Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Nutrient Regulering av Kontinuerlig Fôring for storstilt utvidelse av pattedyrceller i Spheroids

Published: September 25, 2016 doi: 10.3791/52224
Automatic Translation
1, 2, 2, 2, 3, 2, 2, 2, 4, 2
1Radiology, University of Minnesota, 2Medicine, University of Minnesota, 3School of Public Health, University of Minnesota, 4Surgery, University of Arizona

Introduction

For å generere et stort antall levedyktige og funksjonelle humane celler for transplantasjon, er avgjørende regulering av dyrkningsforhold. Uttømming av næringsstoffer, sammen med oppbygging av metabolsk avfall er viktige bidragsytere til senescence og metabolske endringer som reduserer kvaliteten av cellen produkt 1 - 3. Denne fremgangsmåten viser en metode for å dyrke pattedyrceller i kuler ved hjelp av en omrørt bioreaktor i kombinasjon med en justert rate perfusjon matesystem for å regulere glukose i en fysiologiske området 4 gjennom hele varigheten av kulturen. For hensikten med disse studiene, ble det fysiologiske området definert som mellom 100 og 200 mg / dl. De samme fremgangsmåter kan anvendes for å regulere andre næringsstoffer og metabolske avfall så som laktat.

Statiske kulturer i små volumer (1 - 30 ml) blir typisk anvendt i laboratorieoppsett for å opprettholde og differensiere cellelinjer for experimental formål. Cell aging utføres med komplett medium endringer som trengs med jevne mellomrom. Mest "konvensjonelle" kulturmediet har en høy glukosekonsentrasjon (450 mg / dl for DMEM brukt i disse studiene) for å tillate mindre hyppig mellom endringer uten risiko for nærings begrensninger. Dette krever imidlertid batch-fôring metoden fortsatt hyppig manipulasjon, introduserer variasjon i cellen miljø, og øker risikoen for forurensning 5-9. Rørt suspensjon bioreaktorer (SSB) gir bedre blanding og redusert håndtering 3,10 - 20, men som statiske kulturer, krever manuelle mellom endringer som bidrar til potensielt skadelige svingninger i nærings og avfallsproduktnivå. Perfusjon fôring av SSB kulturer reduserer disse problemene ved kontinuerlig infusjon og fjerning av middels, men store endringer i næringsinnhold på grunn av cellevekst er fortsatt et problem. Bruken av en justert mate rate fra beregninger av næringsbruk basert på estimerte cellekrav kan gi stabile cellemiljøet nødvendig for å optimalisere celle levedyktighet og funksjon 21-24.

Det er en stor mengde litteratur som beskriver metoder for skalerbare SSB kulturer av pattedyrceller spesielt for kultur og utvidelse av pluripotente celler 25 - 32, med andre fokusert på holmen (beta) celler 17,33,34, eller produksjon av biologiske produkter 24, 35-38. Mange av disse undersøkte celletyper kan dyrkes i kulturer sfæroide, og spesifikke prosedyrer for celletypen som brukes bør optimaliseres før implementering av et kontinuerlig matesystem. I denne demonstrasjonen ble en perfusjon mate metode som brukes til å utvide en beta-cellelinje dyrkes som kuler i en omrørt bioreaktor 39-43. Fremgangsmåten beskrevet heri tilveiebringer engrei gjennomføring av fôringsrate justeringer basert på off-line glukose målinger for å oppnå målrettede dyrkningsforhold. Justering av matehastigheten med denne metoden for å opprettholde en fysiologisk glukosenivået er vist å øke celleutbytte. Pattedyrceller er avhengig av en nøkkel næringsstoff, glukose, for energiproduksjon, så bruken av denne cellelinje er en modell for mange dyrkede pattedyrceller 44. I tillegg eksemplifiserer denne linjen den ytterligere kompleksitet av beta-celler, som er følsomme for kroniske høye nivåer av glukose 45. For denne studien ble p-TC6 cellene tillatt å danne kuler i kultur for å tilnærme den gjennomsnittlige størrelsen av Langerhans øyer in vivo. Perfusjon bioreaktor system 17 - 19,21,46 med en matehastighet justert til glukose forbruk, resulterte i opprettholdelse av fysiologiske betingelser og høyere celleutbytte uten forandringer i levedyktighet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Cell Line og vedlikehold

  1. Skaffe p-TC6 celler (eller annen ønsket tilhenger pattedyrcellelinje). I forberedelsene til studien, kultur, passasje, og fryse ned cellene i henhold til leverandørens anvisninger.

2. Fest Kontinuerlig Feeding System

MERK: kontinuerlig mating system design i metoden nedenfor var basert på liknende systemer som er beskrevet i litteraturen 17 - 19,21,47 - 49. Montering av systemet som brukes her er beskrevet i detalj i en tidligere publikasjon tre.

  1. Samle komponentene som trengs for matesystem som består av fem hovedkomponenter: et medium reservoar, peristaltiske pumpen, rørt bioreaktor, avfall reservoar, og tilpasset designet slange / sampling sett.
    1. Etablere medium reservoaret ved hjelp av en 1-liters glassflaske, avfallsreservoar ved bruk av en 2 liters glassflaske, og den stirred bioreaktor ved hjelp av en 250 ml volum glassreaktor (hyllevare versjon).
    2. Bruk en digital peristaltisk pumpe eller lignende pumpe med en 8 kanals pumpehodet til å kontrollere medium utveksling.
    3. Produksjon reservoaret og modifiserte bioreaktor lokk fra hardt og autoklaverbare plast med rustfritt stål rør pass-through-porter for å gi ventilasjon gjennom sterile filtre, og gir mulighet for medium overføring mellom reservoarer og bioreaktorer. Alternativt kjøpe spesialiserte lokk med strømningsportene fra ulike leverandører.
      MERK: bioreaktor lokket kan inneholde ytterligere pass-through-porter for ekstra instrumentering og overvåking sonder (f.eks oksygen monitor).
    4. Feste en innsats rør (OT) er fremstilt av porøse glass lufte rør med en midlere pore-størrelsesområde på 40 um til 60 um, og en poretetthet på 40% til den modifiserte SSB lokket. Du kan også velge en annen strøm tube basert på de spesifikke kravene i kulturen.
      MERK: VelgOT porestørrelse å fjerne bare medium og celleavfall, forlater celleaggregater i kultur (som beskrevet i kapittel 6 og offentliggjøring 3 for mer informasjon).
  2. Monter autoklaver Perfusjonsslangen sett fra polyvinylidenfluorid (PVDF) slangekoblinger og holdbar peristaltiske pumpeslanger. Lengden av seksjonen er avhengig av avstanden mellom de forskjellige komponentene.
    MERK: Vær spesielt forsiktig når du velger tubing utvalg for å sikre holdbarhet og pålitelighet for langsiktige eksperimenter.
  3. Montere røret sett fra tre deler: en tilførselsledning, et avfall linje, og en prøvelinje.
    1. Monter matelinje ved hjelp av to rør diameter (L / S 14 og L / S 13). Bruk L / S-14 for primærrøret som vil spenne avstanden fra bioreaktoren til mediet reservoaret, og sette inn en kort lengde på L / S 13 i midten av rørlengden for pumpedelen ved bruk av passende PVDF-adapterne.
    2. Bruk Standard PVDF slange-piggtråd tubing adaptere til å bli to stykker av L / S 14 rør på hver side av den korteste pumpeseksjon (L / S 13) produksjonsrør.
      MERK: Alternativt kan hele lengden av røret kan være mindre diameter L / S-13 rør, og hele rørlengden kan bli erstattet når pumpeseksjonen integritet er aktuelle.
  4. Monter andre slangen seksjon for avfallsfjerning ved hjelp av større diameter (L / S 16) rør og sette en kort del av L / S 14 rør i midten for pumping delen. Dette gjøres på samme måte som mateledningen sammenstillingen ved bruk av PVDF slange piggete adaptere, eller alternativt ved å bruke en kontinuerlig lengde av den ønskede pumpeslangen størrelse, og å bytte ut etter behov.
    MERK: Hvis den samme pumpe og pumpehodet brukes til matekretsen, og avfallet kretsen, må pumpedelen av fjernings avfall slangeledninger være en større diameter enn pumpedelen til matelinjen. Dette sikrer at fjerningen pumpehastigheten er hurtigere enn fremføringshastigheten, og vil unngå potentIal for store endringer i kulturvolum, og redusere risikoen for overløp.
  5. Monter den siste komponenten av slangen set: en eksempelsamling montering.
    1. Denne prosedyren beskriver en tilpasset montert prøvetaking port system; alternativt kan en steril prøvetakingsport kjøpes fra flere leverandører.
    2. Konstruer sett fra tre korte (~ 6 cm) L / S 14 rørlengder som er koblet sammen med en T-type PVDF-kontakt, og to små slangeklemmer på to av rørlengder.
    3. Fest en steril gassfilter for gassventilering til en av de klemte lengder, og den andre benyttes for tilkobling til en steril prøvetaking sprøyte (sterile gassfiltre kan ha behov for å bli lagt i et bio-sikkerhetskabinett følgende sterilisering så mange sterile filtre er ikke autoklaverbar).
    4. Koble den tredje enden til en rustfri stålprøvekontakten er festet på lokket av bioreaktoren.
    5. Autoklav samplingsenheten mens koblet til bioreaktoren før begynnelsenforsøket (se trinn 3 nedenfor).
    6. Bruk denne forsamlingen til å samle sterile prøver fra bioreaktor ved behov uten å forstyrre den kontinuerlige strømmen prosessen.

