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Immunology and Infection

लिस्टेरिया मोनोसाइटोजीन का उपयोग कर संक्रमित चूहों में संस्कृति और हृदय उपनिवेशीकरण में हृदय कोशिकाओं के जीवाणु आक्रमण का आकलन

Published: May 27, 2015 doi: 10.3791/52497
Automatic Translation
1, 1
1Department of Microbiology and Immunology, College of Medicine, University of Illinois at Chicago

Summary

लिस्टेरिया मोनोसाइटोजीन गर्भवती महिलाओं में भ्रूण संक्रमण और अतिसंवेदनशील आबादी में दिमागी बुखार का कारण बनता है। बैक्टीरिया की उपआबादी हृदय ऊतक उपनिवेश कर सकते हैं, रोगियों और प्रयोगशाला जानवरों में मायोकार्डाइटिस के कारण । यहां हम एक प्रोटोकॉल पेश करते हैं जो संक्रमित जानवरों में एल मोनोसाइटोजीन कार्डियक सेल आक्रमण इन विट्रो और कार्डियक उपनिवेशीकरण का आकलन करने का तरीका बताता है।

Abstract

लिस्टेरिया मोनोसाइटोजीन एक ग्राम-सकारात्मक संकाय इंट्रासेलुलर रोगजनक है जो इम्यूनोसमझी रोगियों, बुजुर्गों और गर्भवती महिलाओं में गंभीर आक्रामक संक्रमण पैदा करने में सक्षम है। मनुष्यों में लिस्टेरियोसिस की सबसे आम अभिव्यक्तियों में दिमागी बुखार, इंसेफेलाइटिस और भ्रूण गर्भपात शामिल हैं। आक्रामक एल मोनोसाइटोजीन संक्रमण की एक महत्वपूर्ण लेकिन बहुत कम प्रलेखित अगली कड़ी में दिल शामिल है। हृदय रोग से मृत्यु दर उपचार के बावजूद 35% तक हो सकती है, हालांकि हृदय ऊतक और इसके परिणामस्वरूप विकृतियों के एल मोनोसाइटोजीन उपनिवेशीकरण के बारे में बहुत कम जाना जाता है। इसके अलावा, यह हाल ही में स्पष्ट हो गया है कि एल मोनोसाइटोजीन की उपआबादी में हृदय ऊतक के भीतर आक्रमण और विकास करने की क्षमता बढ़ी है। यह प्रोटोकॉल विट्रो में और वीवो विधियों में विस्तार से वर्णन करता है जिसका उपयोग एल मोनोसाइटोजीन आइसोले के कार्डियोट्रोपिज्म का आकलन करने के लिए किया जा सकता है। ऊतक संस्कृति में H9c2 चूहा कार्डियक मायोब्लास्ट के संक्रमण के साथ-साथ संक्रमित चूहों के दिलों के बैक्टीरियल उपनिवेशीकरण के निर्धारण के लिए विधियां प्रस्तुत की जाती हैं। ये विधियां न केवल संक्रमित जानवरों में हृदय ऊतक को उपनिवेश बनाने की क्षमता के साथ उपभेदों की पहचान करने के लिए उपयोगी हैं, बल्कि जीवाणु जीन उत्पादों की पहचान को भी सुविधाजनक बना सकती हैं जो हृदय कोशिका आक्रमण को बढ़ाने और/या हृदय विकृति में परिवर्तन को चलाने की सेवा करते हैं । इन तरीकों में कई एल मोनोसाइटोजीन उपभेदों के बीच कार्डियोट्रोपिज्म की सीधी तुलना भी प्रदान की गई है।

