Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Küresellerde Memeli Hücrelerinin Büyük ölçekli Genişleme için sürekli Beslenme ile Besin Yönetmeliği

Published: September 25, 2016 doi: 10.3791/52224
Automatic Translation
1, 2, 2, 2, 3, 2, 2, 2, 4, 2
1Radiology, University of Minnesota, 2Medicine, University of Minnesota, 3School of Public Health, University of Minnesota, 4Surgery, University of Arizona

Introduction

Transplantasyon için uygulanabilir ve fonksiyonel insan hücrelerinin çok sayıda oluşturmak için, kültür koşullarının düzenlenmesi zorunludur. 3 - metabolik atıkların birikimi ile birlikte besinlerin tükenmesi, hücre ürününün 1 kalitesini azaltır yaşlanması ve metabolik değişikliklere önemli sebeplerindendir. Bu prosedür kültürünün süresi boyunca fizyolojik aralığında 4 glikoz düzenleyen ayarlanmış oran perfüzyon besleme sistemi ile birlikte karıştırılan bir biyoreaktör kullanarak küresellerde kültür memeli hücrelerinin bir yöntemi gösterir. Bu çalışmaların amacı için, fizyolojik aralığı 100 ila 200 mg / dl olarak tanımlandı. Aynı yöntemleri diğer besin ve laktat gibi metabolik atıkları regüle etmek için kullanılabilir.

küçük hacimlerde statik kültürler (1-30 mi), genellikle experime hücre hatları korumak ve ayırt laboratuar ortamında kullanılanntal amaçlar. Hücre pasajı düzenli aralıklarla gerektiğinde komple ortam değişiklikleri ile gerçekleştirilir. En "klasik" kültür ortamı, besin sınırlamalar riski olmadan daha az sık ve orta değişiklikleri sağlamak için, yüksek glukoz konsantrasyonuna (bu çalışmalarda kullanılan DMEM 450 mg / dL) sahiptir. Ancak, bu toplu beslenme yöntemi hala, sık manipülasyon gerektiren hücre ortamında değişkenlik tanıtır ve kontaminasyon 5 riskini artırır - 9. Karıştırılan süspansiyon biyoreaktörler (SSB) daha iyi karışmasını sağlamak ve 3,10 işleme azalmış - 20, ama statik kültürler gibi, besin ve atık ürün düzeylerinde potansiyel zarar verici dalgalanmalar katkıda manuel orta değişiklikler gerektirir. SSB kültürlerin perfüzyon besleme sürekli infüzyon ve orta kaldırılması, fakat hücre büyümesi besin seviyelerindeki büyük değişikliklere göre bu sorunların bir sorun olmaya devam azaltır. düzeltilmiş besleme ra kullanımıTahmini hücre gereksinimlerine göre besin kullanım hesaplamalarından te hücre canlılığını optimize etmek için gerekli kararlı hücre ortamı sağlamak ve 21 işlev görebilir - 24.

25 özel pluripotent hücrelerin kültür ve genişleme için memeli hücrelerinin ölçeklenebilir SSB kültürler için yöntemleri tarif literatür büyük bir gövde var - diğerleri ile 32, adacık (beta) hücreleri 17,33,34 odaklanmış, ya da biyolojik ürünlerin 24 üretim, 35-38. Bu araştırılmıştır hücre tiplerinin bir çok sferoid kültürlerde yetiştirilebilir ve kullanılan hücre tipi için özel prosedürler sürekli bir besleme sisteminin uygulanması öncesinde optimize edilmelidir. 43 - Bu gösteri, bir perfüzyon besleme yöntemi bir karıştıran bioreaktör 39 sferoidler olarak yetiştirilen beta hücre hattı genişletmek için kullanıldı. Bu tarifnamede tarif edilen metod sağlarhedeflenen kültür koşullarını elde etmek için off-line glukoz ölçümlerine dayanarak oranı ayarlamaları beslenme basit uygulama. Bu yöntem ile besleme oranı ayarlama fizyolojik glukoz seviyesi artar, hücre verimleri gösterilir korumak için. Memeli hücreleri, enerji üretimi için, önemli bir besin, glikoz bağlıdır, bu yüzden, bu hücre hattının kullanılması bir çok kültürlenmiş memeli hücrelerine 44 bir modeli temsil etmektedir. Buna ek olarak, bu hat glukoz 45, kronik yüksek düzeyde duyarlı olan beta hücreleri, daha karmaşık örnek teşkil etmektedir. Bu çalışma için, β-TC6 hücreler, in vivo olarak Langerhans adacıklarında ortalama büyüklüğü yaklaşık kültür içinde parçacıklarının oluşturulması için bırakılmıştır. Perfüzyon biyoreaktör sistemi 17 - tüketimi glikoz ayarlanmış bir besleme oranı ile 19,21,46, canlılığı değişiklik olmaksızın, fizyolojik koşullar ve yüksek hücre verimi muhafaza ile sonuçlanmıştır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Hücre Hattı ve Bakım

  1. Elde β-TC6 hücreleri (ya da diğer arzu edilen yapışkan memeli hücre çizgisi). Çalışmanın hazırlık, kültür, geçit ve sağlayıcı talimatlarına göre hücrelerin cryopreserve.

2. Sürekli Besleme Sistemi birleştirin

NOT: - 19,21,47 - 49 aşağıda yöntemi sürekli besleme sistemi tasarımı literatürde 17'de açıklandığı benzer sistemler dayanmaktadır. Burada kullanılan sistemin montaj önceki yayında 3'te detaylı olarak tarif edilmektedir.

  1. orta rezervuar, peristaltik pompa, karıştırılmış biyoreaktör, atık haznesi ve özel olarak tasarlanmış boru / örnekleme seti: beş ana bileşenden oluşmaktadır besleme sistemi için gerekli bileşenleri toplayın.
    1. 1 L'lik bir cam şişe, 2 L'lik bir cam şişe kullanarak atık haznesi ve stirre kullanarak, orta hazne kurulması(Raf sürümü kapalı) 250 ml'lik bir hacim cam reaktörü kullanılarak d biyoreaktör.
    2. orta alışverişini kontrol etmek için 8 kanallı pompa kafası olan bir dijital peristaltik pompa veya benzer pompayı kullanın.
    3. pass-through limanları steril filtreler aracılığıyla havalandırma sağlamak ve rezervuarlar ve Biyoreaktörlerde arasındaki orta transferi için izin vermek için paslanmaz çelik boru ile sert ve otoklavlanabilen plastikten rezervuar ve modifiye biyoreaktör kapaklarını imalatı. Alternatif olarak, çeşitli satıcılardan akış limanları ile özel kapakları satın alın.
      NOT: biyoreaktör kapak isteğe bağlı enstrümantasyon ve izleme sondalar (örn oksijen monitörü) için ek geçiş noktalarını içerebilir.
    4. 40 um ila 60 arasında bir ortalama gözenek boyutu aralığı gözenekli cam havalandırma tüplerden imal edilen bir çıkış borusunu (OT) ve tadil edilmiş SSB kapak% 40 bir gözenek yoğunluğu takın. Alternatif olarak, kültürün belirli ihtiyaçlarına göre başka çıkış borusunu seçin.
      NOT: SeçOT gözenek boyutu (Daha fazla bilgi için bölüm 6 ve yayın 3'te açıklandığı gibi) kültürde hücre agrega bırakarak, sadece orta ve hücre enkaz kaldırmak için.
  2. poliviniliden florür (PVDF) boru konnektörleri ve dayanıklı peristaltik pompa tüp otoklav perfüzyon boru setleri birleştirin. Bölüm uzunluğu bileşenleri arasındaki mesafeye bağlıdır.
    NOT: Uzun süreli deneyler için dayanıklılık ve güvenilirlik sağlamak için boru çeşitli seçerken özel dikkat gösterin.
  3. bir besleme hattı, atık hattı ve örnek bir çizgi: üç bölümden ayarlanır boru monte edin.
    1. İki boru çapları (L / S 14 L / S 13) ile besleme hattını birleştirin. orta hazneye biyoreaktör mesafe span birincil borular için L / S 14 kullanın ve uygun PVDF adaptörleri kullanarak pompa bölümü için boru uzunluğu ortasında / S 13 L kısa bir uzunluğa yerleştirin.
    2. Standart PVDF hortum dikenli Tubi kullanınng adaptörler kısa pompa bölümü (L / S 13) boru her iki tarafında L / S 14 boru, iki parçayı birleştirecek şekilde.
      Not: Alternatif olarak, boru tüm uzunluğu daha küçük çaplı L / S 13 boru olabilir ve pompa bölümü bütünlüğü söz konusu olduğu zaman tüm boru uzunluğu değiştirilebilir.
  4. Daha büyük çaplı (L / S 16) boru kullanılarak atık giderimi için ikinci boru bölümü monte edin ve pompalama bölümü için ortada L / S 14 boru kısa bir bölüm yerleştirin. besleme hattı montaj PVDF hortum dikenli adaptörler kullanarak, ya da alternatif olarak istenen pompa hortumu boyutunun sürekli uzunluğu kullanılarak ve gerektiğinde değiştirilmesi gibi bu aynı şekilde yapılır.
    Not: aynı pompa ve pompa kafa besleme devresinin ve atık devresi için kullanıldığında, atık çıkarma boru hatları, pompa bölümü besleme hattı pompa bölümü daha büyük bir çap olmalıdır. Bu kaldırma pompası oranı besleme hızından daha hızlı olmasını sağlar ve güçlü önlemek olacaktırkültür hacminin büyük değişiklikler ial ve taşma tehlikesini azaltır.
  5. bir örnek toplama düzeneğinin boru setinin son bileşeni bir araya getirin.
    1. Bu prosedür port sistemini örnekleme monte özel bir tarif eder; Seçenek olarak ise, steril bir numune alma noktası çeşitli satıcılardan temin edilebilir.
    2. T-tipi PVDF konnektörü ile birbirine bağlı üç kısa (~ 6 cm) L / S 14 boru uzunlukları ve boru uzunlukları iki iki küçük hortum kelepçeleri gelen set inşa.
    3. kenetlenmiş uzunlukları birine gaz havalandırma için steril bir gaz filtre takın ve diğer steril bir örnekleme şırınga bağlantı için kullanılır (steril gazlı filtreleri gibi birçok steril filtre olmayan sterilizasyon aşağıdaki bir biyo-güvenlik kabini ilave edilmesi gerekebilir otoklavlanabilir).
    4. biyoreaktör kapağına takılı bir paslanmaz çelik numune konnektörüne üçüncü ucunu.
    5. başlamadan önce biyoreaktör bağlıyken örnekleme düzeneğini OtoklavDeney (aşağıda 3. adıma bakın).
    6. sürekli besleme işlemini bozmadan gerektiği gibi biyoreaktör steril numune toplamak için bu derleme kullanın.

