Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Spheroids में स्तनधारी कोशिकाओं के बड़े पैमाने पर विस्तार के लिए सतत खिलाने से पोषक तत्व विनियमन

Published: September 25, 2016 doi: 10.3791/52224
Automatic Translation
1, 2, 2, 2, 3, 2, 2, 2, 4, 2
1Radiology, University of Minnesota, 2Medicine, University of Minnesota, 3School of Public Health, University of Minnesota, 4Surgery, University of Arizona

Introduction

आदेश में प्रत्यारोपण के लिए व्यवहार्य और कार्यात्मक मानव कोशिकाओं की बड़ी संख्या उत्पन्न करने के लिए, संस्कृति की स्थिति के नियमन के लिए जरूरी है। 3 - पोषक तत्वों की कमी, चयापचय अपशिष्ट के buildup के साथ वार्धक्य और चयापचय में परिवर्तन है कि सेल उत्पाद 1 की गुणवत्ता को कम करने के लिए प्रमुख योगदान कर रहे हैं। यह प्रक्रिया एक समायोजित दर छिड़काव खिला प्रणाली के साथ संयुक्त एक उभारा बायोरिएक्टर का उपयोग करते हुए संस्कृति की अवधि के दौरान एक शारीरिक सीमा 4 में ग्लूकोज को विनियमित करने के लिए spheroids में संस्कृति स्तनधारी कोशिकाओं के लिए एक विधि को दर्शाता है। इन अध्ययनों के प्रयोजन के लिए, शारीरिक सीमा 100 और 200 एमजी / डीएल के बीच के रूप में परिभाषित किया गया था। एक ही तरीके का अन्य पोषक तत्वों और ऐसे लैक्टेट के रूप में चयापचय अपशिष्ट को विनियमित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

छोटी मात्रा में स्टेटिक संस्कृतियों (1 - 30 मिलीलीटर) आम तौर पर बनाए रखने और experime के लिए सेल लाइनों को अलग करने के लिए प्रयोगशाला स्थापित करने में उपयोग किया जाता हैntal प्रयोजनों। सेल passaging पूरा मध्यम परिवर्तन के रूप में नियमित अंतराल पर जरूरत के साथ किया जाता है। अधिकांश "पारंपरिक" संस्कृति के माध्यम से एक उच्च ग्लूकोज एकाग्रता (इन अध्ययनों में प्रयुक्त DMEM के लिए 450 एमजी / डीएल) पोषक तत्व सीमाओं के जोखिम के बिना लगातार कम मध्यम परिवर्तन के लिए अनुमति देने के लिए है। हालांकि, इस बैच खिला पद्धति अभी भी लगातार हेरफेर की आवश्यकता है, सेल के माहौल में परिवर्तनशीलता का परिचय है, और प्रदूषण 5 का खतरा बढ़ जाता है - 9। उभारा निलंबन बायोरिएक्टर (एसएसबी) बेहतर मिश्रण प्रदान करते हैं और 3,10 से निपटने में कमी आई है - 20, लेकिन स्थिर संस्कृतियों की तरह, मैनुअल मध्यम परिवर्तन है कि पोषक तत्व और अपशिष्ट उत्पाद के स्तर में संभावित हानिकारक उतार-चढ़ाव के योगदान की आवश्यकता है। एसएसबी संस्कृतियों का छिड़काव खिला कम कर देता है सतत प्रेरणा और मध्यम को हटाने, लेकिन सेल के विकास के कारण पोषक तत्वों का स्तर में बड़े परिवर्तन से इन समस्याओं को एक मुद्दा बना हुआ है। एक समायोजित खिला Ra का उपयोगपोषक तत्व उपयोग के गणना का अनुमान सेल की आवश्यकताओं पर आधारित ते स्थिर सेल पर्यावरण सेल व्यवहार्यता का अनुकूलन करने के लिए आवश्यक प्रदान करते हैं और 21 कार्य कर सकते हैं - 24।

साहित्य का एक बड़ा शरीर विशेष संस्कृति और pluripotent कोशिकाओं के विस्तार के लिए स्तनधारी कोशिकाओं की स्केलेबल एसएसबी संस्कृतियों के लिए तरीकों 25 का वर्णन है - 32, दूसरों के साथ आइलेट (बीटा) कोशिकाओं 17,33,34 पर केंद्रित है, या जैविक उत्पादों के उत्पादन 24, 35 - 38। इन जांच सेल प्रकार के बहुत से अंडाकार आकृति संस्कृतियों में उगाया जा सकता है, और इस्तेमाल किया जा रहा सेल प्रकार के लिए विशिष्ट प्रक्रियाओं के लिए एक सतत खिला प्रणाली को लागू करने से पहले अनुकूलित किया जाना चाहिए। 43 - इस प्रदर्शन में, एक छिड़काव खिला विधि एक बीटा सेल लाइन एक उभारा बायोरिएक्टर 39 में spheroids के रूप में हो विस्तार करने के लिए इस्तेमाल किया गया था। विधि यहाँ बताया प्रदान करता है एकबंद लाइन ग्लूकोज माप के आधार पर लक्षित संस्कृति की स्थिति को प्राप्त करने के लिए दर समायोजन खिलाने का सीधा कार्यान्वयन। इस विधि के साथ फ़ीड दर का समायोजन बनाए रखने के लिए एक शारीरिक ग्लूकोज का स्तर बढ़ता सेल पैदावार करने के लिए दिखाया गया है। स्तनधारी कोशिकाओं को ऊर्जा उत्पादन के लिए, एक महत्वपूर्ण पोषक तत्व, ग्लूकोज पर निर्भर हैं, इसलिए इस सेल लाइन के उपयोग के कई संवर्धित स्तनधारी कोशिकाओं 44 के लिए एक मॉडल का प्रतिनिधित्व करता है। इसके अलावा, इस लाइन बीटा कोशिकाओं है, जो ग्लूकोज 45 की पुरानी उच्च स्तर के प्रति संवेदनशील हैं की आगे की जटिलता एक मिसाल है। इस अध्ययन के लिए, β-TC6 कोशिकाओं विवो में आइलेट्स के टापू का औसत आकार लगभग करने के लिए संस्कृति में spheroids फार्म के लिए अनुमति दी गई। छिड़काव बायोरिएक्टर प्रणाली 17 - 19,21,46 खपत ग्लूकोज को समायोजित एक फ़ीड दर के साथ, व्यवहार्यता में परिवर्तन के बिना शारीरिक स्थिति और उच्च सेल पैदावार बनाए रखने में हुई।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. सेल लाइन और रखरखाव

  1. प्राप्त β-TC6 कोशिकाओं (या अन्य वांछित पक्षपाती स्तनधारी सेल लाइन)। अध्ययन के लिए तैयारी, संस्कृति, मार्ग, और में प्रदाता के निर्देशों के अनुसार कोशिकाओं cryopreserve।

2. निरंतर खिलाने प्रणाली को इकट्ठा

नोट: - 19,21,47 - 49 से नीचे विधि में लगातार खिला प्रणाली के डिजाइन साहित्य में वर्णित 17 इसी तरह की प्रणाली पर आधारित था। यहां इस्तेमाल किया प्रणाली की विधानसभा में पिछले एक प्रकाशन 3 में विस्तार से वर्णन किया गया है।

