Nutrient regulation using continuous growth adjusted feeding improves growth rates of mammalian cell spheroids compared to intermittent batch feeding for cultures in stirred suspension bioreactors. This study demonstrates the methods required for establishing simple adjusted rate fed cultures.
In this demonstration, spheroids formed from the β-TC6 insulinoma cell line were cultured as a model of manufacturing a mammalian islet cell product to demonstrate how regulating nutrient levels can improve cell yields. In previous studies, bioreactors facilitated increased culture volumes over static cultures, but no increase in cell yields were observed. Limitations in key nutrients such as glucose, which were consumed between batch feedings, can lead to limitations in cell expansion. Large fluctuations in glucose levels were observed, despite the increase in glucose concentrations in the media. The use of continuous feeding systems eliminated fluctuations in glucose levels, and improved cell growth rates when compared with batch fed static and SSB culture methods. Additional increases in growth rates were observed by adjusting the feed rate based on calculated nutrient consumption, which allowed the maintenance of physiological glucose over three weeks in culture. This method can also be adapted for other cell types.
आदेश में प्रत्यारोपण के लिए व्यवहार्य और कार्यात्मक मानव कोशिकाओं की बड़ी संख्या उत्पन्न करने के लिए, संस्कृति की स्थिति के नियमन के लिए जरूरी है। 3 – पोषक तत्वों की कमी, चयापचय अपशिष्ट के buildup के साथ वार्धक्य और चयापचय में परिवर्तन है कि सेल उत्पाद 1 की गुणवत्ता को कम करने के लिए प्रमुख योगदान कर रहे हैं। यह प्रक्रिया एक समायोजित दर छिड़काव खिला प्रणाली के साथ संयुक्त एक उभारा बायोरिएक्टर का उपयोग करते हुए संस्कृति की अवधि के दौरान एक शारीरिक सीमा 4 में ग्लूकोज को विनियमित करने के लिए spheroids में संस्कृति स्तनधारी कोशिकाओं के लिए एक विधि को दर्शाता है। इन अध्ययनों के प्रयोजन के लिए, शारीरिक सीमा 100 और 200 एमजी / डीएल के बीच के रूप में परिभाषित किया गया था। एक ही तरीके का अन्य पोषक तत्वों और ऐसे लैक्टेट के रूप में चयापचय अपशिष्ट को विनियमित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
छोटी मात्रा में स्टेटिक संस्कृतियों (1 – 30 मिलीलीटर) आम तौर पर बनाए रखने और experime के लिए सेल लाइनों को अलग करने के लिए प्रयोगशाला स्थापित करने में उपयोग किया जाता हैntal प्रयोजनों। सेल passaging पूरा मध्यम परिवर्तन के रूप में नियमित अंतराल पर जरूरत के साथ किया जाता है। अधिकांश "पारंपरिक" संस्कृति के माध्यम से एक उच्च ग्लूकोज एकाग्रता (इन अध्ययनों में प्रयुक्त DMEM के लिए 450 एमजी / डीएल) पोषक तत्व सीमाओं के जोखिम के बिना लगातार कम मध्यम परिवर्तन के लिए अनुमति देने के लिए है। हालांकि, इस बैच खिला पद्धति अभी भी लगातार