Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Питательные Регулирование непрерывной подачи для крупномасштабного Расширение клеток млекопитающих в сфероидов

Published: September 25, 2016 doi: 10.3791/52224
Automatic Translation
1, 2, 2, 2, 3, 2, 2, 2, 4, 2
1Radiology, University of Minnesota, 2Medicine, University of Minnesota, 3School of Public Health, University of Minnesota, 4Surgery, University of Arizona

Introduction

Для генерирования большого количества жизнеспособных и функциональных клеток человека для трансплантации, регулирование условий культивирования является обязательным условием. Истощение питательных веществ, наряду с накоплением отходов метаболизма являются основными факторами , способствующими стареющих и метаболические изменения , которые снижают качество клеточного продукта 1 - 3. Эта процедура демонстрирует способ к культуре клеток млекопитающих в сфероидов с применением перемешиваемой биореактора в сочетании с отрегулированной системой подачи скорость перфузии , чтобы регулировать уровень глюкозы в физиологическом диапазоне 4 в течение всего периода культивирования. Для целей этих исследований, физиологический диапазон был определен как от 100 до 200 мг / дл. Те же методы могут быть использованы для регулирования других питательных веществ и метаболические отходы, такие как лактат.

Статические культуры в небольших объемах (1 - 30 мл), как правило, используются в лабораторных условиях для поддержания и дифференциации клеточных линий для experimental целей. Cell пассажи выполняется с полными изменениями среды по мере необходимости через регулярные промежутки времени. Большинство "обычных" питательная среда имеет высокую концентрацию глюкозы (450 мг / дл для DMEM, используемого в этих исследованиях), чтобы позволить менее частых изменений средних без риска питательных ограничений. Тем не менее, эта партия вскармливания метод все еще требует частых манипуляций, вносит вариабельность в среде клеток, а также увеличивает риск загрязнения 5 - 9. Перемешанной суспензии биореакторы (SSB) обеспечивают лучшее перемешивание и снижение обработки 3,10 - 20, но как статические культуры, требуют ручного изменения средних , которые способствуют потенциально опасных колебаний в питательных веществах и отходов уровней продукции. Перфузия кормление ОБП культур уменьшает эти проблемы путем непрерывной инфузии и удаления среды, но большие изменения уровней питательных веществ из-за роста клеток остаются проблемой. Использование скорректированной ра подачит.е из расчета питательного использования на основе оценки потребностей клеток может обеспечить стабильную среду для клеток , необходимых для оптимизации жизнеспособности клеток и функции 21 - 24.

Существует большое количество литературы , описания методов для масштабируемых ОБП культур клеток млекопитающих , специально для культуры и расширения плюрипотентных клеток 25 - 32, с другими сосредоточены на островке (бета) клеток 17,33,34, или производство биологических продуктов 24, 35 - 38. Многие из этих исследованных типах клеток, могут быть выращены в культурах сфероидов, и специфические процедуры типа клеток, используемой должна быть оптимизирована до внедрения непрерывной системы подачи. В этой демонстрации, метод перфузии кормления был использован для расширения линии бета - клеток , выращенного в качестве сфероидов в перемешанной биореактора 39 - 43. Описанный в настоящем документе способ обеспечиваетпростая реализация кормления корректировки курса на основе определения уровня глюкозы в офф-лайн для достижения целевых условий культивирования. Регулировка скорости подачи с помощью этого метода для поддержания физиологического уровня глюкозы показано, что урожайность увеличивается клеток. Клетки млекопитающих , зависят от основным питательным веществом, глюкозу, для выработки энергии, так что использование этой линии клеток представляет собой модель для многих культивируемых клетках млекопитающих 44. Кроме того, эта линия иллюстрирует дальнейшую сложность бета - клеток, которые чувствительны к хроническим высоким уровнем глюкозы 45. Для этого исследования, бета-ТС6 клетки оставляли для формирования сфероидов в культуре , чтобы приблизить средний размер островков Лангерганса в естественных условиях. Система биореактора перфузию 17 - 19,21,46 со скоростью подачи , скорректированной на глюкозу потребления, привело к поддержанию физиологических условий , и более высокие урожаи клеток без изменений в жизнеспособности.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Клеточная линия и техническое обслуживание

  1. Получить бета-ТС6 клетки (или другой требуемый приверженцем линии клеток млекопитающих). В ходе подготовки к исследованию, культуры, прохождение, и криоконсервируют клетки в соответствии с инструкциями поставщика.

2. Собрать Непрерывная система кормления

Примечание: Непрерывная конструкция системы подачи ниже метод был основан на аналогичных системах , описанных в литературе 17 - 19,21,47 - 49. Сборка системы , используемой здесь , подробно описана в предыдущей публикации 3.

  1. Соберите компоненты, необходимые для системы питания, которая состоит из пяти основных компонентов: среда коллектора, перистальтический насос, перемешивают биореакторов, отходы резервуара, и специально разработанные набор трубок / выборки.
    1. Установите средний резервуар с помощью стеклянной бутылке объемом 1 л, резервуар отходов, используя стеклянную бутылку с 2 л, а stirred биореактор с использованием объема стеклянный реактор объемом 250 мл (от версии полке).
    2. Используйте цифровой перистальтический насос или аналогичный насос с головкой 8 канала насоса для контроля среды обмена.
    3. Производство резервуара и модифицированные крышки биореакторе из жесткого и автоклавируемый пластика с трубой из нержавеющей стали сквозная портов, чтобы обеспечить вентиляцию через стерильные фильтры, а также позволяют среды передачи между резервуарами и биореакторах. В качестве альтернативы, приобрести специализированные крышки с портами потока от различных поставщиков.
      Примечание: Крышка биореактор может содержать дополнительные порты сквозная для опционального измерительных приборов и датчиков мониторинга (например, кислород монитор).
    4. Приложить оттоку трубку (OT), изготовленную из пористого стекла аэрационных труб со средним размером пор от 40 мкм до 60 мкм, и плотность пор 40% до модифицированной крышкой ОБП. В качестве альтернативы, выберите другой отток трубки на основе конкретных требований культуры.
      Примечание: ВыберитеOT размер пор для удаления только средних и остатков клеток, в результате чего клеточных агрегатов в культуре (как описано в разделе 6 и публикации 3 для более подробной информации).
  2. Собрать автоклавируемые наборы перфузия трубок из поливинилиденфторида (PVDF) насосно-компрессорных труб и соединителей прочный перистальтический насос. Длина секции зависит от расстояния между различными компонентами.
    Примечание: Соблюдайте особую осторожность при выборе разнообразных труб для обеспечения долговечности и надежности для длительных экспериментов.
  3. Соберите трубки набор из трех частей: питающую линию, линию отходов и образец линии.
    1. Собрать линию подачи с помощью двух трубок диаметра (L / S 14 и L / S 13). С помощью L / S 14 для первичной трубки, которая будет осуществляться расстояние от биореактора средневол- резервуара, и вставить короткую длину L / S 13 в середине длины трубопровода для секции насоса, используя соответствующие PVDF адаптеров.
    2. Используйте стандартный PVDF шланг-колючую TUBIнг адаптеры, чтобы соединить две части L / S 14 трубки с обеих сторон короткой секции насоса (л / с 13) насосно-компрессорных труб.
      Примечание: В качестве альтернативы, вся длина трубки может быть меньше диаметра L / S 13 трубки, а по всей длине трубки могут быть заменены, если целостность насоса сечение находится под вопросом.
  4. Соберите вторую секцию трубопровода для удаления отходов, используя больший диаметр (L / S 16) трубки и вставить короткий отрезок L / S 14 трубки в середине для насосной секции. Это делается таким же образом, как линия подачи в сборе с использованием PVDF шланга колючую адаптеров, или в качестве альтернативы с использованием непрерывной длины требуемого размера насоса насосно-компрессорных труб, и замена при необходимости.
    Примечание: Если тот же насос и напор насоса используются для цепи питания и цепи отходов, секция насоса насосно-компрессорной колонны линий удаления отходов должны быть большего диаметра, чем секции насоса линии подачи. Это гарантирует, что скорость удаления насоса происходит быстрее, чем скорость подачи, и позволит избежать сильнодействующегоIAL для больших изменений объема культуры, а также снизить риск переполнения.
  5. Соберите последний компонент комплекта трубок: узел сбора образца.
    1. Эта процедура описывает пользовательские собранное выборки системы портов; В качестве альтернативы, стерильный порт отбора проб может быть приобретен у различных поставщиков.
    2. Построить набор из трех коротких (~ 6 см) L / S 14 длин труб, соединенных вместе с разъемом PVDF Т-типа, а также два небольших хомутов на двух длин труб.
    3. Приложить стерильный фильтр газа для газовой продувки к одному из зажатого длины, а другая используется для подключения к стерильным шприцем для отбора проб (стерильные газовые фильтры, возможно, должны быть добавлены в шкафу биологической безопасности после стерилизации, как многие стерильные фильтры не являются автоклавируемый).
    4. Подключите третий конец нержавеющей стали соединителем образца, прикрепленной к крышке биореактора.
    5. Автоклава узел отбора проб при подключении к биореакторе до началаэксперимент (обратитесь к шагу 3 ниже).
    6. Используйте эту сборку для сбора стерильных проб из биореактора по мере необходимости, не нарушая процесса непрерывной подачи.

