Summary
많은 다른 방법은 유동 세포 계측법 (FCM)를 사용하여 세포 외 소체 (전기 자동차)의 측정을 위해 존재한다. 사용하기에 가장 적절한 방법을 결정할 때 여러 측면이 고려되어야한다. 측정 전기 자동차에 대한 두 프로토콜은 개별 감지 또는 비드 기반의 접근 방식을 사용하여,되게됩니다.
Abstract
세포 외 소포 (전기 자동차)는 세포 - 세포 통신에 매우 관여하고 생물학적 과정의 다양한 범위를 조절하는 데 도움이 체액에서 발견 된 작은, 막 유래 소포입니다. 유동 세포 계측법 (FCM)를 사용하여 전기 자동차의 분석은 그들의 작은 크기와 관심의 마커에 대한 긍정적 인 이산 인구의 부족으로 악명 어려웠다. 상당히 지난 10 년 동안 개선하면서 EV 분석하는 방법은, 여전히 진행중인 작품입니다. 안타깝게도 거기 아무도 전천후 프로토콜없고, 사용하는 가장 적절한 방법을 결정할 때 여러 측면이 고려되어야한다. 여러 가지 처리 전기 자동차에 대한 기술과 개인 검출 또는 비드 기반의 접근 방식을 사용하여 전기 자동차를 분석하는 두 가지 프로토콜은 여기에 표시됩니다. 합리적인 F에서 일반적 상업적 제제 검색된 항체 응집체를 제거에 도움이된다 여기 기재된 방법, 증가하는 신호 대 잡음비, 및 설정 게이트배경 형광 검출을 최소화 ashion. 제 2 프로토콜 캡처 작은 전기차와 엑소 좀을 검출하도록 비드 기반 방식을 사용하는 반면 제 1 프로토콜은 임상 샘플의 대용량 분석에 특히 적합 개별 검출 방법을 사용한다.
Introduction
세포 외 소포 (전기 자동차)는 세포 - 세포 통신에 매우 관여하고 생물학적 과정의 다양한 범위를 조절하는 데 도움이 체액에서 발견 된 작은, 막 유래 소포입니다. 유동 세포 계측법 (FCM)를 사용하여 전기 자동차의 분석은 그들의 작은 크기와 관심의 마커에 대한 긍정적 인 이산 인구의 부족으로 악명 어려웠다. 상당히 지난 10 년 동안 개선하면서 EV 분석하는 방법은, 여전히 진행중인 작품입니다. 안타깝게도 거기 아무도 전천후 프로토콜없고, 사용하는 가장 적절한 방법을 결정할 때 여러 측면이 고려되어야한다. 여러 가지 처리 전기 자동차에 대한 기술과 개인 검출 또는 비드 기반의 접근 방식을 사용하여 전기 자동차를 분석하는 두 가지 프로토콜은 여기에 표시됩니다. 합리적인 F에서 일반적 상업적 제제 검색된 항체 응집체를 제거에 도움이된다 여기 기재된 방법, 증가하는 신호 대 잡음비, 및 설정 게이트배경 형광 검출을 최소화 ashion. 제 2 프로토콜 캡처 작은 전기차와 엑소 좀을 검출하도록 비드 기반 방식을 사용하는 반면 제 1 프로토콜은 임상 샘플의 대용량 분석에 특히 적합 개별 검출 방법을 사용한다.
또한 미세 입자로 알려진 전기 자동차는 세포 - 세포 통신에 관여 생물학적 과정 (1)의 다양한 범위를 조절하는 데 도움이되는 체액에서 발견 된 작은, 막 유래 소포입니다. 4 - 다양 표면 마커 및 / 또는 생물학적 물질의 직접 전사 식을 통해, 전기차가 활성화 또는 세포 간 통신 (2)에서의 역할을 억제하거나 재생받는 세포의 기능을 변경할 수있다. 다른 종양 촉진 metasta에서, 광범위한 조건에 기여하는 것으로 도시되었지만 임상 혈소판 유래 전기차는 강력한 항 응고 활성을 5 것으로 알려진질병 (7)에 대한 보호에 동생 (6). 전기차는 크기와 (8)의 생성 메커니즘에 따라 엑소 좀과 같은 마이크로 소포 (조작량) 등을 세포 유래 소포 작은 범주로 분류 될 수있다. MVS가 100~1000를 클수록 동안 세포 유래 소포 개체군의 명칭이 지속적인 논쟁 -8,9- 화제가되고 있지만, 엑소 좀은 일반적으로 소형으로 세포막과 엔도 좀의 융합으로부터 유도 40~100 nm의 입자를 설명한다 나노 입자들은 세포막의 열 발산에 의해 형성되어있다. 여기서, 일반적인 용어 "전기 자동차"는 세포에 의해 세포 외 방출 생물학적 소체의 모든 유형을 참조하는 데 사용된다.
전혈에서 전기차의 분리 다단계 절차 및 다양한 처리 변수는 보관 온도와 기간 (11, 12), 항응고제 / 방부제를 사용하고 (13)를 포함하여 EV 콘텐츠에 영향을 미치는 것으로 밝혀졌다원심 분리 방법 (14)을 사용했다. 이러한 변수의 표준화에 대한 요구가 혈전증 및 지혈 과학 적절한에 대한 표준화위원회 (ISTH SSC) 혈액 처리 및 EV 격리 절차 15, 16에 대한 국제 사회에 의해 추천되었다, 아직 최적의 프로토콜에 연구자간에 합의가 존재하지 않았다 (12)를 사용합니다. 대부분 미리 엄격하게 제어 변수 분석이 정확하고 재현성에 매우 중요한 데이터 있다는 것이 동의.
전기차를 분석하기 위하여, 연구자들은 22, 23, 20, 21 및 웨스턴 블롯 산란 투과 전자 현미경 (17), 주사 전자 현미경 (18,19), 원자력 현미경, 동적 광을 포함한, 다양한 방법을 이용했다. FCM은 많은 연구자 9,24에 대한 선택의 방법이지만 - 인해 높은 처리 능력을 26, FCM을 사용하여 전기 자동차의 분석은있다32 - 그들의 크기와 이산 긍정적 인 인구 27의 부족으로 어렵기로 악명이 높다. 세포의 분석에 비해 필요가 입자 당 항원의 적은 수로 인해 방출 1) 적은 형광의 전기 자동차 결과의 작은 크기와 후 얼룩 세척 2) 제한된 타당성, 배경 형광을 줄일 수 있습니다. 연구자들 사이 일반적인 문제는 면역 글로불린 집계 (27, 28) 및 항체 (29)의 자체 집계에서 발생하는 신호를 포함한다. 또한, 긴 처리 시간 및 현재 프로토콜 33,34 많은 의해 사용 긴 세척 / 분리 절차는 그들에게 높은 처리량 애플리케이션에 이상적 미만을, 적은 수의 샘플을 분석하기 위해 여러 날 동안의 투입을 요구한다. 일부 연구자들은 정확하게 혈중 알코올 농도를 평가하기위한 형광 물질 하나를 뺀 (FMO)과 항체 이소 타입 쓸모으로 전통적으로 사용 FCM 음성 대조군 렌더링, 모두 세척 단계를 지내다kground 형광 (30).
항체 집계 및 기타 비 소포, 언 바운드 항체를 제거하는 어려움과 식별 할 수있는 긍정적 인 인구의 부족에서 발생하는 신호 : 우리의 프로토콜은 전기 자동차의 적절한 FCM 분석을 방해 할 수있는 세 가지 일반적인 문제를 해결합니다. 여기에 기재된 기술은, 일반적으로 상업적 제제 검색된 항체 응집체를 제거하는 신호 대 잡음비를 증가시키고 배경 형광의 검출을 최소화 합리적인 방식으로 게이트를 설정을 지원한다. 두 개의 서로 다른 검출 방법들이 여기에 제시된다 : 제 2 프로토콜 캡처 작은 전기차와 엑소 좀을 검출하도록 비드 기반 방식을 사용하는 반면 제 1 프로토콜은, 임상 샘플의 대용량 분석에 특히 적합 개별 검출 방법을 사용한다.
