Here, real-time monitoring of tumor cell metabolism, combined with an in vivo chicken embryo chorio-allantoic membrane (CAM) model of metastasis, are used to evaluate novel anti-cancer targets/agents for their ability to sensitize tumor cells to DNA damaging chemotherapeutics.
בשל הרמה הגבוהה של הטרוגניות ומוטציות הגלומות בסרטן בבני אדם, טיפולי סוכן יחידים, או משטרי שילוב הממקדים את אותו המסלול, צפויים להיכשל. דגש צריך להיות ממוקם על העיכוב של מסלולים כי הם אחראים להתנגדות פנימית ו / או להתאמה לטיפול. שדה פעיל של החקירה הוא הפיתוח והבדיקה של מעכבי תיקון דנ"א המקדמים את הפעולה של, ולמנוע התנגדות ל, נפוץ כימותרפיה והקרנות. אנחנו השתמשנו בפרוטוקול רומן כדי להעריך את היעילות של עיכוב BRCA2 כאמצעי לרגישות תאים סרטניים לציספלטין התרופה המזיק DNA. חילוף חומרים בתא גידול (החמצה ונשימה) היה פיקוח בזמן אמת, לתקופה של 72 שעות כדי להתוות את יעילות טיפול בדקה אחרת דקת בסיס. בשילוב, ביצענו הערכה של תדירות גרורתי באמצעות קרום עובר עוף chorioallantoic (רמ"א) מודל של extravasation ופלישה. זהפרוטוקול כמה כתובות של החולשות של שימוש נפוץ במבחנה ובשיטות vivo להעריך משטרי טיפול בסרטן רומן. ניתן להשתמש בו, בנוסף לשיטות נפוצות כגון מבחני שגשוג תאים, מבחני מוות של תאים, ובמחקרי xenograft עכבריים vivo, להפלות באופן הדוק יותר בין יעדי מועמד וסוכנים, ובחר את המועמדים המבטיחים ביותר רק להמשך פיתוח.
רכש התנגדות לממוקדת ו / או טיפול בסרטן ציטוטוקסיות היא בעיה קלינית חשובה שיכול להוביל לכישלון טיפול, התקפים, והגדיל את תמותת חולה 1. על רקע הרמה הגבוהה של ההטרוגניות ברוב הגידולים, זה ודאות מתמטית שגידול של מספר תאים גבוה מספיק יכיל תת-קבוצה של תאים עמידים לטיפולים בודדים או בשילוב מיקוד מסלולים מולקולריים שבו תאים אלה תלויים להישרדות 2,3. תאי גידול מסוג זה יכול להיות שנבחר באופן חיובי לטיפול ב, שמוביל להישנות מחלה. פיתוח של טיפולים חדשניים שבו זמנית למקד מנגנוני הישרדות של תאי הסרטן שונים, לפני או אחרי בחירה בתיווך טיפול, לכן חשוב מבחינה קלינית.
רמה גבוהה של חוסר יציבות הגנום ומוטציה בגנומים גידול היא מאפיין בסיסי שמבדיל את התאים סרטניים לתאי מארח שאינו סרטני 4. כתוצאה מכך, usefuאסטרטגית l כדי להגדיל את האפקטיביות של כימותרפיה פוגע ב- DNA ולמנוע את התפתחותה של התנגדות היא לעכב באופן פעיל בתיקון ה- DNA בתאי גידול 5. זהו שדה פעיל של חקירה ומגוון רחב של יעדי תיקון DNA רומן נבדקים בסביבה פרה-קלינית. מספר המולקולה קטנה או המעכבים מבוססי antisense של מטרות אלו פותחו ועוברים בדיקת 6-8. המטרה היא לזהות את המועמדים פרה-קליניים המבטיחים ביותר ולהעריך את הבטיחות והיעילות שלהם בניסויים קליניים.
העלות הגבוהה של ניסויים קליניים ואת הסיכון לכשל (עבור מגוון רחב של סיבות, כולל הערכה טרום-קלינית תת-אופטימלי) הם מכשולים אדירים להתקדמות בפיתוח הטיפולים החדשים 9. השימוש במודלים מתאימים וקפדניים פרה-קליניים להעריך כראוי חדש מטרות טיפוליות ותרופות מועמד עלול להפחית את שיעור כישלון הגבוה של ניסויים קליניים 10 </sup>.