3. автоклавов Все материалы

  1. Подготовьте все компоненты биореактора для стерилизации в автоклаве.
  2. Собрать отдельные компоненты для стерилизации. Средние и отходов резервуары (собранные из стадии 2.1.1), 250 мл вращающаяся колба (собранный из 2.1.1), необходимые модифицированные крышки (собранные из 2.1.3), отток трубки (описанный в 2.1.4), три комплекта трубок ( собраны в разделах 2.2 through2.5), выпускную трубу (по мере необходимости для непрерывной подачи).
    1. Соберите вращающуюся колбу со всеми компонентами и убедитесь, что отток трубки надежно закреплен внутри вращающейся колбе (описано в разделе 2.1.4), и приложите пользовательские собранный порт выборки (раздел 2.5) или другой порт отбора проб в верхней части крышки ,
    2. Оберните всю вращающуюся колбу в сборе с автоклаве обертка материал, и автоклав с указанием ленты. Убедитесь, что упаковка герметична. Примечание: Алюминиевая фольга или подобный материал может быть использован для покрытия отдельных концов каждого порта доступа в крышке биореактора, чтобы сохранить стерильность разъема / заканчивается, когда разворачивание и когда не связанных с наборами трубок внутри инкубатора.
    3. Соберите модифицированные крышки среды и сточных коллекторов, а затем прикрепить к соответствующим стеклянные бутылки. Покройте их с помощью алюминиевой фольги и автоклава с указанием ленты.
    4. Индивидуально обернуть наборы трубок (раздел 2.2 - 2.5) с автоклавной обручем и лентой, чтобы помочь в окончательной сборке. Алюминиевая фольга или подобный материал может быть использован, чтобы обернуть отдельные концы каждой трубки, установленной для сохранения стерильности разъема / заканчивается, когда разворачивание.
    5. Автоклав все обернутые предметы , используя стандартный сухой автоклавный цикл (например, "Гравитация" установка с ~ 15 фунтов на квадратный дюйм при 121 ° С в течение 30 мин или более).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Не крепите стерильнаяфильтры перед автоклавированием, если они не будут подтверждены, чтобы быть в автоклаве безопасными.

4. Формирование Сфероид

Примечание: Этот метод аналогичен тем , которые описаны в литературе 17 - 19,21,50 - 52 для других культур клеток млекопитающих. Все процедуры после стерилизации должно быть сделано в колпаке с ламинарным потоком и с применением стерильных перчаток для поддержания стерильных условий для культивирования клеток.

  1. Для всех условий, культуры и расширения β-TC6 клеток в стандартных культурах адгезивных (характеризующегося поставщика) до достаточных количеств клеток получают семян требуемого количества биореакторов.
    1. Соберите непрерывную подачу биореактор с оттоком трубки , как показано на Рисунке 1 и описано в разделе 2, и подключить порт дискретизации к крышке выборки. Примечание: Отток трубка и отбор проб в сборе порт должен быть добавлен к bioreactили для непрерывной подачи до начала сфероида формации, и должен быть исторгаемы из культуральной среды до тех пор, пока не начнется непрерывной подачи.
    2. Стерилизовать модифицированный узел ОБП в автоклаве (описано в разделе 3).
    3. Приложить стерильные отверстия (0,22 мкм или менее стерильные фильтры) в соответствующих местах на крышках вращающуюся колбу и средних и отходов судов.
      Примечание: Это важно для предотвращения паровых пробок, и чтобы позволить газообмен между инкубаторе (2 5% CO) окружающей среды и биореактора. Газообмен необходимо поддерживать правильный рН при использовании бикарбонат-буферные среды.
  2. Собирают клетки путем осторожного трипсином с использованием 0,25% (вес / объем) раствора трипсино 0,53 мМ ЭДТА, при комнатной температуре в помогший механическом перемешивании в течение 2 - 3 мин, и семя в биореакторах при плотности приблизительно 1,3 × 10 6 клеток / мл в 200 мл культуральной среды.
    1. Перемещение назначенных колб из инкубатора ив шкаф биологической безопасности.
      Примечание: Все культуры и манипуляции клеток должно быть сделано в шкафу биологической безопасности с использованием надлежащей стерильной техники.
    2. Удалить из культуральной среды колбах аспирацией.
    3. Промыть клеток с помощью пипетки 5 мл фосфатно - буферного раствора (без Ca ++ или Mg ++), в колбу, и полоскание через клетки на поверхности, а затем отсасывает PBS.
    4. Добавьте 3 мл раствора Трипсин-EDTA в каждую колбу , которая будет собрана ( как правило , примерно в 10 раз 175 см 2 Т-склянки).
    5. Разрешить заготовленные клетки инкубировать при комнатной температуре в течение 2 - 3 мин в шкафу биологической безопасности.
    6. Перемешивайте осторожно вручную, чтобы ослабить клетки с поверхности колбы, и клетки собирают путем добавления 6 мл культуральной среды (с сывороткой) в колбу, и переносят клетки в 50 мл пробирку. Когда один 50 мл трубки заполнена, используют другую порцию 50 мл трубку, пока все необходимые клетки не были собраны (примерно 50 мл трубки будет необходима для каждых 5 Т-175 колбсобраны).
    7. Аккуратно центрифуге (приблизительно 50 х тяжести) собранные клеточные суспензии для осаждения клеток.
    8. Аспирируйте оставшуюся среду, оставляя осадок нетронутыми.
    9. Собирают все клетки в одной пробирке путем ресуспендирования гранул в культуральной среде (содержащей сыворотку крови) с помощью пипетки, и перенос всех гранул в той же трубе.
    10. Подсчитайте плотность клеток с использованием стандартного гемоцитометра с окрашивания трипановым синим , как описано в литературе 53.
    11. Добавьте необходимое количество общего числа клеток в стерильную SSB для каждого условия (1.3 × 10 6 клеток / мл была целевые плотности начальной ячейки для этой демонстрации).
    12. Добавить среду (с желаемой концентрацией глюкозы, в данном случае мы использовали средние уровни глюкозы в пределах физиологического диапазона) для ОБП, с помощью пипетки, чтобы достичь желаемого полный объем культуры (200 мл объема культуры использовали для этих исследований).
      Примечание: Для этих непрерывных сытый ССБ изучает куб ltures были посеяны с использованием модифицированного "с низким содержанием глюкозы" версию культуральной среды (100 мг / дл). Это позволило начать культуры в нужной концентрации глюкозы мишени, а не начинать с "высоким содержанием глюкозы" среды и ждет потребление глюкозы, чтобы довести уровень глюкозы вниз в физиологическом диапазоне, чтобы начать кормление. Все другие носители для кормления в этих исследованиях использовали стандарт "высокого уровня глюкозы" средний (500 мг / дл).
    13. Перемещение ОБП с клетками на мешалке внутри клеточной культуры инкубатора.
  3. Клетки культуры в биореакторах без кормления в течение 3 -х дней при 37 ° C, 5% CO 2, 100% относительной влажности и скорости ротационной 70 оборотов в минуту , чтобы сфероиды в форме.
    Примечание: Никакого значительного распространения не должно наблюдаться в течение трех дней периода формирования сфероида.
  4. После формирования сфероида, делят сфероидов среди биореакторах с заданными условиями культивирования.
ле "> 5. Непрерывная подача Культура и Скорректированный Скорость подачи