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Protocol
참고 : 다음 프로토콜은 인간의 복지에 대한 모든 제도적 국내 및 국제 지침에 따라 수행되고있다. 모든 인간의 주제 샘플은 기관 검토위원회 (IRB)가 승인 한 프로토콜에서와 주제의 동의와 시험 하였다.
1. 방법 A : 개별 탐지 방법
전기 자동차의 혈액 샘플 / 절연 1.1) 처리
- 다음 2 단계 차등 원심 분리 프로토콜을 사용하여 ACD-솔루션 또는 다른 즉시 적절한 항 응고 및 프로세스 (30 분 이내 최대)의 1.5 ml에 포함 된 2 개의 10 ml의 유리 튜브에 기증자 / 환자의 혈액을 그립니다.
참고 :이 프로토콜은 그려진 혈액의 결합 ~ 17 ml의에서 약 10 ml의 혈소판 가난한 플라즈마 (PPP)의를 얻을 것입니다. 다소간 PPP가 필요한 경우, 혈액 수집 튜브의 수는 적절히 조절 될 수있다. - RT에서 10 분 동안 1,500 XG에서 원심 분리버피 코트와 적혈구에서 혈장을 분리합니다. 버피 코트와 붉은 세포를 포함하는 바닥 층을 방해하지 않도록주의, 1.5 ml의 원심 분리기 튜브에 플라즈마 상층 액의 1.2 분취 량을 전송합니다.
- 혈소판 및 대 세포 단편을 제거하기 위해 RT에서 10 분 동안 13,000 XG 스핀. 조심스럽게 펠렛을 방해하지 않도록하고 새로운 튜브에 PPP를 추가하는 200 ㎕를 뒤에 남겨두고, PPP를 전송합니다.
- 이 시점에서, 나중에 분석을 위해 최대 2 년 (개요도 1a를 참조)에 대한 -80 ° C에서 분석하거나 새로운 1.5 ml의 원심 분리기 튜브에 1.0 ml의 분량에 전송 및 저장 즉시 PPP를 사용합니다.
- 정제 전기 자동차는 초 원심 분리기 튜브에 기능 실험, 전송 PPP 6 ml의 필요와 0.2 μm의 필터링 된 인산염 완충 생리 식염수 28 ㎖ (PBS)를 추가하는 경우. 스윙 버킷 로터가 장착 된 초 원심 분리기를 사용하여 실온에서 10 만 XG에 60 분 동안 회전. 기음 뜨는에 resuspend의 EV 펠1.5 ml의 미디어 보자.
참고 : 가장 높은 재현성, 혈액 샘플을 기증자 기증자로 일관하게 처리해야한다. EV 분리 방법에서의 변화는 상당히 상관 검출 전기차의 수 및 유형에 영향을 미칠 수있다.
1.2) 분석을위한 시료 준비
참고 :이 시점에서, 단계 3 패널 14 마커 12 샘플을 분석하기위한 높은 처리량 프로토콜을 설명합니다. 그러나, 다른 항체의 조합이 여기에 사용될 수있다; 프로토콜은 관심있는 사람들을 위해 제안 된 마커를 대체하여 다른 EV 개체군을 연구하기에 적합 할 수있다.
- 37 ° C에서 해동 (-80 ° C에 저장하는 경우) 냉장고에서 12 샘플을 제거합니다.
- 피펫 내용을 위아래로 몇 번 혼합합니다. 각 샘플에서 320 μl를 제거하고 96 웰 플레이트의 맨 위 행에 추가합니다.
참고 : 폭 조절 멀티 웰 피펫이와 엉덩이에 걸쳐 많은 다른 단계에 매우 도움이된다네, 한 번에 여러 샘플을 분석 할 때 특히.
1.3) 염색 EV 샘플
- 염색하기 전에 긍정적 인 신호를 발생할 수있는 집계를 제거하기 위해 모든 항체 (ABS)를 필터링 할 수 있습니다.
- Ab의 혼합물 모두는 필터를 통과 한 결합 항체는 2 분 동안 실온에서 고정 된 각도 단일 고속 원심 분리기 (~ 750 XG)를 사용하여 별도의 0.22 μm의 원심 필터 튜브와 원심 분리기 (3) 각 패널에 사용될 때까지 또는 어떠한 항체 액은 필터의 표면에 잔류하지 않는다. 스토어 구간 최대 2 주 동안 냉장고에 칵테일하지만 다시 필터를 사용하기 전에 각각의 시간.
- 잘 2 행의 각 여과 Ab의 혼합물의 적절한 금액을 추가 (예를 들면, 나는 각 Ab의 2 μL 묻 패널의 샘플은, 그래서 필터링 Ab의 칵테일 12 μL 총 2 행 잘 당 추가됩니다). 제안 된 판지도의 개요에 대해도 1b를 참조하십시오. 이 또한 반복이상의 패널이 실행되는 경우 아래의 행에의 (여기에 잘 사를 행하기 위해 패널 III 칵테일의 3, 11 μL /는 행 8 μL / 웰 패널 II 칵테일의 추가, 특정 패널 정보에 대한 자료 목록 참조).
- 멀티 채널 피펫을 사용하여, 상하 1 행 PPP 샘플들을 혼합하고 혼합 2. 상하 행의 웰에 1 행의 웰에서 100 μl를 옮긴다. 30 분 동안 4 ° C에서 행 3, 4 품어의 행에 1에서 100 μl를 전송 변경 팁과 반복.
1.4) 세척 MV 샘플
- 생물 안전 캐비닛에 96 웰 4 ° C 접시와 전송을 제거합니다. / 잘 행 6-8 PBS의 220 μl를 추가, 멀티 채널 피펫을 사용하여 (/ 린스 스테인드 PPP를 포함하는 우물을 세척에 사용되는).
- 항체의 패널 (3), 12 × 3 = 36 필터 튜브와 함께, 샘플 (12)의 폭 조절이 다중 채널 피펫 (미리 라벨링하여 원심 필터 튜브로 각 웰의 내용물을 옮길 것이다) 필요. 동일한 팁 사용 세척 행에서 PBS 200㎕를 제거하고 PPP 방금 제거 된 대응하는 웰에 추가한다.
- 우물을 씻어 PPP 이전에 추가 된에 동일한 필터로 세척 용액을 전송 아래로 섞는다. 원심 필터의 확대 꼭대기. 변경 팁.
- 모든 스테인드 PPP 샘플을 원심 필터 그들의 린스 솔루션과 함께 전송 될 때까지 남아있는 스테인드 샘플이 과정을 반복합니다.
- RT에서 3 분 동안 850 XG에 고정 된 회 전자 원심 분리기 스핀에 원심 필터를 전송합니다.
참고 : 어떤 액체가 필터 꼭대기에 남아 있는지 확인합니다. 원심 분리 후, 필터는 눈에 보이는 유체 층 위에 남아 없습니다 함께 "건조"로 나타납니다. 가능성이 있지만, 특정 PPP 샘플은 필터를 통해 효과적으로 이동 원심 긴 시간을 필요로 할 수있다. - 원심 필터 튜브를 제거하고 생물 안전 캐비닛으로 돌아갑니다.멀티 채널 피펫을 사용하여 300 ㎕의 PBS에 필터의 상단을 재현 탁. 재현 탁 내용이 즉시 FCM 분석을위한 튜브를 표지가 미리 전송합니다.
주 : 샘플 간 변동을 피하기 위해 샘플 간의 일관성 피펫 플런저 함몰 힘과 수를 유지하는 것이 매우 중요하다. 이 이상적으로 최대 특정 볼륨 아래로 피펫하도록 프로그램 된 전자 피펫을 사용하여 수행해야합니다 (예를 들어, 280 μL), 각 샘플에 대한 시간 (예를 들어, 8 회)의 정확한 숫자.