Introduction

लिस्टेरिया मोनोसाइटोजीन एक ग्राम-पॉजिटिव इंट्रासेलुलर रोगजनक है जो अतिसंवेदनशील आबादी में गंभीर बीमारी पैदा करने में सक्षम है, जिसमें बुजुर्ग, गर्भवती महिलाएं, एचआईवी/एड्स वाले लोग और कीमोथेरेपी प्राप्त करने वाले व्यक्ति शामिल हैं1। इन आबादी में संक्रमण अक्सर दूषित खाद्य उत्पादों को निगलने का परिणाम होता है, और अधिकांश संक्रमण बड़े पैमाने पर खाद्य जनितप्रकोपों 2,3से जुड़े होते हैं। मनुष्यों और अन्य स्तनधारियों में, एल मोनोसाइटोजीन छोटी आंत की एपिथेलियल सीमा के पार स्थानांतरित करने में सक्षम है, इसके बाद जिगर4,5में ले जाया जा रहा है। पशु मॉडल का सुझाव है कि निगलना बैक्टीरिया आंतों विली के भीतर दोहराने और पोर्टल नस के माध्यम से जिगर के लिए पारगमन या रक्त प्रवाह में mesenteric लिम्फ नोड्स के माध्यम से फैल गया, जिगर और तिल्ली६,७के लिए हेमेटोजेनस प्रसार के लिए अग्रणी । जिगर और तिल्ली में, जीवाणु दोनों पेशेवर phagocytes के रूप में के रूप में अच्छी तरह से निवासी parenchymal कोशिकाओं में तेज मध्यस्थता करने में सक्षम है, और जल्दी से इन अंगों के भीतर संक्रमण स्थापित करता है । बैक्टीरियल लोड बढ़ने के साथ, कई बैक्टीरिया रक्त में वापस फैल जाते हैं, जहां वे केंद्रीय तंत्रिका तंत्र और प्लेसेंटा (जहां वर्तमान) सहित अतिसंवेदनशील ऊतकों को आगे उपनिवेश बनाने में सक्षम होते हैं। इन साइटों का उपनिवेशीकरण मनुष्यों में लिस्टिरियोसिस की सबसे आम अभिव्यक्तियों को पहले से ही रोकता है, जिसमें दिमागी बुखार, इंसेफेलाइटिस और भ्रूण गर्भपात2शामिल हैं।

एल मोनोसाइटोजीन के चयनित उपजनसंख्या को हाल ही में हृदय ऊतक8के भीतर आक्रमण करने और दोहराने की क्षमता को दर्शाया गया है । दिल की भागीदारी की अभिव्यक्तियां भिन्न होती हैं, और एंडोकार्डाइटिस और पेरिकार्डाइटिस से लेकर, चालन असामान्यताओं9-13के साथ पूर्ण हो सकती हैं। प्रति वर्ष एल मोनोसाइटोजीन कार्डियक मामलों की कुल संख्या कम है, लेकिन अनुमान लगाया जा सकता है क्योंकि संक्रमण के इस पहलू को आम तौर पर अच्छी तरह से मान्यता प्राप्त नहीं है। रोगजनकों द्वारा दिल के उपनिवेशन को अक्सर मेजबान पूर्वाग्रहों जैसे पूर्व-मौजूदा वाल्वुलर क्षति या कृत्रिम हृदय वाल्व की आवश्यकता होती है। हालांकि, एल मोनोसाइटोजीन के आइसोले हैं जिन्हें पहचाना गया है जो किसी भी हृदय क्षति और/या असामान्यताओं8के अभाव में संक्रमित जानवरों के दिलों को उपनिवेश बनाने की उनकी क्षमता के लिए उल्लेखनीय हैं ।