  1. Автоклаве или газа стерилизовать все компоненты, и собрать в кабинете биологической безопасности с использованием стерильной техники (шаги 2 - 4).
  2. После формирования сфероида, удалите ОБП из инкубатора и собрать компоненты для системы непрерывной подачи в кабинете биологической безопасности.
    1. Во-первых заполнить резервуар свежую среду с желаемой культуральной среды, а затем подключить к одной стороне питающей линии. Кроме того, убедитесь, что резервуар свежей среды вентилируется со стерильным фильтром.
    2. Подключение одной стороне линии подачи к впускному отверстию подачи на биореакторе в стерильных условиях. Стерильный фильтр должен быть установлен между линией подачи и входной порт биореактор для фильтрации среды перед поступлением в биореактор.
    3. Подключите линию отходов к выпускному биореактор трубки и резервуар среды отходов, а также обеспечить, чтобы резервуар отходов вентилируется с Sterilе фильтра.
  3. Переместить сборку из биологической безопасности кабинета (это, вероятно, потребуется два человека, чтобы нести все сосуды и трубки), и поместить все компоненты за долгосрочной культуры.
    1. Поместите ОБП на мешалке внутри инкубатора с использованием тех же самых параметров культуры для формирования сфероида (37 ° C, 5% CO 2, влажность 100% и 70 оборотов в минуту). Примечание: Может возникнуть необходимость временного отключения сегментов трубок, из биореактора, если линии должны проходить через отверстия в боковой стороне инкубатора, а не через прокладку в двери. Это может быть сделано в асептическом способом, окружив концы комплектов труб с алюминиевой фольгой перед автоклавированием (этап 3), и ждет, чтобы прикрепить биореактора сторону секций подачи и отходов труб до тех пор, биореактор не находится внутри инкубатора. Линии трубку можно поставить на место, а алюминиевая фольга может быть удалена внутри инкубатора и быстро крепится к биореакторе.
    2. Выполнить оставшиеся концы трубок наборов (те, которые не подключены к крышке биореактора) через порт доступа инкубатор (сквозная), либо через прорезь в инкубаторе уплотнителя дверцы.
    3. Вне инкубатора (в соседнем кабинете биологической безопасности, если это возможно), быстро подключить линию подачи к свежей среде резервуара, а линия отходов в резервуар среды отходов, а также обеспечить, чтобы резервуар отходов вентилируется со стерильным фильтром. Примечание: Для того, чтобы сделать это в асептической образом, удалить алюминиевую фольгу из насосно-компрессорных труб и соединителей судов и подключить к соответствующим судам как можно быстрее (особенно, если это соединение должно быть сделано за пределами кабинета биологической безопасности).
    4. Положите свежую среду резервуар (заполненный желаемой средой подачи) внутри соседнего мини-холодильник. Проверьте, чтобы убедиться, что корма и отходы линии способны выйти из инкубатора и войти в холодильник, не мешая двери на каждом из закрытия. Также важно, чтобы подача лИнес не были зажаты закрыты двери либо холодильника или в инкубаторе.
      Примечание: Среда, используемая для этих исследований был стандартным с высоким содержанием глюкозы (500 мг / дл), культуральная среда рекомендованные производителем для этого типа клеток. Любая высокая средняя глюкоза может быть использована на основе конкретных потребностей типа клеток культивируются. Концентрация глюкозы в питательной среде, должна быть достаточно выше (2x или более), чем желаемая концентрация в культуре, как система подачи опирается на повышение скорости подачи высокой среде глюкозы для поддержания необходимого уровня глюкозы в культурах, сохраняя при этом приемлемые скорости подачи ,
    5. Затем среда отходов резервуар можно поставить на скамье вне инкубатора в удобном месте.
    6. Затем поместите "секция насоса" подающих и отходов линий в головку насоса, обеспечивающего надлежащую ориентацию так, чтобы питающие линии будут перекачивать среды из свежей среды резервуара в SSB, а линии отходовбудет качать среду из SSB и к среде отходов резервуара.
  4. Включите насос на требуемой скорости подачи.
    1. Вычислить скорость подачи с помощью уравнения скорректированной скорости подачи , описанных в литературе 3 и в соответствующем разделе репрезентативные результаты ниже.
    2. Используйте самую последнюю информацию подсчета клеток (процедура описана в пункте 5), наряду с прогнозом роста, а также измерения глюкозы средних для оценки скорости подачи, необходимой для поддержания нужной концентрации глюкозы в культуре.
      Примечание: Темпы роста клеток и глюкозы нормы потребления должны быть получены до выполнения этих процедур.
    3. Установить скорость насоса на основе расчетной скорости подачи.
  5. Повторите вычисление скорости подачи и регулировки скорости насоса для каждой точки отбора проб (каждые три дня описанного метода).

6. Количество клеток, Жизнеспособность и глюкозы измерений концентрации

<ол>
  • Сбор образцов из каждой биореактор каждые три дня, или по желанию.
  • Отбирают образцы культуры из непрерывно подают культур SSB с использованием специализированного порта выборки, описанной выше.
    1. Оставив непрерывно подают SSB внутри биореактора, приложите стерильный шприц (5 мл объема шприц использовался для этих исследований), чтобы отменить его фильтрованное соединения порта выборки.
    2. Переместить пробоотборную трубку вниз в культуральную среду.
    3. Освободить раздел трубку, идущую к шприцу, и вывести требуемый общий объем выборки.
    4. Передвигайте выборки трубки таким образом, чтобы он больше не погружен в культуру, и продолжают снимать шприц, пока воздух не будет удален.
    5. Зажмите трубку, которая питает шприц, и отсоединить шприц, содержащий образец, и отложить в сторону.
    6. Предзагрузить второй свежий стерильный шприц с воздухом, и прикрепить к стерильную фильтровальную стороне порта для отбора проб.
    7. Освободить в трубку, идущую в сторону шприц-фильтрапорт отбора проб, а затем продуть отверстие для взятия проб, осторожно вытесняя воздух в шприц через стерильный фильтр. Это гарантирует, что порт выборки будет ясно из любой остаточной среды.
    8. Повторно зажать трубку, идущую к фильтру, отсоедините стерильный шприц и выбросьте его.
  • Возьмите шприц, содержащий образец клеток из культуры, и выталкивать его в 10 мл пробирку. Подвыборках известных объемов могут быть взяты непосредственно из этой трубки.
  • Для подсчета клеток, удалить известный объем клеток и переносят в микро-центрифужную пробирку и осторожно центрифугировать в течение 1 - 2 мин (приблизительно 50 х гравитации).
  • Передача супернатант в отдельную пробирку для определения уровня глюкозы в, и повторно приостанавливать осадок с таким же объемом трипсин-ЭДТА раствором (0,25% (вес / об) трипсин, 0,53 мМ ЭДТА), и рассчитывать в трех экземплярах с использованием стандартного гемоцитометра с окрашивания трипановым синим , как описано в литературе 53.
    1. Добавить среду (с сывороткой) вобразец для разбавления по мере необходимости.
    2. Граф клеток, и рассчитать жизнеспособность клеток путем записи в реальном времени (неокрашенных) клеток, и мертвые (тонированный) клетки независимо друг от друга (жизнеспособность% = живые клетки / общее количество клеток).
  • Измерение среднего уровня глюкозы в трех экземплярах с помощью глюкометра и для однократного применения тест-полосок.
    1. Возьмите глюкозы измерения, как описано в инструкции глюкозы метр, замещающих культуральной среды для крови.
    2. Опустите тест-полоску в среде тестируемой (собранной из образцов количества выше), и повторить для требуемого количества повторов (рекомендуется три повторности).
    3. Проверьте как свежую среду и среду для отходов концентрации глюкозы.
      Примечание: Для некоторых метров, измерения ниже, чем 20 мг / дл (обнаруживаемый порог счетчика), можно наблюдать, как ошибка в выходном сигнале счетчика.