1.5) 사이토 설치
- FCM 소프트웨어를 엽니 다. , 설정 실험 (제조업체의 지침에 따라) 장비 설정 비즈를 사용하여 매일 계측기 교정 및 설치를 수행하기 전에.
- EV 샘플 하나 이상의 항체로 염색 한 경우 다수의 형광체는 다음과 같이 보정 값을 계산 한번에 측정한다 :
- 이전으로 보상 구슬 2 방울을 추가표지 된 튜브 (각 Fluorochrome과 접합 된 항체 1 관)과 항체의 권장 금액을 추가합니다. 흠 보상 제어로 사용할 다른 튜브에 부정적인 보상 구슬 2 방울을 추가합니다.
- 30 분 동안 4 ° C에서 품어 PBS 400 μL에 PBS와 resuspend에 씻어.
- 기기에 포함되어있는 소프트웨어 흐름 cytometer를 사용하여 각 보상 튜브를 실행하고 5 년간의 로그 스케일에 약 10 4 각 피크를 배치 형광 전압을 조정합니다. 형광 피크가 다른 채널에 비해 자신의 형광 채널에서 가장 높은 (밝은)되어 있는지 확인하고 필요한 경우 다시 형광 매개 변수의 전압을 조정합니다. 각 개별적으로 염색 미리 튜브를 실행하고 튜브 당 최소 5,000 개의 이벤트를 포착 할 수 있습니다.
- 다음 선택 "실험"탭을 선택 "보상"을 모든 샘플에 보정 값을 적용하는 "계산 보상"을 선택합니다.
- 0.22 μm의 필터 PBS의 관을 실행하는 동안, (즉, 단지 이벤트 레이트 5 이벤트 / 초를 상회하는 전압 임계치 아래) 배경 잡음의 대부분을 배제 최고 값 FSC 및 SSC 전압을 조정한다.
- 필요한 경우 PBS에 희석 1.0 ㎛의 비드, - 다음으로, 0.2 ㎛의 함유 튜브를 실행. FCS SSC 대 플롯에서, [㎛ 0.2 내지 1.0 이벤트를 캡처하는 비드 인구 주위에 게이트를 그립니다. 또한, SSC-H의 히스토그램, 1.0 μm의 구슬보다 작은 모든 이벤트를 포함하는 게이트를 그립니다.
- "소호"(약 8 ~ 12 μL / 분)에 계측기의 유량을 설정합니다. 구슬 튜브를 사용 (또는 구슬의 공지 농도를 함유하는 다른 튜브) 직전까지 사이토에 유량을 조절 다이얼NT 속도는 약 200 이벤트 / 초에 도달한다. 같은 유량으로 모든 샘플 튜브를 읽고 그 흐름 속도가 실행 사이의 일관성을 유지하기 위해 미래의 실험에서 동일한 비드 농도를 사용합니다.
- PBS에 희석 무지개 입자의 형광 관을 실행. 5000 이벤트를 취득. FSC, SSC, 각 컬러 채널에 대한 평균 휘도 값을 기록한다. 그 형광 강도 실험 사이의 일관성을 유지하기 위해 미래의 실험에서 전압을 조정하기 위해이 값을 사용합니다.
1.6) 샘플 읽기
- "소호"(약 8 ~ 12 μL / 분)에 계측기의 유량을 설정하고 정확하게 1 또는 2 분 동안 각각의 샘플을 실행합니다.
- 먼저 읽은 후, NP-40 아래 각 샘플, 피펫 최대 10 %의 20 μl를 추가하고, 검출 긍정적 인 이벤트의 공제 할 수 있도록 같은 시간 (1 또는 2 분)에 대해 다시 읽어 동일한 기간 동안 분해 된 샘플.
참고 : 그것은 매우 꼬마 도깨비입니다샘플 피펫보다는 와류로 혼합되는 것이 ortant. 우리의 경험에 비추어 볼 때, 볼텍스 EV-흉내 긍정적 인 이벤트로 이어지는, 일부 항체의 자체 집계가 발생할 수 있습니다. - 일단 모든 샘플 수출이 별도의 파일로 모든 파일 .fcs FCM 분석 소프트웨어를 이용하여 추가 분석에 사용되는, 판독되었다.
1.7) 데이터 분석
- FCM 분석 소프트웨어를 엽니 다. 새로운 실험 파일로 .fcs 파일을 모두 가져옵니다.
- 구슬 전용 튜브를 엽니 다. SSC-A 플롯 대 FSC-A에서 0.2 μm의 1.0 μm의 사이에 크기가 모든 구슬을 문을 그립니다. 이 EV 게이트입니다. 드래그 모든 샘플에 추가 할 수 있습니다.
- 부정적인 컨트롤을 용해 샘플을 사용하여, 사용 된 각각의 형광 채널에서 배경 형광의 가장자리에 문을 그립니다. 해당하는 각 비 용해 샘플의 EV 게이트에 형광 문을 끕니다.
참고 :이 시점에서 그것은 또한 듀얼 형광 이중 매개 변수 플롯을 검사하는 데 유용합니다. 로켓 모양마커는 관련이없는 세포 유형에 존재하는 것으로 알려진 경우 특히 이중 양성 사분면 응집 또는 다른 소포 흉내 낸 사건으로부터 아티팩트를 나타낼 수있다 (도 8 참조). - 각 형광 마커를 들어, 비 - 분해 된 샘플의 이벤트 수와 샘플의 용균 이벤트 수를 뺀다. 선택적 % 양의 값을 얻기 위해 비 용균 EV 게이트 내에 전기차의 총 개수로이 번호를 나눈다.
2. 방법 B : 비즈 방법
전기 자동차의 혈액 샘플 / 절연 2.1) 처리
- (1.1 절) 방법에 설명 된 혈액 처리 방법을 참조하십시오.
2.2) 분석을위한 시료 준비
- 원하는 경우, 엑소 좀과 마이크로 소포에 PPP 또는 ultracentrifuged 전기차를 분별. 0.22 μm의 원심 필터에 PPP 또는 ultracentrifuged 전기 자동차의 250 μl를 추가하고 750 X에서 고정 된 회 전자 원심 분리기 스핀에 전송실온에서 2 분 동안 g.
참고 : 어떤 액체가 필터 꼭대기에 남아 있는지 확인합니다. 원심 분리 후, 필터는 눈에 보이는 유체 층 위에 남아 없습니다 함께 "건조"로 나타납니다. 가능성이 있지만, 특정 샘플은 유체가 필터를 통해 효과적으로 이동하기위한 원심 약간 긴 시간을 필요로 할 수있다. - 2 ㎖에 코팅 6 μm의 폴리스티렌 비즈 (예를 들어, 음의 ABC 구슬) RPMI 매체와 배, 그리고에 resuspend을 씻으십시오. 각 FACS 튜브에 6,000 구슬을 추가합니다. 음성 대조군 튜브에, 구슬 형 RPMI 매체의 400 μl를 추가. 다른 모든 튜브, PPP 또는 ultracentrifuged 전기 자동차 (또는 그 분획물) 200 μL와 RPMI 미디어 200 μl를 추가합니다.
- 미디어 400 μl의 모든 튜브의 최종 볼륨을 조정하고, 진탕 기에서 4 ° C에서 밤새 품어.
- 다음 날 아침, 미디어의 2 ml로 구슬을 씻는다. 뜨는을 대기음.
- 4 ℃에서 3 시간 동안 미디어 (400 μL)에 5 % 소 혈청 알부민 (BSA)으로 차단# 176; 통에 C.
- 미디어의 2 ml로 구슬을 씻으십시오. 배지 100 ㎕에 대기음에 resuspend 펠렛.
2.3) 염색 EV 샘플
- 모든 항체를 필터링합니다. 방법에 사용 된 동일한 항체 패널을 사용하거나, 필요한 경우, 그만큼의 형광체들간에 호환성으로 항체의 상이한 조합을 생성한다.
