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Bioengineering

Nutrient regulamento, a alimentação contínua de Expansão em grande escala de células de mamíferos em Spheroids

Published: September 25, 2016 doi: 10.3791/52224
Automatic Translation
1, 2, 2, 2, 3, 2, 2, 2, 4, 2
1Radiology, University of Minnesota, 2Medicine, University of Minnesota, 3School of Public Health, University of Minnesota, 4Surgery, University of Arizona

Introduction

A fim de gerar grandes números de células humanas viáveis ​​e funcionais para transplante, a regulação das condições de cultura é imperativo. O esgotamento de nutrientes, juntamente com a acumulação de resíduos metabólicos são importantes contribuintes para a senescência e alterações metabólicas que reduzem a qualidade do produto celular 1-3. Este procedimento demonstra um método para cultura de células de mamífero em esferóides utilizando um biorreactor agitado combinado com um sistema de alimentação de perfusão taxa ajustada para regular a glucose numa gama fisiológica 4 durante toda a duração da cultura. Para a finalidade destes estudos, a gama fisiológica foi definida como entre 100 e 200 mg / dl. Os mesmos métodos podem ser utilizados para regular outros nutrientes e resíduos metabólicos, tais como lactato.

culturas estáticas em pequenos volumes (1 - 30 ml) são normalmente utilizados no ambiente de laboratório para manter e diferenciar linhas celulares para experimefins ntal. Passaging celular é realizada com as mudanças de meio completo, conforme necessário, em intervalos regulares. Mais meio de cultura "convencional" tem uma concentração de glucose elevada (450 mg / dl para DMEM utilizado nestes estudos) para permitir as mudanças de meio menos frequentes, sem o risco de limitações nutricionais. No entanto, esse método de alimentação de lote ainda requer manipulação frequente, introduz variabilidade no ambiente celular, e aumenta o risco de contaminação 5-9. Biorreatores suspensão agitada (SSB) fornecer uma melhor mistura e diminuição da manipulação de 3,10 - 20, mas como culturas estáticas, exigir mudanças médias manuais que contribuem para flutuações potencialmente prejudiciais nos níveis de produtos nutricionais e de resíduos. alimentação perfusão de culturas SSB reduz esses problemas por infusão contínua e remoção do meio, mas grandes mudanças nos níveis de nutrientes devido ao crescimento celular continuam a ser um problema. A utilização de uma alimentação adequada rate a partir de cálculos de uso de nutrientes com base em requisitos de células estimados podem proporcionar o ambiente celular estável necessário para otimizar a viabilidade celular e funcionar 21-24.

Há um grande corpo de literatura métodos para culturas escaláveis SSB de células de mamíferos, especificamente para a cultura e expansão de células pluripotentes 25 descrevendo - 32, com os outros focados em (beta) células 17,33,34 ilhota, ou a produção de produtos biológicos 24, 35-38. Muitos destes tipos de células investigadas podem ser cultivadas em culturas de esferóides, e procedimentos específicos para o tipo de célula a ser utilizado deve ser optimizado antes da implementação de um sistema de alimentação contínuo. Nesta demonstração, um método de alimentação de perfusão foi usada para expandir uma linha celular cultivada como beta esferóides num biorreactor agitado 39-43. O método aqui descrito proporciona umaimplementação direta de alimentar ajustes de taxa com base em medições de glicose no off-line para alcançar condições de cultura alvo. Ajustando a taxa de alimentação com este método para manter um nível de glucose fisiológica é mostrado para colheitas de células aumenta. As células de mamíferos são dependentes de um nutriente essencial, glucose, para a produção de energia, de modo que o uso desta linha de células representa um modelo para muitas células de mamíferos em cultura 44. Além disso, esta linha exemplifica a complexidade adicional de células beta, que são sensíveis a níveis elevados de glicose 45 crónicas. Para este estudo, as células beta-TC6 permissão para formar esferóides em cultura para aproximar o tamanho médio das ilhotas de Langerhans in vivo. O sistema de bioreactor de perfusão 17 - 19,21,46 com uma taxa de alimentação ajustada ao consumo de glicose, resultou na manutenção de condições fisiológicas e rendimentos mais elevados de células, sem alterações na viabilidade.

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Protocol

1. Linha de Células e manutenção

  1. Obter células-p TC6 (ou outra linha de células de mamífero aderente desejada). Em preparação para o estudo, a cultura, a passagem, e criopreservação de células de acordo com as instruções do provedor.

2. Montar o sistema de alimentação contínua

NOTA: O design do sistema de alimentação contínua no método a seguir foi baseado em sistemas semelhantes aos descritos na literatura 17 - 19,21,47 - 49. Montagem do sistema utilizado aqui é descrito em pormenor na publicação anterior 3.

  1. Recolher os componentes necessários para o sistema de alimentação que consiste de cinco componentes principais: um reservatório médio, bomba peristáltica, biorreatores agitados, reservatório de resíduos, e projetado conjunto de tubos / amostragem.
    1. Estabelecer o reservatório meio utilizando uma garrafa de 1 L de vidro, o reservatório de resíduos usando uma garrafa de vidro de 2 L, eo stirred biorreator utilizando um reactor de vidro de volume de 250 ml (off a versão de prateleira).
    2. Use uma bomba peristáltica digital ou bomba semelhante com uma cabeça de bomba de 8 canais para controlar troca de meio.
    3. Fabricação do reservatório e tampas de biorreatores modificados a partir de plástico duro e autoclavável com tubo de aço inoxidável de passagem portas para assegurar a ventilação através de filtros estéreis, e permitir a transferência de meio entre reservatórios e biorreatores. Em alternativa, comprar tampas especializadas com portas de fluxo de vários fornecedores.
      NOTA: A tampa biorreator podem conter portas repasse adicional para instrumentação opcional e sondas de monitoramento (por exemplo, monitor de oxigênio).
    4. Anexar um tubo de saída (OT) fabricados a partir de tubos de arejamento de vidro poroso com uma gama média de tamanho de poro de 40 um a 60 um, e uma densidade de poros de 40% para a tampa SSB modificado. Alternativamente, escolha outro tubo de saída com base nos requisitos específicos da cultura.
      NOTA: Escolha oTamanho dos poros OT para remover apenas médio e restos celulares, deixando agregados de células em cultura (como descrito na seção 6 e publicação 3 para mais detalhes).
  2. Montar conjuntos de tubos de perfusão autoclaváveis ​​de fluoreto de polivinilideno (PVDF) conectores de tubos e tubos de bomba peristáltica durável. O comprimento da secção é dependente da distância entre os diferentes componentes.
    NOTA: Tome especial cuidado ao selecionar variedade tubulação para garantir a durabilidade e confiabilidade para experimentos de longa duração.
  3. Montar o tubo de definir a partir de três partes: a linha de alimentação, uma linha de resíduos, e uma linha de amostra.
    1. Monte a linha de alimentação com dois diâmetros de tubulação (l / s 14 e L / S 13). Utilizar a relação L / S 14, para a tubagem principal que irá transpor a distância a partir do bio-reactor para o reservatório de meio, e inserir um curto comprimento de L / S 13 no meio do comprimento do tubo para a parte de bomba usando os adaptadores de PVDF adequadas.
    2. Use PVDF padrão mangueira de farpado tubing adaptadores para unir duas peças de tubo de L / S 14, de cada lado da secção de bomba mais curto (relação L / S 13) do tubo.
      NOTA: Como alternativa, todo o comprimento da tubagem pode ser de menor diâmetro L / S 13 tubos, e todo o comprimento da tubagem pode ser substituída quando a integridade-parte de bomba está em questão.
  4. Monte a segunda seção tubulação para remoção dos resíduos utilizando maior diâmetro (L / S 16) tubos e inserir uma seção curta de L tubulação / S 14 no meio da seção de bombeamento. Isso é feito da mesma maneira como a linha de alimentação de montagem usando PVDF adaptadores de mangueira farpada, ou, alternativamente, utilizando um comprimento contínuo do tubo da bomba de tamanho desejada, e substituindo, conforme necessário.
    NOTA: Se a mesma bomba e cabeça da bomba são usados ​​para o circuito de alimentação e circuito de resíduos, a parte de bomba das linhas de tubulação de remoção de resíduos deve ser um diâmetro maior do que a secção da bomba da linha de alimentação. Isto assegura que a taxa de bombagem de remoção é mais rápida do que a taxa de alimentação, e vai evitar a potenteial para grandes alterações no volume da cultura, e reduzir o risco de transbordamento.
  5. Monte o componente final do conjunto de tubos: um conjunto de coleta de amostras.
    1. Este procedimento descreve um costume montados amostragem sistema portuário; Em alternativa, uma porta de amostragem estéril pode ser adquirido a partir de vários fornecedores.
    2. Construir o conjunto de três curtas (~ 6 cm) L / S 14 comprimentos de tubos ligados entre si com um conector PVDF tipo T, e duas braçadeiras das mangueiras pequenas em dois dos comprimentos de tubulação.
    3. Coloque um filtro de gás estéril para ventilação de gás para um dos comprimentos bloqueada, e a outra é usada para ligação a uma seringa de amostragem estéril (filtros de gás estéril pode necessitar de ser adicionada num armário de bio-segurança após a esterilização tantos filtros estéreis não são autoclavável).
    4. Ligue o terceiro extremidade a um conector de amostra de aço inoxidável ligado na tampa do bioreactor.
    5. Autoclave a montagem de amostragem, enquanto conectado ao biorreator antes do inícioo experimento (consulte a etapa 3 abaixo).
    6. Utilize este conjunto para coletar amostras estéreis do biorreator, conforme necessário, sem perturbar o processo de alimentação contínua.