हेरफेर की आवश्यकता है, सेल के माहौल में परिवर्तनशीलता का परिचय है, और प्रदूषण 5 का खतरा बढ़ जाता है – 9। उभारा निलंबन बायोरिएक्टर (एसएसबी) बेहतर मिश्रण प्रदान करते हैं और 3,10 से निपटने में कमी आई है – 20, लेकिन स्थिर संस्कृतियों की तरह, मैनुअल मध्यम परिवर्तन है कि पोषक तत्व और अपशिष्ट उत्पाद के स्तर में संभावित हानिकारक उतार-चढ़ाव के योगदान की आवश्यकता है। एसएसबी संस्कृतियों का छिड़काव खिला कम कर देता है सतत प्रेरणा और मध्यम को हटाने, लेकिन सेल के विकास के कारण पोषक तत्वों का स्तर में बड़े परिवर्तन से इन समस्याओं को एक मुद्दा बना हुआ है। एक समायोजित खिला Ra का उपयोगपोषक तत्व उपयोग के गणना का अनुमान सेल की आवश्यकताओं पर आधारित ते स्थिर सेल पर्यावरण सेल व्यवहार्यता का अनुकूलन करने के लिए आवश्यक प्रदान करते हैं और 21 कार्य कर सकते हैं – 24।
साहित्य का एक बड़ा शरीर विशेष संस्कृति और pluripotent कोशिकाओं के विस्तार के लिए स्तनधारी कोशिकाओं की स्केलेबल एसएसबी संस्कृतियों के लिए तरीकों 25 का वर्णन है – 32, दूसरों के साथ आइलेट (बीटा) कोशिकाओं 17,33,34 पर केंद्रित है, या जैविक उत्पादों के उत्पादन 24, 35 – 38। इन जांच सेल प्रकार के बहुत से अंडाकार आकृति संस्कृतियों में उगाया जा सकता है, और इस्तेमाल किया जा रहा सेल प्रकार के लिए विशिष्ट प्रक्रियाओं के लिए एक सतत खिला प्रणाली को लागू करने से पहले अनुकूलित किया जाना चाहिए। 43 – इस प्रदर्शन में, एक छिड़काव खिला विधि एक बीटा सेल लाइन एक उभारा बायोरिएक्टर 39 में spheroids के रूप में हो विस्तार करने के लिए इस्तेमाल किया गया था। विधि यहाँ बताया प्रदान करता है एकबंद लाइन ग्लूकोज माप के आधार पर लक्षित संस्कृति की स्थिति को प्राप्त करने के लिए दर समायोजन खिलाने का सीधा कार्यान्वयन। इस विधि के साथ फ़ीड दर का समायोजन बनाए रखने के लिए एक शारीरिक ग्लूकोज का स्तर बढ़ता सेल पैदावार करने के लिए दिखाया गया है। स्तनधारी कोशिकाओं को ऊर्जा उत्पादन के लिए, एक महत्वपूर्ण पोषक तत्व, ग्लूकोज पर निर्भर हैं, इसलिए इस सेल लाइन के उपयोग के कई संवर्धित स्तनधारी कोशिकाओं 44 के लिए एक मॉडल का प्रतिनिधित्व करता है। इसके अलावा, इस लाइन बीटा कोशिकाओं है, जो ग्लूकोज 45 की पुरानी उच्च स्तर के प्रति संवेदनशील हैं की आगे की जटिलता एक मिसाल है। इस अध्ययन के लिए, β-TC6 कोशिकाओं विवो में आइलेट्स के टापू का औसत आकार लगभग करने के लिए संस्कृति में spheroids फार्म के लिए अनुमति दी गई। छिड़काव बायोरिएक्टर प्रणाली 17 – 19,21,46 खपत ग्लूकोज को समायोजित एक फ़ीड दर के साथ, व्यवहार्यता में परिवर्तन के बिना शारीरिक स्थिति और उच्च सेल पैदावार बनाए रखने में हुई।
58 – जैविक एजेंटों की और सेल उपचार के लिए उत्पादन के लिए स्तनधारी सेल उत्पादों सृजन संस्कृति और बड़े पैमाने पर 55 में स्तनधारी कोशिकाओं की निगरानी की आवश्यकता है। इसके अलावा, इन आवेदनों में पर…
The authors have nothing to disclose.
The authors thank Michael Garwood and Sam Stein for their helpful comments, and Kristen M. Maynard for assistance with manuscript preparation.
Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number / Link | Comments/Description |
BTC-6 Cells | ATCC, Manassas, VA | CRL-11506 | Mouse Insulinoma cell line (adherent cell type) |
DPBS No CA, No Mg | Invitrogen, Carlsbad, CA | 14190-144 | https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/14190144?ICID=search-14190144 |
Dulbecco's Modified Eagles Medium | Invitrogen, Carlsbad, CA | See below for product numbers | |
DMEM High Glucose (500mM) | Invitrogen, Carlsbad, CA | 11965-092 | http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/11965092 |
DMEM Low Glucose (100mM) | Invitrogen, Carlsbad, CA | 11885-084 | http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/11885084 (note that this medium already contains pyruvate) |
L-gultamine | Invitrogen, Carlsbad, CA | 25030081 | http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/25030081?ICID=search-product |
Sodium Pyruvate | Invitrogen, Carlsbad, CA | 11360070 | https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/11360070?ICID=search-product |
Heat Inactivated Porcine Serum | Gibco – Life Technologies | 10082147 | http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/10082147 |
Trypsin-EDTA | Invitrogen, Carlsbad, CA | 25200056 | https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/25200056?ICID=search-product |
T-150 Tissue Culture Treated Flasks | Corning, Corning, NY | 430825 | http://catalog2.corning.com/LifeSciences/en-US/Shopping/ProductDetails.aspx?productid=430825(Lifesciences) &categoryname= |
NuAire Cell culture incubator | Princeton, MN | US Autoflow , Any water-jacketed CO2 regulating cell culture incubator could be used | |
Centrifuge | Sorvall RT 7 (Any similar benchtop centrifuge may be used) | ||
Refrigerator | Any laboratory refrigerator could be used (a small table-top version was used for these studies) | ||
1L Glass Bottle | Corning, Corning, NY | 1395-1L | Any vendor could be used http://catalog2.corning.com/LifeSciences/en-US/Shopping/ProductDetails.aspx?productid=1395-1L(Lifesciences) &categoryname= |
2L Glass Bottle | Corning, Corning, NY | 1395-2L | Any vendor could be used |
250 ml stirred bioreactors | Corning, Corning, NY | 4500-250 | http://catalog2.corning.com/LifeSciences/en-US/Shopping/ProductDetails.aspx?productid=4500-250(Lifesciences) &categoryname= |
Stir Plate | Fisher Scientific | 11-496-104A | Any incubator safe stir-plate can be used, any vendor |
Tissue Culture Dishes 100mm Diameter | Nunc, Rochester, NY (Fisher Scientific) | 1256598 | Any vendor could be used (ordered through Fisher Sci) |
FALCON 50 ml Conical Tubes | Falcon, San Jose, CA | 1256598 | Any vendor could be used |
Delran Plastic Used for Custom Parts | McMaster Carr | Various | Any material of choice could be used, but Deran is chosen because it is autoclave safe, non-reactive, and easy to machine, http://www.mcmaster.com/#acetal-homopolymer-sheets/=rjrcac |
Stainless Steel Pipe for custom lids | McMaster Carr | Various | Any vendor could be used, http://www.mcmaster.com/#standard-stainless-steel-tubing/=rjrd91 |
Custom Modified Delran Bioreactor Lids for Continuous Feeding | Custom made | Not aware of any vendors producing a similar product | |
Custom Modified Glass Bottle Lids for Continuous feeding | Custom made | Some vendors (eg. Fischer Sci, Corning) make similar products in the links below | |
Masterflex Digital Peristaltic Pump | Cole Parmer, Vernon Hills, IL | EW-77919-25 | Any precision peristaltic pump could be used, http://www.coleparmer.com/Product/L_S_Eight_Channel_Four_Roller_ Cartridge_Pump_System_115_230 _VAC/EW-77919-25 |
PVDF Tubing Connectors (various) | Cole Parmer, Vernon Hills, IL | see link | Any vendor could be used, http://www.coleparmer.com/Category/Cole_Parmer_PVDF_Premium _Luer_Fittings/55889 |
Pharmed BPT Tubing L/S 16 | Cole Parmer, Vernon Hills, IL | WU-06508-16 | Any vendor could be used, http://www.coleparmer.com/Product/Masterflex_PharMed_BPT_Tubing _L_S_13_25/WU-06508-16 |
Pharmed BPT Tubing L/S 14 | Cole Parmer, Vernon Hills, IL | WU-06508-14 | Any vendor could be used, http://www.coleparmer.com/Product/Masterflex_PharMed_BPT_Tubing _L_S_13_25/WU-06508-14 |
Pharmed BPT Tubing L/S 13 | Cole Parmer, Vernon Hills, IL | WU-06508-13 | Any vendor could be used, http://www.coleparmer.com/Product/Masterflex_PharMed_BPT_Tubing _L_S_13_25/WU-06508-13 |
Millipore Millex GP PES membrane 0.22ul sterile syringe filter (used for venting, and medium filtration) | Fisher Scientific | SLGP033RS | Any vendor could be used |
25ml Graduated Pipette | Fisher Scientific | 13-678-11 | Any vendor could be used, and various sizes may be used |
Pipetter | Fisher Scientific | 13-681-15E | Any vendor, or similar product could be used |
Hemocytometer | Fisher Scientific | 02-671-6 | Any vendor, or similar product could be used |
Trypan Blue | Gibco – Life Technologies | 15250-061 | Any vendor, or similar product could be used, https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/15250061 |
Inverted Light Microscope | Leica | Any vendor, or similar product could be used | |
One Touch Ultra Blood Glucose Meter | Fisher Scientific | 22-029-293 | Any vendor, or similar product could be used (eg. Bayer) |
One Touch Ultra-Strips | Fisher Scientific | 22-029-292 | Any vendor, or similar product could be used (eg. Bayer) |