- 결합 된 항체는 모두 0.22 μm의 필터 원심 튜브에 단일 패널에 사용될 수있다. 2 분 동안 또는 혼합물 구간까지의 모든 각도 고정 된 단일 고속 원심 분리기를 사용하여 원심 분리 필터를 통과 한 어떠한 항체 액은 필터의 표면에 잔류하지 않는다.
- 모든 튜브에 필터링 된 항체 칵테일의 적절한 볼륨을 추가하고 4 ℃에서 30 분 동안 품어.
- 사이토 흐름에 미디어의 400 μL 미디어, 재현 탁 2 ml로 구슬을 세척하고 즉시 실행 (또는 같은 날 내에서).
2.4) 설치 및 샘플 읽기 사이토
- FCM 소프트웨어를 엽니 다. , 설정 실험 (제조업체의 지침에 따라) 장비 설정 비즈를 사용하여 매일 계측기 교정 및 설치를 수행하기 전에.
- EV 샘플 하나 이상의 항체로 염색 한 경우 다수의 형광체는 다음과 같이 보정 값을 계산 한번에 측정한다 :
- 튜브를 표지가 미리 보상 구슬 2 방울 (각 Fluorochrome과 접합 된 항체 1 관)을 추가하고 항체의 권장 금액을 추가합니다. 흠 보상 제어로 사용할 다른 튜브에 부정적인 보상 구슬 2 방울을 추가합니다. 30 분 동안 4 ° C에서 품어 PBS 400 μL에 PBS와 resuspend에 씻어.
- FCM 소프트웨어를 사용하여, 각각의 보상 튜브를 실행하고 5 년간의 로그 스케일에 약 10 4 각 피크를 배치 형광 전압을 조정합니다. 형광 피크가 다른 채널에 비해 자신의 형광 채널 (밝은) 가장 높은 있는지 확인하고필요한 경우 다시 형광 매개 변수의 전압을 조정합니다. 각 개별적으로 염색 미리 튜브를 실행하고 튜브 당 최소 5,000 개의 이벤트를 포착 할 수 있습니다.
- 탭 선택 "실험"다음 "보상"을 선택한 후 "계산 보상"모든 샘플에 보정 값을 적용합니다.
- 규모를 기록하고 각 세포 계수기 (FSC = 200 SSC = 200)에 의해 허용되는 가장 낮은 임계 값을 선택할 수있는 FSC와 SSC 전압 매개 변수를 변경합니다.
- 중항 비즈 인구에 실행 샘플, 게이트 및이 게이트에 2000 이벤트를 취득. 수출 .fcs 파일.
- 파일을 .fcs 분석 FCM 분석 소프트웨어를 사용합니다. 중항 구슬에 문입니다. 각각의 형광 색소에 대한 기하 평균 형광 강도 (MFI)를 계산하고, 음성 대조군의 MFI 비교.
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Representative Results
도 1은 분리 및 비드 기반 방법 또는 개별 검출 방법 중 하나를 사용하여 전기차의 검출을위한 전반적인 프로세싱 방식을 설명. FCM 큰 전기차를 분석 잘 작동하지만 대부분의 세포 계측기 개별적으로 엑소 좀 같이 입자에게 작은을 검출 할 수없는 사용하여 전기 자동차의 개별 감지. 비드 - 기반 접근은 표 1에 요약 된 작은 전기 자동차는, 그러나,이 방법의 사용과 관련된 단점이있다 검출 될 수있다. 일반적으로, (또는 수 크로스 구배 분획 절차의 첨가없이) 초 원심 분리를 사용하여 전기차의 격리는 전기 자동차는 기능 분석에 필요한 경우 추천. 초 원심은 혈청 단백질 및 기능 실험 결과에 영향을 미칠 수있는 플라즈마에서 다른 수용성 오염 물질을 포함하여 불순물을 제거합니다. 그러나, 초 원심은 시간 소모와 EV의 양과 질 (12)을 변경할 수 있습니다.
"> 두 검출법에 대한 예상 결과가 그림 2-3에 묘사되어있다. 해당 비 용해 샘플에 대한 게이트 (맨 윗줄을 설정하는 데 사용되는 각각의 검출 분석, 분해 된 제어 (맨 아래 행, 그림 2)의 경우, 그림 2). 사건의 대부분은 EV 게이트 내에해야합니다. 쿼드런트 게이트 더블 긍정적 인 이벤트를 공개하지 않아야 비교하여 두 개의 마커가 일반적으로 동일한 셀에없는 경우. 그림 2의 오른쪽 biparameter 플롯 마커 CD108a 및 CD235a을 보여 세포에 공존하는 것으로 알려진 두 적혈구 마커 좋으. 여기서, 전기 자동차에서, 예상대로 포지티브 이벤트의 절반 이상, 모두 마커 양성이다. 동일한 방식으로, 공지 된 세포 표면 마커가 동일한 셀에 있도록해야 전기 자동차를 두 번 양성의 유사한 패턴을 보여줍니다. 중앙 biparameter 플롯 세포에 공존 할 수 없습니다 알려진 두 개의 마커의 EV 식을 보여줍니다. CD235a의이 분석에서 (빨간색 (B100)를을D 세포 마커) 및 CD41a (혈소판 마커), 전기차는 다른 세포 유형에서 온 이후 예상되는 구별, 분리, 양성 집단을 나타낸다. 용해 할 때, 긍정적 인 이벤트가 사라집니다. 일반적으로, 분해 후 남아있는 긍정적 인 이벤트는 비 소포 입자 응집체 및 / 또는 세제 내성 전기차에서 오는 신호의 존재를 나타낸다. 비드 기반 검출 방법을 사용하여 예상되는 결과를도 3에 도시도. 각각의 검출 방법과는 달리, 이러한 데이터는 / 양방향 매개 변수 플롯에서 볼 수 없습니다 수 없습니다. 상부 도트 플롯에서, 양 및 음의 집단 사이에 간격이 존재하지 않으며, 이벤트들이 정상적으로 의한 전기차의 두 유형에 결합 할 사실 동일한 유형의 세포에서 발견되지 않는 경우에도 이중 포지티브 사분면에 나타 하나의 구슬. 비드 기반 검출 방법의 경우, 데이터는 최선 (도트 플롯 아래에 도시 됨), 음성 대조군으로 히스토그램 오버레이를 사용하여 분석된다. 긍정의 난마커의 MFI를 (평균 형광 강도)를 사용하여 측정 및 음성 대조군의 것과 비교하여 s를 직접적. 샘플은 당해 마커 긍정적이면, 그 MFI은 음성 대조군보다 더 높을 것이다. 비드 방법에 대한 음성 대조군은 단순히 동일한 항체로 염색하고, EV-코팅 구슬과 함께 세척 된 BSA로 차단 구슬 (더 전기차가 추가되지)입니다. 두 가지 방법을 사용하여 예상 된 결과의 비교는도 4에서 볼 수있다.적절 EV 표현형을 평가하기 개별 검출법의 능력은 배경 형광로부터 AB-포지티브 이벤트를 분리하는 정확한 게이팅에 크게 의존한다. 따라서, 가장 적절하게 모방 / 주어진 샘플에 대한 형광 배경 예측 음성 대조군을 선택하는 것이 중요하다. 스테인드 전기 자동차가 읽기 전에 세척하지 않는 경우, 일반적으로 (예를 들면, 아이소 타입) 정확하게 배경 fluorescenc을 예측하는 데 실패 부정적인 컨트롤을 사용모든 마커 전자 (그림 5A). 세탁 옵션 아닌 경우이 경우에는, 용해 된 샘플은 배경 형광을 예측 잘 작동하는 경향이있다. 스테인드 전기차가 읽기 전에 세척 그러나, 샘플 (도 5A)의 배경 형광을 예측 잘 작동 음성 대조군 (이소 타입 및 용균 샘플) 모두, (이 경우, 원심 여과를 사용하여). 이것은, 그러나, 주목해야들이 (예를 들어, 세제 내성 비 소포 - 관련 이벤트들 및 / 또는 응집물의 존재) 샘플에 대한 추가 정보를 제공하기 때문에 모든 음성 대조군 "작업은, 「용균 컨트롤 바람직 동안 그 해당 비 EV 긍정적 인 신호가 발생할 부적절 Ab의 수를 부풀려 수 있습니다. 염색 표본 일치 이소 제어 항체로 염색 동일한 샘플보다 더 적은 양의 이벤트가도 5b에 도시 된 바와 같이, 또한, 아이소 타입 컨트롤 때로는 심지어 세척 샘플에서, 신뢰성이 없을 수있다. 언 바운드 항체의 철저한 제거하지 않으면, 일부 EV 마커의 FCM 도트 플롯은 희미 형광 입자의 구름들은 높은 형광 배경을 구별로 나타나는, (그림 6, 상단 플롯) 해석하기가 거의 불가능하다. 배경과 긍정적 인 마커 신호 사이의 간격이 원심 필터를 사용하여 스테인드 샘플을 향상 세척 (그림 6, 바닥 플롯); 그러나, 전기 자동차 및 소형 엑소 좀은 필터의 기공을 통해 손실 될 수있다.