3. Autoclave Alle materialer

  1. Forbered alle bioreaktor komponenter for autoklav sterilisering.
  2. Samle individuelle komponenter for sterilisering. Medium og avfall reservoarer (montert fra trinn 2.1.1), 250 ml spinner kolbe (samlet fra 2.1.1), nødvendige modifisert lokk (satt sammen av 2.1.3), strøm tube (beskrevet i 2.1.4), tre slangesett ( montert i avsnitt 2.2 through2.5), strøm tube (som trengs for kontinuerlig mating).
    1. Monter spinner kolbe med alle komponenter og være sikker på at utstrømningen slangen er godt festet på innsiden av spinner kolbe (beskrevet i avsnitt 2.1.4), og fest den tilpassede montert sampling port (avsnitt 2.5), eller annen prøvetaking port til toppen av lokket .
    2. Pakk hele spinner kolbe forsamlingen med autoclave wrap materiale, og autoklav indikerer tape. Vær sikker på at wrap lufttett. MERK: aluminiumsfolie eller tilsvarende materiale kan benyttes til å dekke de enkelte ender av hver adgangsport i bioreaktoren lokket for å bevare steriliteten av konnektoren / slutter når pakker opp, og når ikke-koblet til røret settene inne i inkubatoren.
    3. Monter de modifiserte lokk på middels og avfalls reservoarer og deretter legge til de respektive glassflasker. Dekk dem med aluminiumsfolie og autoklaveres indikerer tape.
    4. Individuelt vikle slangen sett (avsnitt 2.2 til 2.5) med autoklav wrap og tape for å bistå i sluttmontering. Aluminiumfolie eller tilsvarende materiale kan brukes til å vikle de enkelte endene av hver slange satt for å bevare steriliteten av konnektoren / slutter når pakker.
    5. Autoklav alle innpakket elementer ved hjelp av en standard tørr autoklav syklus (for eksempel "Gravity" innstilling med ~ 15 psi ved 121 ° C i 30 min eller mer).
      MERK: Ikke sett sterilfiltre forut for autoklavering med mindre de er bekreftet å være sikker autoklav.

4. spheroid Formation

MERK: Denne teknikken er lik de som er beskrevet i litteraturen 17 - 19,21,50 - 52 for andre pattedyrcellekulturer. Alle prosedyrer følgende sterilisering bør utføres i en laminær strømningshette og ved hjelp av sterile hansker for å opprettholde sterile betingelser for cellekultur.

  1. For alle forhold, kultur og utvide β-TC6 celler i standardheft kulturer (beskrevet av selger) inntil tilstrekkelige celle mengder oppnås til frø ønsket antall bioreaktorer.
    1. Montere den kontinuerlige mating bioreaktor med utløpsrøret som vist i figur 1, og beskrevet i seksjon 2, og kobler prøvetakingsport til prøvetaking lokk. MERK: strøm tube og prøvetaking port montering skal legges til bioreacteller for kontinuerlig mating før sfæroide formasjon, og skal trekkes opp ut av dyrkningsmediet til kontinuerlig tilførsel startes.
    2. Steriliser den modifiserte SSB montering av autoklav (beskrevet i kapittel 3).
    3. Fest sterile vents (0,22 mikrometer eller mindre sterile filtre) til de aktuelle stedene på lokkene av spinner flasken, og middels og avfalls fartøy.
      MERK: Dette er viktig for å forebygge damplås, og for å tillate gassutveksling mellom inkubator (5% CO2) miljø og bioreaktoren. Gassutvekslings er nødvendig for å opprettholde riktig pH ved bruk av bikarbonat-bufret media.
  2. Samle cellene ved mild trypsinisering hjelp av 0,25% (vekt / volum) trypsin-0,53 mM EDTA-oppløsning, ved romtemperatur hjelp av mekanisk omrøring i 2 - 3 minutter, og frø inn i bioreaktorer med en tetthet på omtrent 1,3 x 10 6 celler / ml i 200 ml kulturmedium.
    1. Flytt utpekt kolber ut av inkubatoren oginn i en bio-sikkerhet kabinett.
      MERK: All cellekultur og manipulasjoner bør gjøres i en bio-sikkerhet skapet ved hjelp av riktig steril teknikk.
    2. Fjern kultur medium fra kolbene ved å aspirere.
    3. Vask cellene ved å pipettere 5 ml fosfatbufret saltvann (uten Ca ++ eller Mg ++), inn i kolben, og skylling på tvers av cellene på overflaten, og deretter suge PBS.
    4. Tilsett 3 ml trypsin-EDTA-løsning til hver kolbe som vil bli samlet (typisk ca. 10 x 175 cm 2 T-kolber).
    5. Tillat høstes cellene inkuberes ved værelsestemperatur i 2 - 3 minutter i bio-sikkerhetskabinett.
    6. Agitere forsiktig for hånd for å løsne cellene fra kolbe overflate, og samle cellene ved tilsetning av 6 ml kulturmedium (med serum) til kolben, og overføre cellene til en 50 ml tube. Når en 50 ml tube er full, kan du bruke en annen 50 ml tube til alle de nødvendige cellene har blitt samlet inn (ca. en 50 ml tube vil være nødvendig for hver 5 T-175 kolbersamlet).
    7. Forsiktig sentrifuge (ca. 50 x tyngdekraften) de oppsamlede cellesuspensjoner for å pelletere cellene.
    8. Aspirer resterende medium forlater pellet intakt.
    9. Samle alle cellene i et enkelt rør ved å gjensuspendere pelleten i kulturmedium (inneholdende serum) ved hjelp av en pipette, og å overføre alle pellets i det samme rør.
    10. Telle celletettheten ved hjelp av en standard hemocytometer med trypanblått-farving, som beskrevet i litteraturen 53.
    11. Legg ønsket antall totale celler til sterile SSB for hver tilstand (1,3 x 10 6 celler / ml var målrettede startcelletettheter for denne demonstrasjonen).
    12. Legg medium (med den ønskede glukosekonsentrasjon, i dette tilfelle vi brukte mellomglukosenivåer innenfor det fysiologiske området) til SSB ved hjelp av en pipette for å oppnå den ønskede totale kulturvolum (200 ml kulturvolum ble anvendt for disse studiene).
      MERK: For disse kontinuerlig matet SSB studerer cu ltures ble sådd ut ved bruk av en modifisert "low-glukose" versjon av kulturmedium (100 mg / dl). Dette tillot kulturene for å begynne på det ønskede mål for glukosekonsentrasjonen i stedet for å starte med en "høy glukose" medium og venter på at glukoseforbruk for å bringe glukosenivåer ned i det fysiologiske område for å begynne mating. Alle andre medium for å mate i disse studiene ble det brukt standard "høy glukose" medium (500 mg / dl).
    13. Flytt SSB med celler til oppstuss plate inne i en cellekultur inkubator.
  3. Kultur celler i bioreaktorer uten mating i 3 dager ved 37 ° C med 5% CO2, 100% relativ fuktighet, og en rørehastighet på 70 rpm for å tillate kulene å danne.
    MERK: Ingen betydelig spredning bør observeres i løpet av tre dagers spheroid formasjon periode.
  4. Etter spheroid formasjon, dele kuler blant bioreaktorer med ønskede dyrkningsforhold.
le "> 5. Kontinuerlig Fôring Kultur og Justert mating

