EPR puros. Hemos demostrado anteriormente utilizando este protocolo diferenciación dirigida con activina A que podemos generar iPS-EPR que se asemejan fuertemente hRPE basado en la transcriptómica, proteómica, metabolómica y funcionalidad, y que retardar la degeneración de la retina cuando se implanta en ratas RCS 12,31,32 . El proceso de generación de iPS-RPE es mucho tiempo, pero no laboriosa (Figura 1). Una vez que los cultivos alcanzan la confluencia iPS deben ser alimentados con medio de diferenciación sobre una base diaria. Complementamos los medios de comunicación, ya sea con la activina A o una pequeña molécula menos costoso IDE-1, y continuamos alimentando durante dos semanas, mientras que el seguimiento de los cultivos de colonias pigmentadas iPS-RPE que generalmente aparecen después de 5-7 semanas (Figura 2A-C). Una vez llegando a tamaños suficientes (Figuras 2D-F y 3A), la colonizaciónES se retiran y se transfirieron a nuevas placas para la expansión manualmente. Esto se produce más o menos después de 8 semanas y es el paso más laborioso de todo el protocolo.
El aspecto más difícil es evitar la contaminación con células no RPE en los cultivos en expansión mediante la recopilación accidentalmente células vecinas no deseados en o alrededor de las colonias pigmentadas. Dependiendo del grado de contaminación, islas de células no RPE pueden eliminarse manualmente durante la expansión, aunque cada vez que los cultivos se manejan riesgos adicionales de la introducción de contaminantes bacterianos o fúngicos se incrementan. Vale la pena señalar que en nuestra experiencia el iPS-RPE puede realmente "outcompete" un pequeño número de células contaminantes durante los pasos de pases. Pero recomendamos que se tome mucha precaución al momento de retirar las colonias para garantizar que son tan puros como sea posible para evitar tener que recurrir a estas medidas. Por el segundo o tercer paso las culturas iPS-RPE son suficientemente puro y sufinúmeros cientes de células están disponibles para la caracterización y la implantación.
La técnica informó aquí ciertamente no es el único método para derivar células madre RPE derivada. De hecho, no es ni la más fácil ni más rápido. El método más fácil y más ampliamente es utilizar diferenciación espontánea. (Sin embargo, la suplementación con IDE-1 durante dos semanas es de bajo costo y aumenta en gran medida el rendimiento de iPS-RPE.) IPS-RPE también han generado en cuerpos embrionarios que se diferencian en las esferas de las células RPE polarizadas que pueden ser obligados a adherirse a la superficie de placas de cultivo y se expanden como una monocapa. Células del EPR generan usando este método también se han caracterizado muy vigorosamente y se asemejan fuertemente hRPE 27. RPE puede diferenciar muy rápidamente (en sólo 14 días) a partir de células madre complementando los medios de comunicación con nicotinamida, IGF1, Noggin, Dkk1, y bFGF para convertirlos en destinos neurales progenitoras de la retina, luego añadir el pro-RPE factores de nicotinamida unnd activina A 37. RPE también se puede generar incluso más rápidamente directamente a partir de fibroblastos en aproximadamente un mes a la transducción de los fibroblastos con un conjunto mínimo de factores de transcripción incluyendo cMYC, MITF, OTX2, RAX, y CRX 44. Sin embargo, mientras estos resultados son muy alentadores RPE genera estas dos últimas técnicas aún no han sido rigurosamente caracterizado por implantarlos en vivo. Por lo tanto, sugerimos que el lector considere todas las opciones de derivación RPE cuidado al decidir qué emplear en sus estudios.
Las ventajas de utilizar el protocolo descrito aquí son su simplicidad y consistentemente altos rendimientos de RPE de muy alta calidad 31. La suplementación con IDE-1 en lugar de activina A reduce en gran medida el costo total y disminuye el riesgo involucrado en el uso de proteínas recombinantes. Dado que aún no está claro si la opción de utilizar diferentes métodos de diferenciación tendráun impacto en el producto final, podría ser ventajoso utilizar protocolos estandarizados, especialmente si serán necesarias comparaciones directas entre RPE generada en diferentes laboratorios (quizás particularmente en el caso de modelado de la enfermedad). Un protocolo sencillo como éste que requiere poca experiencia y reactivos, y que genera un alto rendimiento de iPS-RPE, podría ser ideal para estas situaciones.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Corneal knife | Surgipro | SPOI-070 | knife x 1 |
| DMEM/F-12, HEPES | Life Technologies | 11330-032 | 500 ml x 4 |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline, 1X w/out Ca or Mg | VWR | 45000-434 | 500 ml x 6 |
| Fetal Bovine Serum, Regular (Heat Inactivated) | VWR | 45000-736 | 500 ml x 1 |
| FGF-Basic (AA 10-155) Recombinant Human Protein | Life Technologies | PHG0021 | 100 µg x 1 |
| IDE-1 | Stemgent | 04-0026 | 2 mg x 1 |
| Knockout DMEM | Life Technologies | 10829-018 | 500 ml x 1 |
| KnockOut Serum Replacement | Life Technologies | 10828-028 | 500 ml x 1 |
| L-Glutamine 200 mM | Life Technologies | 25030-081 | 100 ml x 1 |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution 100X | Life Technologies | 11140-050 | 100 ml x 1 |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N0636-100G | 100 g x 1 |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml) | Life Technologies | 15140-148 | 20 ml x 1 |
| Recombinant Human/Murine/Rat Activin A | PeproTech | 120-14E | 10 µg x 2 |
| Synthemax-T Surface 6 Well Plates | Corning | 3877 | Case(12) x 1 |
| TrypLE-Express Enzyme (1X), no phenol red | Life Technologies | 12604-021 | 500 ml x 1 |
| Vacuum Filter/Storage Bottle System, 0.1µm pore, 500ml | Corning | 431475 | Case(12) x 1 |
References
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