세제 용해 공정의 이용은 면역 복합체로부터 긍정적 소포 흉내 낸 이벤트를 드러내고 단백질 21 집계. PPP가 용해와 사라지지 않는 긍정적 인 이벤트가 발생, 개별 검색을 사용하여 분석하면 상당히 자주 발생합니다. 이러한 세제 방지 이벤트가 자주 모두 하나의 매개 변수와 biparameter 플롯에서 의심스러운, 높은 형광 대각선 신호를 표시합니다 (그림7). 임상 적으로, 이들 단백질 복합체 및 / 또는 불용성 면역 복합체는, 예를 들면, 류마티스 성 관절염 28 19 신 증후군, 전신성 홍 반성 낭창 (29) 등의 각종 질병 (21)을 앓고있는 환자를 더 유행이다. 따라서, 연구의 목적에 따라, 하나의 포함 또는 대각선 신호가 특히 분해 시약의 첨가 (도 8) 한 후, 샘플을 볼 텍싱하는 것이다 형성 할 analysis.Another 방식에서 제거 할 수있다. 샘플은 항상 응집체의 형성을 방지하기 위하여 피펫에 의해 상하로 혼합한다.
도 1 : 절연 비드 기반 방법 또는 개별 검출 방법 중 하나를 사용하여 전기차의 검출을위한 전반적인 처리 방식. (A) 전혈은 먼저 PPP로 처리된다. 에서PPP 단리 전기차를 수득 초 원심 분리를 이용하여 추가로 처리되거나 개별 검출 또는 비드 기반 분석에서 그대로 사용될 수 중, 재. 각각의 검출 방법을 이용하여 높은 처리량의 시료 분석을위한 제안 된 플레이트 맵 (B)의 개요. 를 클릭하세요 여기에이 그림의 더 큰 버전을 볼 수 있습니다.
그림 2 :. 개별 탐지에 대한 예상 결과 도트 플롯 유동 세포 계측법은 용해 및 unlysed EV 샘플의 대표 염색을 보여줍니다. 값은 긍정적 인 사건의 비율을 보여줍니다. 이벤트의 대부분은 EV 게이트 내에. 오른쪽 biparameter 플롯에 표시된 이벤트는 왼쪽에 FSC / SSC EV 게이트에 있습니다. 용해 샘플 (맨 아래 줄) 개를위한 형광 기반의 게이트를 설정하는 데 사용됩니다CH (비 용균) 샘플을 대응. 비교에서 두 개의 마커가 일반적으로 동일한 셀에없는 경우 쿼드 게이트 더블 긍정적 인 이벤트를 공개해서는 안된다. 여기에, biparameter의 CD235a 및 CD41a 플롯은 적혈구 세포 마커를 발현하는 전기 자동차 및 그 표현 혈소판 세포 마커 사이에 별개의 분리를 보여줍니다. 마찬가지로, 동일한 셀에 존재하는 것으로 알려진 세포 표면 마커는 전기 자동차에 이중 양성의 유사한 패턴을 보여 주어야한다. 오른쪽 biparameter 플롯은 CD235a 양성 전기 자동차의 절반 이상도 보조 적혈구 (RBC) 마커, CD108a에 대한 긍정적 인 것을 알 수있다. 용해 할 때, 긍정적 인 이벤트가 사라집니다. 용해 후 남은 포지티브 이벤트는 비 소포 또는 세제 입자 내성 및 / 또는 응집체로부터 나오는 신호의 존재를 나타낸다.
그림 3 : 비드 기반 탐지를 사용하여 예상 결과방법. 음성 대조군 역할 BSA로 차단 된 비드에 비해 도트 플롯은, 비드에 결합 된 전기차의 대표적인 염색을 보여 유동 세포 계측법. 값은 긍정적 인 사건의 비율을 보여줍니다. 오른쪽 biparameter 플롯에 표시된 이벤트는 왼쪽에 FSC / SSC 비즈 게이트에 있습니다. 비드 기반 검출 방법의 경우, 데이터는 최선 (도트 플롯 아래에 도시 됨), 음성 대조군으로 히스토그램 오버레이를 사용하여 분석된다. 양성율을 마커의 MFI (평균 형광 강도)를 이용하여 측정하고, 음의 대조군과 직접 비교된다.
그림 4 :. 구슬 대 개별 검색을 사용하여 예상 된 결과의 비교 개별 검출 (아랫 줄)을 사용하여 분석 전기 자동차에 비해, 세포 계측법 플롯 구슬 (맨 위 행)에 결합 된 전기 자동차의 대표 염색을 보여 도트 흐름. 이벤트플롯 왼쪽에 FSC / SSC 비즈 게이트 내에 biparameter 우측에.
그림 5 :. 개별 탐지 분석에서 다른 음성 대조군의 비교 값은 긍정적 인 사건의 비율을 보여줍니다. 표시된 이벤트는 FSC / SSC EV 게이트에 있습니다. 씻지 대에서 음성 대조군의 (A) 비교 샘플을 씻어. 이소 또는 용균 컨트롤 완전히 스테인드 샘플 (아래쪽 열)에서 서로 다른 두 개의 마커에 걸쳐 배경 형광의 적절한 지시를 제공하는 능력을 평가 하였다. 각 마커에 대한 게이츠는 아래 행에 복사 한 후 분해 된 샘플 (맨 윗줄)과를 사용 하였다. 아이소 타입 컨트롤 샘플 WI 염색보다 더 양 이벤트를 갖는 염색의 세척하고 시료 샘플 후의 얼룩을 여과하여 세척 하였다. (B) 실시 예실제 항체를 토륨.
그림 6. 개인 검출 후 얼룩 세척의 효과 표시 비율과 긍정적 인 이벤트의 숫자 값. 표시된 이벤트는 FSC / SSC EV 게이트에 있습니다. 각 샘플에 대한 게이츠 (; 세척 샘플 대 씻지에서 게이트 설정을 위의 그림을 참조하지 않음) 각 시료의 용해 상대를 사용 하였다. 높은 배경 형광 부정적인 이벤트 어렵다 (위 그래프)에서 긍정적 인 구별합니다. 세정시 언 바운드 형광 항체 제거 및 배경 형광 (아래쪽 플롯) 감소됨에 따라, 그러나, 양의 인구 드러난다.
도 7 : 세제 용해 EV 비 (S)의 존재를 확인표시 ignals. 이벤트는 FSC / SCC EV 게이트에 있습니다. 값은 긍정적 인 사건의 비율을 보여줍니다. 스테인드 EV 샘플 이전 (좌측 열) 판독하고, 세제 (우측 칼럼)을 첨가 한 후, 면역 복합체 및 기타 비 EV 관련 이벤트에 의한 긍정적 인 신호를 식별하기.