3. Otoklav Tüm Malzemeler

  1. otoklav sterilizasyon için tüm biyoreaktör bileşenleri hazırlayın.
  2. sterilizasyon için bileşenleri tek tek topluyoruz. (Adım 2.1.1 monte) Orta ve atık depoları, (2.1.1 monte) 250 ml spinner şişesi, gerekli modifiye kapaklar (2.1.3 monte), (2.1.4 anlatılmıştır) çıkış borusu, üç boru setleri ( ) sürekli beslenmesi için gerektiği gibi bölümlerde 2.2 through2.5), çıkış borusu (monte.
    1. Kapağın üstüne özel monte örnekleme noktasını (bölüm 2.5), ya da diğer örnekleme noktasını tüm bileşenleri ile eğiren şişeyi monte edin ve çıkış borusu sıkıca (bölüm 2.1.4 açıklanmıştır) dönen şişeden içinde takılı olduğundan emin olun, ve eklemek .
    2. oto ile tüm spinner şişesi düzeneğini sarınbandı belirten clave sarma malzemesi ve otoklav. şal ​​Hermetik emin olun. Not: unwrapping ne zaman ve inkübatör içinde tüp setleri olmayan bağlandığında alüminyum folyo veya benzeri bir malzeme konektörü sterilliğinin muhafaza edilmesi amacıyla biyoreaktör kapağın her bir erişim noktası bireysel uçlarını kapatmak için kullanılabilir / biter.
    3. orta ve atık rezervuarların modifiye kapakları monte ve daha sonra ilgili cam şişe eklemek. alüminyum folyo kullanarak bunları Kapak ve bant belirten otoklav.
    4. son montaj yardımcı olmak için otoklav şal ve bant ile - Bireysel boru setleri (2.5 bölüm 2.2) sarın. unwrapping zaman alüminyum folyo veya benzeri malzeme konnektörü steril korumak için ayarlanmış her tüp bireysel uçlarını sarmak için kullanılabilir / biter.
    5. Bir standart kuru otoklav döngüsü kullanılarak sarılarak ürün kapta (örneğin, "ağırlık" ~ 30 dakika ya da daha fazla 121 ° C'de 15 psi ayarlama).
      NOT: Steril takmayınOnlar teyit sürece önce otoklav için filtreler otoklav güvenli olması için.

4. Sfero Oluşumu

NOT: Bu teknik literatürde 17'de tarif edilenlere benzer - diğer memeli hücre kültürlerinin 52 - 19,21,50. sterilizasyon aşağıdaki Tüm prosedürler bir laminer akış kaputu yapılan ve hücre kültürü için steril koşulları sağlamak için steril eldiven kullanılarak yapılmalıdır.

  1. Yeterli hücre miktarları kadar (satıcı tarafından açıklanmıştır) standart yapışık kültürlerinde tüm koşullarda, kültür ve genişletmek β-TC6 hücreler için biyoreaktörler istenilen sayıda tohum elde edilir.
    1. Şekil 1'de gösterildiği ve 2. bölümünde açıklandığı gibi çıkış borusu ile sürekli besleme biyoreaktör monte ve örnekleme kapağına örnekleme noktasına bağlamak. NOT: çıkış borusu ve örnekleme noktası montaj bioreact eklenmelidirsürekli besleme başlayıncaya kadar ya da önceden sferoid oluşumuna sürekli beslenmesi için, kültür ortamının üzerinden yukarı doğru çekilmelidir.
    2. otoklav modifiye SSB derleme sterilize (3. bölümde anlatılmıştır).
    3. dönücü Şişenin kapakları, orta ve atık gemilerin uygun yerlere steril delikleri (0.22 mikron ya da daha küçük steril filtreler) takın.
      Not: Bu buhar kabarcığı önlemek ve inkübatör (% 5 CO2), çevre ve biyoreaktör arasındaki gaz alışverişi sağlamak için önemlidir. Gaz değişimi bikarbonat tamponlu ortam kullanıldığında, doğru pH'ı korumak için gereklidir.
  2. 2 için mekanik çalkalama yardımıyla oda sıcaklığında, (ağ / hac) tripsin 0.53 mM EDTA çözeltisi% 0.25 kullanılarak hafif tripsinizasyon ile hücreleri toplamak - 3 dakika ve yaklaşık 1.3 x 10 6 hücre / ml'lik bir yoğunlukta biyo-reaktörlere tohum 200 ml kültür ortamı içinde.
    1. kuluçka belirlenen şişeler Taşı veBio-güvenlik kabininin içine.
      NOT: Tüm hücre kültürü ve manipülasyonlar uygun steril tekniği kullanarak bir Biyo-Güvenlik kabinesinde yapılmalıdır.
    2. aspire şişelerinden alınan kültür ortamı çıkarın.
    3. Şişe içine, (Ca ++, Mg ++ ya da olmadan), fosfat tamponlu tuzlu su içinde 5 ml pipetle ve yüzeyde hücreler boyunca durulama ile hücreler yıkanır, ve daha sonra PBS aspire.
    4. Toplanır, her bir kaba (tipik olarak yaklaşık 10 x 175 cm2 T balonları) için tripsin-EDTA çözeltisi 3 ml ekleyin.
    5. biyo-güvenlik kabini 3 dakika - elde edilen hücrelerin 2, oda sıcaklığında inkübe izin verin.
    6. Şişe yüzey hücreleri gevşetin ve şişeye (serumu) kültür ortamının 6 ml ekleyerek hücreleri toplamak ve 50 ml'lik bir tüp hücreleri aktarmak için elle hafifçe karıştırın. bir 50 ml tüp dolu olduğunda gerekli tüm hücreleri toplanıncaya kadar, başka bir 50 ml tüp kullanmak (yaklaşık bir 50 ml tüp her 5 T-175 matara için gerekli olacaktoplanmış).
    7. Yavaşça santrifüj (yaklaşık 50 x yerçekimi) toplanan hücre süspansiyonları pelet hücreleri.
    8. sağlam pelet bırakarak geri kalan ortam aspire.
    9. Kültür ortamı (serum içeren) pelet yeniden süspansiyon bir pipet kullanılarak ve aynı tüp içine tüm granül aktarılarak tek bir tüp içerisinde hücre toplayın.
    10. Literatürde 53'te tarif edildiği gibi tripan mavi boyama ile standart hemositometre kullanılarak hücre yoğunluğu sayın.
    11. Her durumda (1.3 x 10 6 hücre / ml bu gösteri için hedeflenen başlangıç hücre yoğunlukları idi) için SSB steril toplam hücrelerin istenilen sayıda ekleyin.
    12. (200 mi kültür hacmi bu çalışmalar için kullanılmıştır), istenen toplam kültür hacmi elde etmek üzere, bir pipet kullanılarak SSB (bu durumda fizyolojik aralıkta orta glikoz düzeyleri kullanılan arzu edilen glukoz konsantrasyonu) ortam ekleyin.
      NOT: SSB cu çalışmalar bu sürekli beslenen İçin ltures kültür ortamında (100 mg / dl) bir tadil edilmiş "düşük glukoz" versiyonu ile tohumlanmıştır. Bu kültürler ziyade bir "yüksek glikoz" orta ile başlayan ve glikoz tüketimi besleme başlamak için fizyolojik bir aralığı içine aşağı glikoz düzeyleri getirmek için bekleyen daha arzu edilen hedef glukoz konsantrasyonunda başlatmak için izin. Bu çalışmalarda beslemek için tüm diğer orta standart "yüksek-glukoz" ortamı (500 mg / dl) kullanılır.
    13. bir hücre kültür inkübatörü içinde bir karıştırıcı plaka hücrelerle SSB hareket ettirin.
  3. Sferoidler oluşturulması için izin vermek için,% 5 CO2,% 100 nispi nem ve 70 rpm'lik bir karıştırma hızı ile, 37 ° C 'de 3 gün boyunca besleme olmadan biyo-reaktörlerde kültür hücreleri.
    NOT: Hiçbir önemli bir çoğalma üç günlük sfero oluşumu süresince uyulmalıdır.
  4. sfero oluşumundan sonra, istenen kültür koşulları ile biyoreaktörler arasında parçacıklarının bölün.
le "> 5. Sürekli Besleme Kültür ve Düzeltilmiş Yem Oranı