  1. Autoklav eller gass sterilisere alle komponentene, og montere i et biologisk sikkerhetskabinett ved hjelp av sterile teknikker (trinn 2-4).
  2. Etter spheroid formasjon, fjerner SSB fra inkubatoren og montere komponentene for kontinuerlig mating system i et biologisk sikkerhetskabinett.
    1. Først fyller friskt medium reservoar med den ønskede kulturmediet, og deretter koble seg til en side av den tilførselsledningen. Også sørge for at friskt medium reservoaret er skikkelig ventilert med et sterilt filter.
    2. Koble den ene side av den tilførselsledningen til mateinnløpsåpningen på bioreaktoren på en steril måte. Et sterilt filter skal monteres mellom mateledningen og bioreaktoren innløpsporten for å filtrere mediet før den kommer inn i bioreaktoren.
    3. Koble avfall linjen til bioreaktoren utløpsrøret og mediet avfallsreservoaret, og sørge for at avfallsreservoaret er riktig ventilert med en sterile filter.
  3. Flytt enheten ut av biologisk sikkerhetskabinett (dette vil trolig kreve to personer til å bære alle fartøyene og rør), og sette alle komponentene ut for langsiktig kultur.
    1. Sett SSB på røreplate på innsiden av inkubatoren ved hjelp av de samme dyrkningsbetingelsene for sfæroide formasjon (37 ° C, 5% CO2, 100% fuktighet og 70 rpm). NB: Det kan være nødvendig å midlertidig frakoble rør segmenter fra bioreaktoren dersom linjene må kjøre gjennom hull i siden av inkubatoren i stedet for ut gjennom pakningen i døren. Dette kan gjøres på en aseptisk måte ved å vikle endene av slangen settene med aluminiumsfolie før autoklavering (trinn 3), og venter på å feste bioreaktor side av mate og avfall rørseksjoner til bioreaktoren er inne i inkubatoren. De rør linjer kan settes på plass, og aluminiumfolien kan fjernes inne i inkubatoren og raskt festes til bioreaktoren.
    2. Kjør gjenværende endene av rør settene (de ikke er koblet til bioreaktor lokket) ut gjennom inkubatoren tilgang port (pass-through), eller gjennom et hakk i kuvøse dørpakningen.
    3. Utsiden av inkubator (i en nærliggende biosikkerhet kabinett hvis mulig), raskt koble tilførselsledningen til friskt medium reservoaret, og avfallet linje til mediet avfallsreservoaret, og sørge for at avfallsreservoaret er riktig ventilert med et sterilt filter. MERK: For å gjøre dette på en aseptisk måte, fjern aluminiumsfolien fra slangen og fartøyet, og koble dem til de respektive skipene så raskt som mulig (spesielt hvis denne sammenheng må gjøres utenfor biosikkerhet kabinettet).
    4. Sett friskt medium reservoar (fylt med ønsket fôr medium) inne i nærheten mini-kjøleskap. Kontroller at mate og avfall linjene er i stand til å gå ut av inkubatoren og skriv kjøleskapet uten at det hindrer dørene på hver lukker seg. Det er også viktig at føde lines er ikke klemt stengt av dørene enten kjøleskapet eller inkubatoren.
      MERK: Mediet anvendt for disse studiene var den standard høy glukose (500 mg / dl) kulturmedium som anbefales av leverandøren for denne celletype. Enhver høy glukose medium kan brukes basert på de spesifikke behovene til celletype som dyrkes. Glukosekonsentrasjonen av fødemediet bør være rimelig høyere (2x eller mer) enn den ønskede konsentrasjon i kulturen som matesystemet baserer seg på å øke matehastigheten for høy glukosemedium for å opprettholde tilstrekkelig glukosenivåer i kulturene under opprettholdelse av rimelige matehastigheter .
    5. Deretter kan avfallet medium reservoaret settes på benken toppen utenfor inkubatoren på et passende sted.
    6. Deretter plasserer "pumpedelen" av fôr og avfall linjer i pumpehodet sikre riktig vei, slik at mateledninger vil pumpe medium fra den ferske medium reservoaret inn i SSB, og avfalls linjervil pumpe medium fra SSB og til avfalls medium reservoaret.
  4. Slå på pumpen til ønsket matehastighet.
    1. Beregn mating med justerte mating ligningen beskrevet i litteraturen tre og i den medfølgende representative resultater nedenfor.
    2. Bruker den siste celletall informasjon (måten beskrevet i trinn 5) sammen med veksten prediksjon, og de mellom glukose målinger for å estimere matehastigheten som trengs for å opprettholde den ønskede glukosekonsentrasjon i kulturen.
      MERK: celle vekst og glukoseforbruk må innhentes før gjør disse prosedyrene.
    3. Angi at pumpehastigheten basert på den beregnede fremføringshastigheten.
  5. Gjenta beregning matehastigheten og justere pumpehastighet for hvert prøvetakingspunkt (hver tredje dag til den beskrevne metode).

6. legemer, levedyktighet, og glukosekonsentrasjonen Målinger

<ol>
  • Samle inn prøver fra hver bioreaktor hver tredje dag, eller som ønsket.
  • Ta kultur prøver fra kontinuerlig matet SSB kulturer som bruker spesialiserte sampling port beskrevet ovenfor.
    1. Forlater kontinuerlig matet SSB inne i bioreaktor, feste en steril sprøyte (5 ml volum sprøyte ble brukt for disse studiene) for å un-filtrert forbindelse med prøvetakingen porten.
    2. Bevege prøvetagningsrøret ned i kulturmediet.
    3. Unclamp rørseksjonen som skal til sprøyten, og trekke tilbake den ønskede totale prøvevolum.
    4. Bevege prøvetagningsrøret opp, slik at det ikke lenger er neddykket i kultur, og fortsetter å trekke sprøyten inntil luften er fjernet.
    5. Klem rør som strømmer sprøyten, og ta sprøyten inneholder prøven, og sett til side.
    6. Pre-load en annen frisk steril sprøyte med luft, og fest den sterile filteret siden av sampling port.
    7. Unclamp røret går til den sprøytefilter side avprøvetagningsåpningen, og deretter rense prøvetagningsåpningen ved forsiktig å drive ut luften i sprøyten gjennom det sterile filter. Dette sikrer at prøvetagningsåpningen vil være klar av eventuelle gjenværende medium.
    8. Re-klemme røret går til filteret, kobler steril sprøyte og kast den.
  • Ta sprøyten som inneholder celleprøve fra kulturen, og utvise den inn i et 10 ml rør. Sub-prøver av kjente volumer kan bli tatt direkte fra dette rør.
  • For celletall, fjerne et kjent volum av celler og overføre til et mikro-sentrifugerør, forsiktig og sentrifuger i 1 - 2 minutter (ca. 50 x tyngdekraften).
  • Overfør supernatanten til et separat rør for glukosemålinger, og re-suspen pellet med det samme volum av trypsin-EDTA-løsning (0,25% (vekt / volum) trypsin, 0,53 mM EDTA), og telle in triplo ved bruk av en standard hemocytometer med trypan blå flekker som beskrevet i litteraturen 53.
    1. Legg medium (med serum) tilprøven for fortynning som er nødvendig.
    2. Telle celler, og beregne cellen levedyktighet ved å ta opp levende (ufargede) celler, og døde (farget) celler uavhengig (levedyktighet% = levende celler / total celler).
  • Mål mellom blodsukkeret i tre eksemplarer med en blodsukkermåler og engangsteststrimler.
    1. Ta glukosemålinger som beskrevet av glukosemåler instruksjonene erstatte kulturmediet for blod.
    2. Dypp teststrimmelen i mediet som skal testes (hentet fra telleprøver ovenfor), og gjenta for ønsket antall gjentak (tre gjentak anbefales).
    3. Teste både friskt medium og avfall medium for glukosekonsentrasjoner.
      MERK: For noen meter, målinger lavere enn 20 mg / dl (påviselig terskel meter), kan observeres som en feil i apparatet utgang.