  1. एक मध्यम जलाशय, क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला पंप, हड़कंप मच गया बायोरिएक्टर, बेकार जलाशय, और कस्टम डिजाइन ट्यूबिंग / नमूना सेट: घटकों खिला प्रणाली पांच प्राथमिक घटक होते हैं जिसके लिए जरूरत ले लीजिए।
    1. एक 1 एल कांच की बोतल, बेकार जलाशय एक 2 एल कांच की बोतल का उपयोग कर, और stirre का उपयोग कर मध्यम जलाशय स्थापित करनाडी बायोरिएक्टर (शेल्फ संस्करण बंद) एक 250 मिलीलीटर मात्रा कांच रिएक्टर का उपयोग कर।
    2. मध्यम विदेशी मुद्रा नियंत्रण के लिए एक 8 चैनल पंप सिर के साथ एक डिजिटल क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला पंप या इसी तरह के पंप का प्रयोग करें।
    3. कड़ी मेहनत और autoclavable प्लास्टिक से जलाशय और संशोधित बायोरिएक्टर पलकों स्टेनलेस स्टील पाइप के साथ निर्माण पास के माध्यम से बंदरगाहों बाँझ फिल्टर के माध्यम से वेंटिलेशन प्रदान करते हैं और जलाशयों और बायोरिएक्टर के बीच मध्यम हस्तांतरण के लिए अनुमति देने के लिए। वैकल्पिक रूप से, विभिन्न विक्रेताओं से प्रवाह बंदरगाहों के साथ विशेष पलकों की खरीद।
      नोट: बायोरिएक्टर ढक्कन वैकल्पिक इंस्ट्रूमेंटेशन और निगरानी जांच (जैसे, ऑक्सीजन निगरानी) के लिए अतिरिक्त पास के माध्यम से बंदरगाहों हो सकती है।
    4. एक बहिर्वाह ट्यूब (ओटी) 40 माइक्रोन 60 माइक्रोन तक के एक औसत ताकना आकार सीमा के साथ झरझरा कांच वेंटिलेशन ट्यूब से गढ़े, और संशोधित एसएसबी ढकने के लिए 40% की एक ताकना घनत्व संलग्न। वैकल्पिक रूप से, संस्कृति की विशिष्ट आवश्यकताओं पर आधारित एक और बहिर्वाह ट्यूब चुनें।
      नोट: चुनेंओटी में छेद के आकार केवल मध्यम और सेल मलबे को हटाने के लिए, (अधिक जानकारी के लिए धारा 6 और प्रकाशन 3 में वर्णित के रूप में) संस्कृति में सेल समुच्चय को छोड़कर।
  2. polyvinylidene फ्लोराइड (PVDF) ट्यूबिंग कनेक्टर्स और टिकाऊ क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला पंप ट्यूबिंग से autoclavable छिड़काव ट्यूबिंग सेट इकट्ठा करो। अनुभाग की लंबाई विभिन्न घटकों के बीच की दूरी पर निर्भर है।
    नोट: जब ट्यूबिंग किस्म का चयन करने के लिए लंबी अवधि के प्रयोगों के लिए स्थायित्व और विश्वसनीयता सुनिश्चित करने के लिए विशेष ध्यान रखना।
  3. एक फ़ीड लाइन, बर्बादी लाइन, और एक नमूना पंक्ति: ट्यूबिंग तीन हिस्सों से सेट इकट्ठा करो।
    1. फ़ीड लाइन दो ट्यूबिंग व्यास (एल / एस 14 और एल / एस 13) का उपयोग कर इकट्ठा करो। प्राथमिक ट्यूबिंग कि मध्यम जलाशय को बायोरिएक्टर से दूरी जाएगा अवधि के लिए एल / एस 14 का प्रयोग करें, और उचित PVDF एडेप्टर का उपयोग कर पंप अनुभाग के लिए ट्यूबिंग लंबाई के बीच में एल की एक छोटी लंबाई / एस 13 डालें।
    2. स्टैंडर्ड PVDF नली-कांटेदार tubi का प्रयोग करेंएनजी एडेप्टर छोटे पंप खंड (एल / एस 13) ट्यूबिंग के दोनों तरफ एल / एस 14 ट्यूबिंग के दो टुकड़े में शामिल होने के लिए।
      नोट: वैकल्पिक रूप से, ट्यूबिंग की पूरी लंबाई हो सकता है छोटे-व्यास एल / एस 13 ट्यूबिंग, और जब पंप अनुभाग अखंडता सवाल में है पूरे ट्यूबिंग लंबाई प्रतिस्थापित किया जा सकता है।
  4. बड़ा व्यास (एल / एस 16) ट्यूबिंग का उपयोग कर कचरे को हटाने के लिए दूसरा ट्यूबिंग अनुभाग इकट्ठा और पम्पिंग अनुभाग के लिए बीच में एल / एस 14 ट्यूबिंग के एक छोटे वर्ग डालें। यह उसी तरह से किया जाता है के रूप में फ़ीड लाइन विधानसभा PVDF नली-कांटेदार एडेप्टर का उपयोग कर, या वैकल्पिक रूप से वांछित पंप ट्यूबिंग आकार की एक सतत लंबाई का उपयोग कर, और जरूरत के रूप में जगह ले।
    नोट: एक ही पंप और पंप सिर फ़ीड सर्किट और अपशिष्ट सर्किट के लिए उपयोग किया जाता है, तो कचरे को हटाने ट्यूबिंग लाइनों के पंप खंड खिला लाइन के पंप खंड की तुलना में एक बड़ा व्यास होना चाहिए। यह है कि हटाने पंप दर फ़ीड दर की तुलना में तेजी है सुनिश्चित करता है, और शक्तिशाली बचना होगासंस्कृति मात्रा में बड़े परिवर्तन के लिए ial, और अतिप्रवाह के जोखिम को कम।
  5. एक नमूना संग्रह विधानसभा: ट्यूबिंग सेट के अंतिम घटक इकट्ठा करो।
    1. यह प्रक्रिया एक कस्टम बंदरगाह प्रणाली के नमूने इकट्ठे वर्णन करता है; वैकल्पिक रूप से, एक बाँझ नमूना बंदरगाह विभिन्न विक्रेताओं से खरीदा जा सकता है।
    2. तीन छोटी (~ 6 सेमी) एल / एस 14 ट्यूबिंग एक टी प्रकार PVDF कनेक्टर के साथ एक साथ जुड़े लंबाई, और ट्यूबिंग लंबाई में से दो पर दो छोटे नली clamps से सेट का निर्माण।
    3. clamped लंबाई में से एक के लिए गैस निकाल लिए एक बाँझ गैस फिल्टर देते हैं, और अन्य एक बाँझ नमूना सिरिंज के लिए कनेक्शन के लिए प्रयोग किया जाता है (बाँझ गैस फिल्टर नसबंदी के बाद एक जैव सुरक्षा कैबिनेट में जोड़े जाने की जरूरत हो सकती है के रूप में कई बाँझ फिल्टर नहीं हैं autoclavable)।
    4. एक स्टेनलेस स्टील नमूना बायोरिएक्टर के ढक्कन पर संलग्न कनेक्टर के लिए तीसरे अंत कनेक्ट।
    5. नमूना विधानसभा आटोक्लेव बायोरिएक्टर शुरुआत से पहले से जुड़ा है, जबकिप्रयोग (नीचे चरण 3 को देखें)।
    6. के रूप में निरंतर फ़ीड प्रक्रिया परेशान बिना जरूरत बायोरिएक्टर से बाँझ नमूने एकत्र करने के लिए इस विधानसभा का प्रयोग करें।

3. आटोक्लेव सभी सामग्री

  1. आटोक्लेव नसबंदी के लिए सभी घटकों बायोरिएक्टर तैयार करें।
  2. नसबंदी के लिए अलग-अलग घटकों लीजिए। मध्यम और अपशिष्ट जलाशयों (कदम 2.1.1 से इकट्ठा), 250 मिलीलीटर स्पिनर कुप्पी (2.1.1 से इकट्ठा), आवश्यक संशोधित पलकों (2.1.3 से इकट्ठा), बहिर्वाह ट्यूब (2.1.4 में वर्णित), तीन ट्यूबिंग सेट ( वर्गों 2.2 through2.5), बहिर्वाह ट्यूब (के रूप में निरंतर खिलाने के लिए आवश्यक) में इकट्ठे हुए।
    1. ढक्कन के शीर्ष करने के लिए सभी घटकों के साथ स्पिनर कुप्पी को इकट्ठा करने और सुनिश्चित करें कि बहिर्वाह ट्यूब मजबूती (धारा 2.1.4 में वर्णित) स्पिनर कुप्पी के अंदर जुड़ा हुआ है हो सकता है, और देते कस्टम इकट्ठे नमूना बंदरगाह (धारा 2.5), या अन्य नमूने बंदरगाह ।
    2. लपेटें ऑटो के साथ पूरे स्पिनर कुप्पी विधानसभाचिपट लपेटो सामग्री, और आटोक्लेव टेप का संकेत है। सुनिश्चित करें कि लपेटो वायुरोधी रहें। / समाप्त होता है जब unwrapping और मशीन के अंदर ट्यूबिंग सेट करने के लिए जब गैर जुड़ा एल्यूमीनियम पन्नी या इसी तरह की सामग्री कनेक्टर के बाँझपन संरक्षित करने के लिए बायोरिएक्टर ढक्कन में प्रत्येक का उपयोग बंदरगाह के अलग-अलग सिरों को कवर करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है: नोट।
    3. मध्यम और अपशिष्ट जलाशयों की संशोधित पलकों को इकट्ठा करने और उसके बाद संबंधित कांच की बोतलों को देते हैं। एल्यूमीनियम पन्नी का उपयोग कर उन्हें कवर और टेप का संकेत आटोक्लेव।
    4. अंतिम विधानसभा में सहायता करने के लिए आटोक्लेव की चादर और टेप के साथ - व्यक्तिगत ट्यूबिंग सेट (2.5 अनुभाग 2.2) लपेटो। / समाप्त होता है जब unwrapping एल्यूमीनियम पन्नी या इसी तरह की सामग्री प्रत्येक ट्यूबिंग कनेक्टर के बाँझपन को संरक्षित करने के लिए सेट की अलग-अलग सिरों को लपेटने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
    5. (जैसे, "ग्रेविटी" के साथ 30 मिनट या अधिक के लिए 121 डिग्री सेल्सियस पर 15 साई की स्थापना ~) एक मानक सूखी आटोक्लेव चक्र का उपयोग कर सभी लिपटे आइटम आटोक्लेव।
      नोट: बाँझ संलग्न नहीं हैautoclaving करने से पहले फिल्टर जब तक कि वे इस बात की पुष्टि कर रहे हैं आटोक्लेव सुरक्षित करने के लिए।

4. उपगोल गठन

नोट: इस तकनीक साहित्य 17 में वर्णित उन लोगों के लिए इसी तरह की है - अन्य स्तनधारी सेल संस्कृतियों के लिए 52 - 19,21,50। निम्नलिखित नसबंदी सभी प्रक्रियाओं एक लामिना का प्रवाह हुड में किया जाना चाहिए और बाँझ दस्ताने का उपयोग सेल संस्कृति के लिए बाँझ स्थिति बनाए रखने के लिए।