3. Autoclave Todos os Materiais

  1. Prepare todos os componentes de biorreatores para esterilização em autoclave.
  2. Recolha componentes individuais para a esterilização. reservatórios de médio e resíduos (montados a partir do passo 2.1.1), 250 ml balão rotativo (montado a partir de 2.1.1), tampas modificados necessários (montados a partir de 2.1.3), tubo de saída (descrito em 2.1.4), três conjuntos de tubos ( montadas em secções 2.2 through2.5), tubo de saída (conforme necessário para a alimentação contínua).
    1. Montar balão giratório, com todos os componentes e verifique se o tubo de saída está firmemente presa no interior do balão rotativo (descrito no ponto 2.1.4), e anexar o costume montados porta de amostragem (ponto 2.5), ou outra porta de amostragem para o topo da tampa .
    2. Enrole todo o conjunto do balão rotativo com automaterial de clave envoltório, e autoclave indicando fita. Certifique-se de que o envoltório hermético. NOTA: folha de alumínio ou material semelhante pode ser utilizado para cobrir as extremidades individuais de cada orifício de acesso na tampa biorreactor para preservar a esterilidade do conector / termina quando desempacota e, quando não ligado aos conjuntos de tubos no interior da incubadora.
    3. Monte as tampas modificadas dos reservatórios de médio e resíduos e, em seguida, anexar as respectivas garrafas de vidro. Cubra-os com folha de alumínio e autoclave indicando fita.
    4. Individualmente embrulhar os conjuntos de tubos (seção 2,2-2,5) com envoltório autoclave e fita adesiva para ajudar na montagem final. A folha de alumínio ou material semelhante pode ser usado para envolver as extremidades individuais de cada conjunto de tubos para preservar a esterilidade do conector / termina quando desenrole.
    5. Autoclave todos os itens envolvidos, utilizando um ciclo padrão de autoclave seca (por exemplo, "gravidade" configuração com ~ 15 psi a 121 ° C durante 30 min ou mais).
      NOTA: Não coloque estérilfiltros antes da autoclavagem a menos que sejam confirmadas para ser seguro autoclave.

4. Formação Spheroid

NOTA: esta técnica é semelhante à descrita na literatura 17 - 19,21,50 - 52 para outras culturas de células de mamíferos. Todos os procedimentos seguintes a esterilização deve ser feito de uma câmara de fluxo laminar utilizando luvas esterilizadas e para manter condições estéreis para cultura de células.

  1. Para todas as condições de cultura, e expandir células β-TC6 em culturas aderentes padrão (descritas pelo fornecedor), até quantidades de células suficientes são obtidos para semear o número desejado de biorreactores.
    1. Monte o biorreator de alimentação contínua com o tubo de saída, como mostrado na Figura 1 e descrita na secção 2, e conectar a porta de amostragem a tampa de amostragem. NOTA: O tubo de saída e o conjunto porta de amostragem deve ser adicionado ao bioreactou para uma alimentação contínua antes da formação de esferóides, e deve ser puxado para cima para fora do meio de cultura até que a alimentação contínua é iniciado.
    2. Esterilizar o conjunto SSB modificado por autoclave (descrito na seção 3).
    3. Anexar aberturas estéreis (0,22 m ou menores filtros estéreis) para os locais apropriados nas tampas do frasco com agitação, e em vasos de médio e de resíduos.
      NOTA: Isso é importante para evitar bloqueio de vapor, e para permitir a troca de gás entre a incubadora (2 5% CO) meio ambiente e do biorreator. A troca gasosa é necessário para manter o pH correto quando usando a mídia tamponada com bicarbonato.
  2. Recolher as células por tripsinização suave usando 0,25% (w / v) de solução de tripsina EDTA 0,53 mM, à temperatura ambiente, auxiliado por agitação mecânica durante 2-3 min, e semente em biorreactores a uma densidade de aproximadamente 1,3 x 10 6 células / ml em 200 ml de meio de cultura.
    1. Mover frascos designados para fora da incubadora eem um gabinete de Bio-Segurança.
      NOTA: Todos cultura de células e manipulações deve ser feito em um gabinete de Bio-Segurança usando técnica estéril adequada.
    2. Remova o meio de cultura a partir de frascos por aspiração.
    3. Lave as células por pipetagem de 5 ml de solução salina tamponada com fosfato (sem Ca ++ ou Mg ++), para dentro do balão, e a lavagem entre as células sobre a superfície, e, em seguida, aspirar o PBS.
    4. Adicionar 3 ml de solução de Tripsina-EDTA a cada balão que vai ser recolhida (tipicamente cerca de 10x 175 centímetros 2 frascos-T).
    5. Permitir que as células colhidas a incubar à temperatura ambiente durante 2-3 min em armário bio-segurança.
    6. Agita-se suavemente com a mão para soltar as células da superfície balão, e recolher as células por adição de 6 ml de meio de cultura (com soro) para o balão, e transferência das células para um tubo de 50 ml. Quando um tubo de 50 ml é cheio, utilizar um outro tubo de 50 mL até que todas as células necessárias foram recolhidas (aproximadamente será necessário um tubo de 50 ml para cada 5 frascos T-175coletado).
    7. Suavemente centrifugação (aproximadamente 50 x gravidade) as suspensões de células colhidas para sedimentar as células.
    8. Aspirar o meio restante deixando o sedimento intacta.
    9. Recolha todas as células de um único tubo através de re-suspender as pelotas em meio de cultura (contendo soro), utilizando uma pipeta, e a transferência de todos os peletes no mesmo tubo.
    10. Contagem de a densidade de células utilizando um hemocitómetro padrão de coloração com azul de tripano, tal como descrito na literatura 53.
    11. Adicionar número desejado de células totais de estéril SSB para cada condição (1,3 x 10 6 células / ml foi a densidades celulares de partida para esta demonstração segmentados).
    12. Adicionar meio (com a concentração de glucose desejado, neste caso utilizou-se níveis de glucose no meio dentro do intervalo fisiológico) para SSB usando uma pipeta de alcançar (200 ml de volume de cultura foi utilizado para estes estudos) do volume total da cultura desejada.
      NOTA: Para estes alimentados contínua SSB estuda o cu ltures foram inoculadas usando uma versão modificada de "baixa-glicose" do meio de cultura (100 mg / dl). Isto permitiu que as culturas para iniciar a concentração de glicose no alvo desejado, em vez de começar com um meio de "alto teor de glucose-" e esperando que o consumo de glucose para trazer os níveis de glucose para dentro da gama fisiológica para começar a alimentação. Todos os outros meios para alimentar nesses estudos utilizaram o padrão "de alta de glucose" meio (500 mg / dl).
    13. Mover SSB com células de uma placa de agitação dentro de um incubador de cultura de células.
  3. Células de cultura em biorreatores sem alimentação durante 3 dias a 37 ° C, com 5% de CO 2, 100% de humidade relativa, e uma velocidade de agitação de 70 rpm para permitir esferóides para formar.
    NOTA: Não proliferação significativa devem ser observados durante o período de formação esferóide de três dias.
  4. Após a formação de esferóides, dividir entre esferóides biorreactores com condições de cultura desejadas.
le "> 5. Cultura alimentação contínua e ajustados taxa de alimentação