    • 7. spheroid Bosetting måling

    1. For å sikre at cell klynger blir ikke fjernet ved kontinuerlig matesystem, måler sedimenteringshastigheten av p-TC6 klumper ved å observere deres sedimentering i en stor plast diameter pipette.
    2. Kultur p-TC6 celler i SSB bioreaktorer for å danne kuler som beskrevet ovenfor.
    3. Etter 3 dagers dyrking, ta 30 ml prøver av den sfæroide suspensjon og plasser i et 50 ml rør.
    4. Forsiktig pipettér opp og ned ved hjelp av en bred diameter 25 ml pipette for å fordele jevnt i suspensjonen, og deretter stoppe pipettering med suspensjonen på et visst nivå i pipette (f.eks, 20 ml-merket), og deretter registrerer tiden for alle kulene i bosette 5 cm.
    5. Gjenta denne prosedyren nok ganger for å oppnå statistisk sikkerhet (vanligvis n> 3).
      MERK: For biologiske studier, ap verdi mindre enn 0,05 anses å være statistisk signifikant når man sammenligner målinger. Standard feil av gjennomsnittet ble brukt for rapportering av feil, og de to tailed un-paret student-t-testble brukt til å sammenligne forholdene for de presenterte data.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Representative Results

    Medium blodsukkeret og Svingninger Begrense Cell Ekspansjon i Standard SSB kulturer

    Blodsukkeret svinger i statiske kulturer og SSB kulturer gjennom hele dyrkningsperioden tre. Disse svingningene intensivere med økende celle nummer i løpet av 21-dagers kultur periode, og var nesten identiske i både statiske og SSB kulturer. Disse observasjonene er presentert i vår forrige publisering tre. De glukosenivåer kan bli super-fysiologiske for varigheten av dyrkningsperioden for begge metodene. Fordi dette kronisk eksponering kan hemme cellevekst 54, ble en kontinuerlig matesystem utviklet for å eliminere glukose svingninger og forbedre nærings kontroll under spheroid kultur.

    Kontinuerlig Feeding System for spheroid Culture

    Kontinuerlig tilsetning av friskt medium, og fjerne gammel medium for varigheten av dyrkningsperiodenkan oppnås ved hjelp av et enkelt medium etterfylling system. Det system som er beskrevet i metode 2, og vist i figur 1 anvendes en pumpe og slange satt til kontinuerlig etterfylle medium og et separat utløp rør for kontinuerlig å fjerne medium mens hindre fjerning av kuler fra kulturen. Mediet innløp var på den motsatte side av reaktoren for å minimalisere enhver mulighet for å blande seg med den riktige funksjon av OT, og for å tillate grundig blanding. Friskt medium (med høy glukose, 450 mg / dl) ble holdt ved kjøleskapstemperatur for å sikre langtidsstabilitet og kontinuerlig tilsatt til kulturen gjennom et medium innløp med en komplett medium erstatningshastighet hver tredje dag for å etterfylle næringsstoffer. Dette systemet begrenset manipulasjoner og intervensjon nødvendig under kultur perioden ved å erstatte den manuelle batch medium erstatningsprosess med en kontinuerlig prosess 3,22,23. Den kalde medium inngått bioreaktor i små volumer enn time (0,046 ml / min) i forhold til det totale kulturvolum (200 ml), slik at hver "drop" av tilsatt medium tid for å ekvilibrere temperaturen til det omgivende dyrkningsmedium som var ved 37 ° C. Dette sikret at det tilsatte kalde mediet ikke redusere den samlede kultur temperaturen ble holdt inne i inkubatoren. Omrøring av kulturmediet også økt varmeoverføringseffektivitet og forbedret temperaturensartethet i disse kulturene. Temperatur vedlikehold kan være et problem hvis svært høye matehastigheter ble brukt med små kulturvolumer, men disse usannsynlige forholdene ble ikke testet for disse studiene. Kulturen volum ble opprettholdt på et konstant nivå i den kontinuerlige tilførselssystem ved å sikre at den gjennomsnittlige medium fjerningsraten var lik matehastigheten. Systemet anvendt for disse studiene som faktisk ble fjernet medium ved en høyere strømningshastighet enn matehastigheten fordi fjerning rørseksjon anvendes rør med større diameter for pumpedelen. Til tross for raskere removal hastighet, kulturen volum ble opprettholdt ved å justere nivået av utløpsrøret inne i reaktoren til det ønskede kultur volumnivå. Kontinuerlig tilsetning av frisk medium til SSB resulterte i en liten økning i middels nivå i reaktoren, og når mediet nådde nivået av OT, ble mediet fjernet fra reaktoren ved en raskere hastighet. Mediet ble fjernet gjennom det porøse glass OT, forlater cellen kulene i kulturmediet inntil nivået falt under bunnen av OT. Dette systemet unngås kompleksiteten ved hjelp av tynn strøm og volum sensorer for å styre pumpehastigheter, og er den standard for bruk sammen med mange SSB basert kultur apparatur 47,48. OT er designet for å sikre at kulene ikke ble fjernet fra kulturen gjennom fjerning krets, og porestørrelsen og tetthet i den frittet glassrøret var store nok (40% og 40 - 60 um henholdsvis) for å sikre at den lineære strømningshastighet var mindre enn sedimenteringshastigheten av kulene ossed for disse kulturstudier. Den lineære strømnings ble beregnet som beskrevet i detalj tre. Den gjennomsnittlige lineære hastighet medium gjennom porene i OT ble beregnet til å være 0,17 cm / min, og dette var langt lavere enn det laveste observerte sfæroide settling hastighet. Den gjennomsnittlige bunnfellingshastigheten ble målt som beskrevet i metode 7, og var 2,53 ± 0,26 cm / min for sfæroidene som benyttes i disse studiene. Sfæroidene ble observert til å øke i størrelse som kulturen skrider frem, og disse større sfæroider avgjort raskere på grunn av deres høyere masse-drag-forhold, noe som reduserer videre muligheten for fjerning gjennom OT. Noen kuler ble fanget i de lavere porene på ytterkantene av OT, men dette var først og fremst på grunn av mekanisk kollisjon når utløpsrøret fall i den omrørte medium. Dette hindret ikke riktig funksjon av OT, og ikke bidra til en målbar tap av kuler i kulturene som ble testet. OT for disse studiene ble rengjort etter hver undersøkelse, (med DI vann flush), og skiftes ut etter bruk for to kulturstudier for å unngå risiko for nedsatt funksjon. OT kan bli erstattet etter hvert studium hvis kuler er observert å tette porene i løpet av en bestemt studie (dette ble ikke observert i fremlagt arbeid). På grunn av den sykliske fjerning av mediet ved hjelp av denne metoden, mediet kulturvolum svingt med så mye som 6%. Svingningene var forårsaket av overflatespenningen for det medium som tillot OT for å fjerne litt mer medium etter at det gjennomsnittlige medium nivået falt under bunnen av OT.