    • 7. сфероида Измерения Скорость отстаивания

    1. Для того, чтобы гарантировать, что CELл кластеры не удаляются с помощью системы непрерывной подачи, измеряют скорость осаждения бета-ТС6 сфероидов путем наблюдения за их оседание в большом пластиковом диаметра пипетки.
    2. Культура бета-TC6 клетки в ОБП биореакторах с образованием сфероидов, как описано выше.
    3. После 3-х дней культивирования, принимать по 30 мл пробы сфероида суспензии, и место в 50 мл трубки.
    4. Аккуратно пипеткой вверх и вниз , используя широкий диаметр 25 мл пипетки равномерно распределить в виде суспензии, а затем прекратить пипетирования с подвеской на известном уровне в пипетку (например, 20 мл марка), а затем записать время для всех сфероидов в оседать на 5 см.
    5. Повторите эту процедуру достаточное количество раз, чтобы достичь статистической достоверности (обычно п> 3).
      Примечание: Для биологических исследований, значение ар меньше, чем 0,05 считается статистически значимым при сравнении результатов измерений. Стандартная ошибка среднего значения использовали для сообщения об ошибках, а также два хвостами не-тест в паре студент-тиспользовали для сравнения условий для представленных данных.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Representative Results

    Средние уровни глюкозы и Флуктуации Ограничить клеток Расширение в стандартных ОБП культур

    Уровни глюкозы колеблются в статических культурах и ОБП культур в течение всего периода культивирования 3. Эти колебания усиливаются с увеличением числа клеток в течение периода культивирования 21-дневного и были почти идентичны в обоих статических и ОБП культур. Эти наблюдения представлены в нашей предыдущей публикации 3. Уровни глюкозы могут быть супер-физиологическое в течение продолжительности периода культивирования для обоих методов. Поскольку это хроническое воздействие может подавлять рост клеток 54, непрерывная система подачи была разработана с целью устранения колебаний глюкозы и улучшить питательный контроль во время сфероида культуры.

    Система непрерывной подачи для сфероида культуры

    Непрерывно добавление свежей среды и удаление старой среды на протяжении всего периода культивированияможет быть достигнуто с помощью простой системы среднего пополнения. Система , описанная в способе 2 , и показано на фиг.1 , используется насос и трубки установлен на непрерывно пополнять среду и отдельный отток трубки , чтобы непрерывно удалять среды, предотвращая удаление сфероидов из культуры. Среда на входе был на противоположной стороне реактора, чтобы свести к минимуму любую возможность вмешательства в правильной функции OT, и, чтобы обеспечить тщательное смешивание. Свежую среду (с высоким содержанием глюкозы, 450 мг / дл) выдерживали при температуре холодильника, чтобы обеспечить долгосрочную стабильность и непрерывно добавляли к культуре через среду входное отверстие с полной скоростью замены среды каждые три дня для пополнения питательных веществ. Эта система ограничивает манипуляции и вмешательства , необходимые в течение периода культивирования путем замены ручного периодического способа замены среды с непрерывным процессом 3,22,23. Холодная среда вошла в биореактор в небольших объемах над тиме (0,046 мл / мин) по отношению к общему объему культуры (200 мл), что дает каждому "падение" добавленной среднего времени для уравновешивания температуры с окружающей культуральной среды, которая была при 37 ° С. Это гарантировало, что добавленное холодная среда не снижало общую температуру культуры поддерживали в инкубаторе. Перемешивание культуральной среды также увеличена эффективность теплопередачи, а также улучшение однородности температуры в этих культурах. Поддержание температуры может быть проблемой, если очень высокие скорости подачи были использованы с небольшими объемами культуры, но эти маловероятные условия не были испытаны для этих исследований. Объем культуры поддерживалась на постоянном уровне в системе непрерывной подачи, гарантируя, что средняя скорость удаления средней была равна скорости подачи. Система, используемая для этих исследований на самом деле удалены среды при более высокой скорости потока, чем скорость подачи, так как секция удаления тюбинга большего диаметра трубки для секции насоса. Несмотря на более быстрый RemoВэл скорость, объем культуры поддерживали путем регулирования уровня оттока трубки внутри реактора до желаемого уровня объема культуры. Непрерывно добавления свежей среды к ОБП привело к небольшому увеличению среднего уровня в реакторе, и, когда среда достигла уровня ВЗ, среду удаляют из реактора с более высокой скоростью. Среду удаляли через пористое стекло ВЗ, оставляя сфероидов клеток в культуре до тех пор, пока средний уровень упал ниже нижней части OT. Эта система избегали сложность использования потока и объема датчиков разреженные для управления скоростью насоса, и является стандартом для использования с аппаратом 47,48 культуры , основанной многие SSB. ВЗ был разработан, чтобы гарантировать, что сфероиды не были удалены из культуры через схему удаления, а размер пор и плотность в спеченного стекла трубки были достаточно большими (40% и 40 - 60 мкм соответственно), чтобы гарантировать, что скорость линейного потока было меньше, чем скорость осаждения сфероидов насред для этих исследований культуры. Линейный поток был рассчитан , как описано подробно 3. Рассчитывали средняя линейная скорость среды через поры в ВЗ 0,17 см / мин, и это было намного медленнее, чем самый медленный скорости оседания наблюдаемый сфероида. Измеряли средняя скорость осаждения, как описано в способе 7 и 2,53 ± 0,26 см / мин для сфероидов, используемых в этих исследованиях. Наблюдались сфероиды увеличиваться в размерах, как культура прогрессирует, и эти более крупные сфероиды обосновались быстрее из-за их повышенной отношения массы сопротивления, что еще больше снижало возможность удаления через OT. Некоторые сфероиды оказались в ловушке в нижних поры на внешних краях ВЗ, но это было в основном за счет механического столкновения, когда отток трубки окунается в перемешиваемой среде. Это не помешало надлежащего функционирования ВЗ, и не способствуют потере измеряемой сфероидов в культурах тестируемых. OT для этих исследований был очищен после каждого исследования, (деионизированной воды флеш), и заменить после использования в течение двух исследований культуры, чтобы избежать риска снижения функции. OT может быть заменен после каждого исследования, если наблюдаются сфероиды закупоривать поры во время конкретного исследования (это не наблюдалось в данной работе). Из-за циклического удаления среды с использованием этого метода, объем культуральную среду колебались на целых 6%. Колебания были вызваны поверхностное натяжение среды, что позволило OT удалить немного больше среды после того, как средний уровень средний упал ниже нижней части OT.