  1. Autoclave ou gás esterilizar todos os componentes, e montar numa câmara de segurança biológica utilizando técnicas estéreis (passos 2-4).
  2. Após a formação de esferóides, remover o SSB da incubadora e montar os componentes do sistema para a alimentação contínua de uma câmara de segurança biológica.
    1. Primeiro encher o reservatório meio fresco com o meio de cultura desejada e, em seguida, conectar-se a um dos lados da linha de alimentação. Também garantir que o reservatório de meio fresco é adequadamente ventilado com um filtro estéril.
    2. Conectar um lado da linha de alimentação para a abertura de entrada de alimentação no biorreactor de forma estéril. Um filtro estéril deve ser instalado entre a linha de alimentação e a abertura de entrada biorreactor para filtrar o meio antes de entrar no biorreactor.
    3. Ligue a linha de resíduos ao tubo biorreator saída eo reservatório de resíduos médio, e garantir que o reservatório de resíduos está devidamente ventilado com um sterile filtro.
  3. Mova o conjunto para fora da cabine de segurança biológica (isto provavelmente irá requerer duas pessoas para transportar todos os vasos e tubos), e colocar todos os componentes para fora para a cultura de longo prazo.
    1. Coloque o SSB para a placa de agitação no interior da incubadora utilizando os mesmos parâmetros de cultura para a formação de esferóides (37 ° C, 5% de CO2, 100% de humidade e 70 rpm). Nota: Pode ser necessário desligar temporariamente os segmentos de tubagem a partir do biorreactor se as linhas necessário executar furos de passagem no lado da incubadora em vez de para fora através da junta de vedação na porta. Isto pode ser feito de uma forma asséptica enrolando as extremidades dos conjuntos de tubos com folha de alumínio antes da autoclavagem (passo 3), e em espera para conectar o lado biorreactor das secções de alimentação e de tubo de descarga até que o bioreactor está dentro da incubadora. As linhas de tubo pode ser colocado no lugar, e a folha de alumínio pode ser removido no interior da incubadora e rapidamente ligada ao biorreactor.
    2. Executar extremidades restantes conjuntos de tubos (aqueles que não estão ligadas à tampa biorreator) para fora através da porta de acesso incubadora (pass-through), ou através de um entalhe na junta porta da incubadora.
    3. Do lado de fora da incubadora (numa cabine de segurança biológica nas proximidades, se possível), rapidamente ligar a linha de alimentação para o reservatório de meio fresco, e a linha de resíduos para o reservatório de resíduos médio, e assegurar que o reservatório de resíduos está devidamente ventilado com um filtro estéril. NOTA: Para fazer isso de uma forma asséptica, retire a folha de alumínio dos conectores de tubos e vasos e se conectar aos respectivos navios o mais rapidamente possível (especialmente se essa ligação tem de ser feito fora da cabine de segurança biológica).
    4. Coloque reservatório de meio fresco (preenchido com meio de alimentação desejado) no interior nas proximidades mini-frigorífico. Verificar para assegurar que as linhas de alimentação de resíduos e são capazes de sair do incubador e entrar no frigorífico sem impedir que as portas em cada de fechar. É também crítico que a alimentação lines não fiquem presos fechado por portas, quer do refrigerador ou da incubadora.
      NOTA: O meio utilizado para estes estudos foi o meio de cultura padrão alto teor de glucose (500 mg / dl) recomendado pelo fornecedor para este tipo de células. Qualquer meio de glucose elevada poderia ser usado com base nas necessidades específicas do tipo de célula a ser cultivada. A concentração de glucose do meio de alimentação deve ser razoavelmente mais elevado (2x ou mais) do que a concentração desejada na cultura como o sistema de alimentação baseia-se no aumento da taxa de alimentação do meio de glucose elevada para manter os níveis de glicose adequados nas culturas enquanto se mantém as taxas de alimentação razoáveis .
    5. Em seguida, o reservatório de meio de resíduos podem ser colocados na bancada fora da incubadora em uma localização conveniente.
    6. Em seguida, coloque a seção "bomba" das linhas de alimentação e de resíduos para a cabeça da bomba assegurando a orientação adequada para que as linhas de alimentação bombeará meio do reservatório meio fresco para o SSB, e as linhas de resíduosbombeará meio do SSB e ao meio resíduos reservatório.
  4. Ligar a bomba para o avanço desejado.
    1. Calcula-se a taxa de alimentação utilizando a equação de taxa de alimentação ajustada descrito na literatura 3 e na secção de resultados representativos apresentados a seguir.
    2. Usar a informação mais recente contagem de células (procedimento descrito no passo 5) juntamente com a previsão do crescimento, e as medições médias de glucose para estimar a taxa de alimentação necessária para manter a desejada concentração de glucose na cultura.
      NOTA: As taxas de crescimento de células e as taxas de consumo de glucose terá de ser obtida antes de fazer estes procedimentos.
    3. Defina a velocidade da bomba com base na taxa de alimentação calculado.
  5. Repita o cálculo da taxa de alimentação e ajustar a velocidade da bomba para cada ponto de amostragem (a cada três dias para o método descrito).