도 8 : 볼텍스 비 EV 신호의 모양을 나타내는 이벤트 발생 FSC / SCC EV 게이트 내에있다.. 값은 긍정적 인 사건의 비율을 보여줍니다. 스테인드 EV 샘플은 전 (왼쪽 열) 세제 (오른쪽 열)을 첨가 한 후 읽은. 샘플을 혼합하는 소용돌이를 사용하여 EV-모방, 대각선 인구 (맨 윗줄)을 형성하는 원인이 될 수 있습니다. 살짝 위로 피펫을 이용하여 다운 믹스 할 때, 그러나, 이들 집단의 형성 (하단 행)을 피할 수있다. 소용돌이로는이, 레아 일부 시료에서 집계의 원인이 될 수 있습니다, 혼합하지 않는 것이 좋습니다딩은 대각선으로 보이는하고, 긍정적 인 인구. 일반적으로, 긍정적 인 게이트 내에서 이벤트 번호는 용균 후 증가하지 않아야합니다.
| 비드 기반 탐지 | 개인 검출 | |
| EV 크기 | <100 nm의 만 추천 | > 100 nm의 추천 만 |
| 시간 | 하룻밤 배양이 필요합니다 | 일일 <에 완료 할 수 있습니다 |
| 감광도 | 클러스터 검출 | 단일 입자 검출 |
| 결과 | 질적 | 정량적 |
| 세탁 | 간단한 표준 원심 분리 | 원심 필터가 필요합니다 |
| 음성 대조군 | BSA 코팅 구슬 | 용해 샘플 |
표 1 : 프로 모두 검출 방법의 단점.
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Discussion
격리, 치료 및 전기 자동차의 분석을위한 두 개의 서로 다른 프로토콜이 각각 검출 또는 비드 기반의 접근 방식을 사용하여, 발표되었다. 사용하기에 가장 적절한 방법을 선택하는 것은 간단하지 않다 항상 관심 개별 소집단뿐만 아니라 테스트되는 샘플의 이해를 요구한다. 가장 적절한 방법을 선택할 때 또한, 취득 사용 계측기의 감도가 고려되어야한다. 때때로 아니라, 방법의 조합은 혼자 어느 한 방법보다 샘플에 대한 자세한 정보를 제공, 사용하는 최상의 단일 프로토콜이 없습니다. 이상적으로는, 여러 다른 분리 및 검출 기술은 EV 특정 인구가 연구되고 성능에 대하여 고려 사이토 개별 고려한 맞춤형 프로토콜을 개발하기 위해서는 먼저 평가해야한다. 대안 격리 기술은 초 원심 분리, 자당 밀도 분획 화, 면역 자기 B를 포함EAD 분리, 크로마토 그래피, 및 친 화성 정제 (12), 다른 검출 방법은 주사 전자 현미경, 투과 전자 현미경, 원자력 현미경, 동적 광산란 및 웨스턴 블로 팅 (8)를 포함한다. 다른 기술을 조합하여, 여기서 제시된 방법들은 다양한 관심 EV 집단 연구를위한 가장 적합한 프로토콜을 생성하기 위해 적응 될 수있다.
일반적으로, FCM 큰 전기차를 분석 잘 작동하지만 전기 자동차가 작아 질수록 감도를 상실하여 전기 자동차의 개별 감지. 개인 검출이 큰 전기 자동차의 검출에 더 일관성이 있지만, 비드 기반 탐지는 큰 전기 자동차와 엑소 좀 더 민감한 검출에 덜 민감하다. 큰 전기차 포스트 얼룩을 여과를 통해 쉽게 세정 FCM 통해 단독으로 검출 할 수있다. 작은 전기 자동차와 엑소 좀은, 다른 한편으로는, FCM을 사용하여 잘 개별적으로 감지 훨씬 더 어렵 후 얼룩을 씻어 수 있습니다되지 않습니다. 비드 캡처프로토콜은 전기 자동차가 쉽게 세척 할 여러 전기 자동차가 FCM에 의해 검출 큰 긍정적 인 신호를 생성하기 위해 함께 측정 할 수 있도록, 이러한 문제를 모두 해결합니다. 그러나, 표 1에 제시된 바와 같이,이 방법의 사용과 관련된 단점이있다.
덜 민감한 세포 계수기로 작업 할 때, 각각의 감지 능력이 제한됩니다. EV 분석에 앞서, 세포 측정기의 감도는 0.1 ~ 1.0 ㎛의 범위에서 비드 크기의 혼합물을 사용하여 결정되어야한다. 사이토의 실패는 비드 기반 프로토콜의 사용이 수반되지 1.0 μm의 아래 입자의 대부분을 검출한다. 고 표현 마커는 쉽게 하나 프로토콜을 사용하여 감지됩니다. 형광 색소의 밝기, 샘플의 EV : 비드 R 흔하지 인구 비드 포착 프로토콜보다는 단일 입자 검출 프로토콜을 이용하여 검출 할 때로 용이하다, 그러나,이 같은 변수에 따라 달라질 수있다페이지에 계속하고, 희귀 세포 표면 마커를 담지 EV의 크기. 단일 입자에 다수의 마커의 검출은 개별 검출 방법의 사용을 필요로한다. 비드 기반 방법은 개별 EV 검출 할 수 없다. 개별 검출 방법은 정량적 데이터를 제공하면서 따라서 비드 기반 프로토콜은 자연에서 더 질적 데이터를 산출 할 것이다.
전기 자동차가 다운 스트림 애플리케이션에 필요할 때마다 추가 분리 기술은 활용해야합니다. 기능 분석에서 사용되는 전기차는 플라즈마 중의 가용성 혈청 단백질 기능성 실험 결과에 영향을 미칠 수 있기 때문에, 3 단계 차등 원심 분리 프로토콜을 사용 ultracentrifuged한다. 이 추가 단계는 EV 질과 양에 영향을 미칠 수 있기 때문에 전기 자동차의 특성은, 그러나, 초 원심 분리로 인해 입자 (12)에 가해지는 높은 힘을 사용하지 않는 것이 좋습니다.
개별 검출 프로토콜은 S를 포함포함하여 높은 처리량 테스트에 대해 최적화 everal 주요 단계 : Ab의 응집체에 의한 긍정적 인 이벤트 빠르고 효과적으로 제거 원심 필터 1) 구현, 2) 초 원심 자당 구배 분획보다 실용적인 대안으로 필터 사용 EV 샘플 후 염색하고,뿐만 아니라 비 전기 자동차에 의한 긍정적 인 이벤트를 알 수 있지만, 배경 형광의 좋은 근사치 도면에 대한 부정적인 인구 긍정적 구분하기 위해 제공하는 음성 대조군과 같은 세제 용해 3) 활용에서 언 바운드 Ab의 세척을위한 게이트. 개별 검출 프로토콜이 하루에 수행 될 수있는 비드 기반 방법은 밤새 배양을 필요로하는 반면 샘플들의 다수의 테스팅을 필요로 할 때 권장된다.
각 프로토콜에 음성 대조군은 서로 다른 장점과 사용되는 검출 방법에 따라 단점이있다. 비드 기반을 사용하는 한 가지 장점ssay 동일한 모노클로 날 항체 음성 및 양성 튜브를 사용할 수 있고, 같은 음성 대조군은 모든 샘플에 대해 사용될 수 있다는 점이다. 개개의 검출 방법은, 다른 한편으로는, 각각의 테스트 샘플에 대해 판독 될 각각의 제어를 필요로한다. 개별 검출 프로토콜에서 사용 음성 대조군 항체는 추가의 사용 / 소비를 요구하지는 않으나, 각각의 튜브는 용균 화제의 첨가 후 두 번 판독 될 것을 필요로 할 용균 된 샘플을 사용한다. 용해 제어는 면역 복합체 (21)과 같은 비 소포 관련 사건에 기인 할 수있는 양의 신호의 부분을 식별 할 수 있다는 이점도있다. 비드 기반 분석은 긍정적 인 사실 전기 자동차에서 발생하는 신호와 비 소포에서 발생하는 그 사이에이 능력 todistinguish이 없습니다.