    Eliminere Nutrient Svingninger Forbedret cellevekst i SSB kulturer

    Kontinuerlig å erstatte mediet i SSB kulturer ved å bruke systemet beskrevet ovenfor økte kultur utbytter i løpet av 21-dagers kulturperiode i forhold til de vanlige SSB kulturer. Tilførselshastigheten ble holdt konstant gjennom hele dyrkningsperioden ved en hastighet som erstattet hele kulturen volumeg hver tredje dag for å være sammenlignbare med batch-matet SSB kulturer. Eliminere nærings svingninger resulterte i en økning i celleutbytte (figur 3) til tross for den høye glukosekonsentrasjonen 3. Sfæroid størrelse ble også målt ved slutten av dyrkningsperioden ved å 2D mikroskopisk vurdering (standard lysmikroskopi beskrevet i litteraturen 3), og sfæroidene i CF-SSB-kulturer var signifikant større (P <0,02, student-t-test), som i statiske eller standard SSB kulturer som rapportert i litteraturen tre. Disse observasjonene støtter celle-count data tyder på en høyere vekst i CF-SSB kulturer mens levedyktighet ble opprettholdt på samme høye nivå (96,23 ± 0,85%), uavhengig av kultur tilstand. Den kontinuerlig matet SSB (CF-SSB) kultursystem eliminert nærings svingninger i sfæroide kulturer, og forbedret cellevekstrater, men blodsukkeret holdt seg super-fysiologiske som kan ha hindret ytterligere imp rovement i celle ekspansjon (figur 2). For ytterligere å forbedre den CF-SSB kultursystem, ble en algoritme som brukes til å justere matehastigheten i løpet av dyrkningsperioden med det mål å forbedre kontroll av glukosenivået i SSB kulturer.

    Beregning av Justert mating

    Flere faktorer kan vurderes for beregning av matehastigheten for å opprettholde konsekvente blodsukkeret. De spesifikke faktorer av interesse kan endres for en gitt studie og for en spesiell cellelinje. For formålet med denne demonstrasjonen vi betraktet veksthastighet og glukoseforbruk bestemt fra tidligere kulturer, samt de faktiske glukosenivåer på tidspunktet for justering av tre. Mating justeringer kan gjøres når som helst intervall i tid. For denne demonstrasjon ble prøver oppsamlet, og tilførselshastigheten ble regulert etter tre dager på grunnlag av de etterfølgende beregninger er beskrevet som følger.

    t "> Beregning av forventet vekstrate

    Ligning 1 spår cellevekst i løpet av en viss periode av kultur, med den forutsagte celletall (N 2) som representerer den forventede totale antall celler i kultur eller annen gang i fremtiden. Denne metoden benytter en lineær veksthastighet tilnærmelse hvor den aktuelle celletall (N 1) tilsettes til den estimerte vekst av cellene i sfæroide kulturer (R g) multiplisert med dyrkningsperioden (t 2 t 1).

    ligning 1 (1)

    Beregnet Baseline matehastighet

    Grunnlinjen matehastighet (R F) ble beregnet ved bruk av ligning 2 ved å estimere glukose forbrukt i kulturen i løpet av dyrkningsperioden (teller) og dele det på glukosekonsentrasjonen i fødemediet (C F (R1) med et veid gjennomsnitt av N 1 og N2 fra ligning 1. Denne forbruk sats ble deretter delt på glukosekonsentrasjon (C F) i næringsmedium til å beregne den gjennomsnittlige medium matehastigheten som trengs for å erstatte glukosen som forbrukes under samme dyrkningsperioden.

    ligning 2 (2)

    Justere mating med Observerte blodsukkeret

    Ytterligere justeringer ble gjort til grunnlinjen mating for å imøtekomme de målte glukosenivåer (C 1) på valgt tidspunkt ved hjelp av ligning 3. Det glukose justert matehastighet (GAFR) kan brukes til å opprettholde nivået når uventede endringer i vekst eller død forekommer i kulturen. dette equatio n innlemmet en styre konstant (X), og en verdi på 0,5 ble anvendt for disse data 3. C 1 representerer glukosekonsentrasjonen målt i kulturmediet på prøven dag, og C-D representerer den målmedium glukosekonsentrasjon. Den endelige verdi justerer den forutsagte matingen fra den andre beregningen.

    ligning 3 (3)

    Figur 1
    Figur 1: Kontinuerlig Feeding System Diagram med Avløp Tube. (A) Diagram av den viste system. (B) frittet glassfilter plassert på utløpsrøret for å tillate mediet å bli fjernet fra kulturen, uten tap av celler. Figur gjengitt med tillatelse. 3

    /files/ftp_upload/52224/52224fig2.jpg "/>
    Figur 2:. Glukose Målinger for SSB, CF-SSB, og justert CF-SSB kulturer (A) Medium glukose målinger fra p-TC6 sfæroide kulturer som bruker statiske, SSB, og CF-SSB kultur metoder og fôring med standard høy glukose medium. Den kontinuerlige mating er i stand til å eliminere de glukosenivåer, men de gjennomsnittlige glukosenivåene i mediet endringen dramatisk i løpet av dyrkningsperioden, og langt over det fysiologiske området (angitt med grå bar). Den justerte foring er i stand til å eliminere de svingninger samt opprettholde glukosekonsentrasjonen i nærheten av fysiologiske nivåer for varigheten av dyrkningsperioden. Feilfelt for glukose målinger er for små til å være synlig på skalaen som vises (Standard Error ≤ 4% for alle målinger). Dataene fra tallene er presentert i forrige publisering med tillatelse. 3


    Figur 3: celletall fra SSB, CF-SSB, og justert CF-SSB kulturer med Vekst Justert Strøm priser Cell vekst rapportert ganger endring i celle nummer i løpet av 21-dagers kulturperiode sammenligne SSB med jevne mellom endringer mot konstant matehastigheten. SSB kulturer og justert innmat rente SSB kulturer. Feilstolper rapporterer standard feil av gjennomsnittet, og p-verdier som er rapportert er for en un-sammenkoblet to-halet Student-t-test statistisk. Gjengitt med tillatelse. 3

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Discussion

    Generering av pattedyrcelleprodukter for fremstilling av biologiske midler, og for celleterapi krever kulturen og overvåking av pattedyrceller i stor skala 55-58. Videre disse programmene krever definerte og godkjente dyrkningsforhold. Bare å øke volumet av celler ved hjelp av forsknings teknologier vil ikke oppfylle alle disse kravene. Manuelle mellom endringer forårsaker svingninger i næringsstoffer og opphoping av avfallsstoffer redusere celle kvalitet, levedyktighet og yield. Bruken av bioreaktorer er godt etablert for den kommersielle kulturen av mikroorganismer for bio-farmasøytiske applikasjoner, og lignende strategier har blitt brukt til pattedyrcellekulturer. Et komplekst samspill av pattedyrceller med sitt miljø nødvendiggjør spesifikke modifikasjoner for å regulere nivåer av næringsstoffer for å optimalisere celleekspansjonsmuligheter.