  1. (- 4 2 adımlar), otoklav veya gaz bileşenlerin tümü sterilize ve steril teknikler kullanılarak bir biyolojik güvenlik kabini monte edin.
  2. sfero oluşumundan sonra, inkübatör gelen SSB kaldırmak ve biyolojik güvenlik kabini sürekli besleme sistemi bileşenlerini bir araya.
    1. Ilk arzu edilen kültür ortamı ile taze ortam haznesine ve besleme hattının bir tarafına bağlanır. Ayrıca taze ortam deposu doğru steril bir filtre ile havalandırılmış olduğundan emin olun.
    2. steril olarak biyoreaktör besleme giriş ağzına besleme hattının bir tarafı bağlayın. Bir steril filtre besleme hattı ve biyoreaktör girmeden önce orta filtre biyoreaktör giriş portu arasına monte edilmelidir.
    3. biyoreaktör çıkış borusu ve orta atık haznesine atık hattını bağlayın ve atık haznesi düzgün bir steril ile Bacalı emine filtresi.
  3. (Bu muhtemelen gemi ve boru tüm taşımak için iki kişi gerekir) biyolojik güvenlik kabini dışında düzeneğini taşımak ve uzun vadeli kültürü için tüm bileşenleri söndürüldü.
    1. Küremsi oluşumu (37 ° C,% 5 CO2,% 100 nem ve 70 rpm), aynı kültür parametreleri kullanarak inkübatör içinde karıştırıcı plaka üzerine SSB koyun. NOT: çizgiler kapı conta ile yerine dışarı daha inkübatör yan deliklerden çalıştırmak için gereken eğer geçici biyoreaktör gelen boru kesimleri kesmek gerekebilir. Bu alüminyum folyo, otoklavlama öncesi (aşama 3) ile birlikte tüp setleri uçlarının sarma ve biyoreaktör inkübatör içinde olana kadar yem ve atık boru kesimlerinden biyoreaktör yan takmak için bekleyerek aseptik bir şekilde yapılabilir. biyoreaktör tüp hatları yerine konabilir, ve alüminyum folyo kuvöz içinde çıkarılabilir ve hızlı bir şekilde bağlanmış.
    2. dışarı inkübatör erişim noktası üzerinden tüp setleri kalan uçları (biyoreaktör kapağına bağlı olanlar) çalıştırın (içinden-pass), ya da inkübatör kapı contasının bir yarıktan.
    3. (Yakındaki bir biyogüvenlik kabini mümkünse de) kuvöz dışında, hızla taze orta rezervuar besleme hattı ve orta atık deposuna atık hattı bağlayın ve atık haznesi düzgün steril bir filtre ile Bacalı olduğundan emin olun. NOT: aseptik bir şekilde bunu (bu bağlantı biyogüvenlik kabini dışında yapılması gereken özellikle) mümkün olduğunca çabuk ilgili gemilere tüp ve damar konnektörleri alüminyum folyoyu çıkarın ve bağlayın.
    4. Yakındaki mini buzdolabı içinde (istenilen besleme ortamı ile dolu) taze orta rezervuar koyun. yem ve atık hatları inkübatör çıkmak ve kapanış her kapıları engellemeden buzdolabı girmek mümkün olduğundan emin olmak için kontrol edin. Ayrıca, besleme l kritiktirines buzdolabı veya kuvöz birinin kapı tarafından kapatıldı sıkışmak değildir.
      Not: Bu çalışmalar için kullanılan ortam, bu hücre tipi için satıcı tarafından tavsiye edilen standart yüksek glikoz (500 mg / dl) kültür ortamı olmuştur. Herhangi bir yüksek glikoz orta kültüre olan hücre tipi özel ihtiyaçlarına göre kullanılabilir. Besleme ortamının glikoz konsantrasyonu besleme sistemi makul yem oranlarını korurken kültürlerde yeterli glikoz düzeylerini korumak için yüksek glukoz orta besleme hızını artırarak dayanır olarak kültürde istenen konsantrasyona daha makul (2x veya daha fazla) daha yüksek olmalıdır .
    5. Sonraki atık orta rezervuar elverişli bir konumda inkübatör dışında tezgah üstüne konabilir.
    6. Sonraki, besleme hatları SSB taze orta hazneden orta pompa böylece doğru yönlendirmeyi sağlayan pompa kafası içine yem ve atık hatlarının "pompa bölümünü", ve atık hatlarını yerinSSB ve atık orta rezervuar orta pompalayacak.
  4. İstenen besleme hızı pompa açın.
    1. Literatürde 3 ve aşağıda verilen temsili sonuçlar bölümünde açıklanan düzeltilmiş besleme oranı denklemi kullanılarak besleme oranı hesaplayın.
    2. kültüründe arzu edilen glukoz konsantrasyonu elde etmek için gerekli olan yem oranını tahmin etmek için bir büyüme tahmini ile birlikte en son hücre sayısı bilgilerini (aşama 5'te tarif edilen prosedür) ve ortam glukoz ölçümleri kullanın.
      NOT: Hücre büyüme oranları ve glukoz tüketim oranları bu prosedürleri yerine getirmeden önce elde edilmesi gerekecektir.
    3. Hesaplanan besleme oranına göre pompa hızını ayarlama.
  5. (Tarif edilen yöntemle her üç gün) ilerleme hızı hesaplama tekrarlayın ve her örnekleme noktası için pompa hızını ayarlayabilirsiniz.

