Summary

פלזמה מהירה ובידוד של מרכיבי דם שלמים בדגימות שהתקבלה מהגדרה מבוססת-קהילה

Published: November 30, 2015
doi:

Summary

We outline a methodology for the processing of whole blood to obtain a variety of components for further analysis. We have optimized a streamlined protocol that enables rapid, high-throughput simultaneous processing of whole blood samples in a non-clinical setting.

Abstract

איסוף ועיבוד של דגימות דם כל בהגדרה הלא-קלינית מציע הזדמנות ייחודית כדי להעריך אנשים המתגוררים בקהילה עם או בלי תנאי preexisting. עיבוד מהיר של דגימות אלה הוא חיוני כדי למנוע השפלה של רכיבים סלולריים מפתח. כלולות כאן הם שיטות לתא בו זמנית היקפי mononuclear הדם (PBMC), DNA, RNA ובידוד בסרום מתיקו דם יחיד שבוצע בבתיהם של משתתפים בהסכמה ברחבי מטרופולין, עם עיבוד יזמו בתוך 2 שעות של אוסף. יש לנו בשימוש בטכניקות אלה לעבד מעל 1,600 דגימות דם חומר מניב עקבי, באיכות גבוהה, אשר לאחר מכן נעשה שימוש במתילציה DNA, genotyping, ביטוי גנים מוצלח וcytometry זרימת מנתח. חלק מהשיטות המועסקות הם סטנדרטיים; עם זאת, בשילוב באופן המתואר, הם מאפשרים עיבוד יעיל של דגימות ממשתתפי population- ו / ולקהילה,מחקרים מבוססים שבדרך כלל לא ניתן להעריך בסביבה קלינית. לכן, יש פרוטוקול זה הפוטנציאל להשיג דגימות (ובהמשך נתונים), כי הם יותר מייצג של האוכלוסייה הכללית.

Introduction

מחקרים רבים אפיינו הבדלים בביטוי גנים, מתילציה DNA ותת-קבוצה של תאים בדם בקרב אנשים עם ובלי נפש (או אחר) המחלות 1-4. מחקרים אלה, לעומת זאת, התקבלו מהגדרות קליניות שבו ההבדלים הקשורים מחלה עלולים להיות מוגדלים בשל האופי בדרך כלל חמור יותר של המחלות שחולים מחפשים טיפול. בשל התקדמות ב" ה"אומיקה "גישות, בעשור האחרון ראה התפוצצות של עניין בקבלת דגימות ביולוגיות מהקהילה ו / או הגדרות אפידמיולוגיים 5-7, על מנת לספק הערכות מבוססות-אוכלוסייה של שכיחות מחלה ותמונה רחבה יותר של גורמים סביבתיים של מחלות נפש ו / או פיזיות אלה.

אתגר מרכזי בהקשר זה הוא הדרישה לעיבוד מהיר של הדגימות שנאספו. השפלה של תאי mononuclear, רכיבי מערכת חיסון מפתח שfrequently משמש כדי להעריך את בריאותו של אדם, מתחילה מייד עם תיקו דם עם ירידה משמעותית בהתאוששות לאחר שעה 2 של אוסף 8-10. כדי להתמודד עם אתגר זה, אנו מציגים פרוטוקול מותאם שברכיבים מרובים של כל דם האנושי מבודדים זמנית מדגימות שהתקבלו בבתיהם של נושאים המתגוררים באזור מטרופולין גדול. הפרוטוקול מבוסס על האוסף והשינוי של טכניקות הנוכחיות, כוללים אחסון של כל השברים "תוספת" במקרה טכניקות עתיד לאפשר לבידוד נוסף שלנו / מנתח. בעוד שיטות או ערכות חלופיות עשויות להיות מועסקות במקום של השיטות בודדות שתוארו כאן, התוו אלה הוכיחו להיות אמצעי אמין ויעיל לעיבוד דגימות באופן תפוקה גבוהה. שברים באיכות גבוהה (PBMCs, DNA, סרום, ו- RNA) של דם טרי יכול להיות מיוצרים בשעה 2 של אוסף וכל דגימות assay-מוכן יכול להיות זמין בתוך 2 ימים (איור 1).