    For å løse disse problemene, har vi utviklet en straightforward metode for å opprettholde glukosenivåer i et bestemt ønsket område, tilnærmet fysiologiske nivåer i en omrørt suspensjon bioreaktor med en justerbar hastighet perfusjon matemekanisme. For å oppnå dette, ble sfæroider av en beta-cellelinje som genereres i en omrørt suspensjon bioreaktor. Et perfusjon matesystem ble anvendt for å tilveiebringe en kontinuerlig matemekanisme for å erstatte standard satstilførselsprosedyrer. Cell vekstrater ble observert, og brukes til å forutsi omtrent glukose bruk priser. Faktiske glukosenivåer ble også målt over tid i kultur til å justere matehastigheter som reaksjon på selve næringsstoffer forbrukes og metabolske produkter deponert i mediet av cellene. Denne metoden hindret svingninger i blodsukkeret sett med andre statiske og SSB systemer 3 hvor blodsukkeret svingt dramatisk med mellom endringer hver 3. dag. Ved hjelp av batch-mate strategier, glukosekonsentrasjonen falt så mye som 275 mg / dl i løpet av tre dager, ved sent stadiums i den 21-dagers vekst. Disse svingningene i blodsukkeret begrenset celle yield.

    Beregning av mediet erstatningshastigheten for demonstrasjon av den justerte matesystem innarbeidet en etablert vekst og glukoseforbrukshastigheten for cellelinje, så vel som de observerte (målt) kultur tettheter og glukosenivåer ved hver foring tids punkt. For ulike celletyper, eller for mer komplekse vevkultursystemer, kan disse forutsetningene ikke er sanne. For å sikre mer nøyaktig glukosekontroll, algoritmen også inkludert et feedback-kontroll system for å ta hensyn til variasjonen av individuelle kulturer. Begrensninger av en perfusjon metode basert på veksthastigheten alene, herunder virkningen av heterogeniteten i glukoseforbruk for celler i hele sfæroidene og endringer i glukoseforbruk basert på parametere som differensierende stamceller, kan reduseres ved en tilbakekoplingsstyresystemet. Avhengig av programmet, celler som viser exponential vekstrater eller mer komplekse vekst profiler kan bli iverksatt for å forbedre algoritmen ytelse. Forutsetningene og verdier som brukes for matehastigheten beregningene kan endres til å følge selve dyrkningsforhold.

    De presenterte fremgangsmåter er beregnet på å fremstille celler for en terapeutisk anvendelse hvor ekspansjonen og kulturen av sfæroider ville være for en endelig varighet, og cellene selv er produktet .. Det kan være ønskelig at en del forskere er å kontinuerlig utvide eller dyrke celler ved hjelp en lignende metode, men dette ville presentere andre utfordringer ikke oppstått for disse studiene. Hvis dyrket i lengre perioder, vil sfæroidene fortsette å vokse i størrelse, og levedyktigheten til noen celler i kjernen av den sfæroide kan lide på grunn av økende næringsstoffer og oksygen diffusjon begrensninger. Disse kulturene kan kreve ytterligere manipulasjoner å distansere store kuler for å unngå denne begrensningen når langsiktige kulturer er ønskelig.Ingen reduksjon i levedyktighet ble observert for sfæroidene generert med denne protokoll, hvilket antyder at denne grensen ikke ble nådd i løpet av 21-dagers kulturperiode for denne studien.

    For cellulære terapier, kan disse teknikkene anvendes i kombinasjon med andre reguleringssystemer for å forbedre celle-utbytte, funksjon og levedyktighet. For eksempel kan SSB metoden kombineres med tilrettelegging teknologier inkludert mikro-bærer overflatekulturer for adherente celler for å forbedre cellevekstrater, eller innkapsling av celler eller kuler. Videre kan mer kompliserte justeringsalgoritmer bli implementert for å gi tettere kultur kontroll. Mate justering kan være kombinert med kontroll av flere andre parametre, slik som pH, konsentrasjon av oppløst oksygen, temperatur, og injeksjon av reagenser for å gjøre ytterligere forbedringer 59,60. For å bedre resultatene i andre programmer, kan denne metoden være automatisert 15,24, og matehastigheter kan beregnes mmalm eller sjeldnere, videreforedling dyrkningsforhold.

    Produksjonsprosesser 61-63 må defineres og kontrolleres nøye for å lage reproduserbare biologiske produkter. Bruken av kontinuerlige medium erstatning kan brukes til å dempe svingningene i kritiske næringsstoffer som observeres i stor skala celle produksjon, og som omfatter en justerbar tilførselssystem kan gjennomføre ytterligere kontroll på cellemiljøet, for å opprettholde de ønskede nivåer av næringsstoffer. Den beskrevne metoden kan brukes sammen med andre pattedyrceller for både mobil og farmasøytiske produkter.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    β TC-6 Cells ATCC, Manassas, VA CRL-11506 Mouse Insulinoma cell line (adherent cell type)
    DPBS No Ca, No Mg Invitrogen, Carlsbad, CA 14190-144 https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/14190144?ICID=search-14190144
    Dulbecco's Modified Eagles Medium Invitrogen, Carlsbad, CA See below for product numbers 
    DMEM High Glucose (500 mM) Invitrogen, Carlsbad, CA 11965-092 http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/11965092
    DMEM Low Glucose (100 mM) Invitrogen, Carlsbad, CA 11885-084 http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/11885084 (note that this medium already contains pyruvate)
    L-glutamine Invitrogen, Carlsbad, CA 25030081 http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/25030081?ICID=search-product
    Sodium Pyruvate Invitrogen, Carlsbad, CA 11360070 https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/11360070?ICID=search-product
    Heat Inactivated Porcine Serum Gibco - Life Technologies 10082147 http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/10082147
    Trypsin-EDTA Invitrogen, Carlsbad, CA 25200056 https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/25200056?ICID=search-product
    T-150 Tissue Culture Treated Flasks Corning, Corning, NY 430825 http://catalog2.corning.com/LifeSciences/en-US/Shopping/ProductDetails.aspx?productid=430825(Lifesciences)
    &categoryname=
    NuAire Cell culture incubator Princeton, MN US Autoflow. Any water-jacketed CO2 regulating cell culture incubator could be used.
    Centrifuge Sorvall RT 7 (Any similar benchtop centrifuge may be used)
    Refrigerator Any laboratory refrigerator could be used (a small table-top version was used for these studies)
    1 L Glass Bottle Corning, Corning, NY 1395-1L Any vendor could be used. http://catalog2.corning.com/LifeSciences/en-US/Shopping/ProductDetails.aspx?productid=1395-1L(Lifesciences)
    &categoryname=
    2 L Glass Bottle Corning, Corning, NY 1395-2L Any vendor could be used
    250 ml stirred bioreactors  Corning, Corning, NY 4500-250 http://catalog2.corning.com/LifeSciences/en-US/Shopping/ProductDetails.aspx?productid=4500-250(Lifesciences)
    &categoryname=
    Stir Plate Fisher Scientific 11-496-104A Any incubator safe stir-plate can be used, any vendor
    Tissue Culture Dishes 100 mm Diameter Nunc, Rochester, NY (Fisher Scientific) 1256598  Any vendor could be used (ordered through Fisher Sci)
    FALCON 50 ml Conical Tubes Falcon, San Jose, CA 1256598 Any vendor could be used
    Delran Plastic Used for Custom Parts McMaster Carr Various Any material of choice could be used, but Deran is chosen because it is autoclave safe, non-reactive, and easy to machine. http://www.mcmaster.com/#acetal-homopolymer-sheets/=rjrcac
    Stainless Steel Pipe for custom lids McMaster Carr Various Any vendor could be used. http://www.mcmaster.com/#standard-stainless-steel-tubing/=rjrd91
    Custom Modified Delran Bioreactor Lids for Continuous Feeding Custom made Not aware of any vendors producing a similar product
    Custom Modified Glass Bottle Lids for Continuous feeding Custom made Some vendors (e.g., Fischer Sci, Corning) make similar products in the links below.
    Masterflex Digital Peristaltic Pump Cole Parmer, Vernon Hills, IL EW-77919-25 Any precision peristaltic pump could be used. http://www.coleparmer.com/Product/L_S_Eight_Channel_Four_Roller_
    Cartridge_Pump_System_115_230
    _VAC/EW-77919-25
    PVDF Tubing Connectors (various) Cole Parmer, Vernon Hills, IL see link Any vendor could be used. http://www.coleparmer.com/Category/Cole_Parmer_PVDF_Premium
    _Luer_Fittings/55889
    Pharmed BPT Tubing L/S 16 Cole Parmer, Vernon Hills, IL WU-06508-16 Any vendor could be used. http://www.coleparmer.com/Product/Masterflex_PharMed_BPT_Tubing
    _L_S_13_25/WU-06508-16
    Pharmed BPT Tubing L/S 14 Cole Parmer, Vernon Hills, IL WU-06508-14 Any vendor could be used. http://www.coleparmer.com/Product/Masterflex_PharMed_BPT_Tubing
    _L_S_13_25/WU-06508-14
    Pharmed BPT Tubing L/S 13 Cole Parmer, Vernon Hills, IL WU-06508-13 Any vendor could be used. http://www.coleparmer.com/Product/Masterflex_PharMed_BPT_Tubing
    _L_S_13_25/WU-06508-13
    Millipore Millex GP PES membrane 0.22 µl sterile syringe filter (used for venting, and medium filtration) Fisher Scientific SLGP033RS Any vendor could be used
    25 ml Graduated Pipette Fisher Scientific 13-678-11 Any vendor could be used, and various sizes may be used
    Pipetter Fisher Scientific 13-681-15E Any vendor, or similar product could be used
    Hemocytometer Fisher Scientific 02-671-6 Any vendor, or similar product could be used
    Trypan Blue Gibco - Life Technologies 15250-061 Any vendor, or similar product could be used. https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/15250061
    Inverted Light Microscope Leica Any vendor, or similar product could be used
    One Touch Ultra Blood Glucose Meter Fisher Scientific 22-029-293 Any vendor, or similar product could be used (e.g., Bayer)
    One Touch Ultra-Strips Fisher Scientific 22-029-292  Any vendor, or similar product could be used (e.g., Bayer)