기술의 한계
전기차의 분리를위한 표준화 된 방법이 없지만, 차동원심 분리 EV 연구자들 사이에서 널리 사용되는 기술이다. 여기에 설명 된 차등 원심 분리 방법은 10-30 분 동안 10,000-13,000 XG 사이 초 원심 분리 한 후, 통상적으로 10 내지 20 분 세포를 제거하기위한 1,200-1,500 XG 간의 초기 원심 분리를 필요 PPP를 단리 공통 프로토콜에 기초 혈소판 (35)를 제거합니다. 본원에 기재된 프로토콜을 10 분 동안 13,000 XG에 원심 분리를 10 분 동안 1,500 XG에서 원심 분리를 이용한다. 25,000-100,000 XG 높은 힘이 일반적으로 전기차 펠렛 필요하지만, 전기 자동차의 큰 일부는 우리가 제시 차등 원심 분리 프로토콜을 사용하여 제거 될 수있다.
100,000 XG에서 1 시간 초 원심 분리하여 손실 된 FCM에 의해 검출 전기차의 최대 90 % (데이터는 보이지 않음). 이 악영향 시료의 조성에 영향을 미칠 수있는 더 긴 시간은 원심 분리, 조심이라도 고려되어야한다. 추가적인 처리 f를 필요한 경우또는 특성화 연구는 여과 더욱 입자 크기에 기초하여 시료를 분획 (염색 전에) 2 단계 원심 분리 후 수행 될 수있다. 초 원심 마찬가지로, 여과 포지티브 마커 사건의 50 %가 손실 될 수 있고, FCM에 의해 검출 된 전체 입자의 90 % 이하 (데이타 미기재). 신호 대 잡음비의 증가가 분명 유익있는 동안 세정 또는 단리 방법을 고려할 때, 작은 전기차의 손실은 상당한 제한을 나타낸다.
마지막으로, 사용되는 항응고제 (예, 헤파린, ACD는 에틸렌 디아민 테트라 아세트산 (EDTA) 등) 채혈시에는 EV 콘텐츠의 질과 양에 영향을 미칠 수있다. ACD는 우리의 연구 잘하고 안정적인 항응고제 것으로 입증되었지만, 다수의 솔루션을 테스트하는 애플리케이션에 가장 적합한 항응고제가 선택되도록 권장된다. 전기차가 하류 검정법에 사용될 때 특히 중요여기서의 결과에 영향을 미칠 수있는 사용 항응고제. 예를 들어, 어떤 항응고제 (예를 들면, EDTA 및 헤파린) 기타 (예를 들면, 테오필린, 아데노신 및 디피 리다 몰)가 판들 (12)로부터 EV 방출을 억제하는 것으로 하였지만 PCR 반응을 방해하는 것으로 알려져있다.
상당히 지난 10 년 동안 개선하면서 EV 분석하는 방법은, 여전히 진행중인 작품입니다. 궁극적으로, 연구에 따라 달라집니다 전기차 분석을위한 최선의 방법을 실시하고 연구원에 도구를 사용할 수된다.
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Disclosures
저자는 공개 할 관심의 충돌이 없습니다.
Acknowledgments
저자는 장비 설정 사이토 흐름에 그의 도움을 혈액 시스템 연구소에서 데일 Hirschkorn에게 감사의 말씀을 전합니다. NIH에 의해 지원되었다이 작품은 HL095470 및 U01의 HL072268과 국방부 계약 W81XWH-10-1-0023 및 W81XWH-2-0028을 부여합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| LSR II benchtop flow cytometer | BD Biosciences | 3-laser (20 mW Coherent Sapphire 488 nm blue, 25 mW Coherent Vioflame 405 nm violet, and 17 mW JDS Uniphase HeNe 633 nm red) | |
| FACS Diva software | BD Biosciences | PC version 6.0 | |
| FlowJo software | Treestar US | Mac version 9.6.1 or PC version 7.6.5 | |
| Sphero Rainbow fluorescent particles | BD Biosciences | 556298 | used to adjust all channel voltages to maintain fluorescence intensity consistency |
| Ultra Rainbow fluorescent particles | Spherotech | URFP-10-5 | used in addition to Megamix-Plus SSC beads to ensure EV gating consistency from batch to batch |
| Megmix-Plus SSC beads | Biocytex | 7803 | used to adjust FSC and SSC voltages to maintain consistency between runs. Can also used to monitor flow rate and ajust flow rate dial in order to ensure that same flow rate is used in all runs |
| AbC Anti-Mouse Bead Kit | Life Technologies | A-10344 | used for compensation controls & negative AbC beads used for beads-based method |
| Nonidet P-40 Alternative (NP-40) (CAS 9016-45-9) | Santa Cruz | sc-281108 | used in the individual detection method only to lyse samples after initial reading for use as negative controls. Stock may be diluted to 1:10 in PBS and stored in fridge for up to 1 month. |
| BD TruCOUNT Tubes | BD Biosciences | 340334 | used whenver absolute EV concentrations are needed |
| Ultrafree-MC, GV 0.22 µm Centrifugal Filter Units | Millipore | UFC30GVNB | used to post-stain wash Evs and/or fractionate EVs based on size |
| Vacutainer glass whole blood tubes ACD-A | BD Biosciences | 364606 | |
| Facs tubes 12x75 polystrene | BD Biosciences | 352058 | |
| 50 ml Reservoirs individually wrapped | Phenix | RR-50-1s | |
| Green-Pak pipet tips - 10 µl | Rainin | GP-L10S | |
| Green-Pak pipet tips -200 µl | Rainin | GP-L250S | |
| Green -Pak pipet tips - 1,000 µl | Rainin | GP-L1000S | |
| Stable Stack L300 tips presterilized | Rainin | SS-L300S | |
| Pipet-Lite XLS 8 Channel LTS Adjustable Spacer | Rainin | LA8-300XLS | |
| 96 well tissue culture plates | E&K Scientific | EK-20180 | |
| RPMI 1640 Media (without Hepes) | UCSF Cell Culture Facility | CCFAE001 | media used for bead-based detection method |
| Dulbeccos PBS D-PBS, CaMg-free, 0.2 µm filtered | UCSF Cell Culture Facility | CCFAL003 | |
| Ultracentrifuge Tube, Thinwall, Ultra-Clear | BECKMAN COULTER INC | 344058 | |
| PANEL I | |||
| CD3 PerCP-Cy5.5 | Biolegend | 344808 | 2 µl |
| CD14 APC-Cy7 | Biolegend | 301820 | 2 µl |
| CD16 V450 | BD Biosciences | 560474 | 2 µl |
| CD28 FITC | biolegend | 302906 | 2 µl |
| CD152 APC | BD Biosciences | 555855 | 2 µl |
| CD19 A700 | Biolegend | 302226 | 2 µl |
| PANEL II | |||
| CD41a PerCP-Cy5.5 | BD Biosciences | 340930 | 2 µl |
| CD62L APC | Biolegend | 304810 | 2 µl |
| CD108 PE | BD Biosciences | 552830 | 2 µl |
| CD235a FITC | biolegend | 349104 | 2 µl |
| PANEL III | |||
| CD11b PE-Cy7 | Biolegend | 301322 | 2 µl |
| CD62p APC | Biolegend | 304910 | 2 µl |
| CD66b PE | Biolegend | 305106 | 2 µl |
| CD15 FITC | exalpha | X1496M | 5 µl |
| CD9 PE | Biolegend | 555372 | |
| CD63 APC | Biolegend | 353008 | |
| APC-Cy7 Ms IgG2a, κ | Biolegend | 400230 |
References
- Andaloussi, S., Mäger, I., Breakefield, X. O., Wood, M. J. A. Extracellular vesicles: biology and emerging therapeutic opportunities. Nature Reviews Drug Discovery. 12 (5), 347-357 (2013).