פרוטוקול זה פותח כדי לאפשר העיבוד יעיל של דגימות שנאספו מהקהילה-מגורים, התושבים בוגרים של העיר דטרויט לבדיקה במחקר בריאות שכונת דטרויט (DNHS; DA022720, RC1MH088283, DA022720-05-S1), המבוסס אוכלוסייה- מחקר של הגורמים החברתיים והביולוגיים של הפרעת דחק פוסט טראומטית (PTSD) ומחלות נפש אחרות. השכיחות של PTSD בדטרויט היא יותר מכפול מהממוצע הארצי 11,12. זיהוי גורמים ביולוגיים של PTSD באוכלוסייה זו עשויה לעזור לפתח תרופתי מתאימה ו / או התערבויות קוגניטיביות-התנהגותיות לסייע לאלו הסובלים מההפרעה, הן באוכלוסייה עירונית זה, ובאוכלוסיות בסיכון גבוה אחרים (למשל, חוזר יוצאי צבא). המעבדה שלנו, הממוקמת בעבר באוניברסיטה ויין סטייט בדטרויט, מישיגן, נבחרה לעיבוד המבוסס על המומחיות שלנו בטיפול בדגימות רקמה טריות המיוצרות ממגווןמקורות, את ההכרח להתחיל עיבוד הדגימות בתוך שעה 2 של אוסף, והקרבה שלנו לאתרי האיסוף. עם הזדמנות ייחודית זו ביד, המטרה שלנו הייתה כדי לייעל את העיבוד לתשואה הגדולה ביותר של ה- DNA, RNA, סרום ותאי הדם היקפיים mononuclear (PBMCs) מכל דגימה (כוללת של N = 1,639 דגימות מעל 5 גלים של אוסף דגימה). הנהלים שתוארו כאן ניתן לבצע בו זמנית בסביבה הלא-קלינית, ובכך לייצר חומר מוצא (ראה טבלה 1 לתשואות ממוצעת) עבור מספר רב של יישומים במורד הזרם כוללים microarray, אפיגנטיים, בזמן אמת RT-PCR, וcytometry זרימת מנתח.

איור 1
איור 1. זרימת עבודה בסך הכל. התהליך הכולל המתואר כאן כוללת את הלוגיסטיקה של קבלת דגימות דם מזיהוי לגבי השתתפות הסכמהipants לדם לצייר את עצמו. באיכות גבוהה, שברים (תאי דם היקפי mononuclear; PBMCs, DNA, סרום, ו- RNA) של כל דם טרי יכולה להיות מיוצרים בשעה 2 של אוסף וכל דגימות assay-מוכן יכולות להיות זמינות בתוך 2 ימים. יתר על כן, שברים שהוכנו באמצעות שיטה זו מתאימים לאחסון לטווח ארוך, אם דגימות אינן להיבדק מייד. ציר הזמן כולו המתוארים כאן יכול להסתיים ביום אחד (~ 5 סך הכל שעות). עם זאת, ביום כזה יהיה מאוד עבודה אינטנסיבית במיוחד עבור טכנאי יחיד עם ניסיון רב עם הטכניקות. לפיכך, אנו ממליצים לחלק את ההליכים ביום 1 בין לפחות שני טכנאים והשלמת עיבוד RNA ביום 2. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Protocol

מחקר בריאות דטרויט השכונה היה נבדק ואושר על ידי אוניברסיטת Institutional Review Board של מישיגן. כל המשתתפים בתנאי הסכמה מדעת לפני השתתפותם במחקר. 1. כראוי לתעד את כל השלבים מגיוס באמצעות ניתו…

Representative Results

זה חיוני כי ההליך הכולל לייצר חומר באיכות גבוהה לניתוח במגוון רחב של יישומים במורד הזרם כוללים ביטוי גנים באמצעות microarray וניתוח RT-PCR, זיהוי של שינויים אפיגנטיים, ווריאציות משנה תא. טבלת 1 מציינת את התפוקה ואיכות הממוצעת של חומרים מכל אחד מהתהליכים. איור 3</s…

Discussion

יש לנו תיארנו פרוטוקול יעיל שיושם בהצלחה לעבד יותר מ -1,600 דגימות דם כל במחקר בריאות דטרויט השכונה. למרות שרבים מטכניקות אלה זמינים בספרות הקיימת, האוסף שלנו צעד-אחר-צעד, כוללים שינויים בעיתוי מדויק בין כל שלב, משקף פרוטוקול מותאם, יעיל שמייצר בהצלחה מגוון רחב של דגימות…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We would like to thank Henriette Mair-Meijers for invaluable attention to detail and hours devoted to processing the blood collections. We are grateful for the graphic design expertise of Natalie Jameson Kiesling. We also appreciate the approval of the manufacturers (Qiagen (Valencia, CA), BD Biosciences (San Jose, CA), Life Technologies (Grand Island, NY)) mentioned herein to publish the use of their products as described. Funding for this work was generously provided by the National Institutes of Health award numbers DA022720, RC1MH088283, and DA022720-05-S1.