6. Hücre sayar, Canlılık ve Glikoz Konsantrasyon Ölçümleri

<ol>
  • İstenilen her üç gün, ya da her bir biyoreaktör numune toplayın.
  • Yukarıda açıklanan özel örnekleme bağlantı noktasını kullanarak sürekli beslenen SSB kültürlerinden kültür örnekleri alır.
    1. biyoreaktör içinde sürekli beslenen SSB bırakarak, numune alma noktası un filtreli bağlantı (5 ml hacimli bir şırınga bu çalışmalar için kullanılmıştır) steril bir şırınga ekleyin.
    2. kültür ortamı içine aşağı örnekleme tüpü hareket ettirin.
    3. şırınga gidiyor tüp bölümü çözülme ve istenen toplam örnek hacmi çekilme.
    4. artık kültürde batık şekilde örnekleme borusu yukarı taşımak ve hava kaldırılıncaya kadar şırınga çekmeye devam ediyor.
    5. şırınga besleyen tüp kelepçe ve örnek içeren şırınga ayırmak, ve bir kenara koyun.
    6. hava ile ikinci bir taze steril şırınga ön yük ve örnekleme liman steril filtre tarafına takın.
    7. şırınga filtre tarafına gidiyor tüp çözülmesonra örnekleme noktası ve yavaşça steril filtre içinden şırınga hava atarak örnekleme noktasını temizlemek. Bu numune alma noktası kalıntı ortamın açık olmasını sağlar.
    8. Tüp filtresine gidiş yeniden kelepçe, steril şırınga ayırın ve atın.
  • kültüründen hücre örneği içeren şırınga alın ve 10 ml'lik bir tüp içine sınırdışı. Bilinen hacimlerin Alt örnekleri bu tüpünden doğrudan alınabilir.
  • hücre sayımları için, hücre bilinen bir hacmi çıkarın ve mikro santrifüj tüpüne transfer ve yavaşça 1 santrifüj - 2 dakika (yaklaşık 50 x yerçekimi).
  • glukoz ölçümü için ayrı bir tüp süpernatantı aktarın ve tripsin-EDTA çözeltisi aynı hacimde pelet (% 0.25 (ağ / hac) tripsin, 0.53 mM EDTA) yeniden askıya ve standart bir hemasitometre ile kullanarak üç kere sayısı literatürde 53'te tarif edildiği gibi mavi boya tripan.
    1. orta (serumu) ekleyingerektiğinde seyreltme örneği.
    2. Hücreleri saymak ve canlı (boyasız) hücreleri kaydederek hücre canlılığı hesaplamak ve bağımsız ölü (boyanmış) hücreleri (canlılık% = canlı hücre / toplam hücreler).
  • Kan şekeri metre ve tek kullanımlık test şeritlerini kullanarak üç nüsha olarak orta glikoz düzeylerini ölçmek.
    1. kan kültür ortamı ikame şekeri ölçüm talimatlarında anlatıldığı gibi glikoz ölçümleri alın.
    2. (Üç çoğaltır tavsiye edilir) (yukarıdaki sayım örneklerinden derlenen) test edilecek orta test şeridi batırın ve çoğaltır istenilen sayıda tekrarlayın.
    3. glukoz konsantrasyonları için taze orta ve atık orta hem de test edin.
      NOT: Bazı metre için, ölçümler daha düşük, 20 mg / dl (metre tespit eşiği), metre üretimde bir hata olarak gözlenebilir.

    • 7. Sfero yerleşmesi Oranı Ölçümleri

    1. Bu cel sağlamakl kümeleri sürekli besleme sistemi tarafından kaldırılmış olan değil, geniş çaplı bir plastik pipet kendi sedimantasyon gözlemleyerek β-TC6 küremsi yerleşme oranını ölçmek.
    2. yukarıda tarif edildiği gibi SSB biyoreaktörlerde Kültür β-TC6 hücreleri sferoidler oluşturulur.
    3. Kültür, 3 gün sonra, 50 ml bir tüp içinde küremsi süspansiyon ve yeri 30 mi örnek alabilir.
    4. Yavaşça pipetlemeyin yukarı ve eşit süspansiyon içinde dağıtmak için geniş çaplı 25 ml pipet kullanarak aşağı, sonra pipet (örneğin, 20 ml işareti) bilinen bir düzeyde süspansiyon ile pipetlenmesini durdurmak ve sferoidler tüm zaman kayıt 5 cm yerleşmek.
    5. İstatistiksel güven ulaşmak için bu prosedürü yeterli kez tekrarlayın (genellikle n> 3).
      Not: Biyolojik çalışmalar için, bir p değeri en az 0,05 ölçümleri karşılaştırırken istatistiksel olarak anlamlı kabul edilir. ortalamanın standart hatası raporlama hataları için kullanıldı ve iki un-eşleştirilmiş student-t testi kuyrukluSunulan veriler için koşulları mukayese etmek için kullanılmıştır.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Representative Results

    Orta Glukoz Düzeyleri ve dalgalanmalar Standart SSB Kültürlerde Hücre Genişleme sınırla

    Glikoz düzeyleri kültür dönemi 3 boyunca statik kültürler ve SSB kültürlerde dalgalanma. Bu dalgalanmalar, 21 günlük kültür döneminde, hücre sayısı arttıkça yoğunlaştırmak ve statik ve SSB kültürleri hem de hemen hemen aynı idi. Bu gözlemler önceki yayında 3'te sunulmuştur. glikoz düzeyleri her iki yöntem için kültür dönemi süresince süper fizyolojik olabilir. Bu kronik maruziyet hücre büyümesini inhibe 54 olabilir, çünkü sürekli besleme sistemi glikoz dalgalanmalarını ortadan kaldırmak ve sfero kültür sırasında besin kontrolünü artırmak için geliştirilmiştir.

    Sfero Kültür Sürekli Besleme Sistemi

    Sürekli taze ortam ilave edilmesi ve kültür dönemi süresince eski orta kaldırmaBasit bir orta besleme sistemi kullanılarak gerçekleştirilebilir. Yöntem 2'de tarif ve Şekil 1 'de gösterilen sistem bir pompa sürekli orta doldurmak için ayarlanmış boru ve kültürden parçacıklarının çıkarılmasını önler sürekli orta kaldırmak için ayrı bir çıkış tüpü kullanılır. orta giriş OT uygun işlevine müdahale ihtimalini en aza indirmek için, ve tam bir karışımın sağlanması için reaktörün karşı tarafında oldu. (Yüksek glukoz, 450 mg / dl) taze ortam uzun vadeli kararlılık sağlamak için soğutma sıcaklığında tutulur ve besin doldurmak için tam bir ortam değiştirme oranında orta girişi boyunca kültüre, her üç günde bir ilave edilir. Bu sistem sürekli bir süreç 3,22,23 manuel toplu orta değiştirme işlemini değiştirerek kültür döneminde gerekli manipülasyonlar ve müdahale sınırlı. Soğuk ortam tim üzerinde küçük hacimlerde biyoreaktör girdiHer 37 ° C'de idi Çevre kültür ortamı ile ısı dengelenmeye ortam ilave zaman "drop" veren toplam kültür hacmi (200 mi) e (0.046 ml / dakika) göre. Bu genel kültür sıcaklığını düşürmek değildi eklenen soğuk ortam kuvöz içinde muhafaza ediliyor olmasını sağlamıştır. Kültür ortamının Karıştırma işlemi, aynı zamanda, ısı transfer verimliliği artar ve bu kültürlerin ısı eşitliği geliştirilebilir. çok yüksek ilerleme hızları küçük kültür hacimleri ile kullanılan, ancak bu pek mümkün şartlar bu çalışmalar için test olmasaydı Sıcaklık bakımı bir endişe olabilir. kültür hacmi, ortalama, orta çıkarma oranı besleme oranına eşit olması sağlanarak sürekli besleme sisteminde sabit bir seviyede tutulur. Aslında temizleme borusu bölümü pompa bölümü için daha büyük çaplı boru kullanılır, çünkü besleme hızından daha yüksek bir akış hızında ortam çıkarıldı, bu çalışmalar için kullanılan sistem. Daha hızlı remo rağmenVal hızı, kültür hacmi istenen kültür hacmi seviyesine reaktör içindeki çıkış borusunun seviyesinin ayarlanması ile muhafaza edilmiştir. Sürekli SSB reaktör içinde orta düzeyde küçük bir artış ile sonuçlanmıştır taze ortam ilave ve ortam OT seviyesine ulaştığı zaman, orta hızlı bir oranda reaktörden çıkarıldı. orta düzeyde OT alt altına düştü kadar orta kültüründe hücre parçacıklarının bırakarak, gözenekli cam OT ile çıkarıldı. Bu sistem, pompa hızlarını kontrol etmek için ince akış ve hacim sensörler kullanılarak karmaşıklığı kaçınılması ve birçok SSB temelli bir kültür aparatı 47,48 ile kullanım için standarttır. OT sferoidler çıkarma devresi üzerinden kültür kaldırılır emin olmak için tasarlanmıştır ve sırlı cam bir tüp içinde, gözenek büyüklüğü ve yoğunluğu yeterince büyük (40 ve% 40 - sırasıyla 60 um) sağlamak için bu doğrusal akış hızı sferoidler bize çökelme hızından daha az olduBu kültür çalışmaları için ed. Ayrıntılı 3'te tarif edildiği gibi doğrusal akış hesaplandı. OT gözenekler yoluyla ortalama doğrusal orta hız 0.17 cm / dak olarak hesaplandı ve bu yavaş gözlenen sfero yerleşme oranı çok daha yavaş oldu. Yöntem 7'de açıklanan ve 2.53 ± 0.26 cm / Bu çalışmalarda kullanılan sferoidler için dk ortalama çökelme hızı ölçülmüştür. Sferoidler kültür ilerledikçe boyut artış gözlenmiştir ve bu büyük sferoidler daha OT ile ortadan kaldırılması olanağını azalmış artmış kütle-drag oranı, daha hızlı nedeniyle yerleşti. Bazı sferoidler OT dış kenarlarında alt gözeneklerde kaldılar, ama çıkış borusu karıştırılan ortama dips bu mekanik çarpışma kaynaklanmıştır. Bu OT düzgün fonksiyon engel olamadı ve test kültürlerde parçacıklarının ölçülebilir kaybına katkıda vermedi. Bu çalışmalar için OT (her çalışmadan sonra temizlendi) DI su floş ile ve azalan fonksiyon riskini önlemek için iki kültür çalışmaları için kullanımdan sonra değiştirilmelidir. sferoidler belirli bir çalışma sırasında gözenekleri (bu sunulan çalışmada gözlenmedi) yapışmasına görülmektedir eğer OT her çalışma sonrasında yerini olabilir. Nedeniyle bu yöntemi kullanarak ortamın döngüsel kaldırılması, orta kültür hacmi kadar 6 olarak% oranında dalgalanma. dalgalanmalar ortalama orta düzeyde OT alt altına düştükten sonra OT biraz daha orta kaldırmak için izin orta yüzey geriliminden kaynaklanan bulundu.