  1. सभी शर्तों, संस्कृति और विस्तार β-TC6 कोशिकाओं मानक पक्षपाती संस्कृतियों में (विक्रेता द्वारा वर्णित) पर्याप्त मात्रा में सेल तक के लिए बायोरिएक्टर की वांछित संख्या बीज के लिए प्राप्त कर रहे हैं।
    1. चित्र 1 में दिखाया गया है और धारा 2 में वर्णित बहिर्वाह ट्यूब के साथ निरंतर खिला बायोरिएक्टर इकट्ठा, और नमूना ढकने के लिए नमूना पोर्ट से कनेक्ट। नोट: बहिर्वाह ट्यूब और नमूना बंदरगाह विधानसभा bioreact में जोड़ा जाना चाहिएया निरंतर खिलाने से पहले अंडाकार आकृति गठन के लिए, और ऊपर से संस्कृति के माध्यम से बाहर तक निरंतर खिला शुरू कर दिया है निकाला जाना चाहिए।
    2. आटोक्लेव द्वारा संशोधित एसएसबी विधानसभा जीवाणुरहित (धारा 3 में वर्णित)।
    3. स्पिनर कुप्पी की पलकों, और मध्यम और अपशिष्ट जहाजों पर उपयुक्त स्थानों के लिए बाँझ झरोखों (0.22 माइक्रोन या छोटे बाँझ फिल्टर) संलग्न।
      नोट: यह वाष्प लॉक को रोकने के लिए, और इनक्यूबेटर (5% सीओ 2) पर्यावरण और बायोरिएक्टर के बीच गैस विनिमय अनुमति देने के लिए महत्वपूर्ण है। गैस विनिमय जब बिकारबोनिट बफर मीडिया का प्रयोग कर सही पीएच बनाए रखने के लिए आवश्यक है।
  2. कमरे के तापमान 2 के लिए यांत्रिक आंदोलन द्वारा सहायता प्राप्त की, कोमल trypsinization 0.25% (w / v) Trypsin- 0.53 मिमी EDTA समाधान का उपयोग करके कोशिकाओं को ले लीजिए - 3 मिनट, और लगभग 1.3 x 10 6 कोशिकाओं / एमएल के घनत्व पर बायोरिएक्टर में बीज 200 मिलीलीटर संस्कृति के माध्यम में।
    1. इनक्यूबेटर से बाहर नामित बोतल ले जाएँ औरएक जैव सुरक्षा कैबिनेट में।
      नोट: सभी सेल संस्कृति और जोड़तोड़ उचित बाँझ तकनीक का उपयोग कर एक जैव सुरक्षा कैबिनेट में किया जाना चाहिए।
    2. श्वास द्वारा बोतल से संस्कृति के माध्यम से निकालें।
    3. फॉस्फेट बफर खारा के 5 मिलीलीटर pipetting (सीए ++ या मिलीग्राम बिना ++), फ्लास्क में, और सतह पर कोशिकाओं के पार rinsing द्वारा कोशिकाओं को धो लें, और फिर पीबीएस aspirate।
    4. प्रत्येक फ्लास्क कि एकत्र किया जाएगा (आमतौर पर के बारे में 10x 175 सेमी 2 टी बोतल) को Trypsin EDTA के समाधान के 3 मिलीलीटर जोड़ें।
    5. जैव सुरक्षा कैबिनेट में 3 मिनट - काटा कोशिकाओं 2 के लिए कमरे के तापमान पर सेते दें।
    6. हाथ से धीरे आंदोलन कुप्पी सतह से कोशिकाओं को ढीला करने के लिए, और कुप्पी के लिए संस्कृति के माध्यम से (सीरम के साथ) के 6 मिलीलीटर जोड़कर कोशिकाओं को इकट्ठा करने, और एक 50 मिलीलीटर ट्यूब कोशिकाओं हस्तांतरण। जब एक 50 मिलीलीटर ट्यूब भरा हुआ है, एक और 50 मिलीलीटर ट्यूब का उपयोग करें जब तक की जरूरत कोशिकाओं के सभी एकत्र किया गया है (लगभग एक 50 मिलीलीटर ट्यूब हर 5 टी-175 बोतल के लिए आवश्यक हो जाएगाजुटाया हुआ)।
    7. धीरे सेंट्रीफ्यूज (लगभग 50 एक्स गुरुत्वाकर्षण) एकत्र सेल निलंबन गोली कोशिकाओं।
    8. गोली बरकरार जा शेष मध्यम aspirate।
    9. (सीरम युक्त) संस्कृति के माध्यम में छर्रों को फिर से निलंबित एक पिपेट का उपयोग, और एक ही ट्यूब में सभी छर्रों के हस्तांतरण से एक एकल ट्यूब में कोशिकाओं के सभी ले लीजिए।
    10. साहित्य 53 में वर्णित के रूप में trypan नीले रंग धुंधला के साथ एक मानक hemocytometer का उपयोग सेल घनत्व की गणना करें।
    11. कुल कोशिकाओं की वांछित संख्या मे हर हालत (1.3 x 10 6 कोशिकाओं / एमएल इस प्रदर्शन के लिए लक्षित शुरू सेल घनत्व था) के लिए एसएसबी बाँझ।
    12. (वांछित ग्लूकोज एकाग्रता के साथ, इस मामले में हम शारीरिक सीमा के भीतर मध्यम शर्करा की मात्रा का इस्तेमाल किया) के माध्यम जोड़ें एक पिपेट का उपयोग वांछित कुल संस्कृति की मात्रा (200 मिलीलीटर संस्कृति मात्रा इन अध्ययनों के लिए इस्तेमाल किया गया था) तक पहुँचने के लिए एसएसबी के लिए।
      नोट: इन निरंतर फेड के लिए एसएसबी घन अध्ययन ltures संस्कृति के माध्यम से (100 एमजी / डीएल) का एक संशोधित "कम ग्लूकोज" संस्करण का उपयोग वरीयता प्राप्त थे। यह संस्कृतियों के बजाय एक "उच्च ग्लूकोज" मध्यम साथ शुरू करने और ग्लूकोज की खपत शारीरिक सीमा में नीचे ग्लूकोज स्तर पर लाने के लिए खिला शुरू करने के लिए प्रतीक्षा की तुलना में वांछित लक्ष्य ग्लूकोज एकाग्रता में शुरू करने के लिए अनुमति दी। इन अध्ययनों में खिलाने के लिए अन्य सभी मध्यम मानक "उच्च ग्लूकोज" मध्यम (500 एमजी / डीएल) का इस्तेमाल किया।
    13. एक सेल संस्कृति इनक्यूबेटर अंदर हलचल प्लेट के लिए कोशिकाओं के साथ एसएसबी ले जाएँ।
  3. बायोरिएक्टर में संस्कृति कोशिकाओं को 37 डिग्री सेल्सियस पर 3 दिनों के लिए खिला spheroids फार्म के लिए अनुमति देने के लिए 5% सीओ 2, 100% सापेक्ष आर्द्रता, और 70 आरपीएम की हलचल दर के साथ, बिना।
    नोट: कोई महत्वपूर्ण प्रसार तीन दिन अंडाकार आकृति के गठन की अवधि के दौरान मनाया जाना चाहिए।
  4. अंडाकार आकृति गठन के बाद, वांछित संस्कृति शर्तों के साथ बायोरिएक्टर में spheroids विभाजित।
Le "> 5। निरंतर खिलाने संस्कृति और समायोजित फ़ीड दर

  1. आटोक्लेव या गैस घटकों के सभी बाँझ, और बाँझ तकनीक का उपयोग कर एक जैविक सुरक्षा कैबिनेट में इकट्ठा (कदम 2 - 4)।
  2. अंडाकार आकृति गठन के बाद, इनक्यूबेटर से एसएसबी को हटाने और एक जैविक सुरक्षा कैबिनेट में निरंतर खिला प्रणाली के लिए घटकों को इकट्ठा।
    1. सबसे पहले वांछित संस्कृति के माध्यम से ताजा मध्यम जलाशय को भरने, और फिर फ़ीड लाइन के एक तरफ से कनेक्ट। यह भी सुनिश्चित करना है कि ताजा मध्यम जलाशय ठीक से एक बाँझ फिल्टर के साथ दिए है।
    2. एक बाँझ ढंग से बायोरिएक्टर पर फ़ीड इनलेट बंदरगाह के लिए फ़ीड लाइन के एक तरफ से कनेक्ट। एक बाँझ फिल्टर फ़ीड लाइन और मध्यम फिल्टर करने के लिए पहले यह बायोरिएक्टर में प्रवेश करती है बायोरिएक्टर इनलेट बंदरगाह के बीच स्थापित किया जाना चाहिए।
    3. बायोरिएक्टर बहिर्वाह ट्यूब और मध्यम बेकार जलाशय को बर्बाद लाइन कनेक्ट करें, और सुनिश्चित करें कि बेकार जलाशय ठीक से एक STERIL साथ दिए हैई फिल्टर।
  3. (यह शायद वाहिकाओं और ट्यूबिंग के सभी ले जाने के लिए दो लोगों की आवश्यकता होगी) जैविक सुरक्षा कैबिनेट से बाहर विधानसभा ले जाएँ, और लंबी अवधि संस्कृति के लिए सभी घटकों को बाहर डाल दिया।
    1. इनक्यूबेटर अंडाकार आकृति गठन (37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2, 100% नमी और 70 आरपीएम) के लिए एक ही संस्कृति मापदंडों का उपयोग कर के अंदर हलचल थाली पर एसएसबी रखो। नोट: यह अस्थायी रूप से बायोरिएक्टर से ट्यूबिंग खंडों डिस्कनेक्ट करने के लिए आवश्यक हो सकता है अगर लाइनों के दरवाजे में गैसकेट के माध्यम से नहीं बल्कि बाहर से इनक्यूबेटर के पक्ष में छेद के माध्यम से चलाने की जरूरत है। यह एल्यूमीनियम पन्नी autoclaving करने से पहले (3 कदम) के साथ ट्यूबिंग सेट के सिरों लपेटकर, और चारा और अपशिष्ट ट्यूब वर्गों के बायोरिएक्टर पक्ष संलग्न करने के लिए जब तक बायोरिएक्टर इनक्यूबेटर के अंदर है इंतज़ार कर रही द्वारा एक सड़न रोकनेवाला तरीके से किया जा सकता है। ट्यूब लाइनों जगह में रखा जा सकता है, और एल्यूमीनियम पन्नी मशीन के अंदर हटाया जा सकता है और जल्दी से जुड़ी बायोरिएक्टर करने के लिए।
    2. ट्यूबिंग सेट के शेष (बायोरिएक्टर ढकने के लिए नहीं जुड़े हैं) इनक्यूबेटर का उपयोग बंदरगाह के माध्यम से बाहर सिरों चलाएं (पास के माध्यम से), या इनक्यूबेटर दरवाजा गैसकेट में एक पायदान के माध्यम से।
    3. इनक्यूबेटर (पास के एक जैव सुरक्षा कैबिनेट में यदि संभव हो तो) के बाहर, जल्दी से ताजा मध्यम जलाशय के लिए फ़ीड लाइन, और मध्यम बेकार जलाशय को बर्बाद लाइन कनेक्ट है, और यह सुनिश्चित करें कि बेकार जलाशय ठीक से एक बाँझ फिल्टर के साथ दिए है। नोट: एक सड़न रोकनेवाला तरीके से ऐसा करने के लिए, एल्यूमीनियम पन्नी के रूप में संभव के रूप में जल्दी ट्यूबिंग और पोत कनेक्टर्स से निकालें और संबंधित जहाजों से कनेक्ट (इस संबंध जैव सुरक्षा कैबिनेट के बाहर किया जा करने की जरूरत है, खासकर अगर)।
    4. ताजा मध्यम जलाशय (वांछित फ़ीड मध्यम से भरा) पास मिनी फ्रिज के अंदर डाल दिया। यह सुनिश्चित करें कि चारा और बेकार लाइनों इनक्यूबेटर से बाहर निकलें और बंद करने से प्रत्येक पर दरवाजे को रोकने के बिना फ्रिज में प्रवेश करने में सक्षम हैं की जाँच करें। यह भी है कि चारा एल महत्वपूर्ण हैइनेस या तो रेफ्रिजरेटर या इनक्यूबेटर के दरवाजे से बंद नहीं pinched रहे हैं।
      नोट: मध्यम इन अध्ययनों के लिए इस्तेमाल मानक उच्च ग्लूकोज (500 एमजी / डीएल) संस्कृति के माध्यम से इस सेल प्रकार के लिए विक्रेता द्वारा सिफारिश की थी। किसी भी उच्च ग्लूकोज मध्यम सुसंस्कृत किया जा रहा है सेल प्रकार की विशिष्ट आवश्यकताओं के आधार पर इस्तेमाल किया जा सकता है। चारा माध्यम की ग्लूकोज एकाग्रता संस्कृति खिला प्रणाली उच्च ग्लूकोज माध्यम की फ़ीड दर बढ़ रही संस्कृतियों में पर्याप्त ग्लूकोज के स्तर को बनाए रखने के लिए, जबकि उचित फ़ीड दरों को बनाए रखने पर निर्भर करता है के रूप में वांछित एकाग्रता से यथोचित उच्च (2x या अधिक) होना चाहिए ।
    5. अगले, अपशिष्ट मध्यम जलाशय एक सुविधाजनक स्थान में इनक्यूबेटर के बाहर बेंच शीर्ष पर रखा जा सकता है।
    6. अगले, उचित उन्मुखीकरण सुनिश्चित इतना है कि चारा लाइनों एसएसबी में ताजा मध्यम जलाशय से मध्यम पंप होगा पंप सिर में फ़ीड और अपशिष्ट लाइनों की "पंप खंड", और अपशिष्ट लाइनें जगहएसएसबी से और अपशिष्ट मध्यम जलाशय के लिए मध्यम पंप होगा।
  4. वांछित फ़ीड दर करने पर पंप मुड़ें।
    1. समायोजित फ़ीड दर समीकरण साहित्य 3 में और नीचे प्रदान की प्रतिनिधि परिणाम खंड में वर्णित का उपयोग कर फ़ीड दर की गणना।
    2. सबसे हाल ही में कोशिकाओं की संख्या की जानकारी (प्रक्रिया चरण 5 में वर्णित) विकास भविष्यवाणी के साथ-साथ, और मध्यम ग्लूकोज माप का उपयोग चारा दर संस्कृति में वांछित ग्लूकोज एकाग्रता बनाए रखने की जरूरत का अनुमान है।
      नोट: सेल विकास दर और ग्लूकोज की खपत की दर इन प्रक्रियाओं कर रही करने से पहले प्राप्त करने की आवश्यकता होगी।
    3. पंप गणना फ़ीड दर के आधार पर की गति सेट करें।
  5. चारा दर गणना दोहराएँ और (वर्णित विधि के लिए हर तीन दिन) प्रत्येक नमूने बिंदु के लिए पंप की गति समायोजित करें।

