Protocol
1. Directed Diferenciação de Stem RPE derivado-Cell
NOTA: Todos os passos de incubação são realizadas a 37 ° C em 5% de CO 2
- Manter as linhas-tronco embrionárias humanas ou quadris (alimentação diária) em meio de manutenção (MM; Tabela 1). Uma vez que as linhas de ter atingido os padrões de controle de qualidade suficientes, mantê-los numa camada de células alimentadoras de rato embrionário (MEFs) semeadas a uma densidade de 250.000 / poço de uma placa de seis bem. Culturas isentas de Xeno também podem ser gerados seguindo o protocolo estabelecido por Tucker et ai. 40.
- Permitir que as colônias de células-tronco para a confluência.
- Mudar para a mídia diferenciação com nicotinamida (DM / NIC; Tabela 1); alimentar diária.
- Depois de três semanas em cultura, mudar para mídia diferenciação com nicotinamida e quer Activin-A ou IDE-1 (DM / NIC / AA ou DM / NIC / IDE1; Tabela 1) para aumentar a diferenciação RPE. Depois de cinco semanas em cultura, voltar para DM / NIC. Mamadas diárias não são mais necessárias uma vez que os indicadores de pH na parada de mídia amarelados o dia após a alimentação.
- Espere por ilhotas de células pigmentadas a parecer que são grandes o suficiente para ser cortado e removido (Ver Figuras 2D-F e 3A).
2. Isolando pigmentadas Ilhotas
- Revestir os poços de uma placa de 24 poços com uma matriz que imita o ambiente de células natural (livre de xeno é preferível).
NOTA: lâminas de córnea e afiados, pinças de ponta fina são muito úteis para a colheita. Toda a folha de células diferenciadas pode separar ao escolher. Evite isso, trabalhar com cuidado e, inicialmente, escolher colônias no centro do prato. - Preencha como muitos poços da placa de 24 poços com media diferenciação (DM; Tabela 1), conforme necessário. Esta decisão irá depender do número de colónias pigmentadascoletado.
- Em uma capa de cultura de células com um escopo de dissecação, corte manualmente ilhotas pigmentadas. Pique cada ilhota na parte inferior da placa original, utilizando um bisturi em cerca de 2-6 peças e agarrar as partes pigmentadas com uma pinça afiada.
- Transferir 1-2 peças pigmentados em cada um de 24 poços.
- Não mude de mídia por 3-5 dias até que as células aderir, então começar a mudar media três vezes por semana. (Se eles não aderem após este tempo, a probabilidade é bom que eles nunca será).
- Expandir células durante 3-4 semanas em meio de diferenciação (DM; Tabela 1) - Uma imagem de uma cultura típica é mostrada na Figura 3B. As células podem ainda não preencher todo o bem, mas espera mais não parece ajudar. Alimentar as células três vezes por semana.
- Depois de cerca de 3 semanas, remover manualmente grupos de células brancas em grupos, se necessário, com uma pinça afiada. Não faça esta etapa a menos que seja necessário - é fácil introduzir contaminantes. É ideal paratentar obter mais puras populações de RPE das colônias pigmentadas originais no passo 1.6.
3. Passaging-tronco derivadas de células RPE
- Separar as células com 200 uL com uma solução de dissociação de células (de preferência não-tripsina um reagente que pode ser inactivada por meio de diluição é preferível) para 5-8 min a 37 ° C, e inactivar que por diluição com o DM. Use uma pipeta de 200 mL para lavar todas as células e para voltar a suspender-los (se o bem selecionada contém apenas algumas células, considere reunir as células a partir de duas de 24 poços).
- Centrífuga (800 xg durante 5 min), descartar o sobrenadante e ressuspender em 3 ml de meio MS.
- As células re-placa de um (ou dois) de 24-poços numa única matriz revestido de 6 poços em 3 ml de DM por poço (1: 5 de expansão).
- Expandir durante 1-2 semanas, até que as células estão 90% confluentes ~; uma imagem de uma cultura pura totalmente diferenciada é mostrado na Figura 3C.
- Retire as células com 1 ml de células dissociation solução para cerca de 5-8 min a 37 ° C, inactivar que por diluição com DM, usar 1000 ul pipeta para lavar todas as células e ressuspender-los.
- Centrifugue (800 xg durante 5 min), descartar o sobrenadante e ressuspender em 18 ml de meio MS.