כמה שיטות פרה-קליניות נפוצה בשימוש כדי להעריך את היעילות של טיפולים אנטי-סרטני רומן הם: א) מדידה של היכולת להפחית שגשוג תאים סרטניים במבחנה (מבחני התפשטות תאים), ב) הפחתה מושרה טיפול בקיבולת של תאי גידול ל מושבות בתרבית רקמת טופס (מבחני הקמת מושבה), ג) הפחתה מושרה טיפול בפעילות המטבולית של תאי גידול במבחנה (המרה חיזור-צבע), ד) אינדוקציה מושרה טיפול של מוות של תאים סרטניים במבחנה (אפופטוטיים, נימקי, autophagic, הקשורים עם מיטוזה ואחרים) 11, וה) in vivo טיפול-induced הפחתה של צמיחה או אבלציה של xenografts אדם והעכבר 12-14.
חולשה העיקרית של מבחנה השיטות המפורטות בהיא שאף אחד מהם לספק הערכה בזמן אמת מתמשכת של השפעת טיפולי מועמד. במקום זאת, הם מספקים מידע רק בנקודתי זמן שנבחרו באופן נרחב מופרדים,במהלך הטיפול. מדידות כאלה הצטמצמו יכולת לשקף את העוצמה ועיתוי של תגובות תאים סרטניים בצורה מדויקת. בvivo מודלים xenograft העכבר מוגבלים גם על ידי עלות גבוהה, משך זמן להשלמת, וסיכון של עיתוי אופטימלי מינון וטיפול (תזמון). בנוסף, יש ראיות לכך שמודלי xenograft המכרסמים הם מנבאים מוגבלים של יעילות קלינית בבני אדם, בהשוואה להערכה במבחנה של תגובות של תאים סרטניים אנושיים ראשוניים ושורות תאי גידול אנושי הוקמו להתערבויות טיפוליות מועמד 15,16.
אנחנו המצאתי פרוטוקול שילוב רומן להעריך שילובי תרופות חדשים מראש קליני, באופן שמטפל בחולשות של ההליכים נפוצים יותר מפורטים לעיל. במקום של שגשוג, יצירת מושבות, או מבחני המרת חיזור-צבע, השתמש יחידת מדידת חילוף חומרים לנתח הידבקות תא, נשימה, והחמצה בזמן אמתבמהלך תקופת הטיפול כל 17. במקביל, אנו חקרנו את ההשפעות של שילוב הטיפול בvivo באמצעות עובר עוף מודל chorioallantoic קרום (CAM) של פלישה וגרורות 18,19. אנחנו השתמשנו בשיטות אלה כדי להעריך את היכולת של מולקולת אנטיסנס קצר (ASO) מיקוד BRCA2 להגברת היעילות של ציספלטין התרופה כימותרפיות הנפוצה.
בשל העלות הכרוכה והסיכון כרוך בניסויים קליניים, יש צורך לפתח טוב יותר ויותר מחמיר מתודולוגיית בדיקות פרה-קלינית להעריך כראוי משטרי טיפול אנטי-סרטני רומן. שיטות קיימים כיום נפוצה בשימוש כל חולשות התערוכה שעלולה להגביל את היכולת שלהם להבחין בין מטרות / סוכנים טיפוליי?…
The authors have nothing to disclose.
עבודה זו התאפשרה על ידי מענקים לJK ממרכזי אונטריו של אקסלנס וקרן המחקר לאונטריו.
ברצוננו להודות לSiddika Pardhan וד"ר פיטר פרגוסון לקבלת סיוע טכני בזמן צילומים.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
A549 cells | ATCC | CCL-185 | http://www.atcc.org/products/all/CCL-185.aspx |
AeraSeal film | Carl Roth GmbH | ||
AMEM | Wisent Bioproducts | 210-011-QK | |
Antisense oligodeoxynucleotides | Avecia | BRCA2 target sequence: 5' – UAAGGAACGUCAAGAGAUAC – 3' (bases 7241-7259 ) | |
Axio Zoom V16 Microscope | Carl Zeiss | http://www.zeiss.ca/microscopy/en_ca/products/stereo-zoom-microscopes/axio-zoom-v16.html | |
Bionas Biosensor Chips | Bionas GmbH and Micronas GmbH | BIS8001D | |
Bionas Discovery 2500 System | Bionas GmbH | http://www.bionas-discovery.com/prodservices/instruments/system2500/ | |
Cisplatin | Sigma Aldrich | 479306 | |
Fertilized chicken eggs | Sourced locally | ||
Fetal bovine serum | Gibco – Life Technologies | ||
Lipofectamine 2000 | Invitrogen – Life Technologies | 12566014 | http://www.lifetechnologies.com/ca/en/home/life-science/protein-expression-and-analysis/transfection-selection/lipofectamine-2000.html |
PBS | Wisent Bioproducts | 311-010-CL | |
Trypsin (0.25%)/EDTA | Wisent Bioproducts | 325-043-CL |