Nutrient regulation using continuous growth adjusted feeding improves growth rates of mammalian cell spheroids compared to intermittent batch feeding for cultures in stirred suspension bioreactors. This study demonstrates the methods required for establishing simple adjusted rate fed cultures.
In this demonstration, spheroids formed from the β-TC6 insulinoma cell line were cultured as a model of manufacturing a mammalian islet cell product to demonstrate how regulating nutrient levels can improve cell yields. In previous studies, bioreactors facilitated increased culture volumes over static cultures, but no increase in cell yields were observed. Limitations in key nutrients such as glucose, which were consumed between batch feedings, can lead to limitations in cell expansion. Large fluctuations in glucose levels were observed, despite the increase in glucose concentrations in the media. The use of continuous feeding systems eliminated fluctuations in glucose levels, and improved cell growth rates when compared with batch fed static and SSB culture methods. Additional increases in growth rates were observed by adjusting the feed rate based on calculated nutrient consumption, which allowed the maintenance of physiological glucose over three weeks in culture. This method can also be adapted for other cell types.
Om grote aantallen levensvatbare en functionele humane cellen voor transplantatie genereren regeling van de kweekomstandigheden is noodzakelijk. Uitputting van voedingsstoffen, samen met de opbouw van metabole afval zijn belangrijke bijdrage aan de veroudering en metabole veranderingen die de kwaliteit van de cel product 1 te verminderen – 3. Deze procedure wordt een methode om niercellenkweek zoogdieren in sferoïden met een geroerde bioreactor gecombineerd met een aangepaste snelheid perfusie toevoersysteem om glucose in een fysiologisch bereik 4 regelt de duur van de kweek. Ten behoeve van deze onderzoeken, werd het fysiologische bereik gedefinieerd tussen 100 en 200 mg / dl. Dezelfde werkwijzen kunnen worden gebruikt om andere voedingsstoffen en metabole afvalstoffen zoals lactaat reguleren.
Statische kweken in kleine hoeveelheden (1-30 ml) worden gewoonlijk gebruikt in de laboratorium omgeving te onderhouden en te differentiëren cellijnen experimental doeleinden. Cel passage wordt uitgevoerd met volledig medium gewenste wijzigingen regelmatig. Meest "klassieke" kweekmedium heeft een hoge glucoseconcentratie (450 mg / dl voor DMEM die in deze studies) om minder frequent mediumveranderingen zonder het risico van nutriënten beperkingen. Echter, deze batch-feeding werkwijze vereist nog steeds frequent manipulatie introduceert variabiliteit in de celomgeving, en verhoogt het risico van besmetting 5-9. Geroerde suspensie bioreactoren (SSB) zorgen voor een betere menging en verminderde de behandeling van 3,10 – 20, maar net als statische culturen, vereisen handmatige medium veranderingen die bijdragen aan potentieel schadelijke schommelingen in de voedings- en afvalproduct niveaus. Perfusie voederen van SSB culturen vermindert deze problemen door continue infusie en verwijdering van medium, maar grote veranderingen in nutriënten als gevolg van de celgroei een probleem blijven. Het gebruik van een aangepaste voeding rate uit berekeningen van nutriënten gebruik op basis van geschatte cel eisen kan de stabiele cel milieu nodig is om levensvatbaarheid van de cellen te optimaliseren te bieden en te functioneren 21-24.