6. कोशिकाओं की गिनती, व्यवहार्यता, और ग्लूकोज एकाग्रता माप

<राजभाषा>
  • हर तीन दिन, या वांछित के रूप में प्रत्येक बायोरिएक्टर से नमूने एकत्र।
  • ऊपर वर्णित विशेष नमूना बंदरगाह का उपयोग कर लगातार खिलाया एसएसबी संस्कृतियों से संस्कृति के नमूने ले लो।
    1. बायोरिएक्टर अंदर लगातार खिलाया एसएसबी छोड़कर, नमूने बंदरगाह के लिए संयुक्त राष्ट्र के फ़िल्टर कनेक्शन के लिए एक बाँझ सिरिंज (एक 5 मिलीलीटर मात्रा सिरिंज इन अध्ययनों के लिए इस्तेमाल किया गया था) देते हैं।
    2. नमूना ट्यूब संस्कृति के माध्यम में नीचे ले जाएँ।
    3. ट्यूब अनुभाग सिरिंज के लिए जा रहा Unclamp, और वांछित कुल नमूना मात्रा वापस ले लें।
    4. इतना है कि यह अब कोई संस्कृति में डूबे हुए है नमूना ट्यूब ऊपर ले जाएँ, और जब तक हवा निकाल दिया जाता है सिरिंज वापस लेने के लिए जारी है।
    5. ट्यूब कि सिरिंज खिलाती बंद करना, और नमूना युक्त सिरिंज अलग है, और अलग निर्धारित करें।
    6. हवा के साथ एक दूसरे ताजा बाँझ सिरिंज पूर्व लोड, और नमूना बंदरगाह की बाँझ फिल्टर पक्ष को देते हैं।
    7. ट्यूब के सिरिंज फिल्टर ओर जा रहा Unclampनमूना बंदरगाह, और फिर धीरे बाँझ फिल्टर के माध्यम से सिरिंज में हवा को खदेड़ने से नमूने बंदरगाह शुद्ध करना। यह सुनिश्चित करता है कि नमूना बंदरगाह किसी भी अवशिष्ट माध्यम की स्पष्ट हो जाएगा।
    8. पुन दबाना ट्यूब फिल्टर करने के लिए जा रहे हैं, बाँझ सिरिंज काटना और इसे त्यागने।
  • सिरिंज कि ​​संस्कृति से सेल नमूना शामिल है ले लो, और एक 10 मिलीलीटर ट्यूब में निष्कासित। नाम से जाना जाता संस्करणों के उप नमूने इस ट्यूब से सीधे लिया जा सकता है।
  • कोशिकाओं की गिनती के लिए, कोशिकाओं का एक ज्ञात मात्रा को हटाने और एक सूक्ष्म अपकेंद्रित्र ट्यूब को हस्तांतरण, और धीरे से 1 के लिए अपकेंद्रित्र - 2 मिनट (लगभग 50 एक्स गुरुत्वाकर्षण)।
  • ग्लूकोज मापन के लिए एक अलग ट्यूब स्थानांतरण सतह पर तैरनेवाला, और trypsin EDTA के समाधान का एक ही मात्रा के साथ गोली (0.25% (w / v) trypsin, 0.53 मिमी EDTA) फिर से निलंबित, और के साथ एक मानक hemocytometer का उपयोग तीन प्रतियों में गिनती नीले धुंधला trypan साहित्य 53 में वर्णित है।
    1. मध्यम (सीरम) के साथ में जोड़ेआवश्यक के रूप में कमजोर पड़ने के लिए नमूना।
    2. कोशिकाओं की गणना, और जीने (अस्थिर) कोशिकाओं की रिकॉर्डिंग के द्वारा सेल व्यवहार्यता की गणना, और मृत (दाग) कोशिकाओं को स्वतंत्र रूप से (व्यवहार्यता% = जीवित कोशिकाओं / कुल कोशिकाओं)।
  • एक रक्त ग्लूकोज मीटर और एकल उपयोग परीक्षण स्ट्रिप्स का उपयोग कर तीन प्रतियों में मध्यम ग्लूकोज के स्तर को मापने।
    1. के रूप में रक्त के लिए संस्कृति के माध्यम प्रतिस्थापन ग्लूकोज मीटर निर्देश के द्वारा वर्णित ग्लूकोज नाप लो।
    2. मध्यम परीक्षण किया जा करने के लिए (ऊपर गिनती के नमूने से एकत्र) में परीक्षण पट्टी डुबकी, और प्रतिकृति की वांछित संख्या के लिए दोहराने (तीन प्रतिकृति सिफारिश कर रहे हैं)।
    3. दोनों ताजा मध्यम और ग्लूकोज सांद्रता के लिए बेकार मध्यम परीक्षण।
      नोट: कुछ मीटर की दूरी के लिए, माप से कम 20 मिलीग्राम / डीएल (मीटर के detectable सीमा), मीटर उत्पादन में किसी त्रुटि के रूप में मनाया जा सकता है।

    • 7. उपगोल व्यवस्थित दर माप

    1. कि सेल सुनिश्चित करने के लिएएल समूहों निरंतर खिला प्रणाली से हटाया नहीं जा रहा है, एक बड़े व्यास प्लास्टिक पिपेट में उनकी अवसादन देख कर β-TC6 spheroids के निपटाने की दर को मापने।
    2. एसएसबी बायोरिएक्टर में संस्कृति β-TC6 कोशिकाओं spheroids के रूप में ऊपर वर्णित के रूप में।
    3. संस्कृति के 3 दिन बाद, एक 50 मिलीलीटर ट्यूब में अंडाकार आकृति निलंबन और जगह की 30 मिलीलीटर नमूने ले।
    4. धीरे pipet और एक विस्तृत व्यास 25 मिलीलीटर पिपेट का उपयोग निलंबन में समान रूप से वितरित करने के लिए नीचे है, तो pipet (जैसे, 20 मिलीलीटर चिह्न) में एक ज्ञात स्तर पर निलंबन के साथ pipetting बंद करो, और फिर spheroids के सभी के लिए समय रिकॉर्ड 5 सेमी बसा।
    5. इस प्रक्रिया को दोहराएँ पर्याप्त समय सांख्यिकीय आत्मविश्वास हासिल करने के लिए (आमतौर पर एन> 3)।
      नोट: जैविक अध्ययन के लिए, एपी मूल्य कम से कम 0.05 जब माप की तुलना सांख्यिकीय महत्वपूर्ण माना जाता है। मतलब की मानक त्रुटि रिपोर्टिंग त्रुटियों के लिए इस्तेमाल किया गया था, और दो पूंछ संयुक्त राष्ट्र बनती छात्र-टी परीक्षणप्रस्तुत डाटा के लिए शर्तों तुलना करने के लिए इस्तेमाल किया गया था।

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Representative Results

    मीडियम शर्करा की मात्रा और उतार चढ़ाव स्टैंडर्ड एसएसबी संस्कृतियों में सेल विस्तार को सीमित करें

    ग्लूकोज का स्तर संस्कृति की अवधि 3 भर में स्थिर संस्कृतियों और एसएसबी संस्कृतियों में उतार चढ़ाव हो। ये उतार-चढ़ाव 21 दिन की संस्कृति की अवधि के दौरान सेल संख्या में वृद्धि के साथ तेज और दोनों स्थिर और एसएसबी संस्कृतियों में लगभग समान थे। इन टिप्पणियों हमारे पिछले प्रकाशन 3 में प्रस्तुत कर रहे हैं। ग्लूकोज के स्तर को दोनों विधियों के लिए संस्कृति अवधि की अवधि के लिए सुपर-शारीरिक हो सकता है। इस वजह से पुरानी जोखिम सेल के विकास को बाधित कर सकते हैं 54, एक सतत खिला प्रणाली ग्लूकोज उतार-चढ़ाव को खत्म करने और अंडाकार आकृति संस्कृति के दौरान पोषक तत्व नियंत्रण में सुधार करने के लिए विकसित किया गया था।