    Besin dalgalanmalar SSB Kültürlerde Geliştirilmiş Hücre Büyüme ortadan kaldırmak

    Sürekli standart SSB kültürleri ile karşılaştırıldığında 21-günlük kültür döneminde yüksek kültür verimleri yukarıda tarif edilen sistemi kullanarak SSB kültürlerinde ortamının değiştirilmesiyle. Besleme hızı tüm kültür VOLU ikame oranında kültür dönemi boyunca sabit tutulmuşturBana her üç günde toplu beslenen SSB kültürlerine karşılaştırılabilir olması. Besin dalgalanmalar yüksek glikoz konsantrasyonu 3 rağmen hücre verimleri (Şekil 3) bir artışa neden ortadan kaldırmak. Sfero boyutu da 2D mikroskobik değerlendirilmesi (literatürde 3 açıklanan standart ışık mikroskobu) kültür periyodunun sonunda ölçülen ve CF-SSB kültürlerinde sferoidler statik o (student-t testi, p <0.02) önemli ölçüde daha büyük idi veya standart SSB kültürleri literatürde 3 bildirildiği gibi. Bu gözlemler, canlılığı bağımsız kültür koşulundaki ile aynı yüksek düzeyde (96,23 ±% 0.85) muhafaza ederken CF-SSB kültürlerinde daha yüksek bir büyüme hızı göstermektedir hücre sayısı veri destekler. Sürekli beslenen SSB (CF-SSB) kültür sistemi sfero kültürlerde besin dalgalanmalar ortadan kaldırdı ve hücre büyüme oranları gelişmiş, ama glukoz düzeyleri daha da imp engellemiş olabilir ki süper-fizyolojik kaldı Hücre genişlemesine yönelik iyileştirme (Şekil 2). daha CF-SSB kültür sistemi geliştirmek için, bir algoritma SSB kültürlerinde glikoz düzeylerinin kontrolü iyileştirilmesi amacı ile kültür süresi boyunca besleme oranı ayarlamak için kullanıldı.

    Düzeltilmiş Yem Oranı Hesaplama

    Çeşitli faktörler, tutarlı glukoz seviyesini korumak için besleme hızının hesaplanması için düşünülebilir. özel ilgi faktörler, belirli bir çalışma için ve belirli bir hücre hattı için değiştirilebilir. Bu gösteri amacı sağlamak için, büyüme oranı ve önceki kültürlerinden belirlenmiş glükoz tüketimi, hem de ayar 3 zamanında, gerçek glikoz düzeyleri olarak. Beslemesi ayarlamaları zaman içinde herhangi bir aralıkta yapılabilir. Bu gösteri için, örnekleri alındı ​​ve besleme oranı şöyle tarif sıralı hesaplamalara dayalı her üç günde ayarlandı.

    Öngörülen Büyüme Oranı t "> Hesaplama

    Denklem 1 gelecekte bir zaman kültür hücrelerinin beklenen toplam sayısını temsil eden öngörülen hücre sayısı ile kültür belirli bir süre boyunca, hücre büyümesini, (N2) öngörür. Bu yöntem, mevcut hücre sayısı (N1) kültür dönemi (t 2-t 1) ile çarpılan sferoid kültürleri (Rg) hücre tahmini büyüme oranı olarak eklenen bir doğrusal büyüme yaklaşımı kullanır.

    denklem 1 (1)

    Hesaplanan Temel Yem Oranı

    Bazal ilerleme hızı (R F) (C F kültür dönemi (pay) sırasında kültüründe tüketilen glukoz tahmin ve yem ortamında glikoz konsantrasyonu bölünerek denklemi 2 kullanılarak hesaplanmıştır 1 ve N 2 ağırlıklı ortalamasına tarafından verilen hücre tipi (R1) için önceden belirlenmiş glikoz tüketim oranı çarpılarak tahmin edilmektedir (C F) besleme ortamında aynı kültür dönemi boyunca tüketilen glukoz değiştirmek için gerekli ortalama orta besleme oranını hesaplamak için.

    denklem 2 (2)

    Gözlemlenen Glikoz Düzeyler ile ayarlamadan Yem Oranı

    Ayrıntılı düzenlemeler seviyeleri korumak için kullanılabilir denklem 3. Bu glükoz ayarlanmış besleme (GAFR) kullanılarak seçilen zaman noktasında ölçülen glikoz düzeylerini (C1) yerleştirmek için baz beslemesiyle yapılan zaman büyüme veya ölümle beklenmeyen değişiklikler kültür içinde meydana gelir. Bu equatio n, bir kontrol sabiti (X) dahil ve 0.5 'lik bir değeri, bu veriler 3 kullanıldı. C1 Örnek gün kültür ortamı içinde ölçülen glikoz konsantrasyonunu temsil eder, ve C D hedef ortamdaki glukoz konsantrasyonu temsil eder. Nihai değer ikinci hesaplama tahmin besleme hızını ayarlar.

    denklem 3 (3)

    Şekil 1
    Şekil 1: Çıkışı Tüp Sürekli Besleme Sistemi Şeması. Gösterilen sistemin (a) Diyagram,. (B), çıkış borusu üzerine yerleştirilmiş fritli cam filtre ortamı hücreleri kaybı olmadan, kültürden çıkarılabilir izin vermek. Şekil izniyle çoğaltılamaz. 3

    /files/ftp_upload/52224/52224fig2.jpg "/>
    Şekil 2:. SSB, CF-SSB ve Düzeltilmiş CF-SSB Kültürler Glikoz Ölçümler (A) statik, SSB ve CF-SSB kültür yöntemleri kullanılarak ve standart yüksek glukoz ortamı ile besleme β-TC6 sfero kültürlerden Orta glukoz ölçümleri. sürekli besleme glikoz dalgalanmalarını ortadan kaldırmak mümkün değildir, ancak önemli ölçüde kültür döneminde ve çok fizyolojik aralığın üzerindeki orta değişim ortalama glukoz düzeyleri (gri çubuk ile gösterilir). Ayarlanan besleme dalgalanmaları ortadan kaldırmak ve kültür dönemi süresince fizyolojik düzeylere yakın glukoz konsantrasyonları muhafaza edebilmektedir. glukoz ölçümü için hata çubukları gösterilen ölçek (Standart Hata tüm ölçümler için ≤% 4) görünür olmasını çok küçük. Rakamlar veri izni ile önceki yayında sunulmuştur. 3


    Şekil 3: Büyüme Arındırılmış besleme hızları ile SSB CF-SSB hücre sayısı ve Arındırılmış CF-SSB Kültürleri Hücre büyümesi, sabit bir besleme oranına karşı normal ortam değişiklikleri ile SSB karşılaştıran 21 günlük kültür döneminde, hücre sayısındaki katlı olarak belirlenir. SSB kültürleri ve düzeltilmiş besleme oranı SSB kültürleri. Hata çubukları, ortalamanın standart hatasını rapor ve rapor p-değerleri bir un-eşleştirilmiş iki kuyruklu student-t istatistik testi içindir. Izni ile yeniden basılmıştır. 3

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Discussion

    58 - biyolojik maddelerin ve hücre terapileri için üretimi için memeli hücre üreten ürünlerin büyük ölçüde 55 kültür ve memeli hücreleri izlenmesini gerektirir. Dahası, bu uygulamalar tanımlanmış ve valide kültür koşulları için çağrı. Sadece bu gereksinimleri karşılamak olmaz araştırma teknolojilerini kullanarak hücrelerin hacminin artırılması. besin ve atık ürünlerin birikimi dalgalanmalara yol açması, Manuel ortam değişiklikleri hücre kalitesi, canlılığı ve verimi azaltır. Biyoreaktör kullanımı iyi biyo-farmasötik uygulamalar için mikroorganizmaların ticari kültürü için kurulur ve benzer stratejiler, memeli hücre kültürlerine uygulandı. çevre ile memeli hücrelerinin karmaşık etkileşimi hücre artışı potansiyeli optimize etmek için besin seviyelerini düzenlemeye bağlı olarak modifiye gerektirir.