    Устранение NUTRIENT флуктуациями Улучшение роста клеток в ОБП культур

    Непрерывно замены среды в ОБП культур с использованием системы, описанной выше, повышение урожайности культуры в течение периода культивирования 21-день, когда по сравнению со стандартными культурами ОБП. Скорость подачи поддерживалась постоянной в течение всего периода культивирования со скоростью, которая заменила всю культуру VOLUменя каждые три дня, чтобы быть сопоставимы с пакетными вскармливании культур SSB. Устранение питательных колебаний привело к увеличению урожайности клеток (рисунок 3) , несмотря на высокую концентрацию глюкозы 3. Сфероид размер также измеряли в конце периода культивирования 2D - микроскопических исследований (стандартной световой микроскопии описана в литературе 3), и сфероиды в CF-ОБП культур были значительно больше (р <0,02, студент-т тест) , что в статической или стандартные культуры SSB , как сообщалось в литературе 3. Эти наблюдения подтверждают данные клеточного подсчета, предполагающие более высокие темпы роста в CF-ОБП культур в то время как жизнеспособность поддерживается на том же высоком уровне (96,23 ± 0,85%), независимо от условий культивирования. Непрерывно подается SSB (CF-SSB) система культуры ликвидировали колебания питательных веществ в шаровидных культур, а также улучшение темпов роста клеток, но уровни глюкозы оставались супер-физиологические, которые, возможно, предотвратила еще более имп rovement в расширении клеток (рисунок 2). Для дальнейшего улучшения по системе культуры CF-ОБП, алгоритм был использован для регулировки скорости подачи в течение периода культивирования с целью улучшения контроля уровня глюкозы в ОБП культурах.

    Расчет скорректированной скорости подачи

    Несколько факторов могут быть рассмотрены для расчета скорости подачи, чтобы поддерживать постоянный уровень глюкозы. Специфические факторы интерес, могут быть изменены для данного исследования и для конкретной клеточной линии. Для целей этой демонстрации, мы рассмотрели темпы роста и потребления глюкозы определяется из предыдущих культур, а также фактические уровни глюкозы во время регулировки 3. регулировки скорости подачи могут быть выполнены в любом интервале времени. Для этой демонстрации, образцы собирали, а скорость подачи регулировали каждые три дня на основании последовательных вычислений, описанных следующим образом.

    т "> Расчет прогнозируемого коэффициента роста

    Уравнение 1 прогнозирует рост клеток в течение определенного периода культуры, с прогнозируемым количеством клеток (N 2) , представляющую ожидаемую общее количество клеток в культуре в какой - то момент в будущем. Этот метод использует линейную аппроксимацию скорости роста , где текущий подсчет клеток (N 1), добавляют к оценочному скорости роста клеток в культурах сфероидов (R г) , умноженное на период культивирования (т 2 -t 1).

    Уравнение 1 (1)

    Рассчитано Baseline Скорость подачи

    Скорость базовой линии подачи (R F) рассчитывали , используя уравнение 2 путем оценки уровня глюкозы , потребляемой в культуре в течение периода культивирования (числитель) и разделив его на концентрацию глюкозы в питательной среде (C F 1) по средневзвешенным N 1 и N 2 из уравнения 1. Это норма потребления затем делили на концентрацию глюкозы (C F) в питательной среде для расчета средней средней скоростью подачи, необходимого для замены глюкозы, потребляемой в течение того же периода культивирования.

    Уравнение 2 (2)

    Регулировка скорости подачи с наблюдаемыми уровни глюкозы

    Дальнейшие корректировки были сделаны ставки базовой линии подачи для размещения измеренных уровней глюкозы (C 1) в выбранной точке времени , используя уравнение 3. Это глюкоза скорректированные скорости подачи (GAFR) могут быть использованы для поддержания уровня , когда неожиданные изменения в росте или смерти происходят в культуре. Это equatio N включен постоянный контроль (X), а значение 0.5 использовалась для этих данных 3 -х . С 1 представляет собой концентрацию глюкозы , измеренного в культуральной среде в день пробы, и С D представляет собой концентрацию глюкозы в среднюю мишень. Окончательное значение корректирует предсказанную скорость подачи из второго расчета.

    Уравнение 3 (3)

    Рисунок 1
    Рисунок 1: Непрерывная подача Схема системы с оттоком Tube. (А) Схема демонстрируемой системы. (В) из спеченного стекла фильтр помещают на выпускной трубе , чтобы среда , чтобы удалить из культуры без потери клеток. Рисунок воспроизведено с разрешения. 3

    /files/ftp_upload/52224/52224fig2.jpg "/>
    Рис . 2: Глюкоза Измерения для SSB, CF-SSB и скорректированной культур CF-SSB (А) Средние измерения уровня глюкозы из бета-ТС6 сфероида культур с использованием статических, методов культуры SSB, и CF-SSB и кормящим со стандартной среде с высоким содержанием глюкозы. Непрерывная подача способна устранить колебания глюкозы, но средний уровень глюкозы в среде изменения резко в течение периода культивирования, и намного выше физиологического диапазона (обозначается серой полосой). Скорректированная подача способна устранить колебания, а также поддерживать концентрацию глюкозы вблизи физиологических уровней в течение продолжительности периода культивирования. Усы для глюкозы измерений слишком малы, чтобы быть видимыми на шкале, показанной (Стандартная ошибка ≤ 4% для всех измерений). Данные из фигур представлена в предыдущей публикации с разрешением. 3


    Рисунок 3: Количество клеток от SSB, CF-SSB и Скорректированная CF-SSB Культуры с Growth Скорректированная Кормовые темпы роста Cell сообщили в кратном изменении числа клеток в течение 21-дневного периода культивирования по сравнению SSB с регулярными среды изменяется от постоянной скорости подачи. SSB культуры и скорректированная скорость подачи SSB культуры. Усы сообщить стандартную ошибку среднего значения, и р-величины являются для статистического теста ун-парные с двумя хвостами студент-т. Воспроизводится с разрешения. 3

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Discussion

    Генерирующее клеток млекопитающих для производства биологических агентов и для клеточной терапии требует культуры и мониторинга клеток млекопитающих в больших масштабах 55 - 58. Кроме того, эти приложения требуют определенных и обоснованных условий культивирования. Простое увеличение объема клеток с использованием научно-исследовательских технологий не будет отвечать всем этим требованиям. Ручные изменения средних вызывающие колебания питательных веществ и накоплению продуктов жизнедеятельности клеток снижения качества, жизнеспособность и урожайность. Использование биореакторов хорошо установлена ​​для коммерческой культуры микроорганизмов для биофармацевтических применений, и подобные стратегии были применены к культурам клеток млекопитающих. Сложное взаимодействие клеток млекопитающих с окружающей их средой требует определенных изменений для регулирования уровня питательных веществ в целях оптимизации потенциала расширения клеток.

    Для решения этих проблем, мы разработали straightforward метод для поддержания уровня глюкозы в конкретной целевой диапазон, аппроксимирующих физиологические уровни в перемешиваемой суспензии биореакторе с механизмом подачи перфузионной регулируемой скоростью. Для достижения этой цели, сфероиды бета-клеточной линии генерировались в перемешанной суспензии биореакторе. Система перфузионного кормления использовали, чтобы обеспечить непрерывный механизм подачи для замены стандартных процедур периодического кормления. наблюдались темпы роста клеток, а также используются для прогнозирования приблизительные цены используют глюкозу. Фактические уровни глюкозы также измеряли с течением времени в культуре, чтобы регулировать скорость подачи в ответ на фактические питательных веществ, потребляемых и продуктов обмена веществ, депонированных в среде клетками. Этот метод предотвратить колебания уровня глюкозы видели с другими статическими и ОБП систем 3 , где резко колебались уровни глюкозы со средними изменениями каждые 3 дня. Использование стратегии периодического кормления, концентрации глюкозы упал в максимально 275 мг / дл в течение трех дней, на поздней стадииs в расширении 21-дневного. Эти колебания уровня глюкозы ограничены выхода клеток.