6. contagens de células, viabilidade e as medições da concentração de glicose

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  • Recolher amostras de cada biorreactor de três em três dias, ou se o desejar.
  • Tome amostras de cultura a partir de culturas SSB continuamente alimentado usando a porta de amostragem especializada descrito acima.
    1. Deixando o SSB continuamente alimentada dentro do biorreator, anexar uma seringa estéril (a seringa de 5 ml de volume foi utilizado para estes estudos) para conexão filtrada-un do porto de amostragem.
    2. Mover o tubo de recolha de amostras para dentro do meio de cultura.
    3. Soltar a secção do tubo vai da seringa, e retirar o volume da amostra total desejado.
    4. Mover o tubo de amostragem para cima de modo que já não se encontra submersa na cultura, e continuar a retirar a seringa até que o ar é removido.
    5. Prender o tubo que alimenta a seringa e retire a seringa contendo a amostra, e reserve.
    6. Pré-carregar uma segunda seringa estéril fresco com o ar, e anexar ao lado de filtro estéril do porto de amostragem.
    7. Soltar o tubo vai para o lado do filtro de seringa deo orifício de amostragem, e depois purgar o orifício de amostragem, por expulsão suavemente o ar na seringa através do filtro estéril. Isso garante que o orifício de amostragem será claro de qualquer meio residual.
    8. Re-apertar o tubo vai para o filtro, desconecte a seringa estéril e descartá-lo.
  • Aqui a seringa que contém a amostra de células a partir da cultura, e expeli-lo para um tubo de 10 ml. Sub-amostras de volumes conhecidos podem ser tomadas directamente a partir deste tubo.
  • Para contagem de células, remover um volume conhecido de células e transferir para um tubo de micro-centrifugação, e suavemente centrifugar durante 1-2 min (cerca de 50 x gravidade).
  • Transferir o sobrenadante para um tubo separado para medições de glucose, e re-suspender o grânulo com o mesmo volume de solução de tripsina-EDTA (0,25% (w v) de tripsina / EDTA 0,53 mM), e contar em triplicado utilizando um hemocitómetro padrão com tripano azul coloração tal como descrito na literatura 53.
    1. Adicionar meio (com soro) paraa amostra de diluição conforme necessário.
    2. Contar as células, e calcular a viabilidade celular através da gravação de células vivas (não coradas), e células mortas (manchadas) de forma independente (de viabilidade% = células vivas / células totais).
  • Medir os níveis de glicose médio em triplicado utilizando um medidor de glicose no sangue e de uso único tiras-teste.
    1. Tome as medições de glicose, conforme descrito nas instruções do medidor de glicose substituindo o meio de cultura de sangue.
    2. Mergulhe a tira de teste no médio a ser testado (recolhidos a partir de amostras de contagem acima), e repita para o número desejado de repetições (três repetições são recomendados).
    3. Testar tanto o meio fresco e médio resíduos para as concentrações de glicose.
      NOTA: Para alguns metros, medições menor do que 20 mg / dl (limite detectável do medidor), pode ser observada como um erro na saída do medidor.

    • 7. Medidas Colonização Taxa Spheroid

    1. Para assegurar que CELclusters de l não estão sendo removidos pelo sistema de alimentação contínua, medir a taxa de sedimentação de esferóides beta-TC6, observando sua sedimentação em um grande pipeta de plástico de diâmetro.
    2. células de cultura de p-TC6 em biorreactores SSB para formar esferóides como descrito acima.
    3. Após 3 dias de cultura, levar 30 ml amostras da suspensão esferóide e coloque em um tubo de 50 ml.
    4. Suavemente pipetar para cima e para baixo usando uma grande diâmetro 25 ml de pipeta para distribuir uniformemente na suspensão, em seguida, parar pipetagem com a suspensão a um nível conhecido na pipeta (por exemplo, 20 ml de marca), e, em seguida, gravar o momento de todos os esferóides de contentar 5 cm.
    5. Repita este procedimento vezes suficientes para atingir confiança estatística (geralmente n> 3).
      NOTA: Para estudos biológicos, um valor de p menor que 0,05 é considerado estatisticamente significativo quando comparando as medições. O erro padrão da média foi utilizada para erros de reporte, e os dois cauda teste t de Student emparelhado-unfoi usado para comparar as condições para os dados apresentados.

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    Representative Results

    Níveis de glicose médio e flutuações Restringir Expansão celular em culturas SSB Padrão

    Os níveis de glicose flutuar nas culturas estáticas e culturas SSB durante todo o período de cultura 3. Estas flutuações intensificar com o aumento do número de células durante o período de cultura de 21 dias e eram quase idênticas em ambas as culturas estáticas e SSB. Estas observações são apresentados na nossa publicação anterior 3. Os níveis de glicose pode ser super-fisiológico para a duração do período de cultura para ambos os métodos. Uma vez que esta exposição crónica pode inibir o crescimento das células 54, um sistema de alimentação contínua foi desenvolvido para eliminar oscilações de glucose e de melhorar o controle durante a cultura nutriente esferóide.

    Sistema de alimentação contínua de Cultura Spheroid

    Continuamente adicionando meio fresco e removendo meio antigo para a duração do período de culturapode ser realizada utilizando um sistema de reabastecimento de meio simples. O sistema descrito no Método 2 e mostrado na Figura 1 utilizado uma bomba e um conjunto de tubo para reabastecer continuamente médio e um tubo de saída separado para remover continuamente forma, evitando a remoção de esferóides a partir da cultura. A entrada do meio estava no lado oposto do reactor para minimizar qualquer possibilidade de interferir com o funcionamento adequado da OT, e para permitir uma mistura completa. meio fresco (com alto teor de glucose, 450 mg / dl) foi mantida à temperatura do frigorífico para assegurar a estabilidade a longo prazo e continuamente adicionado à cultura através de uma entrada do meio com uma taxa de substituição médio total de três em três dias para reabastecer os nutrientes. Este sistema limita as manipulações e intervenção necessária durante o período de cultura, substituindo o processo de substituição médio lote manual com um processo contínuo 3,22,23. O meio frio entrou no biorreator em pequenos volumes mais de timE (0,046 ml / min) em relação ao volume total da cultura (200 ml), dando a cada "gota" do tempo médio adicionou-se equilibrar a temperatura com o meio de cultura circundante que estava a 37 ° C. Isto assegurou que o meio frio adicionado não reduziu a temperatura global de cultura a ser mantido dentro da incubadora. A agitação do meio de cultura, também aumentou a eficiência de transferência de calor, e melhorou a uniformidade da temperatura nessas culturas. manutenção da temperatura pode ser uma preocupação se as taxas de alimentação muito elevadas foram usadas-com pequenos volumes de cultura, mas estas condições improváveis ​​não foram testados para estes estudos. O volume da cultura foi mantida a um nível constante no sistema de alimentação contínuo através da garantia de que a taxa de remoção média média foi igual à taxa de alimentação. O sistema utilizado para estes estudos realmente removidos meio a uma velocidade de fluxo mais elevada do que a taxa de alimentação porque a secção de tubagem de remoção utilizada tubagem de maior diâmetro para a parte de bomba. Apesar do Remo mais rápidotaxa de Val, o volume de cultura foi mantido ajustando-se o nível do tubo de escoamento no interior do reactor para o nível desejado de volume de cultura. Continuamente adição de meio fresco para o SSB resultaram em um pequeno aumento no nível médio no reactor, e quando o meio atingiu o nível da OT, o meio foi removido a partir do reactor a uma taxa mais rápida. O meio foi removido através do vidro poroso OT, deixando os esferóides de células em cultura até que o nível médio caiu abaixo do limite inferior da OT. Este sistema evitada a complexidade do uso de sensores de fluxo e de volume ténues para controlar as velocidades da bomba, e é o padrão para uso com aparelho de cultura de base muitos SSB 47,48. A OT foi concebida para garantir que os esferóides não foram removidas a partir da cultura através do circuito de remoção, e o tamanho de poro e densidade no tubo de vidro de frita foram suficientemente grande (40% e 40 - 60 | iM, respectivamente) para garantir que a velocidade de fluxo linear foi menos do que a velocidade de deposição dos esferóides used para estes estudos de cultura. O fluxo linear foi calculada como descrito em detalhe 3. A velocidade média linear média através dos poros na OT foi calculada em 0,17 cm / min e esta foi muito mais lento do que o mais lento taxa de sedimentação esferóide observado. A velocidade de sedimentação média foi medida como descrito no método 7 e foi de 2,53 ± 0,26 cm / min para os esferóides utilizados nestes estudos. Foram observados os esferóides a aumentar de tamanho como a cultura progride, e estes esferóides maiores resolvido mais rapidamente devido à sua maior proporção de massa-arrasto, que diminuiu ainda mais a possibilidade de remoção através do OT. Alguns esferóides foram presos nos poros menores nas bordas exteriores da OT, mas isso foi principalmente devido a colisão mecânica quando o tubo de saída mergulha no meio agitado. Isso não impediu o funcionamento adequado do OT, e não contribuiu para uma perda mensurável de esferóides nas culturas testadas. O OT para estes estudos foi limpos após cada estudo, (com DI fluxo de água), e substituído após o uso de dois estudos de cultura para evitar o risco de diminuição da função. O OT poderia ser substituído após cada estudo se esferóides são observados para obstruir os poros durante um estudo específico (que não foi observado no trabalho apresentado). Devido à remoção de forma cíclica utilizando este método, o volume de meio de cultura variou por tanto quanto 6%. As flutuações eram causadas pela tensão superficial do meio que permitiu que o OT para remover um pouco mais de meio após o nível médio média caiu abaixo do limite inferior da OT.