    उपगोल संस्कृति के लिए सतत खिला प्रणाली

    लगातार ताजा माध्यम से जोड़ने और संस्कृति अवधि की अवधि के लिए पुराने मध्यम हटानेएक साधारण मध्यम आपूर्ति प्रणाली का उपयोग कर पूरा किया जा सकता है। प्रणाली विधि 2 में वर्णित है और चित्र 1 में दिखाया गया है एक पंप और ट्यूबिंग लगातार मध्यम भरपाई करने के लिए सेट और एक अलग बहिर्वाह ट्यूब लगातार मध्यम दूर करने के लिए है, जबकि संस्कृति से spheroids के हटाने को रोकने के लिए इस्तेमाल किया। मध्यम इनलेट रिएक्टर के विपरीत दिशा में था ओटी के समुचित कार्य के साथ हस्तक्षेप की किसी भी संभावना को कम करने के लिए, और पूरी तरह से मिश्रण के लिए अनुमति देने के लिए। ताजा मध्यम (उच्च ग्लूकोज, 450 एमजी / डीएल) के साथ रेफ्रिजरेटर के तापमान पर बनाए रखा गया था दीर्घकालिक स्थिरता सुनिश्चित करने और लगातार एक पूर्ण मध्यम प्रतिस्थापन दर के साथ हर तीन दिन पोषक तत्वों की भरपाई करने के लिए एक माध्यम के प्रवेश के माध्यम से संस्कृति को जोड़ा गया। इस प्रणाली के एक सतत प्रक्रिया 3,22,23 के साथ मैनुअल बैच मध्यम प्रतिस्थापन की प्रक्रिया की जगह से जोड़तोड़ और हस्तक्षेप संस्कृति अवधि के दौरान आवश्यक सीमित है। ठंड मध्यम टिम पर छोटे खंडों में बायोरिएक्टर में प्रवेश कियाई (0.046 मिलीग्राम / मिनट) कुल संस्कृति की मात्रा (200 मिलीलीटर) के सापेक्ष, प्रत्येक आसपास के संस्कृति माध्यम है कि 37 डिग्री सेल्सियस पर था के साथ तापमान को संतुलित करने के लिए जोड़ा मध्यम समय की "ड्रॉप" दे रही है। यह सुनिश्चित किया है कि जोड़ा ठंड मध्यम समग्र संस्कृति के तापमान को कम नहीं किया इनक्यूबेटर के भीतर बनाए रखा जा रहा है। संस्कृति के माध्यम से की सरगर्मी भी गर्मी हस्तांतरण दक्षता में वृद्धि हुई है, और इन संस्कृतियों में तापमान एकरूपता में सुधार हुआ। तापमान रखरखाव के लिए एक चिंता का विषय है, तो बहुत-उच्च फ़ीड दरों छोटे संस्कृति संस्करणों के साथ इस्तेमाल किया गया है, लेकिन इन स्थितियों की संभावना नहीं इन अध्ययनों के लिए परीक्षण नहीं किया गया है हो सकता है। संस्कृति मात्रा सुनिश्चित करना है कि औसत मध्यम हटाने दर खिला दर के बराबर था द्वारा निरंतर खिला प्रणाली में एक निरंतर स्तर पर बनाए रखा गया था। प्रणाली इन अध्ययनों वास्तव में चारा दर क्योंकि हटाने ट्यूबिंग खंड पंप अनुभाग के लिए बड़ा व्यास ट्यूबिंग इस्तेमाल की तुलना में एक उच्च प्रवाह दर पर मध्यम हटा लिए इस्तेमाल किया। तेजी के बावजूद रेमोवैल दर, संस्कृति मात्रा वांछित संस्कृति खंड स्तर को रिएक्टर के अंदर बहिर्वाह ट्यूब के स्तर का समायोजन करके बनाए रखा गया था। लगातार ताजा मध्यम जोड़ने एसएसबी को रिएक्टर में मध्यम स्तर के एक छोटे से वृद्धि हुई है, और जब मध्यम ओटी के स्तर पर पहुंच गया, मध्यम एक तेज दर से रिएक्टर से हटा दिया गया था। मध्यम झरझरा कांच ओटी के माध्यम से हटा दिया गया था, संस्कृति में सेल spheroids छोड़ने तक मध्यम स्तर ओटी के नीचे से नीचे गिर गया। इस प्रणाली को कमजोर प्रवाह और मात्रा सेंसर का उपयोग पंप की गति को नियंत्रित करने की जटिलता से परहेज है, और कई एसएसबी आधारित संस्कृति तंत्र 47,48 के साथ प्रयोग के लिए मानक है। (40% और 40 - 60 में क्रमश: माइक्रोन) OT सुनिश्चित करने के लिए कि spheroids हटाने सर्किट के माध्यम से संस्कृति से हटाया नहीं गया था डिजाइन किया गया था, और छेद के आकार और fritted ग्लास ट्यूब में घनत्व काफी बड़े थे कि यह सुनिश्चित करने रैखिक प्रवाह वेग spheroids हम में से बसने की दर से भी कम थाइन संस्कृति के अध्ययन के लिए एड। रैखिक प्रवाह विस्तार 3 में वर्णित के रूप में गणना की गई। ओटी में छिद्रों के माध्यम से औसत रेखीय मध्यम वेग 0.17 सेमी / मिनट होने की गणना की गई थी और यह सबसे धीमी मनाया अंडाकार आकृति को निपटाने दर की तुलना में कहीं धीमी थी। औसत पर निपटाने के वेग विधि 7 में वर्णित है और 2.53 ± 0.26 सेमी / इन अध्ययनों में प्रयुक्त spheroids के लिए न्यूनतम था के रूप में मापा गया था। spheroids आकार में वृद्धि के रूप में संस्कृति की प्रगति मनाया गया, और इन बड़े spheroids तेजी से वृद्धि हुई है उनके बड़े पैमाने पर खींचें अनुपात है, जो आगे ओटी के माध्यम से हटाने की संभावना को कम करने के कारण बस गए। कुछ spheroids ओटी के बाहर के किनारों पर कम pores में फंस गए थे, लेकिन इस यांत्रिक टक्कर के कारण मुख्य रूप से किया गया था जब बहिर्वाह ट्यूब हड़कंप मच माध्यम में डालता है। इस ओटी के समुचित कार्य को रोकने नहीं था, और संस्कृतियों का परीक्षण में spheroids के एक measureable घटाने के लिए योगदान नहीं किया। इन अध्ययनों के लिए ओटी प्रत्येक अध्ययन के बाद साफ किया गया था, (डि पानी फ्लश के साथ), और कम समारोह के जोखिम से बचने के लिए दो संस्कृति के अध्ययन के लिए इस्तेमाल करने के बाद बदल दिया। ओटी हर अध्ययन के बाद बदला जा सकता है spheroids एक विशेष अध्ययन के दौरान pores (इस प्रस्तुत काम में नहीं मनाया गया था) को रोकना मनाया जाता है। इस पद्धति का उपयोग माध्यम की चक्रीय हटाने की वजह से, मध्यम संस्कृति मात्रा के रूप में ज्यादा के रूप में 6% की fluctuated। उतार चढ़ाव के माध्यम है कि ओटी थोड़ा और अधिक मध्यम हटाने के बाद औसत मध्यम स्तर के ओटी के नीचे से नीचे गिर गया अनुमति की सतह तनाव के कारण किया गया।

    पोषक तत्व उतार चढ़ाव को खत्म एसएसबी संस्कृति में सुधार सेल के विकास

    लगातार 21 दिन की अवधि के दौरान संस्कृति प्रणाली वृद्धि की संस्कृति की पैदावार ऊपर वर्णित का उपयोग कर एसएसबी संस्कृतियों में मध्यम की जगह जब मानक एसएसबी संस्कृतियों की तुलना में। चारा दर एक दर है कि पूरी संस्कृति volu की जगह पर संस्कृति अवधि के दौरान स्थिर बनाए रखा गया थामुझे हर तीन दिन बैच खिलाया एसएसबी संस्कृतियों के बराबर हो सके। खत्म करना पोषक तत्व उतार चढ़ाव उच्च ग्लूकोज एकाग्रता 3 के बावजूद सेल पैदावार (चित्रा 3) में वृद्धि हुई। अंडाकार आकृति का आकार भी 2 डी सूक्ष्म आकलन (मानक प्रकाश माइक्रोस्कोपी साहित्य 3 में वर्णित) द्वारा संस्कृति अवधि के अंत में मापा गया था, और CF-एसएसबी संस्कृतियों में spheroids कि काफी बड़े थे (पी <0.02, छात्र-टी परीक्षण) स्टेटिक में या साहित्य 3 में सूचना के रूप में मानक एसएसबी संस्कृतियों। इन टिप्पणियों CF-एसएसबी संस्कृतियों में एक उच्च विकास दर का सुझाव जबकि व्यवहार्यता एक ही उच्च स्तर (96.23 ± 0.85%) संस्कृति हालत की परवाह किए बिना पर बनाए रखा गया था सेल गिनती डेटा समर्थन करते हैं। लगातार खिलाया एसएसबी (CF-एसएसबी) संस्कृति प्रणाली अंडाकार आकृति संस्कृतियों में पोषक तत्व उतार-चढ़ाव का सफाया कर दिया, और सेल की वृद्धि दर में सुधार हुआ है, लेकिन ग्लूकोज का स्तर सुपर शारीरिक जो आगे भी छोटा सा भूत रोका हो सकता बने सेल विस्तार में rovement (चित्रा 2)। आगे CF-एसएसबी संस्कृति प्रणाली पर सुधार करने के लिए, एक एल्गोरिथ्म एसएसबी संस्कृतियों में ग्लूकोज के स्तर के नियंत्रण में सुधार के लक्ष्य के साथ संस्कृति की अवधि के दौरान चारा दर को समायोजित करने के लिए इस्तेमाल किया गया था।

    समायोजित फ़ीड दर की गणना

    कई कारकों फ़ीड दर की गणना के अनुरूप ग्लूकोज के स्तर को बनाए रखने के लिए के लिए विचार किया जा सकता है। हित के विशिष्ट कारकों एक अध्ययन के लिए दिया जाता है और एक विशेष सेल लाइन के लिए बदला जा सकता है। इस प्रदर्शन के प्रयोजन के लिए, हम विकास दर और ग्लूकोज की खपत पिछले संस्कृतियों से चुना गया है, साथ ही समायोजन 3 के समय में वास्तविक ग्लूकोज के स्तर पर विचार किया। चारा दर समायोजन समय में किसी भी अंतराल पर बनाया जा सकता है। इस प्रदर्शन के लिए, नमूने एकत्र किए गए थे और चारा दर के रूप में वर्णित अनुक्रमिक गणना के आधार पर हर तीन दिन समायोजित किया गया।

    टी "> भविष्यवाणी की वृद्धि दर की गणना

    1 समीकरण संस्कृति की एक निश्चित अवधि के दौरान सेल के विकास की भविष्यवाणी की कोशिकाओं की संख्या के साथ (एन 2) भविष्य में कुछ समय में संस्कृति में कोशिकाओं की उम्मीद की कुल संख्या का प्रतिनिधित्व भविष्यवाणी की है। इस पद्धति का एक रेखीय विकास दर सन्निकटन जहां मौजूदा कोशिकाओं की संख्या (एन 1) संस्कृति अवधि (टी 2 आयकर 1) से गुणा अंडाकार आकृति संस्कृतियों (आर जी) में कोशिकाओं की अनुमानित विकास दर को जोड़ा जाता है का उपयोग करता है।

    1 समीकरण (1)

    परिकलित आधारभूत फ़ीड दर

    आधारभूत फ़ीड दर (आर एफ) संस्कृति अवधि (अंश) के दौरान ग्लूकोज संस्कृति में भस्म का आकलन और चारा माध्यम में ग्लूकोज एकाग्रता से विभाजित (सी एफ द्वारा 2 समीकरण का उपयोग कर की गणना की गई 1 और 2 एन की भारित औसत द्वारा दिए गए सेल प्रकार (आर 1) के लिए पहले से निर्धारित ग्लूकोज की खपत दर गुणा इस खपत की दर तो ग्लूकोज एकाग्रता से विभाजित किया गया था द्वारा अनुमान लगाया गया है (सी एफ) चारा माध्यम में औसत मध्यम फ़ीड दर ग्लूकोज ही संस्कृति की अवधि के दौरान खपत की जगह की जरूरत गणना करने के लिए।