    Вычисление скорости средней заменой для демонстрации скорректированной системы питания включены установленную скорость роста и глюкозы нормы потребления для клеточной линии, а также наблюдаемым (измеряемым) плотности культуры и уровней глюкозы при каждом кормлении временной точке. Для разных типов клеток, или для более сложных систем для культивирования тканей, эти предположения не верны. Для обеспечения более точного контроля уровня глюкозы, алгоритм включает также систему управления с обратной связью для учета изменчивости отдельных культур. Ограничения метода перфузионной на основе скорости роста в одиночку, в том числе влияния гетерогенности утилизации глюкозы для клеток по всему сфероидов и изменений в потреблении глюкозы на основе таких параметров, как дифференциации стволовых клеток, могут быть смягчены с помощью системы управления с обратной связью. В зависимости от применения, клетки, которые демонстрируют exponential темпы роста или более сложные профили роста могут быть реализованы для улучшения работы алгоритма. Предположения и значения, используемые для расчета скорости подачи может быть изменена, чтобы придерживаться реальных условий культивирования.

    Представленные способы предназначены для производства клеток для терапевтического применения, в которых расширение и культура сфероидов было бы для конечной длительности, а сами клетки являются продуктом .. Может быть желательно для некоторых исследователей к непрерывно расширяться или культуры клеток с использованием подобный метод, но это бы представить другие проблемы, с которыми сталкиваются не для этих исследований. Если культивировали в течение длительных периодов времени, сфероиды будет продолжать расти в размерах, и жизнеспособность некоторых клеток в ядре сфероида может пострадать из-за увеличения питательных веществ и диффузии кислорода ограничений. Эти культуры могут потребоваться дальнейшие манипуляции диссоциировать больших сфероидов, чтобы предотвратить это ограничение при длительных культур желательны.Нет снижение жизнеспособности не наблюдалось для сфероидов, полученных с этим протоколом, предполагая, что не было достигнуто этот предел в течение 21-дневного периода культивирования данного исследования.

    Для клеточной терапии, эти методы могут быть использованы в сочетании с дополнительными системами регулирования для повышения выхода клеток, функции и жизнеспособность. Например, метод ОБП может сочетаться с содействием технологий, включая микро-носителя поверхностных культур для адгезивных клеток, чтобы улучшить скорости роста клеток, или инкапсулирование клеток или сфероидов. Кроме того, алгоритмы более сложные регулировки могут быть реализованы, чтобы обеспечить более жесткий контроль культуры. Кормление регулировка может быть в сочетании с контролем нескольких других параметров, таких как рН, концентрации растворенного кислорода, температуры и инжекции реагентов к дальнейшему совершенствованию 59,60. Для улучшения результатов в других приложениях, этот метод может быть автоматизирован 15,24, а скорость подачи может быть вычислено мруда или реже, дальнейшие условия переработки культуры.

    Производственные процессы 61 - 63 должны быть определены и тщательно контролировать , чтобы сделать воспроизводимых биологических продуктов. Использование сплошной среды замены могут быть использованы для смягчения колебаний в критических питательных веществ, наблюдаемые в большом масштабе производства клеток, и включающий регулируемую систему подачи может реализовать еще больший контроль на окружающую среду клеток, для поддержания желаемого уровня питательных веществ. Описанный способ может быть использован с другими клетками млекопитающих для обеих клеточных и фармацевтических продуктов.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    β TC-6 Cells ATCC, Manassas, VA CRL-11506 Mouse Insulinoma cell line (adherent cell type)
    DPBS No Ca, No Mg Invitrogen, Carlsbad, CA 14190-144 https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/14190144?ICID=search-14190144
    Dulbecco's Modified Eagles Medium Invitrogen, Carlsbad, CA See below for product numbers 
    DMEM High Glucose (500 mM) Invitrogen, Carlsbad, CA 11965-092 http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/11965092
    DMEM Low Glucose (100 mM) Invitrogen, Carlsbad, CA 11885-084 http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/11885084 (note that this medium already contains pyruvate)
    L-glutamine Invitrogen, Carlsbad, CA 25030081 http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/25030081?ICID=search-product
    Sodium Pyruvate Invitrogen, Carlsbad, CA 11360070 https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/11360070?ICID=search-product
    Heat Inactivated Porcine Serum Gibco - Life Technologies 10082147 http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/10082147
    Trypsin-EDTA Invitrogen, Carlsbad, CA 25200056 https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/25200056?ICID=search-product
    T-150 Tissue Culture Treated Flasks Corning, Corning, NY 430825 http://catalog2.corning.com/LifeSciences/en-US/Shopping/ProductDetails.aspx?productid=430825(Lifesciences)
    &categoryname=
    NuAire Cell culture incubator Princeton, MN US Autoflow. Any water-jacketed CO2 regulating cell culture incubator could be used.
    Centrifuge Sorvall RT 7 (Any similar benchtop centrifuge may be used)
    Refrigerator Any laboratory refrigerator could be used (a small table-top version was used for these studies)
    1 L Glass Bottle Corning, Corning, NY 1395-1L Any vendor could be used. http://catalog2.corning.com/LifeSciences/en-US/Shopping/ProductDetails.aspx?productid=1395-1L(Lifesciences)
    &categoryname=
    2 L Glass Bottle Corning, Corning, NY 1395-2L Any vendor could be used
    250 ml stirred bioreactors  Corning, Corning, NY 4500-250 http://catalog2.corning.com/LifeSciences/en-US/Shopping/ProductDetails.aspx?productid=4500-250(Lifesciences)
    &categoryname=
    Stir Plate Fisher Scientific 11-496-104A Any incubator safe stir-plate can be used, any vendor
    Tissue Culture Dishes 100 mm Diameter Nunc, Rochester, NY (Fisher Scientific) 1256598  Any vendor could be used (ordered through Fisher Sci)
    FALCON 50 ml Conical Tubes Falcon, San Jose, CA 1256598 Any vendor could be used
    Delran Plastic Used for Custom Parts McMaster Carr Various Any material of choice could be used, but Deran is chosen because it is autoclave safe, non-reactive, and easy to machine. http://www.mcmaster.com/#acetal-homopolymer-sheets/=rjrcac
    Stainless Steel Pipe for custom lids McMaster Carr Various Any vendor could be used. http://www.mcmaster.com/#standard-stainless-steel-tubing/=rjrd91
    Custom Modified Delran Bioreactor Lids for Continuous Feeding Custom made Not aware of any vendors producing a similar product
    Custom Modified Glass Bottle Lids for Continuous feeding Custom made Some vendors (e.g., Fischer Sci, Corning) make similar products in the links below.
    Masterflex Digital Peristaltic Pump Cole Parmer, Vernon Hills, IL EW-77919-25 Any precision peristaltic pump could be used. http://www.coleparmer.com/Product/L_S_Eight_Channel_Four_Roller_
    Cartridge_Pump_System_115_230
    _VAC/EW-77919-25
    PVDF Tubing Connectors (various) Cole Parmer, Vernon Hills, IL see link Any vendor could be used. http://www.coleparmer.com/Category/Cole_Parmer_PVDF_Premium
    _Luer_Fittings/55889
    Pharmed BPT Tubing L/S 16 Cole Parmer, Vernon Hills, IL WU-06508-16 Any vendor could be used. http://www.coleparmer.com/Product/Masterflex_PharMed_BPT_Tubing
    _L_S_13_25/WU-06508-16
    Pharmed BPT Tubing L/S 14 Cole Parmer, Vernon Hills, IL WU-06508-14 Any vendor could be used. http://www.coleparmer.com/Product/Masterflex_PharMed_BPT_Tubing
    _L_S_13_25/WU-06508-14
    Pharmed BPT Tubing L/S 13 Cole Parmer, Vernon Hills, IL WU-06508-13 Any vendor could be used. http://www.coleparmer.com/Product/Masterflex_PharMed_BPT_Tubing
    _L_S_13_25/WU-06508-13
    Millipore Millex GP PES membrane 0.22 µl sterile syringe filter (used for venting, and medium filtration) Fisher Scientific SLGP033RS Any vendor could be used
    25 ml Graduated Pipette Fisher Scientific 13-678-11 Any vendor could be used, and various sizes may be used
    Pipetter Fisher Scientific 13-681-15E Any vendor, or similar product could be used
    Hemocytometer Fisher Scientific 02-671-6 Any vendor, or similar product could be used
    Trypan Blue Gibco - Life Technologies 15250-061 Any vendor, or similar product could be used. https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/15250061
    Inverted Light Microscope Leica Any vendor, or similar product could be used
    One Touch Ultra Blood Glucose Meter Fisher Scientific 22-029-293 Any vendor, or similar product could be used (e.g., Bayer)
    One Touch Ultra-Strips Fisher Scientific 22-029-292  Any vendor, or similar product could be used (e.g., Bayer)