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Reuveny, S., Velez, D., Macmillan, J. D., Miller, L. Factors affecting cell growth and monoclonal antibody production in stirred reactors. J. Immunol. Methods. 86 (1), 53-59 (1986).
    2. Tarleton, R. L., Beyer, A. M. Medium-scale production and purification of monoclonal antibodies in protein-free medium. Biotechniques. 11 (5), 590-593 (1991).
    3. Weegman, B. P., et al. Nutrient regulation by continuous feeding removes limitations on cell yield in the large-scale expansion of Mammalian cell spheroids. PLoS One. 8 (10), e76611 (2013).
    4. Klueh, U., et al. Continuous glucose monitoring in normal mice and mice with prediabetes and diabetes. Diabetes Technol. Ther. 8 (3), 402-412 (2006).
    5. Hay, R. J. Operator-induced contamination in cell culture systems. Dev. Biol. Stand. 75, 193-204 (1991).
    6. Dazey, B., Duchez, P., Letellier, C., Vezon, G., Ivanovic, Z. Cord blood processing by using a standard manual technique and automated closed system "Sepax" (Kit CS-530). Stem Cells Dev. 14 (1), 6-10 (2005).
    7. Gastens, M. H., et al. Good manufacturing practice-compliant expansion of marrow-derived stem and progenitor cells for cell therapy. Cell Transplant. 16 (7), 685-696 (2007).
    8. Naing, M. W., Williams, D. J. Three-dimensional culture and bioreactors for cellular therapies. Cytotherapy. 13 (4), 391-399 (2011).
    9. Stacey, G. N. Cell culture contamination. Cancer Cell Culture. , Methods Mol Biol; 731. Humana Press. Totowa, NJ. 79-91 (2011).
    10. Zur Nieden, I. N., Cormier, J. T., Rancourt, D. E., Kallos, M. S. Embryonic stem cells remain highly pluripotent following long term expansion as aggregates in suspension bioreactors. J. Biotechnol. 129 (3), 421-432 (2007).
    11. Kehoe, D. E., Jing, D., Lock, L. T., Tzanakakis, E. S. Scalable stirred-suspension bioreactor culture of human pluripotent stem cells. Tissue Eng. Part A. 16 (2), 405-421 (2010).
    12. Krawetz, R., et al. Large-scale expansion of pluripotent human embryonic stem cells in stirred-suspension bioreactors. Tissue Eng. Part C. Methods. 16 (4), 573-582 (2010).
    13. Shafa, M., et al. Expansion and long-term maintenance of induced pluripotent stem cells in stirred suspension bioreactors. J. Tissue Eng. Regen. Med. 6 (6), 462-472 (2012).
    14. Oh, S. K. W., et al. Long-term microcarrier suspension cultures of human embryonic stem cells. Stem Cell Res. 2 (3), 219-230 (2009).
    15. Olmer, R., et al. Suspension culture of human pluripotent stem cells in controlled, stirred bioreactors. Tissue Eng. Part C. Methods. 18 (10), 772-784 (2012).
    16. Baptista, R. P., Da Fluri,, Zandstra, P. W. High density continuous production of murine pluripotent cells in an acoustic perfused bioreactor at different oxygen concentrations. Biotechnol. Bioeng. 110 (2), 648-655 (2013).
    17. Papas, K. K. Characterization of the metabolic and secretory behavior of suspended free and entrapped ART-20 spheroids in fed-batch and perfusion cultures [dissertation]. , Georgia Institute of Technology. Atlanta, GA. (1992).
    18. Papas, K. K., Constantinidis, I., Sambanis, A. Cultivation of recombinant, insulin-secreting AtT-20 cells as free and entrapped spheroids. Cytotechnology. 13 (1), 1-12 (1993).
    19. Sambanis, A., Papas, K. K., Flanders, P. C., Long, R. C., Kang, H., Constantinidis, I. Towards the development of a bioartificial pancreas: immunoisolation and NMR monitoring of mouse insulinomas. Cytotechnology. 15 (1-3), 351-363 (1994).
    20. Sharma, S., Raju, R., Sui, S., Hu, W. -S. Stem cell culture engineering - process scale up and beyond. Biotechnol. J. 6 (11), 1317-1329 (2011).
    21. Papas, K. K., Long, R. C., Constantinidis, I., Sambanis, A. Role of ATP and Pi in the mechanism of insulin secretion in the mouse insulinoma betaTC3 cell line. Biochem. J. 326 (Pt 3), 807-814 (1997).
    22. Papas, K. K., Long, R. C., Sambanis, A., Constantinidis, I. Development of a bioartificial pancreas: I. long-term propagation and basal and induced secretion from entrapped betaTC3 cell cultures. Biotechnol. Bioeng. 66 (4), 219-230 (1999).
    23. Papas, K. K., Long, R. C., Sambanis, A., Constantinidis, I. Development of a bioartificial pancreas: II. Effects of oxygen on long-term entrapped betaTC3 cell cultures. Biotechnol. Bioeng. 66 (4), 231-237 (1999).
    24. Hu, W. S. Cell culture process monitoring and control-a key to process optimization. Cytotechnology. 14 (3), 155-156 (1994).
    25. Alfred, R., et al. Efficient suspension bioreactor expansion of murine embryonic stem cells on microcarriers in serum-free medium. Biotechnol. Prog. 27 (3), 811-823 (2011).
    26. Cormier, J. T., zur Nieden, N. I., Rancourt, D. E., Kallos, M. S. Expansion of undifferentiated murine embryonic stem cells as aggregates in suspension culture bioreactors. Tissue Eng. 12 (11), 3233-3245 (2006).
    27. Dang, S. M., Zandstra, P. W. Scalable production of embryonic stem cell-derived cells. Methods Mol. Biol. 290 (1), 353-364 (2005).
    28. Elseberg, C. L., et al. Microcarrier-based expansion process for hMSCs with high vitality and undifferentiated characteristics. Int. J. Artif. Organs. 35 (2), 93-107 (2012).
    29. Kallos, M. S., Behie, L. A. Inoculation and growth conditions for high-cell-density expansion of mammalian neural stem cells in suspension bioreactors. Biotechnol. Bioeng. 63 (4), 473-483 (1999).
    30. Kehoe, D. E., Lock, L. T., Parikh, A., Tzanakakis, E. S. Propagation of embryonic stem cells in stirred suspension without serum. Biotechnol. Prog. 24 (6), 1342-1352 (2008).
    31. Kirouac, D. C., Zandstra, P. W. The systematic production of cells for cell therapies. Cell Stem Cell. 3 (4), 369-381 (2008).
    32. Serra, M., et al. Stirred bioreactors for the expansion of adult pancreatic stem cells. Ann. Anat. 191 (1), 104-115 (2009).
    33. Chawla, M., Bodnar, C. A., Sen, A., Kallos, M. S., Behie, L. A. Production of islet-like structures from neonatal porcine pancreatic tissue in suspension bioreactors. Biotechnol. Prog. 22 (2), 561-567 (2006).