    Bu sorunları gidermek için, biz bir straightfo geliştirdirward yöntem ayarlanabilir oranı perfüzyon besleme mekanizması ile karıştırılan süspansiyon biyoreaktör fizyolojik seviyelere yaklaşan, belirli bir hedef aralıkta glukoz seviyesini korumak için. Bunu gerçekleştirmek için, bir beta hücre çizgisinin sferoidler karıştırılan bir biyo-reaktör içinde üretilmiştir. Bir perfüzyon besleme sistemi standart toplu beslenme prosedürlerini yerine sürekli besleme mekanizması sağlamak için kullanılmıştır. Hücre büyüme oranları gözlendi ve yaklaşık glikoz kullanımı oranlarını tahmin etmek için kullanılmıştır. Güncel glukoz seviyeleri, hücreler tarafından ortam içinde biriken gerçek tüketilen besinler ve metabolizma ürünlerine karşılık ilerleme değeri kültür zaman içinde ölçülmüştür. Bu yöntem, glukoz düzeyleri her 3 günde bir orta değişikliklerle dramatik dalgalanma diğer statik ve SSB sistemleri 3 ile görülen glukoz düzeylerinde dalgalanmalar engelledi. toplu beslenme stratejileri kullanarak, glukoz konsantrasyonları geç aşamada, üç gün boyunca 275 mg / dl kadar düştü21 günlük büyüme s. glukoz seviyelerinde Bu dalgalanmalar, hücre verimi sınırlamıştır.

    hücre hattı için kurulmuş bir büyüme oranına ve glikoz tüketim oranı dahil ayarlanmış besleme sistemi gösteri için, orta ikame oranı, hem de her bir besleme bir zaman noktasında gözlenmiştir (ölçülen), kültür yoğunlukları ve glikoz seviyelerinin hesaplanması. farklı hücre tipleri için, ya da daha karmaşık doku kültürü sistemleri, bu varsayımlar doğru tutun olmayabilir. Daha doğru glikoz kontrolünü sağlamak için algoritma aynı zamanda bireysel kültürlerin değişkenliği açıklamak için bir geri besleme kontrol sistemi dahil. sferoidler ve farklılaştırıcı kök hücreleri gibi parametrelere dayalı glikoz tüketimi değişiklikleri boyunca hücrelerin glikoz kullanımında heterojenite etkisi de dahil olmak üzere tek başına büyüme oranına dayalı bir perfüzyon yönteminin sınırlamaları, bir geri besleme kontrol sistemi ile hafifletilebilir. Uygulamaya EXPone gösteren hücreleri bağlıntial büyüme oranları ya da daha karmaşık bir büyüme profilleri algoritması performansını artırmak için uygulanabilir. besleme hızı hesaplamalarında kullanılan varsayımlar ve değerler gerçek kültür koşullarına uymak için değiştirilebilir.

    sunulan yöntemler parçacıklarının genişlemesi ve Kültür sonlu süresince olacağını bir terapötik uygulama için hücreler üretmek için tasarlanmıştır ve bazı araştırmacılar ile sürekli olarak genişletmek ya da kültür hücreleri kendileri ürünü hücreler .. istenebilecektir benzer bir yöntem, ancak bu bu çalışmalar için karşılaşmadım diğer zorluklar olacaktır. Uzun süre kültüre ise, sferoidler boyutları büyümeye devam edeceğini ve sfero çekirdeğinde bazı hücrelerin canlılığı nedeniyle besin ve oksijen difüzyon sınırlamaları artan düşebilir. Bu kültürler, uzun süreli kültürleri arzu edildiğinde, bu sınırlama önlemek için büyük parçacıklarının ayrışmasına için daha başka manipülasyonlara gerektirebilir.canlılığı hiçbir azalma bu sınır Bu çalışmada 21-günlük kültür döneminde ulaşılamamıştır düşündüren bu protokol oluşturulacak parçacıklarının gözlenmiştir.

    Hücresel tedaviler için, bu teknikler, hücre verimi, fonksiyon ve canlılığını geliştirmek için ilave düzenleyici sistem ile bir arada kullanılabilir. Örneğin, SSB yöntemi, hücre büyüme oranları, ya da hücrelerin ya da küresel cisimler kapsüllenmesini geliştirmek Yapışık hücreler mikro-taşıyıcı yüzeyi kültürler de dahil olmak üzere kolaylaştıran teknolojileri ile kombine edilebilir. Bundan başka, daha karmaşık ayarlama algoritmaları sıkı kültür kontrolü sağlamak için uygulanabilir. Besleme ayarı daha fazla iyileştirmeler 59,60 yapmak için reaktifler pH, birden çok diğer parametreler kontrol, çözünmüş oksijen konsantrasyonu, ısı, ve enjeksiyon ile birleştirilebilir. Diğer uygulamalarda sonuçlarını geliştirmek için, bu yöntem 15,24 otomatik olabilir, ve yem oranları m hesaplanabilircevher ya da daha az sıklıkta fazla arıtma kültür koşulları.