- Sugawara, A., Nollet, K. E., Yajima, K., Saito, S., Ohto, H. Preventing platelet-derived microparticle formation--and possible side effects-with prestorage leukofiltration of whole blood. Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 134 (5), 771-775 (2010).
- Théry, C., Ostrowski, M., Segura, E. Membrane vesicles as conveyors of immune responses. Nature Reviews Immunology. 9 (8), 581-593 (2009).
- Mause, S. F., Weber, C. Microparticles Protagonists of a Novel Communication Network for Intercellular Information Exchange. Circulation Research. 107 (9), 1047-1057 (2010).
- Bouvy, C., Gheldof, D., Chatelain, C., Mullier, F., Dogne, J. -M. Contributing role of extracellular vesicles on vascular endothelium haemostatic balance in cancer. Journal of Extracellular Vesicles. 3, (2014).
- Hood, J. L., San, R. S., Wickline, S. A. Exosomes Released by Melanoma Cells Prepare Sentinel Lymph Nodes for Tumor Metastasis. Cancer Research. 71 (11), 3792-3801 (2011).
- Gatti, S., Bruno, S., et al. Microvesicles derived from human adult mesenchymal stem cells protect against ischaemia-reperfusion-induced acute and chronic kidney injury. Nephrology Dialysis Transplantation. 26 (5), 1474-1483 (2011).
- Barteneva, N. S., Fasler-Kan, E., et al.
- Van der Pol, E., Böing, A. N., Harrison, P., Sturk, A., Nieuwland, R. Classification functions, and clinical relevance of extracellular vesicles. Pharmacological Reviews. 64 (3), 676-705 (2012).
- Raposo, G., Stoorvogel, W. Extracellular vesicles: Exosomes, microvesicles, and friends. The Journal of Cell Biology. 200 (4), 373-383 (2013).
- Dinkla, S., Brock, R., Joosten, I., Bosman, G. J. C. G. M. Gateway to understanding microparticles: standardized isolation and identification of plasma membrane-derived vesicles. Nanomedicine (London, England). 8 (10), (2013).
- Witwer, K. W., Buzas, E. I., et al. Standardization of sample collection, isolation and analysis methods in extracellular vesicle research. Journal of Extracellular Vesicles. 2, (2013).
- Shah, M. D., Bergeron, A. L., Dong, J. -F., López, J. A. Flow cytometric measurement of microparticles: Pitfalls and protocol modifications. Platelets. 19 (5), 365-372 (2008).
- Dey-Hazra, E., Hertel, B., et al. Detection of circulating microparticles by flow cytometry: influence of centrifugation, filtration of buffer, and freezing. Vascular Health and Risk Management. 6, 1125-1133 (2010).
- Lacroix, R., Judicone, C., et al. Standardization of pre-analytical variables in plasma microparticle determination: results of the International Society on Thrombosis and Haemostasis SSC Collaborative workshop. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 11 (6), 1190-1193 (2013).
- Mullier, F., Bailly, N., Chatelain, C., Chatelain, B., Dogné, J. -M. Pre-analytical issues in the measurement of circulating microparticles: current recommendations and pending questions. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 11 (4), 693-696 (2013).
- Peramo, P., et al. Physical Characterization of Mouse Deep Vein Thrombosis Derived Microparticles by Differential Filtration with Nanopore Filters. Membranes. 2 (1), 1-15 (2012).
- Tilley, R. E., Holscher, T., Belani, R., Nieva, J., Mackman, N. Tissue Factor Activity is Increased in a Combined Platelet and Microparticle Sample from Cancer Patients. Thrombosis research. 122 (5), 604-609 (2008).
- Rood, I. M., Deegens, J. K. J., et al. Comparison of three methods for isolation of urinary microvesicles to identify biomarkers of nephrotic syndrome. Kidney international. 78 (8), 810-816 (2010).
- Van der Pol, E., Hoekstra, A. G., Sturk, A., Otto, C., van Leeuwen, T. G., Nieuwland, R. Optical and non-optical methods for detection and characterization of microparticles and exosomes. Journal of Thrombosis And Haemostasis: JTH. 8 (12), 2596-2607 (2010).
- György, B., Szabó, T. G., et al. Membrane vesicles, current state-of-the-art: emerging role of extracellular vesicles. Cellular and Molecular Life Sciences. 68 (16), 2667-2688 (2011).
- Miguet, L., Béchade, G., et al. Proteomic Analysis of Malignant B-Cell Derived Microparticles Reveals CD148 as a Potentially Useful Antigenic Biomarker for Mantle Cell Lymphoma Diagnosis. Journal of Proteome Research. 8 (7), 3346-3354 (2009).
- Smalley, D. M., Root, K. E., Cho, H., Ross, M. M., Ley, K. Proteomic discovery of 21 proteins expressed in human plasma-derived but not platelet-derived microparticles. Thrombosis and Haemostasis. 97 (1), 67-80 (2007).
- Lacroix, R., Robert, S., Poncelet, P., Dignat-George, F. Overcoming Limitations of Microparticle Measurement by Flow Cytometry. Seminars in Thrombosis and Hemostasis. 36 (08), 807-818 (2010).
- Mobarrez, F., Antovic, J., et al. A multicolor flow cytometric assay for measurement of platelet-derived microparticles. Thrombosis Research. 125 (3), e110-e116 (2010).
- Van der Pol, E., van Gemert, M. J. C., Sturk, A., Nieuwland, R., van Leeuwen, T. G. Single vs. swarm detection of microparticles and exosomes by flow cytometry. Journal of Thrombosis And Haemostasis: JTH. 10 (5), 919-930 (2012).
- György, B., Szabó, T. G., et al. Improved Flow Cytometric Assessment Reveals Distinct Microvesicle (Cell-Derived Microparticle) Signatures in Joint Diseases. PLoS ONE. 7 (11), e49726 (2012).
- György, B., Módos, K., et al. Detection and isolation of cell-derived microparticles are compromised by protein complexes resulting from shared biophysical parameters. Blood. 117 (4), e39-e48 (2011).
- György, B., Pasztoi, M., Buzas, E. I. Response: systematic use of Triton lysis as a control for microvesicle labeling. Blood. 119 (9), 2175-2176 (2012).
- Trummer, A., De Rop, C., Tiede, A., Ganser, A., Eisert, R. Isotype controls in phenotyping and quantification of microparticles: a major source of error and how to evade it. Thrombosis Research. 122 (5), 691-700 (2008).
- Shet, A. S., Aras, O., et al. Sickle blood contains tissue factor-positive microparticles derived from endothelial cells and monocytes. Blood. 102 (7), 2678-2683 (2003).
- Connor, D. E., Exner, T., Ma, D. D. F., Joseph, J. E. The majority of circulating platelet-derived microparticles fail to bind annexin V, lack phospholipid-dependent procoagulant activity and demonstrate greater expression of glycoprotein Ib. Thrombosis and Haemostasis. 103 (5), 1044-1052 (2010).
- Nolte-’t Hoen, E. N. M., van der Vlist, E. J., et al. Quantitative and qualitative flow cytometric analysis of nanosized cell-derived membrane vesicles. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, And Medicine. 8 (5), 712-720 (2012).
- Van der Vlist, E. J., Nolte-’t Hoen, E. N. M., Stoorvogel, W., Arkesteijn, G. J. A., Wauben, M. H. M. Fluorescent labeling of nano-sized vesicles released by cells and subsequent quantitative and qualitative analysis by high-resolution flow cytometry. Nature Protocols. 7 (7), 1311-1326 (2012).
- Orozco, A. F., Lewis, D. E. Flow cytometric analysis of circulating microparticles in plasma. Cytometry Part A. 77 A. 77A (6), 502-514 (2010).