    Eliminar flutuações de nutrientes melhoria do crescimento celular em culturas SSB

    Continuamente substituindo o meio nas culturas SSB usando o sistema acima descrito aumento do rendimento de cultura durante o período de cultura de 21 dias quando em comparação com as culturas SSB padrão. A taxa de alimentação foi mantida constante durante todo o período de cultura a uma taxa que substituído todo o volu culturame três em três dias para ser comparável às culturas SSB fed-batch. A eliminação das flutuações de nutrientes resultou em um aumento dos rendimentos de células (Figura 3), apesar da elevada concentração de glicose 3. Tamanho esferóide foi também medida no final do período de cultura por avaliação microscópica 2D (microscopia de luz padrão descrito na literatura 3), e os esferóides em culturas CF-SSB foram significativamente maiores (p <0,02, teste t de Student) que em estática ou culturas SSB padrão conforme relatado na literatura 3. Estas observações suportam os dados de contagem celular, sugerindo uma maior taxa de crescimento em culturas de CF-SSB enquanto a viabilidade foi mantido ao mesmo nível elevado (96,23 ± 0,85%), independentemente da condição da cultura. A SSB alimentada continuamente (CF-SSB) sistema de cultura eliminado as flutuações de nutrientes em culturas esferóides, e as taxas de crescimento celular melhorada, mas os níveis de glicose manteve-se super-fisiológicas que podem ter impedido mesmo imp ainda mais rovement na expansão de células (Figura 2). Para melhorar ainda mais mediante o sistema de cultura de CF-SSB, um algoritmo foi utilizado para ajustar a taxa de alimentação durante o período de cultura, com o objectivo de melhorar o controlo dos níveis de glicose em culturas de SSB.

    Cálculo da taxa de alimentação Ajustado

    Vários fatores podem ser considerados para o cálculo da taxa de alimentação para manter os níveis de glicose consistentes. Os factores específicos de interesse pode ser alterada para um dado estudo e para uma linha celular específica. Para o propósito desta demonstração, foram considerados taxa de crescimento e o consumo de glucose determinada a partir de culturas anteriores, bem como os níveis reais de glucose no tempo de ajustamento 3. ajustes de taxa de alimentação pode ser feita em qualquer intervalo de tempo. Para esta demonstração, as amostras foram recolhidas e a taxa de alimentação foi ajustada a cada três dias com base nos cálculos sequenciais descritos como se segue.

    t "> Cálculo do previsto Taxa de Crescimento

    A equação 1 prediz o crescimento celular durante um determinado período de cultura, com a contagem de células previsto (N2), que representa o número esperado total de células em cultura, em algum momento no futuro. Este método utiliza uma aproximação taxa de crescimento linear em que o número de células actual (N 1) é adicionada à taxa de crescimento estimado das células em culturas de esferóides (R g) multiplicados por o período de cultura (T 2 -T 1).

    equação 1 (1)

    Calculado taxa de alimentação de linha de base

    A taxa de alimentação da linha de base (Rf) foi calculada usando a equação 2 pela estimativa da glucose consumida na cultura durante o período de cultura (numerador) e dividindo-o pela concentração de glucose no meio de alimentação (F C 1) pela média ponderada de N 1 e N 2 a partir da equação 1. Esta taxa de consumo foi então dividida pela concentração de glucose (C F) no meio de alimentação para calcular a taxa de alimentação média médio necessário para substituir a glucose consumida durante o mesmo período de cultura.

    equação 2 (2)

    Ajustar taxa de alimentação com níveis de glicose observados

    Mais foram efectuados ajustamentos para a taxa de alimentação de linha de base para acomodar os níveis de glucose medidos (C 1) no ponto de tempo escolhido usando a equação 3. Esta taxa de alimentação ajustada-glicose (GAFR) pode ser usado para manter níveis quando as alterações inesperadas no crescimento ou morte ocorrer na cultura. este equatio n incorporada uma constante de controlo (X), e um valor de 0,5 foi utilizado para estes dados 3. C 1 representa a concentração de glucose medida no meio de cultura no dia da amostra, e C D representa a concentração de glucose no meio-alvo. O valor final ajusta a velocidade de alimentação previsto a partir da segunda cálculo.

    equação 3 (3)

    figura 1
    Figura 1: Diagrama de alimentação contínua do sistema com tubo de saída. (A) Diagrama do sistema demonstrada. (B) do filtro de frita de vidro colocada no tubo de saída para permitir o meio a ser removido a partir da cultura sem perda de células. Figura reproduzida com autorização 3.

    /files/ftp_upload/52224/52224fig2.jpg "/>
    Figura 2:. Medições de glicose para SSB, CF-SSB, e ajustada culturas CF-SSB (A) medições de glicose no meio a partir de culturas esferóides beta-TC6, utilizando, métodos estáticos cultura SSB, e CF-SSB e alimentação com meio glicose alta padrão. A alimentação contínua é capaz de eliminar as oscilações de glucose, mas os níveis médios de glicose na mudança de meio drasticamente durante o período de cultura, e muito acima da gama fisiológica (indicado pela barra cinza). A alimentação adequada é capaz de eliminar as flutuações, bem como manter as concentrações de glucose níveis próximos dos fisiológicos para a duração do período de cultura. As barras de erro para medições de glicose são pequenos demais para ser visível na escala apresentada (erro padrão ≤ 4% para todas as medições). Os dados das figuras é apresentado na publicação anterior com permissão 3.


    Figura 3: contagem de células de SSB, CF-SSB, e ajustada culturas CF-SSB com o crescimento ajustado de alimentação taxas de crescimento celular relatados como a mudança vezes no número de células durante o período de cultura de 21 dias comparando SSB com mudanças de meio regulares contra taxa de alimentação constante. culturas SSB e taxa de alimentação ajustada culturas SSB. As barras de erro relatar o erro padrão da média, e os valores de p são reportados para um teste estatístico não-emparelhado de duas caudas t de Student. Reproduzido com permissão. 3

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    Discussion

    Geração de produtos de células de mamíferos para a produção de agentes biológicos e para terapias celulares requer a cultura e monitorização de células de mamífero em grande escala 55-58. Além disso, estas aplicações requerem condições de cultura definidas e validadas. Simplesmente aumentar o volume de células usando tecnologias de pesquisa não vai atender a todos esses requisitos. Manual de alterações a médio causando flutuações em nutrientes e acúmulo de resíduos de produtos reduzir a qualidade celular, viabilidade e produtividade. A utilização de bio-reactores é bem estabelecido para a cultura comercial de microrganismos para aplicações bio-farmacêutica, e estratégias semelhantes foram aplicados a culturas de células de mamíferos. A interacção complexa de células de mamífero com o seu ambiente exige modificações específicas para regular os níveis de nutrientes, a fim de optimizar o potencial de expansão celular.