    63 tanımlanır ve dikkatli bir şekilde tekrarlanabilir biyolojik ürünler yapmak için kontrol edilmelidir - İmalat 61 işler. Sürekli orta yerine kullanılması büyük ölçekli hücre üretiminde gözlenen kritik besin dalgalanmaları azaltmak için kullanılabilir ve ayarlanabilir besleme sistemini içeren istenen besin seviyesini korumak için, hücre ortamında daha fazla kontrol uygulayabilir. tarif edilen yöntem, hem hücresel hem de farmasötik ürünler için diğer memeli hücreleri ile kullanılabilir.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    β TC-6 Cells ATCC, Manassas, VA CRL-11506 Mouse Insulinoma cell line (adherent cell type)
    DPBS No Ca, No Mg Invitrogen, Carlsbad, CA 14190-144 https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/14190144?ICID=search-14190144
    Dulbecco's Modified Eagles Medium Invitrogen, Carlsbad, CA See below for product numbers 
    DMEM High Glucose (500 mM) Invitrogen, Carlsbad, CA 11965-092 http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/11965092
    DMEM Low Glucose (100 mM) Invitrogen, Carlsbad, CA 11885-084 http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/11885084 (note that this medium already contains pyruvate)
    L-glutamine Invitrogen, Carlsbad, CA 25030081 http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/25030081?ICID=search-product
    Sodium Pyruvate Invitrogen, Carlsbad, CA 11360070 https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/11360070?ICID=search-product
    Heat Inactivated Porcine Serum Gibco - Life Technologies 10082147 http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/10082147
    Trypsin-EDTA Invitrogen, Carlsbad, CA 25200056 https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/25200056?ICID=search-product
    T-150 Tissue Culture Treated Flasks Corning, Corning, NY 430825 http://catalog2.corning.com/LifeSciences/en-US/Shopping/ProductDetails.aspx?productid=430825(Lifesciences)
    &categoryname=
    NuAire Cell culture incubator Princeton, MN US Autoflow. Any water-jacketed CO2 regulating cell culture incubator could be used.
    Centrifuge Sorvall RT 7 (Any similar benchtop centrifuge may be used)
    Refrigerator Any laboratory refrigerator could be used (a small table-top version was used for these studies)
    1 L Glass Bottle Corning, Corning, NY 1395-1L Any vendor could be used. http://catalog2.corning.com/LifeSciences/en-US/Shopping/ProductDetails.aspx?productid=1395-1L(Lifesciences)
    &categoryname=
    2 L Glass Bottle Corning, Corning, NY 1395-2L Any vendor could be used
    250 ml stirred bioreactors  Corning, Corning, NY 4500-250 http://catalog2.corning.com/LifeSciences/en-US/Shopping/ProductDetails.aspx?productid=4500-250(Lifesciences)
    &categoryname=
    Stir Plate Fisher Scientific 11-496-104A Any incubator safe stir-plate can be used, any vendor
    Tissue Culture Dishes 100 mm Diameter Nunc, Rochester, NY (Fisher Scientific) 1256598  Any vendor could be used (ordered through Fisher Sci)
    FALCON 50 ml Conical Tubes Falcon, San Jose, CA 1256598 Any vendor could be used
    Delran Plastic Used for Custom Parts McMaster Carr Various Any material of choice could be used, but Deran is chosen because it is autoclave safe, non-reactive, and easy to machine. http://www.mcmaster.com/#acetal-homopolymer-sheets/=rjrcac
    Stainless Steel Pipe for custom lids McMaster Carr Various Any vendor could be used. http://www.mcmaster.com/#standard-stainless-steel-tubing/=rjrd91
    Custom Modified Delran Bioreactor Lids for Continuous Feeding Custom made Not aware of any vendors producing a similar product
    Custom Modified Glass Bottle Lids for Continuous feeding Custom made Some vendors (e.g., Fischer Sci, Corning) make similar products in the links below.
    Masterflex Digital Peristaltic Pump Cole Parmer, Vernon Hills, IL EW-77919-25 Any precision peristaltic pump could be used. http://www.coleparmer.com/Product/L_S_Eight_Channel_Four_Roller_
    Cartridge_Pump_System_115_230
    _VAC/EW-77919-25
    PVDF Tubing Connectors (various) Cole Parmer, Vernon Hills, IL see link Any vendor could be used. http://www.coleparmer.com/Category/Cole_Parmer_PVDF_Premium
    _Luer_Fittings/55889
    Pharmed BPT Tubing L/S 16 Cole Parmer, Vernon Hills, IL WU-06508-16 Any vendor could be used. http://www.coleparmer.com/Product/Masterflex_PharMed_BPT_Tubing
    _L_S_13_25/WU-06508-16
    Pharmed BPT Tubing L/S 14 Cole Parmer, Vernon Hills, IL WU-06508-14 Any vendor could be used. http://www.coleparmer.com/Product/Masterflex_PharMed_BPT_Tubing
    _L_S_13_25/WU-06508-14
    Pharmed BPT Tubing L/S 13 Cole Parmer, Vernon Hills, IL WU-06508-13 Any vendor could be used. http://www.coleparmer.com/Product/Masterflex_PharMed_BPT_Tubing
    _L_S_13_25/WU-06508-13
    Millipore Millex GP PES membrane 0.22 µl sterile syringe filter (used for venting, and medium filtration) Fisher Scientific SLGP033RS Any vendor could be used
    25 ml Graduated Pipette Fisher Scientific 13-678-11 Any vendor could be used, and various sizes may be used
    Pipetter Fisher Scientific 13-681-15E Any vendor, or similar product could be used
    Hemocytometer Fisher Scientific 02-671-6 Any vendor, or similar product could be used
    Trypan Blue Gibco - Life Technologies 15250-061 Any vendor, or similar product could be used. https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/15250061
    Inverted Light Microscope Leica Any vendor, or similar product could be used
    One Touch Ultra Blood Glucose Meter Fisher Scientific 22-029-293 Any vendor, or similar product could be used (e.g., Bayer)
    One Touch Ultra-Strips Fisher Scientific 22-029-292  Any vendor, or similar product could be used (e.g., Bayer)