Er is een grote hoeveelheid literatuur beschrijft werkwijzen voor schaalbare SSB kweken van zoogdiercellen specifiek voor kweek en groei van pluripotente cellen 25 – 32, met andere gericht op islet (beta) cellen 17,33,34 of productie van biologische producten 24, 35-38. Veel van deze onderzochte celtypen kunnen worden gekweekt in bolvormige culturen en specifieke procedures voor het celtype wordt gebruikt, moet voorafgaand aan de uitvoering van een continue toevoer systeem worden geoptimaliseerd. In deze demonstratie, werd een perfusie voederen methode die wordt gebruikt om een beta cellijn gegroeid als bolletjes in een geroerde bioreactor 39 uit te breiden – 43. De werkwijze hierin beschreven is, eeneenvoudige uitvoering van het voeden van tariefaanpassingen gebaseerd op off-line glucose metingen om gerichte cultuur omstandigheden te bereiken. Aanpassen van de voeding met deze methode om handhaven van een fysiologische glucose-niveau wordt aangetoond dat het verhoogt cel opbrengsten. Zoogdiercellen afhankelijk van een belangrijke voedingsstof, glucose, energieproductie, zodat het gebruik van deze cellijn is een voorbeeld voor veel gekweekte zoogdiercellen 44. Bovendien is deze lijn een voorbeeld van de verdere complexiteit van beta-cellen, die gevoelig zijn voor chronische hoge glucose 45 zijn. Voor deze studie werden β-TC6 cellen mogen sferoïden in de cultuur te vormen om de gemiddelde grootte van de eilandjes van Langerhans in vivo benaderen. De perfusie bioreactorsysteem 17 – 19,21,46 met een voeding aangepast aan het verbruik glucose, resulteerde in het handhaven van fysiologische omstandigheden en hogere opbrengsten cel zonder veranderingen in de levensvatbaarheid.
Genereren van zoogdiercellen voor de productie van biologische agentia en celtherapie vereist cultuur en bewaking van zoogdiercellen in grote 55-58. Verder zijn deze toepassingen vereisen gedefinieerd en gevalideerd kweekomstandigheden. Gewoon verhoging van cellen met behulp onderzoekstechnologieën niet al deze eisen voldoen. Handmatige medium veranderingen veroorzaken schommelingen in voedingsstoffen en ophoping van afvalstoffen te verminderen cel kwaliteit, leefbaarheid en de opbrengs…
The authors have nothing to disclose.
The authors thank Michael Garwood and Sam Stein for their helpful comments, and Kristen M. Maynard for assistance with manuscript preparation.
Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number / Link | Comments/Description |
BTC-6 Cells | ATCC, Manassas, VA | CRL-11506 | Mouse Insulinoma cell line (adherent cell type) |
DPBS No CA, No Mg | Invitrogen, Carlsbad, CA | 14190-144 | https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/14190144?ICID=search-14190144 |
Dulbecco's Modified Eagles Medium | Invitrogen, Carlsbad, CA | See below for product numbers | |
DMEM High Glucose (500mM) | Invitrogen, Carlsbad, CA | 11965-092 | http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/11965092 |
DMEM Low Glucose (100mM) | Invitrogen, Carlsbad, CA | 11885-084 | http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/11885084 (note that this medium already contains pyruvate) |
L-gultamine | Invitrogen, Carlsbad, CA | 25030081 | http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/25030081?ICID=search-product |
Sodium Pyruvate | Invitrogen, Carlsbad, CA | 11360070 | https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/11360070?ICID=search-product |
Heat Inactivated Porcine Serum | Gibco – Life Technologies | 10082147 | http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/10082147 |
Trypsin-EDTA | Invitrogen, Carlsbad, CA | 25200056 | https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/25200056?ICID=search-product |
T-150 Tissue Culture Treated Flasks | Corning, Corning, NY | 430825 | http://catalog2.corning.com/LifeSciences/en-US/Shopping/ProductDetails.aspx?productid=430825(Lifesciences) &categoryname= |