    Para resolver estas questões, nós desenvolvemos um straightforward método para manter os níveis de glucose num intervalo de concentração específica, aproximando níveis fisiológicos num biorreactor suspensão agitada com um mecanismo de alimentação de perfusão taxa ajustável. Para alcançar este objetivo, esferóides de uma linha de células beta foram gerados num biorreactor suspensão agitada. Um sistema de alimentação de perfusão foi empregue para fornecer um mecanismo de alimentação contínua para substituir os procedimentos padrão de alimentação em lotes. as taxas de crescimento celular foram observadas, e utilizada para prever as taxas de utilização da glicose aproximados. os níveis de glucose real também foram medidos ao longo do tempo na cultura de ajustar as taxas de alimentação em resposta aos nutrientes real consumida e produtos metabólicos depositados no meio pelas células. Este método impedido as flutuações nos níveis de glicose no observados com outros sistemas estáticos e SSB 3, onde os níveis de glicose flutuaram dramaticamente com as mudanças de meio a cada 3 dias. Usando as estratégias batch-alimentação, as concentrações de glicose caiu tanto quanto 275 mg / dl ao longo de três dias, na fase finals na expansão de 21 dias. Estas flutuações nos níveis de glucose limitada rendimento celular.

    O cálculo da taxa de substituição médio para a demonstração do sistema de alimentação ajustada incorporada uma taxa de crescimento estabelecido e taxa de consumo de glucose para a linha de células, assim como as observadas (medidas) densidades de cultura e os níveis de glucose em cada ponto de tempo de alimentação. Para diferentes tipos de células, ou para mais sistemas de cultura de tecidos complexos, estes pressupostos não pode prender verdadeiro. Para garantir um controlo mais preciso da glucose, o algoritmo também incluído um sistema de controlo de realimentação para ter em conta a variabilidade das culturas individuais. Limitações de um método de perfusão com base apenas na taxa de crescimento, incluindo o impacto de heterogeneidade na utilização de glicose para as células ao longo dos esferóides e mudanças no consumo de glicose com base em parâmetros tais como a diferenciação de células estaminais, pode ser atenuado por um sistema de controlo de realimentação. Dependendo da aplicação, as células que exibem Exponetaxas de crescimento ntial ou perfis de crescimento mais complexos poderiam ser implementadas para melhorar o desempenho do algoritmo. Os pressupostos e valores utilizados para calcular a taxa de alimentação pode ser alterada para aderir às condições de cultura reais.

    Os métodos apresentados destinam-se a produzir células para uma aplicação terapêutica em que a expansão e a cultura de esferóides seria para uma duração finita, e as células são eles próprios o produto .. Pode ser desejável para alguns investigadores para expandir de forma contínua ou cultura de células usando um método semelhante, mas isso iria apresentar outros desafios não encontrados para estes estudos. Se cultivadas por períodos prolongados, os esferóides continuariam a crescer em tamanho, e a viabilidade de algumas células no núcleo do esferóide pode sofrer limitações devido ao aumento de nutrientes e de difusão de oxigénio. Estas culturas pode exigir mais manipulações dissociar grandes esferóides para evitar esta limitação quando as culturas de longo prazo são desejados.Não há diminuição da viabilidade foi observada para esferóides gerados com este protocolo, o que sugere que este limite não foi alcançado durante o período de cultura de 21 dias do estudo.

    Para terapias celulares, estas técnicas podem ser usadas em combinação com sistemas de regulação adicionais para melhorar o rendimento das células, função e viabilidade. Por exemplo, o método SSB pode ser combinado com tecnologias que facilitam incluindo culturas de superfície micro-transportadores para as células aderentes para melhorar as taxas de crescimento celular, ou a encapsulação de células ou esferóides. Além disso, os algoritmos de ajuste mais complexas poderia ser implementado para fornecer controle de cultura mais apertado. Ajuste de alimentação pode ser combinado com o controlo de vários outros parâmetros, tais como pH, concentração de oxigénio dissolvido, temperatura, e a injecção dos reagentes para melhorar ainda mais 59,60. Para melhorar os resultados em outras aplicações, este método pode ser automatizada 15,24, e as taxas de alimentação pode ser calculado mminério ou com menos frequência, outras condições de cultura de refino.

    Processos de fabricação 61-63 devem ser definidos e cuidadosamente controlada para tornar os produtos biológicos reprodutíveis. O uso de reposição meio contínuo pode ser utilizado para mitigar as flutuações em nutrientes críticos observados na produção de células em grande escala, e que incorpora um sistema de alimentação ajustável pode implementar um controlo ainda maior sobre o ambiente celular, para manter os níveis de nutrientes desejados. O método descrito pode ser usado com outras células de mamífero para os dois produtos celulares e farmacêuticas.

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    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    β TC-6 Cells ATCC, Manassas, VA CRL-11506 Mouse Insulinoma cell line (adherent cell type)
    DPBS No Ca, No Mg Invitrogen, Carlsbad, CA 14190-144 https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/14190144?ICID=search-14190144
    Dulbecco's Modified Eagles Medium Invitrogen, Carlsbad, CA See below for product numbers 
    DMEM High Glucose (500 mM) Invitrogen, Carlsbad, CA 11965-092 http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/11965092
    DMEM Low Glucose (100 mM) Invitrogen, Carlsbad, CA 11885-084 http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/11885084 (note that this medium already contains pyruvate)
    L-glutamine Invitrogen, Carlsbad, CA 25030081 http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/25030081?ICID=search-product
    Sodium Pyruvate Invitrogen, Carlsbad, CA 11360070 https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/11360070?ICID=search-product
    Heat Inactivated Porcine Serum Gibco - Life Technologies 10082147 http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/10082147
    Trypsin-EDTA Invitrogen, Carlsbad, CA 25200056 https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/25200056?ICID=search-product
    T-150 Tissue Culture Treated Flasks Corning, Corning, NY 430825 http://catalog2.corning.com/LifeSciences/en-US/Shopping/ProductDetails.aspx?productid=430825(Lifesciences)
    &categoryname=
    NuAire Cell culture incubator Princeton, MN US Autoflow. Any water-jacketed CO2 regulating cell culture incubator could be used.
    Centrifuge Sorvall RT 7 (Any similar benchtop centrifuge may be used)
    Refrigerator Any laboratory refrigerator could be used (a small table-top version was used for these studies)
    1 L Glass Bottle Corning, Corning, NY 1395-1L Any vendor could be used. http://catalog2.corning.com/LifeSciences/en-US/Shopping/ProductDetails.aspx?productid=1395-1L(Lifesciences)
    &categoryname=
    2 L Glass Bottle Corning, Corning, NY 1395-2L Any vendor could be used
    250 ml stirred bioreactors  Corning, Corning, NY 4500-250 http://catalog2.corning.com/LifeSciences/en-US/Shopping/ProductDetails.aspx?productid=4500-250(Lifesciences)
    &categoryname=
    Stir Plate Fisher Scientific 11-496-104A Any incubator safe stir-plate can be used, any vendor
    Tissue Culture Dishes 100 mm Diameter Nunc, Rochester, NY (Fisher Scientific) 1256598  Any vendor could be used (ordered through Fisher Sci)
    FALCON 50 ml Conical Tubes Falcon, San Jose, CA 1256598 Any vendor could be used
    Delran Plastic Used for Custom Parts McMaster Carr Various Any material of choice could be used, but Deran is chosen because it is autoclave safe, non-reactive, and easy to machine. http://www.mcmaster.com/#acetal-homopolymer-sheets/=rjrcac
    Stainless Steel Pipe for custom lids McMaster Carr Various Any vendor could be used. http://www.mcmaster.com/#standard-stainless-steel-tubing/=rjrd91
    Custom Modified Delran Bioreactor Lids for Continuous Feeding Custom made Not aware of any vendors producing a similar product
    Custom Modified Glass Bottle Lids for Continuous feeding Custom made Some vendors (e.g., Fischer Sci, Corning) make similar products in the links below.
    Masterflex Digital Peristaltic Pump Cole Parmer, Vernon Hills, IL EW-77919-25 Any precision peristaltic pump could be used. http://www.coleparmer.com/Product/L_S_Eight_Channel_Four_Roller_
    Cartridge_Pump_System_115_230
    _VAC/EW-77919-25
    PVDF Tubing Connectors (various) Cole Parmer, Vernon Hills, IL see link Any vendor could be used. http://www.coleparmer.com/Category/Cole_Parmer_PVDF_Premium
    _Luer_Fittings/55889
    Pharmed BPT Tubing L/S 16 Cole Parmer, Vernon Hills, IL WU-06508-16 Any vendor could be used. http://www.coleparmer.com/Product/Masterflex_PharMed_BPT_Tubing
    _L_S_13_25/WU-06508-16
    Pharmed BPT Tubing L/S 14 Cole Parmer, Vernon Hills, IL WU-06508-14 Any vendor could be used. http://www.coleparmer.com/Product/Masterflex_PharMed_BPT_Tubing
    _L_S_13_25/WU-06508-14
    Pharmed BPT Tubing L/S 13 Cole Parmer, Vernon Hills, IL WU-06508-13 Any vendor could be used. http://www.coleparmer.com/Product/Masterflex_PharMed_BPT_Tubing
    _L_S_13_25/WU-06508-13
    Millipore Millex GP PES membrane 0.22 µl sterile syringe filter (used for venting, and medium filtration) Fisher Scientific SLGP033RS Any vendor could be used
    25 ml Graduated Pipette Fisher Scientific 13-678-11 Any vendor could be used, and various sizes may be used
    Pipetter Fisher Scientific 13-681-15E Any vendor, or similar product could be used
    Hemocytometer Fisher Scientific 02-671-6 Any vendor, or similar product could be used
    Trypan Blue Gibco - Life Technologies 15250-061 Any vendor, or similar product could be used. https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/15250061
    Inverted Light Microscope Leica Any vendor, or similar product could be used
    One Touch Ultra Blood Glucose Meter Fisher Scientific 22-029-293 Any vendor, or similar product could be used (e.g., Bayer)
    One Touch Ultra-Strips Fisher Scientific 22-029-292  Any vendor, or similar product could be used (e.g., Bayer)

