Summary

Evaluere effektiviteten av Cancer Drug Sensibilisering<em> In Vitro</em> Og<em> I Vivo</em

Published: February 06, 2015
doi:

Summary

Here, real-time monitoring of tumor cell metabolism, combined with an in vivo chicken embryo chorio-allantoic membrane (CAM) model of metastasis, are used to evaluate novel anti-cancer targets/agents for their ability to sensitize tumor cells to DNA damaging chemotherapeutics.

Abstract

På grunn av det høye nivået av heterogenitet og mutasjoner som ligger i kreft hos mennesker, monoterapi behandlinger, eller kombinasjonsregimer som retter seg mot samme vei, er sannsynlig å mislykkes. Det må legges vekt på hemming av veier som er ansvarlig for indre og / eller adaptive resistens mot behandlingen. En aktiv innen etterforskning er utvikling og testing av DNA-reparasjons hemmere som fremmer virkningen av, og hindre motstand mot, som vanligvis brukes kjemoterapi og strålebehandling. Vi brukte en ny protokoll for å evaluere effektiviteten av BRCA2-inhibering som et middel for å sensibilisere tumorceller for DNA-ødeleggende medikament cisplatin. Svulst celle metabolisme (forsuring og respirasjon) ble overvåket i sanntid for en periode på 72 timer for å avgrense behandlingseffektivitet på et minutt for minutt basis. I kombinasjon, utførte vi en vurdering av metastatisk frekvens ved hjelp av en kylling embryo chorioallantoic membran (CAM) modell av ekstravasasjon og invasjon. Detteprotokollen adressene noen av svakhetene som vanligvis brukes in vitro og in vivo metoder for å vurdere nye kreftterapi regimer. Den kan brukes i tillegg til vanlige metoder som for eksempel celle proliferasjonsanalyser, celledød analyser og in vivo murine xenograft-studier, for nærmere å diskriminere blant kandidat mål og midler, og velger kun de mest lovende kandidater for videre utvikling.

Introduction

Ervervet resistens til målrettet og / eller cytotoksisk kreftbehandling er en viktig klinisk problem som kan føre til behandlingssvikt, tilbakefall, og økt pasient dødelighet 1. Gitt den høye grad av heterogenitet i de fleste tumorer, er det en matematisk sikkerhet at en tumor i tilstrekkelig høy celletallet vil inneholde et undersett av celler som er resistente mot enkle eller kombinerte terapier rettet mot molekylære reaksjonsveier som disse cellene avhengige av for overlevelse 2,3. Slike tumorceller kan bli positivt valgt for under behandlingen, noe som fører til tilbakefall av sykdommen. Utvikling av nye behandlingsformer som samtidig retter seg mot forskjellige cancer-celle overlevelse mekanismer, enten før eller etter behandling-mediert valg, er således klinisk viktige.

Et høyt nivå av genom ustabilitet og mutasjon i tumor genomer er et grunnleggende trekk som skiller kreftceller fra ikke-svulstvertsceller 4. Følgelig en useful strategi for å øke effektiviteten av DNA-skadende kjemoterapi og for å hindre utvikling av resistens er aktivt å hemme DNA-reparasjon i tumorceller 5. Dette er en aktiv felt av undersøkelse og en stor mengde av nye DNA-reparasjons mål blir undersøkt i en pre-klinisk miljø. En rekke små molekyl eller antisense-baserte hemmere av disse målene har blitt utviklet og er under testing 6-8. Målet er å identifisere de mest lovende prekliniske kandidater og vurdere deres sikkerhet og effekt i kliniske studier.

Den høye kostnaden for kliniske studier, og risikoen for å mislykkes (for en rekke årsaker, inkludert sub-optimal pre-klinisk evaluering) er formidable hindringer for å komme videre i utviklingen av nye behandlingsformer 9. Bruk av riktige og strenge pre-kliniske modeller å tilstrekkelig evaluere nye terapeutiske mål og kandidat legemidler kan redusere den høye strykprosent av kliniske studier 10 </sup>.

Noen vanlig brukte pre-kliniske metoder for å evaluere effektiviteten av nye anti-kreft-regimer er: a) måling av evnen til å redusere tumorcelleformering in vitro (celle proliferasjonsanalyser), b) terapi-indusert reduksjon i kapasitets av tumorceller til skjema vevskultur kolonier (kolonidannelse analyser), c) terapi-indusert reduksjon i tumorcelle metabolsk aktivitet in vitro (redox-farvestoff-konvertering), d) terapi-fremkalt induksjon av in vitro tumor celledød (apoptose, nekrotisk, autophagic, forbundet med mitose og andre) 11, og e) in vivo terapi-indusert reduksjon i vekst eller ablasjon av humane og mus xenograft 12-14.