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Reuveny, S., Velez, D., Macmillan, J. D., Miller, L. Factors affecting cell growth and monoclonal antibody production in stirred reactors. J. Immunol. Methods. 86 (1), 53-59 (1986).
    2. Tarleton, R. L., Beyer, A. M. Medium-scale production and purification of monoclonal antibodies in protein-free medium. Biotechniques. 11 (5), 590-593 (1991).
    3. Weegman, B. P., et al. Nutrient regulation by continuous feeding removes limitations on cell yield in the large-scale expansion of Mammalian cell spheroids. PLoS One. 8 (10), e76611 (2013).
    4. Klueh, U., et al. Continuous glucose monitoring in normal mice and mice with prediabetes and diabetes. Diabetes Technol. Ther. 8 (3), 402-412 (2006).
    5. Hay, R. J. Operator-induced contamination in cell culture systems. Dev. Biol. Stand. 75, 193-204 (1991).
    6. Dazey, B., Duchez, P., Letellier, C., Vezon, G., Ivanovic, Z. Cord blood processing by using a standard manual technique and automated closed system "Sepax" (Kit CS-530). Stem Cells Dev. 14 (1), 6-10 (2005).
    7. Gastens, M. H., et al. Good manufacturing practice-compliant expansion of marrow-derived stem and progenitor cells for cell therapy. Cell Transplant. 16 (7), 685-696 (2007).
    8. Naing, M. W., Williams, D. J. Three-dimensional culture and bioreactors for cellular therapies. Cytotherapy. 13 (4), 391-399 (2011).
    9. Stacey, G. N. Cell culture contamination. Cancer Cell Culture. , Methods Mol Biol; 731. Humana Press. Totowa, NJ. 79-91 (2011).
    10. Zur Nieden, I. N., Cormier, J. T., Rancourt, D. E., Kallos, M. S. Embryonic stem cells remain highly pluripotent following long term expansion as aggregates in suspension bioreactors. J. Biotechnol. 129 (3), 421-432 (2007).
    11. Kehoe, D. E., Jing, D., Lock, L. T., Tzanakakis, E. S. Scalable stirred-suspension bioreactor culture of human pluripotent stem cells. Tissue Eng. Part A. 16 (2), 405-421 (2010).
    12. Krawetz, R., et al. Large-scale expansion of pluripotent human embryonic stem cells in stirred-suspension bioreactors. Tissue Eng. Part C. Methods. 16 (4), 573-582 (2010).
    13. Shafa, M., et al. Expansion and long-term maintenance of induced pluripotent stem cells in stirred suspension bioreactors. J. Tissue Eng. Regen. Med. 6 (6), 462-472 (2012).
    14. Oh, S. K. W., et al. Long-term microcarrier suspension cultures of human embryonic stem cells. Stem Cell Res. 2 (3), 219-230 (2009).
    15. Olmer, R., et al. Suspension culture of human pluripotent stem cells in controlled, stirred bioreactors. Tissue Eng. Part C. Methods. 18 (10), 772-784 (2012).
    16. Baptista, R. P., Da Fluri,, Zandstra, P. W. High density continuous production of murine pluripotent cells in an acoustic perfused bioreactor at different oxygen concentrations. Biotechnol. Bioeng. 110 (2), 648-655 (2013).
    17. Papas, K. K. Characterization of the metabolic and secretory behavior of suspended free and entrapped ART-20 spheroids in fed-batch and perfusion cultures [dissertation]. , Georgia Institute of Technology. Atlanta, GA. (1992).
    18. Papas, K. K., Constantinidis, I., Sambanis, A. Cultivation of recombinant, insulin-secreting AtT-20 cells as free and entrapped spheroids. Cytotechnology. 13 (1), 1-12 (1993).
    19. Sambanis, A., Papas, K. K., Flanders, P. C., Long, R. C., Kang, H., Constantinidis, I. Towards the development of a bioartificial pancreas: immunoisolation and NMR monitoring of mouse insulinomas. Cytotechnology. 15 (1-3), 351-363 (1994).
    20. Sharma, S., Raju, R., Sui, S., Hu, W. -S. Stem cell culture engineering - process scale up and beyond. Biotechnol. J. 6 (11), 1317-1329 (2011).
    21. Papas, K. K., Long, R. C., Constantinidis, I., Sambanis, A. Role of ATP and Pi in the mechanism of insulin secretion in the mouse insulinoma betaTC3 cell line. Biochem. J. 326 (Pt 3), 807-814 (1997).
    22. Papas, K. K., Long, R. C., Sambanis, A., Constantinidis, I. Development of a bioartificial pancreas: I. long-term propagation and basal and induced secretion from entrapped betaTC3 cell cultures. Biotechnol. Bioeng. 66 (4), 219-230 (1999).
    23. Papas, K. K., Long, R. C., Sambanis, A., Constantinidis, I. Development of a bioartificial pancreas: II. Effects of oxygen on long-term entrapped betaTC3 cell cultures. Biotechnol. Bioeng. 66 (4), 231-237 (1999).
    24. Hu, W. S. Cell culture process monitoring and control-a key to process optimization. Cytotechnology. 14 (3), 155-156 (1994).
    25. Alfred, R., et al. Efficient suspension bioreactor expansion of murine embryonic stem cells on microcarriers in serum-free medium. Biotechnol. Prog. 27 (3), 811-823 (2011).
    26. Cormier, J. T., zur Nieden, N. I., Rancourt, D. E., Kallos, M. S. Expansion of undifferentiated murine embryonic stem cells as aggregates in suspension culture bioreactors. Tissue Eng. 12 (11), 3233-3245 (2006).
    27. Dang, S. M., Zandstra, P. W. Scalable production of embryonic stem cell-derived cells. Methods Mol. Biol. 290 (1), 353-364 (2005).
    28. Elseberg, C. L., et al. Microcarrier-based expansion process for hMSCs with high vitality and undifferentiated characteristics. Int. J. Artif. Organs. 35 (2), 93-107 (2012).
    29. Kallos, M. S., Behie, L. A. Inoculation and growth conditions for high-cell-density expansion of mammalian neural stem cells in suspension bioreactors. Biotechnol. Bioeng. 63 (4), 473-483 (1999).
    30. Kehoe, D. E., Lock, L. T., Parikh, A., Tzanakakis, E. S. Propagation of embryonic stem cells in stirred suspension without serum. Biotechnol. Prog. 24 (6), 1342-1352 (2008).
    31. Kirouac, D. C., Zandstra, P. W. The systematic production of cells for cell therapies. Cell Stem Cell. 3 (4), 369-381 (2008).
    32. Serra, M., et al. Stirred bioreactors for the expansion of adult pancreatic stem cells. Ann. Anat. 191 (1), 104-115 (2009).
    33. Chawla, M., Bodnar, C. A., Sen, A., Kallos, M. S., Behie, L. A. Production of islet-like structures from neonatal porcine pancreatic tissue in suspension bioreactors. Biotechnol. Prog. 22 (2), 561-567 (2006).
    34. Weegman, B. P., et al. Temperature profiles of different cooling methods in porcine pancreas procurement. Xenotransplantation. , (2014).
    35. Cruz, H. J., Moreira, J. L., Carrondo, M. J. Metabolic shifts by nutrient manipulation in continuous cultures of BHK cells. Biotechnol. Bioeng. 66 (2), 104-113 (1999).
    36. Dowd, J. E., Jubb, A., Kwok, K. E., Piret, J. M. Optimization and control of perfusion cultures using a viable cell probe and cell specific perfusion rates. Cytotechnology. 42 (1), 35-45 (2003).
    37. Goudar, C., Biener, R., Zhang, C., Michaels, J., Piret, J., Konstantinov, K. Towards industrial application of quasi real-time metabolic flux analysis for mammalian cell culture. Cell Culture Engineering. 101, Adv. Biochem. Eng. Biotechnol; 101. Springer Berlin Heidelberg. Berlin, Heidelberg. 99-118 (2006).
    38. Hu, W. S., Piret, J. M. Mammalian cell culture processes. Curr. Opin. Biotechnol. 3 (2), 110-114 (1992).
    39. Knaack, D., et al. Clonal insulinoma cell line that stably maintains correct glucose responsiveness. Diabetes. 43 (12), 1413-1417 (1994).
    40. Poitout, V., Stout, L. E., Armstrong, M. B., Walseth, T. F., Sorenson, R. L., Robertson, R. P. Morphological and functional characterization of beta TC-6 cells--an insulin-secreting cell line derived from transgenic mice. Diabetes. 44 (3), 306-313 (1995).
    41. Poitout, V., Olson, L. K., Robertson, R. P. Insulin-secreting cell lines: classification, characteristics and potential applications. Diabetes Metab. 22 (1), 7-14 (1996).
    42. Suzuki, R., et al. Cyotomedical therapy for insulinopenic diabetes using microencapsulated pancreatic beta cell lines. Life Sci. 71 (15), 1717-1729 (2002).
    43. Skelin, M., Rupnik, M., Cencic, A. Pancreatic beta cell lines and their applications in diabetes mellitus research. ALTEX. 27 (2), 105-113 (2010).
    44. Masters, J. R., Stacey, G. N. Changing medium and passaging cell lines. Nat. Protoc. 2 (9), 2276-2284 (2007).
    45. Murdoch, T. B., McGhee-Wilson, D., Shapiro, A. M. J., Lakey, J. R. T. Methods of human islet culture for transplantation. Cell Transplant. 13 (6), 605-617 (2004).
    46. Woodside, S. M., Bowen, B. D., Piret, J. M. Mammalian cell retention devices for stirred perfusion bioreactors. Cytotechnology. 28 (1-3), 163-175 (1998).
    47. Serra, M., et al. Improving expansion of pluripotent human embryonic stem cells in perfused bioreactors through oxygen control. J. Biotechnol. 148 (4), 208-215 (2010).
    48. Gálvez, J., Lecina, M., Solà, C., Cairó, J., Gòdia, F. Optimization of HEK-293S cell cultures for the production of adenoviral vectors in bioreactors using on-line OUR measurements. J. Biotechnol. 157 (1), 214-222 (2012).
    49. Trabelsi, K., Majoul, S., Rourou, S., Kallel, H. Development of a measles vaccine production process in MRC-5 cells grown on Cytodex1 microcarriers and in a stirred bioreactor. Appl. Microbiol. Biotechnol. 93 (3), 1031-1040 (2012).
    50. Liu, H., et al. A high-yield and scaleable adenovirus vector production process based on high density perfusion culture of HEK 293 cells as suspended aggregates. J. Biosci. Bioeng. 107 (5), 524-529 (2009).
    51. Zhi, Z., Liu, B., Jones, P. M., Pickup, J. C. Polysaccharide multilayer nanoencapsulation of insulin-producing beta-cells grown as pseudoislets for potential cellular delivery of insulin. Biomacromolecules. 11 (3), 610-616 (2010).
    52. Lock, L. T., Laychock, S. G., Tzanakakis, E. S. Pseudoislets in stirred-suspension culture exhibit enhanced cell survival, propagation and insulin secretion. J. Biotechnol. 151 (3), 278-286 (2011).
    53. Marchenko, S., Flanagan, L. Counting human neural stem cells. J. Vis. Exp. (7), e262 (2007).
    54. Campos, C. Chronic hyperglycemia and glucose toxicity: pathology and clinical sequelae. Postgrad. Med. 124 (6), 90-97 (2012).
    55. Eve, D. J., Fillmore, R., Borlongan, C. V., Sanberg, P. R. Stem cells have the potential to rejuvenate regenerative medicine research. Med. Sci. Monit. 16 (10), RA197-RA217 (2010).
    56. Hsiao, L. -C., Carr, C., Chang, K. -C., Lin, S. -Z., Clarke, K. Review Article: Stem Cell-based Therapy for Ischemic Heart Disease. Cell Transplant. , (2012).
    57. Oldershaw, R. A. Cell sources for the regeneration of articular cartilage: the past, the horizon and the future. Int. J. Exp. Pathol. 93 (6), 389-400 (2012).
    58. De Coppi, P. Regenerative medicine for congenital malformations. J. Pediatr. Surg. 48 (2), 273-280 (2013).
    59. Tziampazis, E., Sambanis, A. Modeling of cell culture processes. Cytotechnology. 14 (3), 191-204 (1994).
    60. Sidoli, F. R., Mantalaris, A., Asprey, S. P. Modelling of Mammalian cells and cell culture processes. Cytotechnology. 44 (1-2), 27-46 (2004).
    61. Yim, R. Administrative and research policies required to bring cellular therapies from the research laboratory to the patient’s bedside. Transfusion. 45, Suppl 4. 144S-158S (2005).
    62. Fink, D. W. FDA regulation of stem cell-based products. Science. 324 (5935), 1662-1663 (2009).
    63. Moos, M. Stem-cell-derived products: an FDA update. Trends Pharmacol. Sci. 29 (12), 591-593 (2008).

    Tags

    Biyomühendislik Sayı 115 glikoz besin düzenlemesi sürekli besleme karıştırılan süspansiyon biyoreaktör genişleme sfero kültür biyoreaktör
    Küresellerde Memeli Hücrelerinin Büyük ölçekli Genişleme için sürekli Beslenme ile Besin Yönetmeliği
    Play Video
    PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

    Cite this Article

    Weegman, B. P., Essawy, A., Nash,… More

    Weegman, B. P., Essawy, A., Nash, P., Carlson, A. L., Voltzke, K. J., Geng, Z., Jahani, M., Becker, B. B., Papas, K. K., Firpo, M. T. Nutrient Regulation by Continuous Feeding for Large-scale Expansion of Mammalian Cells in Spheroids. J. Vis. Exp. (115), e52224, doi:10.3791/52224 (2016).

    Less
    Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
    View Video

    Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

    Waiting X
    Simple Hit Counter