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Reuveny, S., Velez, D., Macmillan, J. D., Miller, L. Factors affecting cell growth and monoclonal antibody production in stirred reactors. J. Immunol. Methods. 86 (1), 53-59 (1986).
    2. Tarleton, R. L., Beyer, A. M. Medium-scale production and purification of monoclonal antibodies in protein-free medium. Biotechniques. 11 (5), 590-593 (1991).
    3. Weegman, B. P., et al. Nutrient regulation by continuous feeding removes limitations on cell yield in the large-scale expansion of Mammalian cell spheroids. PLoS One. 8 (10), e76611 (2013).
    4. Klueh, U., et al. Continuous glucose monitoring in normal mice and mice with prediabetes and diabetes. Diabetes Technol. Ther. 8 (3), 402-412 (2006).
    5. Hay, R. J. Operator-induced contamination in cell culture systems. Dev. Biol. Stand. 75, 193-204 (1991).
    6. Dazey, B., Duchez, P., Letellier, C., Vezon, G., Ivanovic, Z. Cord blood processing by using a standard manual technique and automated closed system "Sepax" (Kit CS-530). Stem Cells Dev. 14 (1), 6-10 (2005).
    7. Gastens, M. H., et al. Good manufacturing practice-compliant expansion of marrow-derived stem and progenitor cells for cell therapy. Cell Transplant. 16 (7), 685-696 (2007).
    8. Naing, M. W., Williams, D. J. Three-dimensional culture and bioreactors for cellular therapies. Cytotherapy. 13 (4), 391-399 (2011).
    9. Stacey, G. N. Cell culture contamination. Cancer Cell Culture. , Methods Mol Biol; 731. Humana Press. Totowa, NJ. 79-91 (2011).
    10. Zur Nieden, I. N., Cormier, J. T., Rancourt, D. E., Kallos, M. S. Embryonic stem cells remain highly pluripotent following long term expansion as aggregates in suspension bioreactors. J. Biotechnol. 129 (3), 421-432 (2007).
    11. Kehoe, D. E., Jing, D., Lock, L. T., Tzanakakis, E. S. Scalable stirred-suspension bioreactor culture of human pluripotent stem cells. Tissue Eng. Part A. 16 (2), 405-421 (2010).
    12. Krawetz, R., et al. Large-scale expansion of pluripotent human embryonic stem cells in stirred-suspension bioreactors. Tissue Eng. Part C. Methods. 16 (4), 573-582 (2010).
    13. Shafa, M., et al. Expansion and long-term maintenance of induced pluripotent stem cells in stirred suspension bioreactors. J. Tissue Eng. Regen. Med. 6 (6), 462-472 (2012).
    14. Oh, S. K. W., et al. Long-term microcarrier suspension cultures of human embryonic stem cells. Stem Cell Res. 2 (3), 219-230 (2009).
    15. Olmer, R., et al. Suspension culture of human pluripotent stem cells in controlled, stirred bioreactors. Tissue Eng. Part C. Methods. 18 (10), 772-784 (2012).
    16. Baptista, R. P., Da Fluri,, Zandstra, P. W. High density continuous production of murine pluripotent cells in an acoustic perfused bioreactor at different oxygen concentrations. Biotechnol. Bioeng. 110 (2), 648-655 (2013).
    17. Papas, K. K. Characterization of the metabolic and secretory behavior of suspended free and entrapped ART-20 spheroids in fed-batch and perfusion cultures [dissertation]. , Georgia Institute of Technology. Atlanta, GA. (1992).
    18. Papas, K. K., Constantinidis, I., Sambanis, A. Cultivation of recombinant, insulin-secreting AtT-20 cells as free and entrapped spheroids. Cytotechnology. 13 (1), 1-12 (1993).
    19. Sambanis, A., Papas, K. K., Flanders, P. C., Long, R. C., Kang, H., Constantinidis, I. Towards the development of a bioartificial pancreas: immunoisolation and NMR monitoring of mouse insulinomas. Cytotechnology. 15 (1-3), 351-363 (1994).
    20. Sharma, S., Raju, R., Sui, S., Hu, W. -S. Stem cell culture engineering - process scale up and beyond. Biotechnol. J. 6 (11), 1317-1329 (2011).
    21. Papas, K. K., Long, R. C., Constantinidis, I., Sambanis, A. Role of ATP and Pi in the mechanism of insulin secretion in the mouse insulinoma betaTC3 cell line. Biochem. J. 326 (Pt 3), 807-814 (1997).
    22. Papas, K. K., Long, R. C., Sambanis, A., Constantinidis, I. Development of a bioartificial pancreas: I. long-term propagation and basal and induced secretion from entrapped betaTC3 cell cultures. Biotechnol. Bioeng. 66 (4), 219-230 (1999).
    23. Papas, K. K., Long, R. C., Sambanis, A., Constantinidis, I. Development of a bioartificial pancreas: II. Effects of oxygen on long-term entrapped betaTC3 cell cultures. Biotechnol. Bioeng. 66 (4), 231-237 (1999).
    24. Hu, W. S. Cell culture process monitoring and control-a key to process optimization. Cytotechnology. 14 (3), 155-156 (1994).
    25. Alfred, R., et al. Efficient suspension bioreactor expansion of murine embryonic stem cells on microcarriers in serum-free medium. Biotechnol. Prog. 27 (3), 811-823 (2011).
    26. Cormier, J. T., zur Nieden, N. I., Rancourt, D. E., Kallos, M. S. Expansion of undifferentiated murine embryonic stem cells as aggregates in suspension culture bioreactors. Tissue Eng. 12 (11), 3233-3245 (2006).
    27. Dang, S. M., Zandstra, P. W. Scalable production of embryonic stem cell-derived cells. Methods Mol. Biol. 290 (1), 353-364 (2005).
    28. Elseberg, C. L., et al. Microcarrier-based expansion process for hMSCs with high vitality and undifferentiated characteristics. Int. J. Artif. Organs. 35 (2), 93-107 (2012).
    29. Kallos, M. S., Behie, L. A. Inoculation and growth conditions for high-cell-density expansion of mammalian neural stem cells in suspension bioreactors. Biotechnol. Bioeng. 63 (4), 473-483 (1999).
    30. Kehoe, D. E., Lock, L. T., Parikh, A., Tzanakakis, E. S. Propagation of embryonic stem cells in stirred suspension without serum. Biotechnol. Prog. 24 (6), 1342-1352 (2008).