NuAire Cell culture incubator | Princeton, MN | US Autoflow , Any water-jacketed CO2 regulating cell culture incubator could be used | |
Centrifuge | Sorvall RT 7 (Any similar benchtop centrifuge may be used) | ||
Refrigerator | Any laboratory refrigerator could be used (a small table-top version was used for these studies) | ||
1L Glass Bottle | Corning, Corning, NY | 1395-1L | Any vendor could be used http://catalog2.corning.com/LifeSciences/en-US/Shopping/ProductDetails.aspx?productid=1395-1L(Lifesciences) &categoryname= |
2L Glass Bottle | Corning, Corning, NY | 1395-2L | Any vendor could be used |
250 ml stirred bioreactors | Corning, Corning, NY | 4500-250 | http://catalog2.corning.com/LifeSciences/en-US/Shopping/ProductDetails.aspx?productid=4500-250(Lifesciences) &categoryname= |
Stir Plate | Fisher Scientific | 11-496-104A | Any incubator safe stir-plate can be used, any vendor |
Tissue Culture Dishes 100mm Diameter | Nunc, Rochester, NY (Fisher Scientific) | 1256598 | Any vendor could be used (ordered through Fisher Sci) |
FALCON 50 ml Conical Tubes | Falcon, San Jose, CA | 1256598 | Any vendor could be used |
Delran Plastic Used for Custom Parts | McMaster Carr | Various | Any material of choice could be used, but Deran is chosen because it is autoclave safe, non-reactive, and easy to machine, http://www.mcmaster.com/#acetal-homopolymer-sheets/=rjrcac |
Stainless Steel Pipe for custom lids | McMaster Carr | Various | Any vendor could be used, http://www.mcmaster.com/#standard-stainless-steel-tubing/=rjrd91 |
Custom Modified Delran Bioreactor Lids for Continuous Feeding | Custom made | Not aware of any vendors producing a similar product | |
Custom Modified Glass Bottle Lids for Continuous feeding | Custom made | Some vendors (eg. Fischer Sci, Corning) make similar products in the links below | |
Masterflex Digital Peristaltic Pump | Cole Parmer, Vernon Hills, IL | EW-77919-25 | Any precision peristaltic pump could be used, http://www.coleparmer.com/Product/L_S_Eight_Channel_Four_Roller_ Cartridge_Pump_System_115_230 _VAC/EW-77919-25 |
PVDF Tubing Connectors (various) | Cole Parmer, Vernon Hills, IL | see link | Any vendor could be used, http://www.coleparmer.com/Category/Cole_Parmer_PVDF_Premium _Luer_Fittings/55889 |
Pharmed BPT Tubing L/S 16 | Cole Parmer, Vernon Hills, IL | WU-06508-16 | Any vendor could be used, http://www.coleparmer.com/Product/Masterflex_PharMed_BPT_Tubing _L_S_13_25/WU-06508-16 |
Pharmed BPT Tubing L/S 14 | Cole Parmer, Vernon Hills, IL | WU-06508-14 | Any vendor could be used, http://www.coleparmer.com/Product/Masterflex_PharMed_BPT_Tubing _L_S_13_25/WU-06508-14 |
Pharmed BPT Tubing L/S 13 | Cole Parmer, Vernon Hills, IL | WU-06508-13 | Any vendor could be used, http://www.coleparmer.com/Product/Masterflex_PharMed_BPT_Tubing _L_S_13_25/WU-06508-13 |
Millipore Millex GP PES membrane 0.22ul sterile syringe filter (used for venting, and medium filtration) | Fisher Scientific | SLGP033RS | Any vendor could be used |
25ml Graduated Pipette | Fisher Scientific | 13-678-11 | Any vendor could be used, and various sizes may be used |
Pipetter | Fisher Scientific | 13-681-15E | Any vendor, or similar product could be used |
Hemocytometer | Fisher Scientific | 02-671-6 | Any vendor, or similar product could be used |
Trypan Blue | Gibco – Life Technologies | 15250-061 | Any vendor, or similar product could be used, https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/15250061 |
Inverted Light Microscope | Leica | Any vendor, or similar product could be used | |
One Touch Ultra Blood Glucose Meter | Fisher Scientific | 22-029-293 | Any vendor, or similar product could be used (eg. Bayer) |
One Touch Ultra-Strips | Fisher Scientific | 22-029-292 | Any vendor, or similar product could be used (eg. Bayer) |