- As células re-placa de 6 poços um em cada seis matriz revestido de 6 poços em 3 ml de DM por poço (1: 6 de expansão) ou de um balão de 2 75 centímetros revestida (1: 7,5 expansão).
- Repita os passos de 3,4-3,8 que for necessário até células suficientes são obtidos.
NOTA: Tente recolher o maior número possível de colónias de expansão em vez de planejar para amplificar as culturas via passaging uma vez que cada passagem induz RPE desdiferenciação.
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Representative Results
Os passos descritos neste manuscrito, como representado na Figura 1, pode ser facilmente utilizada para gerar a partir de células estaminais do EPR como relatado anteriormente 10,12. Após manter as linhas de iPS para várias semanas, as colónias pigmentadas começam a aparecer nas colônias após 5-7 semanas (sete semanas culturas antigas são mostrados na Figura 2A-C). Estas colónias podem continuar a crescer durante semanas como as culturas são mantidas. Uma vez atingida a tamanhos suficientes, como mostrado na Figura 2D-F (8 semanas de idade) culturas, eles podem ser manualmente excisado como ilustrado na Figura 3A. Excisão cuidado para evitar a contaminação com células não-RPE vai facilitar grandemente a geração de culturas RPE suficientemente puros (Figura 3B-C).
Figura 1: Esquema de descrição iPS-RPE derivação Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Activina A umad Pequenas colónias pigmentadas IDE-1 aumentar o rendimento das iPS-RPE. (A) começam a aparecer após sete semanas em cultura espontaneamente entre células não-RPE em uma única folha que é aderente ao fundo de uma placa de 6 poços (alguns estão marcados com setas). (B e C) A suplementação com resultados IDE-1 ou Activina A no aparecimento de colónias mesmo mais pigmentadas (alguns estão marcados com setas na CA) o que demonstra que a suplementação com ou Activina A ou IDE-1 aumenta RPE diferenciação. (DF) Após 8 semanas, os efeitos da suplementação com IDE-1 ou Activina A são ainda mais acentuadas. Ambos os números e tamanhos das ilhotas pigmentados são maiores após a diferenciação dirigida. Barra de escala 5 mm
Figura 3: Expansão e diferenciação terminal deiPS-RPE pigmentadas. (A) Imagem representativa de uma colônia iPS-RPE pigmentada que é grande o suficiente para especial de consumo. As células não-RPE rodeiam a colónia no fundo de uma placa de 6 poços. O contorno azul marca a região que seria extirpado. (B) Imagem de células imaturas iPS-RPE pós-confluentes em cultura após a primeira etapa de expansão. (C) dois meses de idade células iPS-RPE terminalmente diferenciadas. Observe a presença de limites da célula óbvias e níveis homogêneos de pigmentação demonstrando diferenciação avançada. Barras de escala = 100 pm
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Discussion
Nesse artigo, procuramos traçar os passos para gerar de forma eficiente um grande número de culturas puras iPS-RPE. Nós mostramos anteriormente que utilizam este protocolo diferenciação dirigido com Activin A que podemos gerar iPS-RPE que assemelham-se fortemente hRPE baseado em transcriptomics, proteômica, metabolômica e funcionalidade, e que retardar a degeneração da retina quando implantados em ratos RCS 12,31,32 . O processo de geração de iPS-EPR é demorada, trabalhosa, mas não (Figura 1). Uma vez que as culturas atingem a confluência iPS eles devem ser alimentados com meios de diferenciação numa base diária. Nós suplementar os meios com ou Activina A ou menos caro uma pequena molécula IDE-1, e continuar a alimentação durante duas semanas, enquanto monitorando as culturas de colónias pigmentadas iPS-RPE que geralmente aparecem após 5-7 semanas (Figura 2A-C). Uma vez atingida a tamanhos suficientes (Figuras 2D-F e 3A), a colonizaçãoes são removidas e transferidas para novas placas de expansão manualmente. Isto ocorre aproximadamente após 8 semanas e o passo é mais trabalhoso de todo o protocolo.