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Reuveny, S., Velez, D., Macmillan, J. D., Miller, L. Factors affecting cell growth and monoclonal antibody production in stirred reactors. J. Immunol. Methods. 86 (1), 53-59 (1986).
    2. Tarleton, R. L., Beyer, A. M. Medium-scale production and purification of monoclonal antibodies in protein-free medium. Biotechniques. 11 (5), 590-593 (1991).
    3. Weegman, B. P., et al. Nutrient regulation by continuous feeding removes limitations on cell yield in the large-scale expansion of Mammalian cell spheroids. PLoS One. 8 (10), e76611 (2013).
    4. Klueh, U., et al. Continuous glucose monitoring in normal mice and mice with prediabetes and diabetes. Diabetes Technol. Ther. 8 (3), 402-412 (2006).
    5. Hay, R. J. Operator-induced contamination in cell culture systems. Dev. Biol. Stand. 75, 193-204 (1991).
    6. Dazey, B., Duchez, P., Letellier, C., Vezon, G., Ivanovic, Z. Cord blood processing by using a standard manual technique and automated closed system "Sepax" (Kit CS-530). Stem Cells Dev. 14 (1), 6-10 (2005).
    7. Gastens, M. H., et al. Good manufacturing practice-compliant expansion of marrow-derived stem and progenitor cells for cell therapy. Cell Transplant. 16 (7), 685-696 (2007).
    8. Naing, M. W., Williams, D. J. Three-dimensional culture and bioreactors for cellular therapies. Cytotherapy. 13 (4), 391-399 (2011).
    9. Stacey, G. N. Cell culture contamination. Cancer Cell Culture. , Methods Mol Biol; 731. Humana Press. Totowa, NJ. 79-91 (2011).
    10. Zur Nieden, I. N., Cormier, J. T., Rancourt, D. E., Kallos, M. S. Embryonic stem cells remain highly pluripotent following long term expansion as aggregates in suspension bioreactors. J. Biotechnol. 129 (3), 421-432 (2007).
    11. Kehoe, D. E., Jing, D., Lock, L. T., Tzanakakis, E. S. Scalable stirred-suspension bioreactor culture of human pluripotent stem cells. Tissue Eng. Part A. 16 (2), 405-421 (2010).
    12. Krawetz, R., et al. Large-scale expansion of pluripotent human embryonic stem cells in stirred-suspension bioreactors. Tissue Eng. Part C. Methods. 16 (4), 573-582 (2010).
    13. Shafa, M., et al. Expansion and long-term maintenance of induced pluripotent stem cells in stirred suspension bioreactors. J. Tissue Eng. Regen. Med. 6 (6), 462-472 (2012).
    14. Oh, S. K. W., et al. Long-term microcarrier suspension cultures of human embryonic stem cells. Stem Cell Res. 2 (3), 219-230 (2009).
    15. Olmer, R., et al. Suspension culture of human pluripotent stem cells in controlled, stirred bioreactors. Tissue Eng. Part C. Methods. 18 (10), 772-784 (2012).
    16. Baptista, R. P., Da Fluri,, Zandstra, P. W. High density continuous production of murine pluripotent cells in an acoustic perfused bioreactor at different oxygen concentrations. Biotechnol. Bioeng. 110 (2), 648-655 (2013).
    17. Papas, K. K. Characterization of the metabolic and secretory behavior of suspended free and entrapped ART-20 spheroids in fed-batch and perfusion cultures [dissertation]. , Georgia Institute of Technology. Atlanta, GA. (1992).
    18. Papas, K. K., Constantinidis, I., Sambanis, A. Cultivation of recombinant, insulin-secreting AtT-20 cells as free and entrapped spheroids. Cytotechnology. 13 (1), 1-12 (1993).
    19. Sambanis, A., Papas, K. K., Flanders, P. C., Long, R. C., Kang, H., Constantinidis, I. Towards the development of a bioartificial pancreas: immunoisolation and NMR monitoring of mouse insulinomas. Cytotechnology. 15 (1-3), 351-363 (1994).
    20. Sharma, S., Raju, R., Sui, S., Hu, W. -S. Stem cell culture engineering - process scale up and beyond. Biotechnol. J. 6 (11), 1317-1329 (2011).
    21. Papas, K. K., Long, R. C., Constantinidis, I., Sambanis, A. Role of ATP and Pi in the mechanism of insulin secretion in the mouse insulinoma betaTC3 cell line. Biochem. J. 326 (Pt 3), 807-814 (1997).
    22. Papas, K. K., Long, R. C., Sambanis, A., Constantinidis, I. Development of a bioartificial pancreas: I. long-term propagation and basal and induced secretion from entrapped betaTC3 cell cultures. Biotechnol. Bioeng. 66 (4), 219-230 (1999).
    23. Papas, K. K., Long, R. C., Sambanis, A., Constantinidis, I. Development of a bioartificial pancreas: II. Effects of oxygen on long-term entrapped betaTC3 cell cultures. Biotechnol. Bioeng. 66 (4), 231-237 (1999).
    24. Hu, W. S. Cell culture process monitoring and control-a key to process optimization. Cytotechnology. 14 (3), 155-156 (1994).
    25. Alfred, R., et al. Efficient suspension bioreactor expansion of murine embryonic stem cells on microcarriers in serum-free medium. Biotechnol. Prog. 27 (3), 811-823 (2011).
    26. Cormier, J. T., zur Nieden, N. I., Rancourt, D. E., Kallos, M. S. Expansion of undifferentiated murine embryonic stem cells as aggregates in suspension culture bioreactors. Tissue Eng. 12 (11), 3233-3245 (2006).
    27. Dang, S. M., Zandstra, P. W. Scalable production of embryonic stem cell-derived cells. Methods Mol. Biol. 290 (1), 353-364 (2005).
    28. Elseberg, C. L., et al. Microcarrier-based expansion process for hMSCs with high vitality and undifferentiated characteristics. Int. J. Artif. Organs. 35 (2), 93-107 (2012).
    29. Kallos, M. S., Behie, L. A. Inoculation and growth conditions for high-cell-density expansion of mammalian neural stem cells in suspension bioreactors. Biotechnol. Bioeng. 63 (4), 473-483 (1999).
    30. Kehoe, D. E., Lock, L. T., Parikh, A., Tzanakakis, E. S. Propagation of embryonic stem cells in stirred suspension without serum. Biotechnol. Prog. 24 (6), 1342-1352 (2008).
    31. Kirouac, D. C., Zandstra, P. W. The systematic production of cells for cell therapies. Cell Stem Cell. 3 (4), 369-381 (2008).
    32. Serra, M., et al. Stirred bioreactors for the expansion of adult pancreatic stem cells. Ann. Anat. 191 (1), 104-115 (2009).
    33. Chawla, M., Bodnar, C. A., Sen, A., Kallos, M. S., Behie, L. A. Production of islet-like structures from neonatal porcine pancreatic tissue in suspension bioreactors. Biotechnol. Prog. 22 (2), 561-567 (2006).