    34. Weegman, B. P., et al. Temperature profiles of different cooling methods in porcine pancreas procurement. Xenotransplantation. , (2014).
    35. Cruz, H. J., Moreira, J. L., Carrondo, M. J. Metabolic shifts by nutrient manipulation in continuous cultures of BHK cells. Biotechnol. Bioeng. 66 (2), 104-113 (1999).
    36. Dowd, J. E., Jubb, A., Kwok, K. E., Piret, J. M. Optimization and control of perfusion cultures using a viable cell probe and cell specific perfusion rates. Cytotechnology. 42 (1), 35-45 (2003).
    37. Goudar, C., Biener, R., Zhang, C., Michaels, J., Piret, J., Konstantinov, K. Towards industrial application of quasi real-time metabolic flux analysis for mammalian cell culture. Cell Culture Engineering. 101, Adv. Biochem. Eng. Biotechnol; 101. Springer Berlin Heidelberg. Berlin, Heidelberg. 99-118 (2006).
    38. Hu, W. S., Piret, J. M. Mammalian cell culture processes. Curr. Opin. Biotechnol. 3 (2), 110-114 (1992).
    39. Knaack, D., et al. Clonal insulinoma cell line that stably maintains correct glucose responsiveness. Diabetes. 43 (12), 1413-1417 (1994).
    40. Poitout, V., Stout, L. E., Armstrong, M. B., Walseth, T. F., Sorenson, R. L., Robertson, R. P. Morphological and functional characterization of beta TC-6 cells--an insulin-secreting cell line derived from transgenic mice. Diabetes. 44 (3), 306-313 (1995).
    41. Poitout, V., Olson, L. K., Robertson, R. P. Insulin-secreting cell lines: classification, characteristics and potential applications. Diabetes Metab. 22 (1), 7-14 (1996).
    42. Suzuki, R., et al. Cyotomedical therapy for insulinopenic diabetes using microencapsulated pancreatic beta cell lines. Life Sci. 71 (15), 1717-1729 (2002).
    43. Skelin, M., Rupnik, M., Cencic, A. Pancreatic beta cell lines and their applications in diabetes mellitus research. ALTEX. 27 (2), 105-113 (2010).
    44. Masters, J. R., Stacey, G. N. Changing medium and passaging cell lines. Nat. Protoc. 2 (9), 2276-2284 (2007).
    45. Murdoch, T. B., McGhee-Wilson, D., Shapiro, A. M. J., Lakey, J. R. T. Methods of human islet culture for transplantation. Cell Transplant. 13 (6), 605-617 (2004).
    46. Woodside, S. M., Bowen, B. D., Piret, J. M. Mammalian cell retention devices for stirred perfusion bioreactors. Cytotechnology. 28 (1-3), 163-175 (1998).
    47. Serra, M., et al. Improving expansion of pluripotent human embryonic stem cells in perfused bioreactors through oxygen control. J. Biotechnol. 148 (4), 208-215 (2010).
    48. Gálvez, J., Lecina, M., Solà, C., Cairó, J., Gòdia, F. Optimization of HEK-293S cell cultures for the production of adenoviral vectors in bioreactors using on-line OUR measurements. J. Biotechnol. 157 (1), 214-222 (2012).
    49. Trabelsi, K., Majoul, S., Rourou, S., Kallel, H. Development of a measles vaccine production process in MRC-5 cells grown on Cytodex1 microcarriers and in a stirred bioreactor. Appl. Microbiol. Biotechnol. 93 (3), 1031-1040 (2012).
    50. Liu, H., et al. A high-yield and scaleable adenovirus vector production process based on high density perfusion culture of HEK 293 cells as suspended aggregates. J. Biosci. Bioeng. 107 (5), 524-529 (2009).
    51. Zhi, Z., Liu, B., Jones, P. M., Pickup, J. C. Polysaccharide multilayer nanoencapsulation of insulin-producing beta-cells grown as pseudoislets for potential cellular delivery of insulin. Biomacromolecules. 11 (3), 610-616 (2010).
    52. Lock, L. T., Laychock, S. G., Tzanakakis, E. S. Pseudoislets in stirred-suspension culture exhibit enhanced cell survival, propagation and insulin secretion. J. Biotechnol. 151 (3), 278-286 (2011).
    53. Marchenko, S., Flanagan, L. Counting human neural stem cells. J. Vis. Exp. (7), e262 (2007).
    54. Campos, C. Chronic hyperglycemia and glucose toxicity: pathology and clinical sequelae. Postgrad. Med. 124 (6), 90-97 (2012).
    55. Eve, D. J., Fillmore, R., Borlongan, C. V., Sanberg, P. R. Stem cells have the potential to rejuvenate regenerative medicine research. Med. Sci. Monit. 16 (10), RA197-RA217 (2010).
    56. Hsiao, L. -C., Carr, C., Chang, K. -C., Lin, S. -Z., Clarke, K. Review Article: Stem Cell-based Therapy for Ischemic Heart Disease. Cell Transplant. , (2012).
    57. Oldershaw, R. A. Cell sources for the regeneration of articular cartilage: the past, the horizon and the future. Int. J. Exp. Pathol. 93 (6), 389-400 (2012).
    58. De Coppi, P. Regenerative medicine for congenital malformations. J. Pediatr. Surg. 48 (2), 273-280 (2013).
    59. Tziampazis, E., Sambanis, A. Modeling of cell culture processes. Cytotechnology. 14 (3), 191-204 (1994).
    60. Sidoli, F. R., Mantalaris, A., Asprey, S. P. Modelling of Mammalian cells and cell culture processes. Cytotechnology. 44 (1-2), 27-46 (2004).
    61. Yim, R. Administrative and research policies required to bring cellular therapies from the research laboratory to the patient’s bedside. Transfusion. 45, Suppl 4. 144S-158S (2005).
    62. Fink, D. W. FDA regulation of stem cell-based products. Science. 324 (5935), 1662-1663 (2009).
    63. Moos, M. Stem-cell-derived products: an FDA update. Trends Pharmacol. Sci. 29 (12), 591-593 (2008).

    Tags

    Bioteknologi glukose næringsregulering kontinuerlig fôring rørt suspensjon bioreaktor utvidelse spheroid kultur bioreaktor
    Nutrient Regulering av Kontinuerlig Fôring for storstilt utvidelse av pattedyrceller i Spheroids
    Play Video
    PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

    Cite this Article

    Weegman, B. P., Essawy, A., Nash,… More

    Weegman, B. P., Essawy, A., Nash, P., Carlson, A. L., Voltzke, K. J., Geng, Z., Jahani, M., Becker, B. B., Papas, K. K., Firpo, M. T. Nutrient Regulation by Continuous Feeding for Large-scale Expansion of Mammalian Cells in Spheroids. J. Vis. Exp. (115), e52224, doi:10.3791/52224 (2016).

    Less
    Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
    View Video

    Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

    Waiting X
    Simple Hit Counter