En stor svakhet av de nevnte in vitro-metoder er at ingen av dem gir kontinuerlig sanntids evaluering av effekten av kandidat terapier. Snarere, de gir informasjon kun på utvalgte, mye separerte tidspunkteri løpet av behandlingen. Slike målinger har redusert kapasitet til å gjenspeile størrelsen og timingen av tumorcelle svar. In vivo mus xenograft modeller er også begrenset av høye kostnader, lang tid å fullføre, og risikoen for sub-optimal dosering og behandling timing (planlegging). I tillegg er det bevis for at gnager xenograft modeller er begrenset prediktorer for klinisk effekt hos mennesker, sammenlignet med in vitro vurdering av svarene av primære humane tumorceller og etablerte humane tumorcellelinjer til kandidat terapeutiske intervensjoner 15,16.

Vi utviklet en ny kombinasjon protokoll for å evaluere nye medikamentkombinasjoner pre-klinisk, på en måte som tar for seg svakheter ved de mer vanlige prosedyrene nevnt ovenfor. I stedet for proliferasjon, kolonidannelse, eller redoks-fargestoff konverterings assays, benyttet vi en metabolisme måleenhet for å analysere celleadhesjon, respirasjon, og surgjøring i sanntidunder hele behandlingsperioden 17. Samtidig har vi undersøkt effekten av behandlingen kombinasjon in vivo ved å bruke et kylling embryo chorioallantoic membran (CAM) modell av invasjon og metastase 18,19. Vi brukte disse fremgangsmåter for å evaluere evnen av et antisense-oligonukleotid (ASO) rettet BRCA2 å forsterke effektiviteten av den vanlig brukte kjemoterapeutisk middel cisplatin.

Protocol

MERK: Følgende protokoll er designet for bruk med heftende celler. Endringer er nødvendig for å bruke metoden til ikke-heftende celler dyrket i suspensjon. CAM-forsøk som er beskrevet i protokollen er konstruert for bruk sammen med celler som uttrykker en fluorescerende markør (f.eks, GFP, RFP, etc.). Ni dager gamle kyllingembryoer er nødvendig på dag 2 av den eksperimentelle protokollen for CAM-eksperimenter. 1. Forberedelse og Transfeksjon av tumorceller med Antisens…

Representative Results

Resultater og tall tilpasset med tillatelse fra publiserte arbeider 22. BRCA2 inhibering induserer en reduksjon i respirasjon i cisplatinbehandlede tumorceller Menneskelige A549 lungekreft celler behandlet med BRCA2-targeting ASO og cisplatin utstilt en tidlig og irreversibel nedgang i åndedrett, sammenlignet med celler som mottok kontroll ASO og cisplatin alene; etter 24 timers behandling med cisplatin forskjellen i respirasjonen mellom BRCA…

Discussion

På grunn av den iboende kostnader og risiko knyttet til kliniske studier, er det behov for å utvikle bedre og mer grundig pre-klinisk testing metodikk å tilstrekkelig evaluere nye anti-kreft behandlingsregimer. Dagens mest brukte teknikker alle utstillingen svakheter som kan begrense deres evne til å diskriminere mellom potensielt lovende terapeutiske mål / agenter, og de som kan være mindre effektive. Vi utviklet en protokoll for å evaluere nye anti-kreft tilnærminger som løser mange av svakhetene ved tradisjo…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dette arbeidet ble gjort mulig med tilskudd til JK fra Ontario Centres of Excellence og Ontario forskningsfond.

Vi vil gjerne takke Siddika Pardhan og Dr. Peter Ferguson for teknisk assistanse under filming.

Materials

Name of Material/ Equipment Company Catalog Number Comments/Description
A549 cells ATCC CCL-185 http://www.atcc.org/products/all/CCL-185.aspx
AeraSeal film  Carl Roth GmbH
AMEM Wisent Bioproducts 210-011-QK
Antisense oligodeoxynucleotides Avecia BRCA2 target sequence: 5' – UAAGGAACGUCAAGAGAUAC – 3' (bases 7241-7259 )
Axio Zoom V16 Microscope Carl Zeiss http://www.zeiss.ca/microscopy/en_ca/products/stereo-zoom-microscopes/axio-zoom-v16.html
Bionas Biosensor Chips Bionas GmbH and Micronas GmbH BIS8001D
Bionas Discovery 2500 System  Bionas GmbH http://www.bionas-discovery.com/prodservices/instruments/system2500/
Cisplatin Sigma Aldrich 479306
Fertilized chicken eggs Sourced locally
Fetal bovine serum  Gibco – Life Technologies
Lipofectamine 2000  Invitrogen – Life Technologies  12566014 http://www.lifetechnologies.com/ca/en/home/life-science/protein-expression-and-analysis/transfection-selection/lipofectamine-2000.html
PBS Wisent Bioproducts 311-010-CL
Trypsin (0.25%)/EDTA Wisent Bioproducts 325-043-CL