O aspecto mais desafiador é evitar a contaminação com células não-RPE nas culturas de expansão por acidentalmente coletando células vizinhos indesejados ou em torno das colônias pigmentadas. Dependendo do grau de contaminação, ilhas de células epiteliais pigmentares não pode ser removido manualmente, durante a expansão, embora cada vez que as culturas são tratadas riscos adicionais de introdução de contaminantes bacterianos ou fúngicos são aumentadas. É interessante notar que, em nossa experiência, a iPS-RPE pode realmente "outcompete" um pequeno número de células contaminantes durante as etapas Passaging. Mas é altamente recomendável tomar muito cuidado ao escolher colônias para garantir que eles são tão puros quanto possível, para evitar ter de recorrer a estas etapas. Com a segunda ou terceira passagem, as culturas iPS-RPE são suficientemente puros e suficazes números de células estão disponíveis para a caracterização e o implante.
A técnica descrita aqui certamente não é o único método para derivar células-tronco epiteliais pigmentares derivadas. Na verdade, não é nem o mais fácil, nem o mais rápido. O método mais fácil e mais amplamente é a utilização de diferenciação espontânea. (No entanto, a suplementação com IDE-1, durante duas semanas é barato e aumenta grandemente o rendimento das iPS-RPE.) IPS-RPE também geraram em corpos embrióides de esferas que se diferenciam em células de RPE polarizadas que podem ser forçadas a aderir à superfície de As placas de cultura e expandir como uma monocamada. Células RPE gerar usando este método também têm sido muito vigorosamente caracterizados e assemelham-se fortemente hRPE 27. RPE pode diferenciar de forma extremamente rápida (em apenas 14 dias) a partir de células-tronco, completando a mídia com nicotinamida, IGF1, Noggin, DKK1 e bFGF para convertê-los para neurais destinos progenitoras da retina, e depois adicionar o pro-RPE fatores nicotinamida umnd Activina A 37. RPE também pode ser gerado mesmo mais rapidamente directamente a partir de fibroblastos em cerca de um mês a transdução dos fibroblastos com um conjunto mínimo de factores de transcrição incluindo cMyc, MITF, OTX2, RAX, e 44 CRX. No entanto, embora estes resultados são muito encorajadores o RPE gerado estas duas últimas técnicas ainda não foram rigorosamente caracterizados por implantá-las in vivo. Portanto, sugerimos que o leitor considerar todas as opções RPE derivação cuidado ao decidir que para empregar em seus estudos.
As vantagens da utilização do protocolo delineado aqui são a sua simplicidade e consistentemente altos rendimentos de RPE de muito alta qualidade 31. A suplementação com IDE-1 ao invés de Activin A reduz bastante o custo global e reduz o risco envolvido com o uso de proteínas recombinantes. Uma vez que ainda não está claro se a opção de usar diferentes métodos de diferenciação teráum impacto no produto final, pode ser vantajoso utilizar protocolos padronizados, especialmente se comparações directas entre EPR gerada em diferentes laboratórios será necessário (talvez particularmente no caso de modelagem de doença). Um protocolo simples como esta que requer pouca experiência e reagentes, e que gera alto rendimento de iPS-RPE, pode ser ideal para estas situações.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Corneal knife | Surgipro | SPOI-070 | knife x 1 |
| DMEM/F-12, HEPES | Life Technologies | 11330-032 | 500 ml x 4 |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline, 1X w/out Ca or Mg | VWR | 45000-434 | 500 ml x 6 |
| Fetal Bovine Serum, Regular (Heat Inactivated) | VWR | 45000-736 | 500 ml x 1 |
| FGF-Basic (AA 10-155) Recombinant Human Protein | Life Technologies | PHG0021 | 100 µg x 1 |
| IDE-1 | Stemgent | 04-0026 | 2 mg x 1 |
| Knockout DMEM | Life Technologies | 10829-018 | 500 ml x 1 |
| KnockOut Serum Replacement | Life Technologies | 10828-028 | 500 ml x 1 |
| L-Glutamine 200 mM | Life Technologies | 25030-081 | 100 ml x 1 |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution 100X | Life Technologies | 11140-050 | 100 ml x 1 |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N0636-100G | 100 g x 1 |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml) | Life Technologies | 15140-148 | 20 ml x 1 |
| Recombinant Human/Murine/Rat Activin A | PeproTech | 120-14E | 10 µg x 2 |
| Synthemax-T Surface 6 Well Plates | Corning | 3877 | Case(12) x 1 |
| TrypLE-Express Enzyme (1X), no phenol red | Life Technologies | 12604-021 | 500 ml x 1 |
| Vacuum Filter/Storage Bottle System, 0.1µm pore, 500ml | Corning | 431475 | Case(12) x 1 |
References
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