    2 समीकरण (2)

    मनाया शर्करा की मात्रा के साथ समायोजन फ़ीड दर

    आगे समायोजन आधारभूत फ़ीड दर करने के लिए किए गए थे समीकरण 3. यह ग्लूकोज से समायोजित फ़ीड दर (GAFR) का उपयोग चुना समय बिंदु पर मापा जाता ग्लूकोज का स्तर (सी 1) को समायोजित करने के स्तर को बनाए रखने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है जब विकास या मौत में अप्रत्याशित परिवर्तन संस्कृति में होते हैं। इस equatio n एक नियंत्रण निरंतर (एक्स) शामिल है, और 0.5 का एक मूल्य के इन आंकड़ों 3 के लिए इस्तेमाल किया गया था। सी 1 ग्लूकोज एकाग्रता नमूना दिन पर संस्कृति के माध्यम में मापा का प्रतिनिधित्व करता है, और सी डी लक्ष्य मध्यम ग्लूकोज एकाग्रता का प्रतिनिधित्व करता है। अंतिम मूल्य के दूसरे गणना से फीड दर की भविष्यवाणी समायोजित करता है।

    3 समीकरण (3)

    आकृति 1
    चित्रा 1: के साथ बहिर्वाह ट्यूब सतत खिला प्रणाली आरेख। (ए) का प्रदर्शन किया प्रणाली का आरेख। (बी) fritted गिलास फिल्टर बहिर्वाह ट्यूब पर रखा मध्यम कोशिकाओं की हानि के बिना संस्कृति से हटाया जा करने की अनुमति है। चित्रा अनुमति के साथ reproduced। 3

    /files/ftp_upload/52224/52224fig2.jpg "/>
    चित्रा 2:। एसएसबी, CF-एसएसबी, और समायोजित CF-एसएसबी संस्कृतियों के लिए ग्लूकोज माप (ए) β-TC6 अंडाकार आकृति स्थिर, एसएसबी, और CF-एसएसबी संस्कृति तरीकों का उपयोग और मानक उच्च ग्लूकोज माध्यम के साथ खिला संस्कृतियों से मध्यम ग्लूकोज माप। निरंतर खिला ग्लूकोज उतार-चढ़ाव को खत्म करने में सक्षम है, लेकिन नाटकीय रूप से संस्कृति की अवधि के दौरान, और अभी तक शारीरिक सीमा के ऊपर मध्यम परिवर्तन में शर्करा की मात्रा औसत (ग्रे पट्टी ने संकेत दिया)। समायोजित खिला उतार-चढ़ाव को खत्म करने के साथ ही संस्कृति अवधि की अवधि के लिए शारीरिक स्तर के पास ग्लूकोज सांद्रता बनाए रखने में सक्षम है। ग्लूकोज माप के लिए त्रुटि सलाखों भी पैमाने से पता चला (मानक त्रुटि सभी मापन के लिए ≤ 4%) पर दिखाई करने के लिए छोटे हैं। आंकड़ों से डेटा अनुमति के साथ पिछले प्रकाशन में प्रस्तुत किया है। 3


    चित्रा 3: एसएसबी, CF-एसएसबी से कोशिकाओं की गिनती, और समायोजित विकास समायोजित फ़ीड दरों के साथ CF-एसएसबी संस्कृतियों सेल विकास 21 दिन की अवधि संस्कृति निरंतर फ़ीड दर के खिलाफ नियमित रूप से मध्यम परिवर्तन के साथ एसएसबी की तुलना दौरान सेल नंबर में परिवर्तन के रूप में गुना की सूचना दी। एसएसबी संस्कृतियों और समायोजित फ़ीड दर एसएसबी संस्कृतियों। त्रुटि सलाखों मतलब की मानक त्रुटि रिपोर्ट, और पी मूल्यों सूचना एक संयुक्त राष्ट्र बनती दो पूंछ छात्र-टी सांख्यिकीय परीक्षण के लिए कर रहे हैं। अनुमति के साथ Reproduced। 3

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Discussion

    58 - जैविक एजेंटों की और सेल उपचार के लिए उत्पादन के लिए स्तनधारी सेल उत्पादों सृजन संस्कृति और बड़े पैमाने पर 55 में स्तनधारी कोशिकाओं की निगरानी की आवश्यकता है। इसके अलावा, इन आवेदनों में परिभाषित किया और पुष्टि संस्कृति की स्थिति के लिए कहते हैं। सीधे शब्दों में अनुसंधान तकनीकों का प्रयोग कर इन सभी आवश्यकताओं को पूरा नहीं होगा कोशिकाओं की मात्रा बढ़ रही है। मैनुअल मध्यम पोषक तत्वों और अपशिष्ट उत्पादों के buildup में उतार चढ़ाव के कारण परिवर्तन सेल गुणवत्ता, व्यवहार्यता और उपज कम हो। बायोरिएक्टर का उपयोग अच्छी तरह से जैव औषधि अनुप्रयोगों के लिए सूक्ष्मजीवों के वाणिज्यिक संस्कृति के लिए स्थापित किया गया है, और इसी तरह की रणनीतियों स्तनधारी सेल संस्कृतियों के लिए लागू किया गया है। अपने वातावरण के साथ स्तनधारी कोशिकाओं के जटिल बातचीत के क्रम में सेल विस्तार संभावित अनुकूलन करने में पोषक तत्वों के स्तर को विनियमित करने के लिए कोई विशिष्ट संशोधन जरूरी है।

    इन मुद्दों का समाधान करने के लिए, हम एक विकसित straightforward विधि एक विशिष्ट लक्षित रेंज में ग्लूकोज के स्तर को बनाए रखने के लिए, एक समायोज्य दर छिड़काव खिला तंत्र के साथ एक उभारा निलंबन बायोरिएक्टर में शारीरिक स्तर का अनुमान करने। इसे पूरा करने के लिए एक बीटा सेल लाइन के spheroids एक उभारा निलंबन बायोरिएक्टर में उत्पन्न किया गया। एक छिड़काव खिला प्रणाली मानक बैच खिला प्रक्रियाओं को बदलने के लिए एक सतत खिला तंत्र प्रदान करने के लिए नियुक्त किया गया था। सेल विकास दर मनाया, और अनुमानित ग्लूकोज का उपयोग दर की भविष्यवाणी करने के लिए इस्तेमाल किया गया। वास्तविक शर्करा की मात्रा भी संस्कृति में समय वास्तविक पोषक तत्वों का सेवन किया और चयापचय उत्पादों कोशिकाओं द्वारा मध्यम में जमा करने के लिए प्रतिक्रिया में फीड दरों को समायोजित करने के लिए खत्म मापा गया। इस विधि में शर्करा की मात्रा अन्य स्थिर और एसएसबी सिस्टम 3 जहां ग्लूकोज का स्तर मध्यम परिवर्तन के साथ नाटकीय रूप से उतार-चढ़ाव हर 3 दिन के साथ देखा में उतार-चढ़ाव को रोका। बैच-खिला रणनीतियों का उपयोग करना, ग्लूकोज सांद्रता के रूप में ज्यादा के रूप में 275 एमजी / डीएल तीन दिनों में गिरा, अंतिम चरण में21 दिन विस्तार में है। ग्लूकोज के स्तर में उतार चढ़ाव ये सेल उपज सीमित है।

    समायोजित खिला प्रणाली की स्थापना की एक विकास दर और सेल लाइन के लिए ग्लूकोज की खपत दर निगमित के प्रदर्शन के लिए मध्यम प्रतिस्थापन दर, के रूप में अच्छी तरह के रूप में मनाया (मापा) संस्कृति घनत्व और प्रत्येक खिला समय बिंदु पर शर्करा की मात्रा की गणना। विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं के लिए, या अधिक जटिल टिशू कल्चर सिस्टम के लिए, इन मान्यताओं सही पकड़ नहीं सकता है। अधिक सटीक ग्लूकोज नियंत्रण सुनिश्चित करने के लिए, कलन विधि भी अलग-अलग संस्कृतियों की परिवर्तनशीलता के लिए खाते में एक प्रतिक्रिया नियंत्रण प्रणाली शामिल थे। एक छिड़काव विधि की सीमाओं अकेले विकास दर के आधार पर, spheroids और इस तरह के फर्क स्टेम कोशिकाओं के रूप में ग्लूकोज की खपत में परिवर्तन के मापदंडों के आधार पर भर कोशिकाओं के लिए ग्लूकोज उपयोग में विविधता के प्रभाव सहित, एक प्रतिक्रिया नियंत्रण प्रणाली द्वारा कम किया जा सकता है। आवेदन के आधार पर, कोशिकाओं है कि expone का प्रदर्शनntial विकास दर या अधिक जटिल विकास प्रोफाइल एल्गोरिथ्म के प्रदर्शन में सुधार करने के लिए लागू किया जा सकता है। मान्यताओं और मूल्यों फ़ीड दर की गणना के लिए इस्तेमाल किया वास्तविक संस्कृति शर्तों का पालन करने के लिए बदला जा सकता है।

    प्रस्तुत तरीकों एक चिकित्सकीय जिसमें आवेदन के विस्तार और spheroids की संस्कृति एक सीमित अवधि के लिए होगा के लिए कोशिकाओं का उत्पादन करने का इरादा कर रहे हैं, और कोशिकाओं को स्वयं उत्पाद कर रहे हैं .. यह कुछ जांचकर्ताओं लगातार विस्तार या संस्कृति की कोशिकाओं के लिए के लिए उपयोग कर वांछनीय हो सकता है इसी तरह की एक विधि है, लेकिन यह इन अध्ययनों के लिए सामना नहीं अन्य चुनौतियों को प्रस्तुत करेंगे। अगर विस्तारित अवधि के लिए सुसंस्कृत, spheroids आकार में विकसित करने के लिए जारी रहेगा, और अंडाकार आकृति के नाभिक में कुछ कोशिकाओं की व्यवहार्यता की वजह से पोषक तत्व और ऑक्सीजन प्रसार सीमाओं को बढ़ाने के लिए पीड़ित हो सकता है। इन संस्कृतियों बड़े spheroids अलग कर देना करने के लिए जब लंबी अवधि संस्कृतियों वांछित हैं इस सीमा को रोकने के लिए आगे जोड़तोड़ की आवश्यकता हो सकती है।व्यवहार्यता में कोई कमी इस प्रोटोकॉल के साथ उत्पन्न spheroids के लिए मनाया गया, सुझाव है कि इस सीमा के इस अध्ययन की 21 दिन की अवधि के दौरान संस्कृति पहुँच नहीं किया गया था।