Materials

QIAamp DNA Blood Mini Kit Qiagen 51104 Day 1: DNA isolation
Phosphate-buffered saline (PBS) Sigma P5493-1L Day 1: PBMC isolation
5 ¾” Pasteur pipets Fisher 13-678-6A Day 1: PBMC isolation
Fetal Bovine Serum (FBS), heat inactivated Life Technologies 10082147 Day 1: PBMC isolation
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) Sigma D8418-500ml Day 1: PBMC isolation
RPMI Medium 1640, liquid Invitrogen 11875119 Day 1: PBMC isolation
0.4% trypan blue stain  Invitrogen T10282 Day 1: PBMC isolation
Countess Cell Counting Chamber Invitrogen C10283 Day 1: PBMC isolation
Countess Automated Cell Counter or cell counting device such as a microscope and hemocytometer Invitrogen C10281 Day 1: PBMC isolation
LeukoLOCK Fractionation & Stabilization Kit  Ambion 1933 Day 1: Leukocyte RNA isolation
25G x 5/8 in. needles Becton Dickinson 305122 Day 1: Leukocyte RNA isolation
Syringes (5ml) Becton Dickinson 309646 Days 1 and 2: Leukocyte RNA isolation
Denaturing Lysis Solution  Ambion 8540G Day 2: Leukocyte RNA isolation
5M NaCl Life Technologies 24740011 Day 2: Leukocyte RNA isolation
TRI Reagent  Ambion 9738 Day 2: Leukocyte RNA isolation
Bromo-3-chloro-propane (BCP) Sigma B-9673 Day 2: Leukocyte RNA isolation
spin cartridges  Ambion 10051G Day 2: Leukocyte RNA isolation
0.1mM EDTA Ambion 9912 Day 2: Leukocyte RNA isolation
DNA-free Kit Ambion AM1960 Day 2: DNase treament
RNA 6000 Ladder  Agilent 5067-1529 Day 2: Bioanalyzer analysis
RNA 6000 Nano Series II Kit  Agilent 5067-1511 Day 2: Bioanalyzer analysis
RNaseZAP Ambion AM8782 Day 2: Bioanalyzer analysis
Ethanol >99% Sigma E7023-500ml
Isopropanol >99%  Sigma I9516-500ml
Nuclease-free ultra pure water  Invitrogen 9938
Pipette tips (nuclease-free) Eppendorf 22491253
Pipetter (serological) Eppendorf 2223020-4
Pipetters (for volumes under 1ml) Eppendorf 3120000-054
Pipettes (serological) Fisher 13-678-27E
Controlled rate freezing containers Nalgene 5100-0001
Cryoboxes (to hold 2ml and 5ml cryovials and 1.5ml microcentrifuge tubes) Fisher 03-395-464
Test tube rack Thermo Scientific 14-804-134
15ml polypropylene tubes  Fisher 14-959-49D
1.5ml and 0.65 microcentrifuge tubes Fisher 07-200-534 and 07-200-185
2ml and 5ml cryovials Fisher 10-500-26 and 10-269-88F 
8ml CPT vacutainer BD Biosciences 362761 2 tubes
6ml K2 EDTA vacutainer BD Biosciences 367863 2 tubes
8.5ml SST vacutainer BD Biosciences 367988 1 tube
Vortexer Fisher 2215365
Dry bath incubator with heating block for microcentrifuge tubes Fisher 11-715-1250
Filtration/vacuum system for use within the cell culture hood Fisher 01-257-87
Fixed-angle rotor for microcentrifuge tubes with aerosol-tight lid Eppendorf 22637002
Refrigerated centrifuge with a swing-bucket rotor and aerosol-tight caps for 16 x 125mm vacutainers and 15ml polypropylene tubes  Eppendorf 22628157 2, one does not need to be refrigerated
Nanodrop 2000 (recommended for accuracy of small volumes) or other spectrophotometric device Fisher 13-400-411
Agilent Bioanalyzer Agilent Technologies G2940CA
Liquid nitrogen tank Thermo Scientific 11-676-56
-80 ˚C freezer Thermo Scientific 992RAK
Sharps container Fisher 22-037-970
Biological waste container Thermo Scientific 1223P52
Biosafety Level 2  certified cell culture hood Thermo Scientific 13-261-315