References

  1. Bouwman, P., Jonkers, J. The effects of deregulated DNA damage signalling on cancer chemotherapy response and resistance. Nat Rev Cancer. 12, 587-598 (2012).
  2. Bozic, I., et al. Evolutionary dynamics of cancer in response to targeted combination therapy. Elife. 2, e00747 (2013).
  3. Diaz, L. A., et al. The molecular evolution of acquired resistance to targeted EGFR blockade in colorectal cancers. Nature. 486, 537-540 (2012).
  4. Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell. 144, 646-674 (2011).
  5. Rytelewski, M., et al. Inhibition of BRCA2 and Thymidylate Synthase Creates Multidrug Sensitive Tumor Cells via the Induction of Combined ‘Complementary Lethality’. Mol Ther Nucleic Acids. 2, e78 (2013).
  6. Lord, C. J., Ashworth, A. The DNA damage response and cancer therapy. Nature. 481, 287-294 (2012).
  7. Helleday, T., Petermann, E., Lundin, C., Hodgson, B., Sharma, R. A. DNA repair pathways as targets for cancer therapy. Nat Rev Cancer. 8, 193-204 (2008).
  8. Shaheen, M., Allen, C., Nickoloff, J. A., Hromas, R. Synthetic lethality: exploiting the addiction of cancer to DNA repair. Blood. 117, 6074-6082 (2011).
  9. Green, S., Benedetti, J., Smith, A., Crowley, J. . Clinical trials in oncology. 28, (2012).
  10. Begley, C. G., Ellis, L. M. Drug development: Raise standards for preclinical cancer research. Nature. 483, 531-533 (2012).
  11. Galluzzi, L., et al. Molecular definitions of cell death subroutines: recommendations of the Nomenclature Committee on Cell Death 2012. Cell Death Differ. 19, 531-533 (2012).
  12. Ruggeri, B. A., Camp, F., Miknyoczki, S. Animal models of disease: pre-clinical animal models of cancer and their applications and utility in drug discovery. Biochem Pharmacol. 87, 150-161 (2014).
  13. Kwon, M. C., Berns, A. Mouse models for lung cancer. Mol Oncol. 7, 165-177 (2013).
  14. Young, M., Ordonez, L., Clarke, A. R. What are the best routes to effectively model human colorectal cancer. Mol Oncol. 7, 178-189 (2013).
  15. Sharma, S. V., Haber, D. A., Settleman, J. Cell line-based platforms to evaluate the therapeutic efficacy of candidate anticancer agents. Nat Rev Cancer. 10, 241-253 (2010).
  16. Garnett, M. J., et al. Systematic identification of genomic markers of drug sensitivity in cancer cells. Nature. 483, 570-575 (2012).
  17. Alborzinia, H., et al. Real-time monitoring of cisplatin-induced cell death. PLoS One. 6, e19714 (2011).
  18. Cvetkovic, D., et al. KISS1R induces invasiveness of estrogen receptor-negative human mammary epithelial and breast cancer cells. Endocrinology. 154, 1999-2014 (2013).
  19. Leong, H. S., Chambers, A. F., Lewis, J. D. Assessing cancer cell migration and metastatic growth in vivo in the chick embryo using fluorescence intravital imaging. Methods Mol Biol. 872, 1-14 (2012).
  20. Hung, Y. P., Albeck, J. G., Tantama, M., Yellen, G. Imaging cytosolic NADH-NAD(+) redox state with a genetically encoded fluorescent biosensor. Cell Metab. 14, 545-554 (2011).
  21. Tantama, M., Hung, Y. P., Yellen, G. Imaging intracellular pH in live cells with a genetically encoded red fluorescent protein sensor. J Am Chem Soc. 133, 10034-10037 (2011).
  22. Rytelewski, M., et al. BRCA2 inhibition enhances cisplatin-mediated alterations in tumor cell proliferation, metabolism, and metastasis. Mol. Onc. 8 (8), 1429-1440 (2014).

Play Video

Cite This Article
Rytelewski, M., Buensuceso, A., Leong, H. S., Deroo, B. J., Chambers, A. F., Koropatnick, J. Evaluating the Effectiveness of Cancer Drug Sensitization In Vitro and In Vivo. J. Vis. Exp. (96), e52388, doi:10.3791/52388 (2015).

View Video