    सेलुलर उपचार के लिए, इन तकनीकों अतिरिक्त नियामक प्रणाली के साथ संयोजन में इस्तेमाल किया जा सकता सेल उपज, समारोह और व्यवहार्यता में सुधार होगा। उदाहरण के लिए, एसएसबी विधि पक्षपाती कोशिकाओं कोशिकाओं की वृद्धि दर, या कोशिकाओं या spheroids के encapsulation में सुधार करने के लिए माइक्रो-वाहक सतह संस्कृतियों सहित सुविधाजनक बनाने प्रौद्योगिकियों के साथ जोड़ा जा सकता है। इसके अलावा, अधिक जटिल समायोजन एल्गोरिदम तंग संस्कृति नियंत्रण प्रदान करने के लिए लागू किया जा सकता है। दूध पिलाने समायोजन ऐसे पीएच के रूप में कई अन्य मानकों के नियंत्रण, भंग ऑक्सीजन एकाग्रता, तापमान, और इंजेक्शन अभिकर्मकों के आगे सुधार 59,60 बनाने के लिए के साथ जोड़ा जा सकता है। अन्य अनुप्रयोगों में परिणामों में सुधार करने के लिए, इस विधि 15,24 स्वचालित किया जा सकता है, और चारा दरों मीटर की गणना की जा सकती हैअयस्क या कम अक्सर, आगे शोधन संस्कृति की स्थिति।

    विनिर्माण प्रक्रियाओं को 61 - 63 परिभाषित किया जाना चाहिए और ध्यान से प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य जैविक उत्पादों को बनाने के लिए नियंत्रित। निरंतर मध्यम प्रतिस्थापन का उपयोग बड़े पैमाने पर सेल के उत्पादन में मनाया महत्वपूर्ण पोषक तत्वों में उतार चढ़ाव को कम करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, और एक समायोज्य खिला प्रणाली को शामिल करने के लिए वांछित पोषक तत्वों का स्तर बनाए रखने के लिए सेल पर्यावरण पर भी अधिक नियंत्रण लागू कर सकते हैं। वर्णित विधि दोनों सेलुलर और दवा उत्पादों के लिए अन्य स्तनधारी कोशिकाओं के साथ इस्तेमाल किया जा सकता है।

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    β TC-6 Cells ATCC, Manassas, VA CRL-11506 Mouse Insulinoma cell line (adherent cell type)
    DPBS No Ca, No Mg Invitrogen, Carlsbad, CA 14190-144 https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/14190144?ICID=search-14190144
    Dulbecco's Modified Eagles Medium Invitrogen, Carlsbad, CA See below for product numbers 
    DMEM High Glucose (500 mM) Invitrogen, Carlsbad, CA 11965-092 http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/11965092
    DMEM Low Glucose (100 mM) Invitrogen, Carlsbad, CA 11885-084 http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/11885084 (note that this medium already contains pyruvate)
    L-glutamine Invitrogen, Carlsbad, CA 25030081 http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/25030081?ICID=search-product
    Sodium Pyruvate Invitrogen, Carlsbad, CA 11360070 https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/11360070?ICID=search-product
    Heat Inactivated Porcine Serum Gibco - Life Technologies 10082147 http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/10082147
    Trypsin-EDTA Invitrogen, Carlsbad, CA 25200056 https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/25200056?ICID=search-product
    T-150 Tissue Culture Treated Flasks Corning, Corning, NY 430825 http://catalog2.corning.com/LifeSciences/en-US/Shopping/ProductDetails.aspx?productid=430825(Lifesciences)
    &categoryname=
    NuAire Cell culture incubator Princeton, MN US Autoflow. Any water-jacketed CO2 regulating cell culture incubator could be used.
    Centrifuge Sorvall RT 7 (Any similar benchtop centrifuge may be used)
    Refrigerator Any laboratory refrigerator could be used (a small table-top version was used for these studies)
    1 L Glass Bottle Corning, Corning, NY 1395-1L Any vendor could be used. http://catalog2.corning.com/LifeSciences/en-US/Shopping/ProductDetails.aspx?productid=1395-1L(Lifesciences)
    &categoryname=
    2 L Glass Bottle Corning, Corning, NY 1395-2L Any vendor could be used
    250 ml stirred bioreactors  Corning, Corning, NY 4500-250 http://catalog2.corning.com/LifeSciences/en-US/Shopping/ProductDetails.aspx?productid=4500-250(Lifesciences)
    &categoryname=
    Stir Plate Fisher Scientific 11-496-104A Any incubator safe stir-plate can be used, any vendor
    Tissue Culture Dishes 100 mm Diameter Nunc, Rochester, NY (Fisher Scientific) 1256598  Any vendor could be used (ordered through Fisher Sci)
    FALCON 50 ml Conical Tubes Falcon, San Jose, CA 1256598 Any vendor could be used
    Delran Plastic Used for Custom Parts McMaster Carr Various Any material of choice could be used, but Deran is chosen because it is autoclave safe, non-reactive, and easy to machine. http://www.mcmaster.com/#acetal-homopolymer-sheets/=rjrcac
    Stainless Steel Pipe for custom lids McMaster Carr Various Any vendor could be used. http://www.mcmaster.com/#standard-stainless-steel-tubing/=rjrd91
    Custom Modified Delran Bioreactor Lids for Continuous Feeding Custom made Not aware of any vendors producing a similar product
    Custom Modified Glass Bottle Lids for Continuous feeding Custom made Some vendors (e.g., Fischer Sci, Corning) make similar products in the links below.
    Masterflex Digital Peristaltic Pump Cole Parmer, Vernon Hills, IL EW-77919-25 Any precision peristaltic pump could be used. http://www.coleparmer.com/Product/L_S_Eight_Channel_Four_Roller_
    Cartridge_Pump_System_115_230
    _VAC/EW-77919-25
    PVDF Tubing Connectors (various) Cole Parmer, Vernon Hills, IL see link Any vendor could be used. http://www.coleparmer.com/Category/Cole_Parmer_PVDF_Premium
    _Luer_Fittings/55889
    Pharmed BPT Tubing L/S 16 Cole Parmer, Vernon Hills, IL WU-06508-16 Any vendor could be used. http://www.coleparmer.com/Product/Masterflex_PharMed_BPT_Tubing
    _L_S_13_25/WU-06508-16
    Pharmed BPT Tubing L/S 14 Cole Parmer, Vernon Hills, IL WU-06508-14 Any vendor could be used. http://www.coleparmer.com/Product/Masterflex_PharMed_BPT_Tubing
    _L_S_13_25/WU-06508-14
    Pharmed BPT Tubing L/S 13 Cole Parmer, Vernon Hills, IL WU-06508-13 Any vendor could be used. http://www.coleparmer.com/Product/Masterflex_PharMed_BPT_Tubing
    _L_S_13_25/WU-06508-13
    Millipore Millex GP PES membrane 0.22 µl sterile syringe filter (used for venting, and medium filtration) Fisher Scientific SLGP033RS Any vendor could be used
    25 ml Graduated Pipette Fisher Scientific 13-678-11 Any vendor could be used, and various sizes may be used
    Pipetter Fisher Scientific 13-681-15E Any vendor, or similar product could be used
    Hemocytometer Fisher Scientific 02-671-6 Any vendor, or similar product could be used
    Trypan Blue Gibco - Life Technologies 15250-061 Any vendor, or similar product could be used. https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/15250061
    Inverted Light Microscope Leica Any vendor, or similar product could be used
    One Touch Ultra Blood Glucose Meter Fisher Scientific 22-029-293 Any vendor, or similar product could be used (e.g., Bayer)
    One Touch Ultra-Strips Fisher Scientific 22-029-292  Any vendor, or similar product could be used (e.g., Bayer)

