Nutrient regulation using continuous growth adjusted feeding improves growth rates of mammalian cell spheroids compared to intermittent batch feeding for cultures in stirred suspension bioreactors. This study demonstrates the methods required for establishing simple adjusted rate fed cultures.
In this demonstration, spheroids formed from the β-TC6 insulinoma cell line were cultured as a model of manufacturing a mammalian islet cell product to demonstrate how regulating nutrient levels can improve cell yields. In previous studies, bioreactors facilitated increased culture volumes over static cultures, but no increase in cell yields were observed. Limitations in key nutrients such as glucose, which were consumed between batch feedings, can lead to limitations in cell expansion. Large fluctuations in glucose levels were observed, despite the increase in glucose concentrations in the media. The use of continuous feeding systems eliminated fluctuations in glucose levels, and improved cell growth rates when compared with batch fed static and SSB culture methods. Additional increases in growth rates were observed by adjusting the feed rate based on calculated nutrient consumption, which allowed the maintenance of physiological glucose over three weeks in culture. This method can also be adapted for other cell types.
Con el fin de generar un gran número de células humanas viables y funcionales para el trasplante, la regulación de las condiciones de cultivo es imprescindible. El agotamiento de nutrientes, junto con la acumulación de residuos metabólicos son los principales contribuyentes a los cambios de senescencia y metabólicos que reducen la calidad del producto de células 1-3. Este procedimiento demuestra un método para células de mamíferos de cultivo en esferoides utilizando un biorreactor agitado en combinación con un sistema de alimentación de perfusión tasa ajustada para regular la glucosa en un rango fisiológico 4 durante toda la duración del cultivo. Para los fines de estos estudios, el intervalo fisiológico se definió como entre 100 y 200 mg / dl. Los mismos métodos se pueden utilizar para regular otros nutrientes y residuos metabólicos, tales como lactato.
cultivos estáticos en pequeños volúmenes (1 – 30 ml) se utilizan normalmente en el entorno de laboratorio para mantener y diferenciar líneas celulares para EXPERIMENTAL propósitos. pases de células se lleva a cabo con los cambios de medio completo, según sea necesario, a intervalos regulares. La mayor parte de medio de cultivo "convencional" tiene una alta concentración de glucosa (450 mg / dl en DMEM utilizado en estos estudios) para permitir cambios de medio de menos frecuentes, sin el riesgo de limitaciones de nutrientes. Sin embargo, este método por lotes de alimentación de aún requiere una manipulación frecuente, introduce variabilidad en el medio ambiente celular, y aumenta el riesgo de contaminación 5-9. Biorreactores suspensión agitada (SSB) proporcionan una mejor mezcla y la disminución de gastos de envío de 3,10 – 20, pero al igual que cultivos estáticos, requieren cambios manuales medianas que contribuyen a las fluctuaciones en los niveles potencialmente dañinos de productos de nutrientes y desechos. alimentación de la perfusión de las culturas SSB reduce estos problemas mediante la infusión continua y la eliminación del medio, pero los grandes cambios en los niveles de nutrientes debido al crecimiento de las células siguen siendo un problema. El uso de un RA de alimentación ajustadate de los cálculos de utilización de nutrientes sobre la base de los requisitos de células estimado puede proporcionar el entorno celular estable requerido para optimizar la viabilidad celular y la función 21 – 24.
Hay una gran cantidad de literatura que describe métodos para cultivos escalables SSB de células de mamíferos específicamente para el cultivo y expansión de células pluripotentes 25 – 32, con otros se centraron en las células de los islotes 17,33,34 (beta), o la producción de productos biológicos 24, 35-38. Muchos de estos tipos de células investigadas pueden crecer en cultivos de esferoides, y procedimientos específicos para el tipo de célula que se utiliza debe ser optimizado antes de implementar un sistema de alimentación continua. En esta demostración, se utilizó un método de alimentación de perfusión para expandir una línea de células beta crecido como esferoides en un biorreactor agitado 39-43. El método descrito en este documento proporciona unala aplicación directa de la alimentación de los ajustes del tipo basado en las mediciones de glucosa fuera de línea para lograr condiciones de cultivo específicas. Ajuste de la velocidad de alimentación con este método para mantener un nivel de glucosa fisiológica se muestra a los rendimientos celulares aumenta. Las células de mamíferos son dependientes de un nutriente clave, glucosa, para la producción de energía, por lo que el uso de esta línea celular representa un modelo para muchas células de mamífero en cultivo 44. Además, esta línea es un ejemplo de la mayor complejidad de las células beta, que son sensibles a los niveles crónicos elevados de glucosa 45. Para este estudio, se dejó que las células ß-TC6 para formar esferoides en cultivo para aproximar el tamaño medio de los islotes de Langerhans in vivo. El sistema de biorreactor de perfusión 17 – 19,21,46 con una velocidad de alimentación ajustada a la glucosa consumo, se tradujo en el mantenimiento de condiciones fisiológicas y los rendimientos celulares más altas sin cambios en la viabilidad.
Generación de productos de células de mamíferos para la producción de agentes biológicos y para las terapias con células requiere la cultura y el seguimiento de las células de mamífero en gran escala 55-58. Además, estas aplicaciones requieren condiciones de cultivo definidas y validadas. Simplemente aumentando el volumen de las células utilizando tecnologías de investigación no va a cumplir con todos estos requisitos. cambios de medio manuales que causan fluctuaciones en nut…
The authors have nothing to disclose.
The authors thank Michael Garwood and Sam Stein for their helpful comments, and Kristen M. Maynard for assistance with manuscript preparation.
Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number / Link | Comments/Description |
BTC-6 Cells | ATCC, Manassas, VA | CRL-11506 | Mouse Insulinoma cell line (adherent cell type) |
DPBS No CA, No Mg | Invitrogen, Carlsbad, CA | 14190-144 | https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/14190144?ICID=search-14190144 |
Dulbecco's Modified Eagles Medium | Invitrogen, Carlsbad, CA | See below for product numbers | |
DMEM High Glucose (500mM) | Invitrogen, Carlsbad, CA | 11965-092 | http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/11965092 |
DMEM Low Glucose (100mM) | Invitrogen, Carlsbad, CA | 11885-084 | http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/11885084 (note that this medium already contains pyruvate) |
L-gultamine | Invitrogen, Carlsbad, CA | 25030081 | http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/25030081?ICID=search-product |
Sodium Pyruvate | Invitrogen, Carlsbad, CA | 11360070 | https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/11360070?ICID=search-product |
Heat Inactivated Porcine Serum | Gibco – Life Technologies | 10082147 | http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/10082147 |
Trypsin-EDTA | Invitrogen, Carlsbad, CA | 25200056 | https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/25200056?ICID=search-product |
T-150 Tissue Culture Treated Flasks | Corning, Corning, NY | 430825 | http://catalog2.corning.com/LifeSciences/en-US/Shopping/ProductDetails.aspx?productid=430825(Lifesciences) &categoryname= |
NuAire Cell culture incubator | Princeton, MN | US Autoflow , Any water-jacketed CO2 regulating cell culture incubator could be used | |
Centrifuge | Sorvall RT 7 (Any similar benchtop centrifuge may be used) | ||
Refrigerator | Any laboratory refrigerator could be used (a small table-top version was used for these studies) | ||
1L Glass Bottle | Corning, Corning, NY | 1395-1L | Any vendor could be used http://catalog2.corning.com/LifeSciences/en-US/Shopping/ProductDetails.aspx?productid=1395-1L(Lifesciences) &categoryname= |
2L Glass Bottle | Corning, Corning, NY | 1395-2L | Any vendor could be used |
250 ml stirred bioreactors | Corning, Corning, NY | 4500-250 | http://catalog2.corning.com/LifeSciences/en-US/Shopping/ProductDetails.aspx?productid=4500-250(Lifesciences) &categoryname= |
Stir Plate | Fisher Scientific | 11-496-104A | Any incubator safe stir-plate can be used, any vendor |
Tissue Culture Dishes 100mm Diameter | Nunc, Rochester, NY (Fisher Scientific) | 1256598 | Any vendor could be used (ordered through Fisher Sci) |
FALCON 50 ml Conical Tubes | Falcon, San Jose, CA | 1256598 | Any vendor could be used |
Delran Plastic Used for Custom Parts | McMaster Carr | Various | Any material of choice could be used, but Deran is chosen because it is autoclave safe, non-reactive, and easy to machine, http://www.mcmaster.com/#acetal-homopolymer-sheets/=rjrcac |
Stainless Steel Pipe for custom lids | McMaster Carr | Various | Any vendor could be used, http://www.mcmaster.com/#standard-stainless-steel-tubing/=rjrd91 |
Custom Modified Delran Bioreactor Lids for Continuous Feeding | Custom made | Not aware of any vendors producing a similar product | |
Custom Modified Glass Bottle Lids for Continuous feeding | Custom made | Some vendors (eg. Fischer Sci, Corning) make similar products in the links below | |
Masterflex Digital Peristaltic Pump | Cole Parmer, Vernon Hills, IL | EW-77919-25 | Any precision peristaltic pump could be used, http://www.coleparmer.com/Product/L_S_Eight_Channel_Four_Roller_ Cartridge_Pump_System_115_230 _VAC/EW-77919-25 |
PVDF Tubing Connectors (various) | Cole Parmer, Vernon Hills, IL | see link | Any vendor could be used, http://www.coleparmer.com/Category/Cole_Parmer_PVDF_Premium _Luer_Fittings/55889 |
Pharmed BPT Tubing L/S 16 | Cole Parmer, Vernon Hills, IL | WU-06508-16 | Any vendor could be used, http://www.coleparmer.com/Product/Masterflex_PharMed_BPT_Tubing _L_S_13_25/WU-06508-16 |
Pharmed BPT Tubing L/S 14 | Cole Parmer, Vernon Hills, IL | WU-06508-14 | Any vendor could be used, http://www.coleparmer.com/Product/Masterflex_PharMed_BPT_Tubing _L_S_13_25/WU-06508-14 |
Pharmed BPT Tubing L/S 13 | Cole Parmer, Vernon Hills, IL | WU-06508-13 | Any vendor could be used, http://www.coleparmer.com/Product/Masterflex_PharMed_BPT_Tubing _L_S_13_25/WU-06508-13 |
Millipore Millex GP PES membrane 0.22ul sterile syringe filter (used for venting, and medium filtration) | Fisher Scientific | SLGP033RS | Any vendor could be used |
25ml Graduated Pipette | Fisher Scientific | 13-678-11 | Any vendor could be used, and various sizes may be used |
Pipetter | Fisher Scientific | 13-681-15E | Any vendor, or similar product could be used |
Hemocytometer | Fisher Scientific | 02-671-6 | Any vendor, or similar product could be used |
Trypan Blue | Gibco – Life Technologies | 15250-061 | Any vendor, or similar product could be used, https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/15250061 |
Inverted Light Microscope | Leica | Any vendor, or similar product could be used | |
One Touch Ultra Blood Glucose Meter | Fisher Scientific | 22-029-293 | Any vendor, or similar product could be used (eg. Bayer) |
One Touch Ultra-Strips | Fisher Scientific | 22-029-292 | Any vendor, or similar product could be used (eg. Bayer) |