    34. Weegman, B. P., et al. Temperature profiles of different cooling methods in porcine pancreas procurement. Xenotransplantation. , (2014).
    35. Cruz, H. J., Moreira, J. L., Carrondo, M. J. Metabolic shifts by nutrient manipulation in continuous cultures of BHK cells. Biotechnol. Bioeng. 66 (2), 104-113 (1999).
    36. Dowd, J. E., Jubb, A., Kwok, K. E., Piret, J. M. Optimization and control of perfusion cultures using a viable cell probe and cell specific perfusion rates. Cytotechnology. 42 (1), 35-45 (2003).
    37. Goudar, C., Biener, R., Zhang, C., Michaels, J., Piret, J., Konstantinov, K. Towards industrial application of quasi real-time metabolic flux analysis for mammalian cell culture. Cell Culture Engineering. 101, Adv. Biochem. Eng. Biotechnol; 101. Springer Berlin Heidelberg. Berlin, Heidelberg. 99-118 (2006).
    38. Hu, W. S., Piret, J. M. Mammalian cell culture processes. Curr. Opin. Biotechnol. 3 (2), 110-114 (1992).
    39. Knaack, D., et al. Clonal insulinoma cell line that stably maintains correct glucose responsiveness. Diabetes. 43 (12), 1413-1417 (1994).
    40. Poitout, V., Stout, L. E., Armstrong, M. B., Walseth, T. F., Sorenson, R. L., Robertson, R. P. Morphological and functional characterization of beta TC-6 cells--an insulin-secreting cell line derived from transgenic mice. Diabetes. 44 (3), 306-313 (1995).
    41. Poitout, V., Olson, L. K., Robertson, R. P. Insulin-secreting cell lines: classification, characteristics and potential applications. Diabetes Metab. 22 (1), 7-14 (1996).
    42. Suzuki, R., et al. Cyotomedical therapy for insulinopenic diabetes using microencapsulated pancreatic beta cell lines. Life Sci. 71 (15), 1717-1729 (2002).
    43. Skelin, M., Rupnik, M., Cencic, A. Pancreatic beta cell lines and their applications in diabetes mellitus research. ALTEX. 27 (2), 105-113 (2010).
    44. Masters, J. R., Stacey, G. N. Changing medium and passaging cell lines. Nat. Protoc. 2 (9), 2276-2284 (2007).
    45. Murdoch, T. B., McGhee-Wilson, D., Shapiro, A. M. J., Lakey, J. R. T. Methods of human islet culture for transplantation. Cell Transplant. 13 (6), 605-617 (2004).
    46. Woodside, S. M., Bowen, B. D., Piret, J. M. Mammalian cell retention devices for stirred perfusion bioreactors. Cytotechnology. 28 (1-3), 163-175 (1998).
    47. Serra, M., et al. Improving expansion of pluripotent human embryonic stem cells in perfused bioreactors through oxygen control. J. Biotechnol. 148 (4), 208-215 (2010).
    48. Gálvez, J., Lecina, M., Solà, C., Cairó, J., Gòdia, F. Optimization of HEK-293S cell cultures for the production of adenoviral vectors in bioreactors using on-line OUR measurements. J. Biotechnol. 157 (1), 214-222 (2012).
    49. Trabelsi, K., Majoul, S., Rourou, S., Kallel, H. Development of a measles vaccine production process in MRC-5 cells grown on Cytodex1 microcarriers and in a stirred bioreactor. Appl. Microbiol. Biotechnol. 93 (3), 1031-1040 (2012).
    50. Liu, H., et al. A high-yield and scaleable adenovirus vector production process based on high density perfusion culture of HEK 293 cells as suspended aggregates. J. Biosci. Bioeng. 107 (5), 524-529 (2009).
    51. Zhi, Z., Liu, B., Jones, P. M., Pickup, J. C. Polysaccharide multilayer nanoencapsulation of insulin-producing beta-cells grown as pseudoislets for potential cellular delivery of insulin. Biomacromolecules. 11 (3), 610-616 (2010).
    52. Lock, L. T., Laychock, S. G., Tzanakakis, E. S. Pseudoislets in stirred-suspension culture exhibit enhanced cell survival, propagation and insulin secretion. J. Biotechnol. 151 (3), 278-286 (2011).
    53. Marchenko, S., Flanagan, L. Counting human neural stem cells. J. Vis. Exp. (7), e262 (2007).
    54. Campos, C. Chronic hyperglycemia and glucose toxicity: pathology and clinical sequelae. Postgrad. Med. 124 (6), 90-97 (2012).
    55. Eve, D. J., Fillmore, R., Borlongan, C. V., Sanberg, P. R. Stem cells have the potential to rejuvenate regenerative medicine research. Med. Sci. Monit. 16 (10), RA197-RA217 (2010).
    56. Hsiao, L. -C., Carr, C., Chang, K. -C., Lin, S. -Z., Clarke, K. Review Article: Stem Cell-based Therapy for Ischemic Heart Disease. Cell Transplant. , (2012).
    57. Oldershaw, R. A. Cell sources for the regeneration of articular cartilage: the past, the horizon and the future. Int. J. Exp. Pathol. 93 (6), 389-400 (2012).
    58. De Coppi, P. Regenerative medicine for congenital malformations. J. Pediatr. Surg. 48 (2), 273-280 (2013).
    59. Tziampazis, E., Sambanis, A. Modeling of cell culture processes. Cytotechnology. 14 (3), 191-204 (1994).
    60. Sidoli, F. R., Mantalaris, A., Asprey, S. P. Modelling of Mammalian cells and cell culture processes. Cytotechnology. 44 (1-2), 27-46 (2004).
    61. Yim, R. Administrative and research policies required to bring cellular therapies from the research laboratory to the patient’s bedside. Transfusion. 45, Suppl 4. 144S-158S (2005).
    62. Fink, D. W. FDA regulation of stem cell-based products. Science. 324 (5935), 1662-1663 (2009).
    63. Moos, M. Stem-cell-derived products: an FDA update. Trends Pharmacol. Sci. 29 (12), 591-593 (2008).

    Tags

    Биоинженерия выпуск 115 глюкоза регулирование питательных веществ непрерывной подачи перемешивают суспензию биореактор расширение сфероид культура биореактор
    Питательные Регулирование непрерывной подачи для крупномасштабного Расширение клеток млекопитающих в сфероидов
    Play Video
    PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

    Cite this Article

    Weegman, B. P., Essawy, A., Nash,… More

    Weegman, B. P., Essawy, A., Nash, P., Carlson, A. L., Voltzke, K. J., Geng, Z., Jahani, M., Becker, B. B., Papas, K. K., Firpo, M. T. Nutrient Regulation by Continuous Feeding for Large-scale Expansion of Mammalian Cells in Spheroids. J. Vis. Exp. (115), e52224, doi:10.3791/52224 (2016).

    Less
    Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
    View Video

    Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

    Waiting X
    Simple Hit Counter