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Reuveny, S., Velez, D., Macmillan, J. D., Miller, L. Factors affecting cell growth and monoclonal antibody production in stirred reactors. J. Immunol. Methods. 86 (1), 53-59 (1986).
    2. Tarleton, R. L., Beyer, A. M. Medium-scale production and purification of monoclonal antibodies in protein-free medium. Biotechniques. 11 (5), 590-593 (1991).
    3. Weegman, B. P., et al. Nutrient regulation by continuous feeding removes limitations on cell yield in the large-scale expansion of Mammalian cell spheroids. PLoS One. 8 (10), e76611 (2013).
    4. Klueh, U., et al. Continuous glucose monitoring in normal mice and mice with prediabetes and diabetes. Diabetes Technol. Ther. 8 (3), 402-412 (2006).
    5. Hay, R. J. Operator-induced contamination in cell culture systems. Dev. Biol. Stand. 75, 193-204 (1991).
    6. Dazey, B., Duchez, P., Letellier, C., Vezon, G., Ivanovic, Z. Cord blood processing by using a standard manual technique and automated closed system "Sepax" (Kit CS-530). Stem Cells Dev. 14 (1), 6-10 (2005).
    7. Gastens, M. H., et al. Good manufacturing practice-compliant expansion of marrow-derived stem and progenitor cells for cell therapy. Cell Transplant. 16 (7), 685-696 (2007).
    8. Naing, M. W., Williams, D. J. Three-dimensional culture and bioreactors for cellular therapies. Cytotherapy. 13 (4), 391-399 (2011).
    9. Stacey, G. N. Cell culture contamination. Cancer Cell Culture. , Methods Mol Biol; 731. Humana Press. Totowa, NJ. 79-91 (2011).
    10. Zur Nieden, I. N., Cormier, J. T., Rancourt, D. E., Kallos, M. S. Embryonic stem cells remain highly pluripotent following long term expansion as aggregates in suspension bioreactors. J. Biotechnol. 129 (3), 421-432 (2007).
    11. Kehoe, D. E., Jing, D., Lock, L. T., Tzanakakis, E. S. Scalable stirred-suspension bioreactor culture of human pluripotent stem cells. Tissue Eng. Part A. 16 (2), 405-421 (2010).
    12. Krawetz, R., et al. Large-scale expansion of pluripotent human embryonic stem cells in stirred-suspension bioreactors. Tissue Eng. Part C. Methods. 16 (4), 573-582 (2010).
    13. Shafa, M., et al. Expansion and long-term maintenance of induced pluripotent stem cells in stirred suspension bioreactors. J. Tissue Eng. Regen. Med. 6 (6), 462-472 (2012).
    14. Oh, S. K. W., et al. Long-term microcarrier suspension cultures of human embryonic stem cells. Stem Cell Res. 2 (3), 219-230 (2009).
    15. Olmer, R., et al. Suspension culture of human pluripotent stem cells in controlled, stirred bioreactors. Tissue Eng. Part C. Methods. 18 (10), 772-784 (2012).
    16. Baptista, R. P., Da Fluri,, Zandstra, P. W. High density continuous production of murine pluripotent cells in an acoustic perfused bioreactor at different oxygen concentrations. Biotechnol. Bioeng. 110 (2), 648-655 (2013).
    17. Papas, K. K. Characterization of the metabolic and secretory behavior of suspended free and entrapped ART-20 spheroids in fed-batch and perfusion cultures [dissertation]. , Georgia Institute of Technology. Atlanta, GA. (1992).
    18. Papas, K. K., Constantinidis, I., Sambanis, A. Cultivation of recombinant, insulin-secreting AtT-20 cells as free and entrapped spheroids. Cytotechnology. 13 (1), 1-12 (1993).
    19. Sambanis, A., Papas, K. K., Flanders, P. C., Long, R. C., Kang, H., Constantinidis, I. Towards the development of a bioartificial pancreas: immunoisolation and NMR monitoring of mouse insulinomas. Cytotechnology. 15 (1-3), 351-363 (1994).
    20. Sharma, S., Raju, R., Sui, S., Hu, W. -S. Stem cell culture engineering - process scale up and beyond. Biotechnol. J. 6 (11), 1317-1329 (2011).
    21. Papas, K. K., Long, R. C., Constantinidis, I., Sambanis, A. Role of ATP and Pi in the mechanism of insulin secretion in the mouse insulinoma betaTC3 cell line. Biochem. J. 326 (Pt 3), 807-814 (1997).
    22. Papas, K. K., Long, R. C., Sambanis, A., Constantinidis, I. Development of a bioartificial pancreas: I. long-term propagation and basal and induced secretion from entrapped betaTC3 cell cultures. Biotechnol. Bioeng. 66 (4), 219-230 (1999).
    23. Papas, K. K., Long, R. C., Sambanis, A., Constantinidis, I. Development of a bioartificial pancreas: II. Effects of oxygen on long-term entrapped betaTC3 cell cultures. Biotechnol. Bioeng. 66 (4), 231-237 (1999).
    24. Hu, W. S. Cell culture process monitoring and control-a key to process optimization. Cytotechnology. 14 (3), 155-156 (1994).
    25. Alfred, R., et al. Efficient suspension bioreactor expansion of murine embryonic stem cells on microcarriers in serum-free medium. Biotechnol. Prog. 27 (3), 811-823 (2011).
    26. Cormier, J. T., zur Nieden, N. I., Rancourt, D. E., Kallos, M. S. Expansion of undifferentiated murine embryonic stem cells as aggregates in suspension culture bioreactors. Tissue Eng. 12 (11), 3233-3245 (2006).
    27. Dang, S. M., Zandstra, P. W. Scalable production of embryonic stem cell-derived cells. Methods Mol. Biol. 290 (1), 353-364 (2005).
    28. Elseberg, C. L., et al. Microcarrier-based expansion process for hMSCs with high vitality and undifferentiated characteristics. Int. J. Artif. Organs. 35 (2), 93-107 (2012).
    29. Kallos, M. S., Behie, L. A. Inoculation and growth conditions for high-cell-density expansion of mammalian neural stem cells in suspension bioreactors. Biotechnol. Bioeng. 63 (4), 473-483 (1999).
    30. Kehoe, D. E., Lock, L. T., Parikh, A., Tzanakakis, E. S. Propagation of embryonic stem cells in stirred suspension without serum. Biotechnol. Prog. 24 (6), 1342-1352 (2008).
    31. Kirouac, D. C., Zandstra, P. W. The systematic production of cells for cell therapies. Cell Stem Cell. 3 (4), 369-381 (2008).
    32. Serra, M., et al. Stirred bioreactors for the expansion of adult pancreatic stem cells. Ann. Anat. 191 (1), 104-115 (2009).
    33. Chawla, M., Bodnar, C. A., Sen, A., Kallos, M. S., Behie, L. A. Production of islet-like structures from neonatal porcine pancreatic tissue in suspension bioreactors. Biotechnol. Prog. 22 (2), 561-567 (2006).
    34. Weegman, B. P., et al. Temperature profiles of different cooling methods in porcine pancreas procurement. Xenotransplantation. , (2014).
    35. Cruz, H. J., Moreira, J. L., Carrondo, M. J. Metabolic shifts by nutrient manipulation in continuous cultures of BHK cells. Biotechnol. Bioeng. 66 (2), 104-113 (1999).
    36. Dowd, J. E., Jubb, A., Kwok, K. E., Piret, J. M. Optimization and control of perfusion cultures using a viable cell probe and cell specific perfusion rates. Cytotechnology. 42 (1), 35-45 (2003).
    37. Goudar, C., Biener, R., Zhang, C., Michaels, J., Piret, J., Konstantinov, K. Towards industrial application of quasi real-time metabolic flux analysis for mammalian cell culture. Cell Culture Engineering. 101, Adv. Biochem. Eng. Biotechnol; 101. Springer Berlin Heidelberg. Berlin, Heidelberg. 99-118 (2006).
    38. Hu, W. S., Piret, J. M. Mammalian cell culture processes. Curr. Opin. Biotechnol. 3 (2), 110-114 (1992).
    39. Knaack, D., et al. Clonal insulinoma cell line that stably maintains correct glucose responsiveness. Diabetes. 43 (12), 1413-1417 (1994).
    40. Poitout, V., Stout, L. E., Armstrong, M. B., Walseth, T. F., Sorenson, R. L., Robertson, R. P. Morphological and functional characterization of beta TC-6 cells--an insulin-secreting cell line derived from transgenic mice. Diabetes. 44 (3), 306-313 (1995).
    41. Poitout, V., Olson, L. K., Robertson, R. P. Insulin-secreting cell lines: classification, characteristics and potential applications. Diabetes Metab. 22 (1), 7-14 (1996).
    42. Suzuki, R., et al. Cyotomedical therapy for insulinopenic diabetes using microencapsulated pancreatic beta cell lines. Life Sci. 71 (15), 1717-1729 (2002).
    43. Skelin, M., Rupnik, M., Cencic, A. Pancreatic beta cell lines and their applications in diabetes mellitus research. ALTEX. 27 (2), 105-113 (2010).
    44. Masters, J. R., Stacey, G. N. Changing medium and passaging cell lines. Nat. Protoc. 2 (9), 2276-2284 (2007).
    45. Murdoch, T. B., McGhee-Wilson, D., Shapiro, A. M. J., Lakey, J. R. T. Methods of human islet culture for transplantation. Cell Transplant. 13 (6), 605-617 (2004).
    46. Woodside, S. M., Bowen, B. D., Piret, J. M. Mammalian cell retention devices for stirred perfusion bioreactors. Cytotechnology. 28 (1-3), 163-175 (1998).
    47. Serra, M., et al. Improving expansion of pluripotent human embryonic stem cells in perfused bioreactors through oxygen control. J. Biotechnol. 148 (4), 208-215 (2010).
    48. Gálvez, J., Lecina, M., Solà, C., Cairó, J., Gòdia, F. Optimization of HEK-293S cell cultures for the production of adenoviral vectors in bioreactors using on-line OUR measurements. J. Biotechnol. 157 (1), 214-222 (2012).
    49. Trabelsi, K., Majoul, S., Rourou, S., Kallel, H. Development of a measles vaccine production process in MRC-5 cells grown on Cytodex1 microcarriers and in a stirred bioreactor. Appl. Microbiol. Biotechnol. 93 (3), 1031-1040 (2012).
    50. Liu, H., et al. A high-yield and scaleable adenovirus vector production process based on high density perfusion culture of HEK 293 cells as suspended aggregates. J. Biosci. Bioeng. 107 (5), 524-529 (2009).
    51. Zhi, Z., Liu, B., Jones, P. M., Pickup, J. C. Polysaccharide multilayer nanoencapsulation of insulin-producing beta-cells grown as pseudoislets for potential cellular delivery of insulin. Biomacromolecules. 11 (3), 610-616 (2010).
    52. Lock, L. T., Laychock, S. G., Tzanakakis, E. S. Pseudoislets in stirred-suspension culture exhibit enhanced cell survival, propagation and insulin secretion. J. Biotechnol. 151 (3), 278-286 (2011).
    53. Marchenko, S., Flanagan, L. Counting human neural stem cells. J. Vis. Exp. (7), e262 (2007).
    54. Campos, C. Chronic hyperglycemia and glucose toxicity: pathology and clinical sequelae. Postgrad. Med. 124 (6), 90-97 (2012).
    55. Eve, D. J., Fillmore, R., Borlongan, C. V., Sanberg, P. R. Stem cells have the potential to rejuvenate regenerative medicine research. Med. Sci. Monit. 16 (10), RA197-RA217 (2010).
    56. Hsiao, L. -C., Carr, C., Chang, K. -C., Lin, S. -Z., Clarke, K. Review Article: Stem Cell-based Therapy for Ischemic Heart Disease. Cell Transplant. , (2012).
    57. Oldershaw, R. A. Cell sources for the regeneration of articular cartilage: the past, the horizon and the future. Int. J. Exp. Pathol. 93 (6), 389-400 (2012).
    58. De Coppi, P. Regenerative medicine for congenital malformations. J. Pediatr. Surg. 48 (2), 273-280 (2013).
    59. Tziampazis, E., Sambanis, A. Modeling of cell culture processes. Cytotechnology. 14 (3), 191-204 (1994).
    60. Sidoli, F. R., Mantalaris, A., Asprey, S. P. Modelling of Mammalian cells and cell culture processes. Cytotechnology. 44 (1-2), 27-46 (2004).
    61. Yim, R. Administrative and research policies required to bring cellular therapies from the research laboratory to the patient’s bedside. Transfusion. 45, Suppl 4. 144S-158S (2005).
    62. Fink, D. W. FDA regulation of stem cell-based products. Science. 324 (5935), 1662-1663 (2009).
    63. Moos, M. Stem-cell-derived products: an FDA update. Trends Pharmacol. Sci. 29 (12), 591-593 (2008).

    Tags

    जैव अभियांत्रिकी अंक 115 ग्लूकोज पोषक तत्व विनियमन निरंतर खिला हड़कंप मच गया निलंबन बायोरिएक्टर विस्तार अंडाकार आकृति संस्कृति बायोरिएक्टर
    Spheroids में स्तनधारी कोशिकाओं के बड़े पैमाने पर विस्तार के लिए सतत खिलाने से पोषक तत्व विनियमन
    Play Video
    PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

    Cite this Article

    Weegman, B. P., Essawy, A., Nash,… More

    Weegman, B. P., Essawy, A., Nash, P., Carlson, A. L., Voltzke, K. J., Geng, Z., Jahani, M., Becker, B. B., Papas, K. K., Firpo, M. T. Nutrient Regulation by Continuous Feeding for Large-scale Expansion of Mammalian Cells in Spheroids. J. Vis. Exp. (115), e52224, doi:10.3791/52224 (2016).

    Less
    Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
    View Video

    Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

    Waiting X
    Simple Hit Counter