References

  1. Hernandez, M. E., Martinez-Fong, D., Perez-Tapia, M., Estrada-Garcia, I., Estrada-Parra, S., Pavon, L. Evaluation of the effect of selective serotonin-reuptake inhibitors on lymphocyte subsets in patients with a major depressive disorder. Eur Neuropsychopharmacol. 20, 88-95 (2010).
  2. Weigelt, K., et al. TREM-1 and DAP12 expression in monocytes of patients with severe psychiatric disorders EGR3, ATF3 and PU.1 as important transcription factors. Brain Behav Immun. 25, 1162-1169 (2011).
  3. Robertson, M. J., et al. Lymphocyte subset differences in patients with chronic fatigue syndrome, multiple sclerosis and major depression. Clin Exp Immunol. 141, 326-332 (2005).
  4. Rotter, A., Asemann, R., Decker, A., Kornhuber, J., Biermann, T. Orexin expression and promoter-methylation in peripheral blood of patients suffering from major depressive disorder. J Affect Disord. 131, 186-192 (2011).
  5. Klengel, T., et al. Allele-specific FKBP5 DNA demethylation mediates gene-childhood trauma interactions. Nat Neurosci. 16, 33-41 (2013).
  6. Segman, R. H., Shefi, N., Goltser-Dubner, T., Friedman, N., Kaminski, N., Shalev, A. Y. Peripheral blood mononuclear cell gene expression profiles identify emergent post-traumatic stress disorder among trauma survivors. Mol Psychiatry. 10, 500-513 (2005).
  7. Smith, B. H., et al. Cohort Profile: Generation Scotland: Scottish Family Health Study (GS:SFHS). The study, its participants and their potential for genetic research on health and illness. Int J Epidemiol. 42, 689-700 (2013).
  8. Mallone, R., et al. Isolation and preservation of peripheral blood mononuclear cells for analysis of islet antigen-reactive T cell responses: position statement of the T-Cell Workshop Committee of the Immunology of Diabetes Society. Clin Exp Immunol. 163, 33-49 (2011).
  9. Duvigneau, J. C., Hartl, R. T., Teinfalt, M., Gemeiner, M. Delay in processing porcine whole blood affects cytokine expression. J Immunol Methods. 272, 11-21 (2003).
  10. Debey, S., et al. Comparison of different isolation techniques prior gene expression profiling of blood derived cells: impact on physiological responses, on overall expression and the role of different cell types. Pharmacogenomics J. 4, 193-207 (2004).
  11. Uddin, M., et al. Epigenetic and immune function profiles associated with posttraumatic stress disorder. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 9470-9475 (2010).
  12. Kessler, R. C., Wang, P. S. The descriptive epidemiology of commonly occurring mental disorders in the United States. Annu Rev Public Health. 29, 115-129 (2008).
  13. . QIAamp® DNA Mini and Blood Mini Handbook Available from: https://www.qiagen.com/us/resources/resourcedetail?id=67893a91-946f-49b5-8033-394fa5d752ea (2010)
  14. Koenen, K. C., et al. SLC6A4 methylation modifies the effect of the number of traumatic events on risk for posttraumatic stress disorder. Depress Anxiety. 28, 639-647 (2011).
  15. Walsh, K., Uddin, M., Soliven, R., Wildman, D. E., Bradley, B. Associations between the SS variant of 5-HTTLPR and PTSD among adults with histories of childhood emotional abuse: Results from two African American independent samples. J Affect Disord. 161, 91-96 (2014).
  16. Bustamante, A. C., et al. Childhood maltreatment is associated with epigenetic differences in hypothalamic-pituitary-adrenal (HPA) axis genes in the Detroit Neighborhood Health Study. , (2013).
  17. Sipahi, L., et al. Longitudinal epigenetic variation of DNA methyltransferase genes is associated with vulnerability to post-traumatic stress disorder. Psychol Med. 44, 3165-3179 (2014).
  18. Uddin, M., Koenen, K. C., Aiello, A. E., Wildman, D., de los Santos, R., Galea, S. Epigenetic and inflammatory marker profiles associated with depression in a community-based epidemiologic sample. Psychol Med. 41, 997-1007 (2011).
  19. Uddin, M., et al. Post-traumatic stress disorder is associated with immunosenescent T cell phenotypes in the Detroit Neighborhood Health Study. , (2011).
  20. Uddin, M., et al. Post-traumatic stress disorder is associated with immunosenescent T cell phenotypes in the Detroit Neighborhood Health Study. , (2011).
  21. Uddin, M. Biological signatures of post-traumatic stress disorder in the Detroit Neighborhood Health Study. , (2010).
  22. Aiello, A. E. Cytomegalovirus antibodies as a marker of immunosenescence in the Detroit Neighborhood Health Study. , (2010).
  23. Bustamante, A. C., et al. . Distinct gene expression profiles characterize lifetime PTSD and childhood maltreatment in the Detroit Neighborhood Health Study. , (2013).

Play Video

Cite This Article
Weckle, A., Aiello, A. E., Uddin, M., Galea, S., Coulborn, R. M., Soliven, R., Meier, H., Wildman, D. E. Rapid Fractionation and Isolation of Whole Blood Components in Samples Obtained from a Community-based Setting. J. Vis. Exp. (105), e52227, doi:10.3791/52227 (2015).

View Video