Nutrient regulation using continuous growth adjusted feeding improves growth rates of mammalian cell spheroids compared to intermittent batch feeding for cultures in stirred suspension bioreactors. This study demonstrates the methods required for establishing simple adjusted rate fed cultures.
In this demonstration, spheroids formed from the β-TC6 insulinoma cell line were cultured as a model of manufacturing a mammalian islet cell product to demonstrate how regulating nutrient levels can improve cell yields. In previous studies, bioreactors facilitated increased culture volumes over static cultures, but no increase in cell yields were observed. Limitations in key nutrients such as glucose, which were consumed between batch feedings, can lead to limitations in cell expansion. Large fluctuations in glucose levels were observed, despite the increase in glucose concentrations in the media. The use of continuous feeding systems eliminated fluctuations in glucose levels, and improved cell growth rates when compared with batch fed static and SSB culture methods. Additional increases in growth rates were observed by adjusting the feed rate based on calculated nutrient consumption, which allowed the maintenance of physiological glucose over three weeks in culture. This method can also be adapted for other cell types.
For å generere et stort antall levedyktige og funksjonelle humane celler for transplantasjon, er avgjørende regulering av dyrkningsforhold. Uttømming av næringsstoffer, sammen med oppbygging av metabolsk avfall er viktige bidragsytere til senescence og metabolske endringer som reduserer kvaliteten av cellen produkt 1 – 3. Denne fremgangsmåten viser en metode for å dyrke pattedyrceller i kuler ved hjelp av en omrørt bioreaktor i kombinasjon med en justert rate perfusjon matesystem for å regulere glukose i en fysiologiske området 4 gjennom hele varigheten av kulturen. For hensikten med disse studiene, ble det fysiologiske området definert som mellom 100 og 200 mg / dl. De samme fremgangsmåter kan anvendes for å regulere andre næringsstoffer og metabolske avfall så som laktat.
Statiske kulturer i små volumer (1 – 30 ml) blir typisk anvendt i laboratorieoppsett for å opprettholde og differensiere cellelinjer for experimental formål. Cell aging utføres med komplett medium endringer som trengs med jevne mellomrom. Mest "konvensjonelle" kulturmediet har en høy glukosekonsentrasjon (450 mg / dl for DMEM brukt i disse studiene) for å tillate mindre hyppig mellom endringer uten risiko for nærings begrensninger. Dette krever imidlertid batch-fôring metoden fortsatt hyppig manipulasjon, introduserer variasjon i cellen miljø, og øker risikoen for forurensning 5-9. Rørt suspensjon bioreaktorer (SSB) gir bedre blanding og redusert håndtering 3,10 – 20, men som statiske kulturer, krever manuelle mellom endringer som bidrar til potensielt skadelige svingninger i nærings og avfallsproduktnivå. Perfusjon fôring av SSB kulturer reduserer disse problemene ved kontinuerlig infusjon og fjerning av middels, men store endringer i næringsinnhold på grunn av cellevekst er fortsatt et problem. Bruken av en justert mate rate fra beregninger av næringsbruk basert på estimerte cellekrav kan gi stabile cellemiljøet nødvendig for å optimalisere celle levedyktighet og funksjon 21-24.
Det er en stor mengde litteratur som beskriver metoder for skalerbare SSB kulturer av pattedyrceller spesielt for kultur og utvidelse av pluripotente celler 25 – 32, med andre fokusert på holmen (beta) celler 17,33,34, eller produksjon av biologiske produkter 24, 35-38. Mange av disse undersøkte celletyper kan dyrkes i kulturer sfæroide, og spesifikke prosedyrer for celletypen som brukes bør optimaliseres før implementering av et kontinuerlig matesystem. I denne demonstrasjonen ble en perfusjon mate metode som brukes til å utvide en beta-cellelinje dyrkes som kuler i en omrørt bioreaktor 39-43. Fremgangsmåten beskrevet heri tilveiebringer engrei gjennomføring av fôringsrate justeringer basert på off-line glukose målinger for å oppnå målrettede dyrkningsforhold. Justering av matehastigheten med denne metoden for å opprettholde en fysiologisk glukosenivået er vist å øke celleutbytte. Pattedyrceller er avhengig av en nøkkel næringsstoff, glukose, for energiproduksjon, så bruken av denne cellelinje er en modell for mange dyrkede pattedyrceller 44. I tillegg eksemplifiserer denne linjen den ytterligere kompleksitet av beta-celler, som er følsomme for kroniske høye nivåer av glukose 45. For denne studien ble p-TC6 cellene tillatt å danne kuler i kultur for å tilnærme den gjennomsnittlige størrelsen av Langerhans øyer in vivo. Perfusjon bioreaktor system 17 – 19,21,46 med en matehastighet justert til glukose forbruk, resulterte i opprettholdelse av fysiologiske betingelser og høyere celleutbytte uten forandringer i levedyktighet.
Generering av pattedyrcelleprodukter for fremstilling av biologiske midler, og for celleterapi krever kulturen og overvåking av pattedyrceller i stor skala 55-58. Videre disse programmene krever definerte og godkjente dyrkningsforhold. Bare å øke volumet av celler ved hjelp av forsknings teknologier vil ikke oppfylle alle disse kravene. Manuelle mellom endringer forårsaker svingninger i næringsstoffer og opphoping av avfallsstoffer redusere celle kvalitet, levedyktighet og yield. Br…
The authors have nothing to disclose.
The authors thank Michael Garwood and Sam Stein for their helpful comments, and Kristen M. Maynard for assistance with manuscript preparation.
Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number / Link | Comments/Description |
BTC-6 Cells | ATCC, Manassas, VA | CRL-11506 | Mouse Insulinoma cell line (adherent cell type) |
DPBS No CA, No Mg | Invitrogen, Carlsbad, CA | 14190-144 | https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/14190144?ICID=search-14190144 |
Dulbecco's Modified Eagles Medium | Invitrogen, Carlsbad, CA | See below for product numbers | |
DMEM High Glucose (500mM) | Invitrogen, Carlsbad, CA | 11965-092 | http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/11965092 |
DMEM Low Glucose (100mM) | Invitrogen, Carlsbad, CA | 11885-084 | http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/11885084 (note that this medium already contains pyruvate) |
L-gultamine | Invitrogen, Carlsbad, CA | 25030081 | http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/25030081?ICID=search-product |
Sodium Pyruvate | Invitrogen, Carlsbad, CA | 11360070 | https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/11360070?ICID=search-product |
Heat Inactivated Porcine Serum | Gibco – Life Technologies | 10082147 | http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/10082147 |
Trypsin-EDTA | Invitrogen, Carlsbad, CA | 25200056 | https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/25200056?ICID=search-product |
T-150 Tissue Culture Treated Flasks | Corning, Corning, NY | 430825 | http://catalog2.corning.com/LifeSciences/en-US/Shopping/ProductDetails.aspx?productid=430825(Lifesciences) &categoryname= |
NuAire Cell culture incubator | Princeton, MN | US Autoflow , Any water-jacketed CO2 regulating cell culture incubator could be used | |
Centrifuge | Sorvall RT 7 (Any similar benchtop centrifuge may be used) | ||
Refrigerator | Any laboratory refrigerator could be used (a small table-top version was used for these studies) | ||
1L Glass Bottle | Corning, Corning, NY | 1395-1L | Any vendor could be used http://catalog2.corning.com/LifeSciences/en-US/Shopping/ProductDetails.aspx?productid=1395-1L(Lifesciences) &categoryname= |
2L Glass Bottle | Corning, Corning, NY | 1395-2L | Any vendor could be used |
250 ml stirred bioreactors | Corning, Corning, NY | 4500-250 | http://catalog2.corning.com/LifeSciences/en-US/Shopping/ProductDetails.aspx?productid=4500-250(Lifesciences) &categoryname= |
Stir Plate | Fisher Scientific | 11-496-104A | Any incubator safe stir-plate can be used, any vendor |
Tissue Culture Dishes 100mm Diameter | Nunc, Rochester, NY (Fisher Scientific) | 1256598 | Any vendor could be used (ordered through Fisher Sci) |
FALCON 50 ml Conical Tubes | Falcon, San Jose, CA | 1256598 | Any vendor could be used |
Delran Plastic Used for Custom Parts | McMaster Carr | Various | Any material of choice could be used, but Deran is chosen because it is autoclave safe, non-reactive, and easy to machine, http://www.mcmaster.com/#acetal-homopolymer-sheets/=rjrcac |
Stainless Steel Pipe for custom lids | McMaster Carr | Various | Any vendor could be used, http://www.mcmaster.com/#standard-stainless-steel-tubing/=rjrd91 |
Custom Modified Delran Bioreactor Lids for Continuous Feeding | Custom made | Not aware of any vendors producing a similar product | |
Custom Modified Glass Bottle Lids for Continuous feeding | Custom made | Some vendors (eg. Fischer Sci, Corning) make similar products in the links below | |
Masterflex Digital Peristaltic Pump | Cole Parmer, Vernon Hills, IL | EW-77919-25 | Any precision peristaltic pump could be used, http://www.coleparmer.com/Product/L_S_Eight_Channel_Four_Roller_ Cartridge_Pump_System_115_230 _VAC/EW-77919-25 |
PVDF Tubing Connectors (various) | Cole Parmer, Vernon Hills, IL | see link | Any vendor could be used, http://www.coleparmer.com/Category/Cole_Parmer_PVDF_Premium _Luer_Fittings/55889 |
Pharmed BPT Tubing L/S 16 | Cole Parmer, Vernon Hills, IL | WU-06508-16 | Any vendor could be used, http://www.coleparmer.com/Product/Masterflex_PharMed_BPT_Tubing _L_S_13_25/WU-06508-16 |
Pharmed BPT Tubing L/S 14 | Cole Parmer, Vernon Hills, IL | WU-06508-14 | Any vendor could be used, http://www.coleparmer.com/Product/Masterflex_PharMed_BPT_Tubing _L_S_13_25/WU-06508-14 |
Pharmed BPT Tubing L/S 13 | Cole Parmer, Vernon Hills, IL | WU-06508-13 | Any vendor could be used, http://www.coleparmer.com/Product/Masterflex_PharMed_BPT_Tubing _L_S_13_25/WU-06508-13 |
Millipore Millex GP PES membrane 0.22ul sterile syringe filter (used for venting, and medium filtration) | Fisher Scientific | SLGP033RS | Any vendor could be used |
25ml Graduated Pipette | Fisher Scientific | 13-678-11 | Any vendor could be used, and various sizes may be used |
Pipetter | Fisher Scientific | 13-681-15E | Any vendor, or similar product could be used |
Hemocytometer | Fisher Scientific | 02-671-6 | Any vendor, or similar product could be used |
Trypan Blue | Gibco – Life Technologies | 15250-061 | Any vendor, or similar product could be used, https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/15250061 |
Inverted Light Microscope | Leica | Any vendor, or similar product could be used | |
One Touch Ultra Blood Glucose Meter | Fisher Scientific | 22-029-293 | Any vendor, or similar product could be used (eg. Bayer) |
One Touch Ultra-Strips | Fisher Scientific | 22-029-292 | Any vendor, or similar product could be used (eg. Bayer) |