    31. Kirouac, D. C., Zandstra, P. W. The systematic production of cells for cell therapies. Cell Stem Cell. 3 (4), 369-381 (2008).
    32. Serra, M., et al. Stirred bioreactors for the expansion of adult pancreatic stem cells. Ann. Anat. 191 (1), 104-115 (2009).
    33. Chawla, M., Bodnar, C. A., Sen, A., Kallos, M. S., Behie, L. A. Production of islet-like structures from neonatal porcine pancreatic tissue in suspension bioreactors. Biotechnol. Prog. 22 (2), 561-567 (2006).
    34. Weegman, B. P., et al. Temperature profiles of different cooling methods in porcine pancreas procurement. Xenotransplantation. , (2014).
    35. Cruz, H. J., Moreira, J. L., Carrondo, M. J. Metabolic shifts by nutrient manipulation in continuous cultures of BHK cells. Biotechnol. Bioeng. 66 (2), 104-113 (1999).
    36. Dowd, J. E., Jubb, A., Kwok, K. E., Piret, J. M. Optimization and control of perfusion cultures using a viable cell probe and cell specific perfusion rates. Cytotechnology. 42 (1), 35-45 (2003).
    37. Goudar, C., Biener, R., Zhang, C., Michaels, J., Piret, J., Konstantinov, K. Towards industrial application of quasi real-time metabolic flux analysis for mammalian cell culture. Cell Culture Engineering. 101, Adv. Biochem. Eng. Biotechnol; 101. Springer Berlin Heidelberg. Berlin, Heidelberg. 99-118 (2006).
    38. Hu, W. S., Piret, J. M. Mammalian cell culture processes. Curr. Opin. Biotechnol. 3 (2), 110-114 (1992).
    39. Knaack, D., et al. Clonal insulinoma cell line that stably maintains correct glucose responsiveness. Diabetes. 43 (12), 1413-1417 (1994).
    40. Poitout, V., Stout, L. E., Armstrong, M. B., Walseth, T. F., Sorenson, R. L., Robertson, R. P. Morphological and functional characterization of beta TC-6 cells--an insulin-secreting cell line derived from transgenic mice. Diabetes. 44 (3), 306-313 (1995).
    41. Poitout, V., Olson, L. K., Robertson, R. P. Insulin-secreting cell lines: classification, characteristics and potential applications. Diabetes Metab. 22 (1), 7-14 (1996).
    42. Suzuki, R., et al. Cyotomedical therapy for insulinopenic diabetes using microencapsulated pancreatic beta cell lines. Life Sci. 71 (15), 1717-1729 (2002).
    43. Skelin, M., Rupnik, M., Cencic, A. Pancreatic beta cell lines and their applications in diabetes mellitus research. ALTEX. 27 (2), 105-113 (2010).
    44. Masters, J. R., Stacey, G. N. Changing medium and passaging cell lines. Nat. Protoc. 2 (9), 2276-2284 (2007).
    45. Murdoch, T. B., McGhee-Wilson, D., Shapiro, A. M. J., Lakey, J. R. T. Methods of human islet culture for transplantation. Cell Transplant. 13 (6), 605-617 (2004).
    46. Woodside, S. M., Bowen, B. D., Piret, J. M. Mammalian cell retention devices for stirred perfusion bioreactors. Cytotechnology. 28 (1-3), 163-175 (1998).
    47. Serra, M., et al. Improving expansion of pluripotent human embryonic stem cells in perfused bioreactors through oxygen control. J. Biotechnol. 148 (4), 208-215 (2010).
    48. Gálvez, J., Lecina, M., Solà, C., Cairó, J., Gòdia, F. Optimization of HEK-293S cell cultures for the production of adenoviral vectors in bioreactors using on-line OUR measurements. J. Biotechnol. 157 (1), 214-222 (2012).
    49. Trabelsi, K., Majoul, S., Rourou, S., Kallel, H. Development of a measles vaccine production process in MRC-5 cells grown on Cytodex1 microcarriers and in a stirred bioreactor. Appl. Microbiol. Biotechnol. 93 (3), 1031-1040 (2012).
    50. Liu, H., et al. A high-yield and scaleable adenovirus vector production process based on high density perfusion culture of HEK 293 cells as suspended aggregates. J. Biosci. Bioeng. 107 (5), 524-529 (2009).
    51. Zhi, Z., Liu, B., Jones, P. M., Pickup, J. C. Polysaccharide multilayer nanoencapsulation of insulin-producing beta-cells grown as pseudoislets for potential cellular delivery of insulin. Biomacromolecules. 11 (3), 610-616 (2010).
    52. Lock, L. T., Laychock, S. G., Tzanakakis, E. S. Pseudoislets in stirred-suspension culture exhibit enhanced cell survival, propagation and insulin secretion. J. Biotechnol. 151 (3), 278-286 (2011).
    53. Marchenko, S., Flanagan, L. Counting human neural stem cells. J. Vis. Exp. (7), e262 (2007).
    54. Campos, C. Chronic hyperglycemia and glucose toxicity: pathology and clinical sequelae. Postgrad. Med. 124 (6), 90-97 (2012).
    55. Eve, D. J., Fillmore, R., Borlongan, C. V., Sanberg, P. R. Stem cells have the potential to rejuvenate regenerative medicine research. Med. Sci. Monit. 16 (10), RA197-RA217 (2010).
    56. Hsiao, L. -C., Carr, C., Chang, K. -C., Lin, S. -Z., Clarke, K. Review Article: Stem Cell-based Therapy for Ischemic Heart Disease. Cell Transplant. , (2012).
    57. Oldershaw, R. A. Cell sources for the regeneration of articular cartilage: the past, the horizon and the future. Int. J. Exp. Pathol. 93 (6), 389-400 (2012).
    58. De Coppi, P. Regenerative medicine for congenital malformations. J. Pediatr. Surg. 48 (2), 273-280 (2013).
    59. Tziampazis, E., Sambanis, A. Modeling of cell culture processes. Cytotechnology. 14 (3), 191-204 (1994).
    60. Sidoli, F. R., Mantalaris, A., Asprey, S. P. Modelling of Mammalian cells and cell culture processes. Cytotechnology. 44 (1-2), 27-46 (2004).
    61. Yim, R. Administrative and research policies required to bring cellular therapies from the research laboratory to the patient’s bedside. Transfusion. 45, Suppl 4. 144S-158S (2005).
    62. Fink, D. W. FDA regulation of stem cell-based products. Science. 324 (5935), 1662-1663 (2009).
    63. Moos, M. Stem-cell-derived products: an FDA update. Trends Pharmacol. Sci. 29 (12), 591-593 (2008).

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