यहां विट्रो में और विवो तरीकों में संक्रमित जानवरों के भीतर हृदय ऊतक के जीवाणु उपनिवेशीकरण का आकलन करने के लिए वर्णित किया जाता है ऊतक संस्कृति के साथ-साथ जीवित पशु संक्रमणों में आक्रमण परख का उपयोग करके। इन तरीकों से न केवल संक्रमित जानवरों में हृदय ऊतक उपनिवेश की क्षमता के साथ उपभेदों की पहचान करने के लिए उपयोगी साबित हो गया है, लेकिन यह भी जीवाणु जीन उत्पादों की पहचान के लिए उपयोगी होना चाहिए कि हृदय कोशिका आक्रमण को बढ़ाने के लिए सेवा और/ ये विधियां कई उपभेदों के बीच कार्डियोट्रोपिज्म की तुलना को सुविधाजनक करती हैं। यहां वर्णित तरीकों के लिए, एल मोनोसाइटोजीन 10403S का उपयोग एक गैर-कार्डियोट्रोपिक तनाव के अच्छी तरह से अध्ययन किए गए प्रतिनिधि के रूप में किया जाता है और नैदानिक आइसोले 07पीएफ0776 का उपयोग कार्डियोट्रॉपिक तनाव के प्रतिनिधि उदाहरण के रूप में किया जाता है। इन दोनों उपभेदों को विट्रो में हृदय कोशिकाओं के जीवाणु आक्रमण और वीवोमें संक्रमित चूहों के दिलों के उपनिवेशीकरण के लिए तुलना प्रदान करने के लिए चुना गया था । आइसोल्यूज 07पीएफ0776 एक नैदानिक आइसोल्यूज एक हस्तक्षेप से बरामद किया गया है जो एक एचआईवी + रोगी में घातक अतालता का कारण बना है8। एल मोनोसाइटोजीन आइसोलेशन उनकी उग्रता क्षमता में भिन्न हो सकते हैं, और लिटेरिया के लिए इम्यूनोसप्रेसेशन और गर्भवती महिलाओं के साथ व्यक्तियों को संक्रमित करने की प्रवृत्ति को देखते हुए, इन आबादी के भीतर व्यक्तियों को विभिन्न नैदानिक आइसोलिट का आकलन करते समय सावधानी बरतनी चाहिए।

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Protocol

1. एल मोनोसाइटोजीन उपभेदों के लिए भंडारण और संस्कृति की स्थिति

  1. मस्तिष्क-हृदय जलसेक आगर (बीएचआई) को ऑटोक्लेव करके ठोस मीडिया तैयार करें और पिघले हुए मीडिया को पेट्री प्लेटों में डाल दें। प्लेटों को कमरे के तापमान पर रात भर सूखने दें, फिर रात भर फिर से 37 डिग्री सेल्सियस पर।
  2. बाँझ लूप का उपयोग करके, पहले से बने फ्रीजर स्टॉक्स (भे तरल मीडिया में 20% ग्लाइसरोल में निलंबित बैक्टीरिया, -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत) या एक अगर प्लेट से एल मोनोसाइटोजीन का एक छोटा सा नमूना प्राप्त करें जिसमें पहले अलगाव के लिए उपनिवेशों से युक्त कालोनियों से होता है।
  3. aseptic तकनीक का उपयोग करना, एकल कॉलोनी अलगाव के लिए नमूना लकीर। अतिरिक्त कैरी-ओवर को रोकने और मूल्यांकन किए जा रहे तनाव के व्यक्तिगत उपनिवेशों के अलगाव को सुनिश्चित करने के लिए क्रॉस धारियों के बीच लूप को निष्फल करना सुनिश्चित करें। थाली (1) रात भर 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
  4. बाँझ लूप का उपयोग करके, 14 मिलीलीटर पॉलीस्टीरिन ट्यूब में अलग-थलग और 2 मिलीलीटर बीएचआई शोरबा (एगर के बिना) की एक कॉलोनी को हटा दें।
  5. परख और संक्रमण के लिए, शोरबा संस्कृति को स्थिर रूप से (बिना मिलाए) 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में रात भर इनक्यूबेट करें। सुसंस्कृत आइसोलेट के मोजा के लिए, रात भर 180-200 आरपीएम पर मिलाते हुए 37 डिग्री सेल्सियस पर शोरबा संस्कृति को इनक्यूबेट करें। संस्कृतियों को 20% की अंतिम एकाग्रता में ग्लाइसरोल जोड़कर और अनिश्चित काल के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर सीलबंद ट्यूबों को संग्रहीत करके स्टॉक किया जा सकता है।

2. H9c2 कार्डियक मायोब्लास्ट जैसी कोशिकाओं के भंडारण और संस्कृति की स्थिति

  1. H9c2 कोशिकाओं के जमे हुए स्टॉक की खरीद या प्राप्त करें, साथ ही ड्यूबेल्को के संशोधित ईगल के माध्यम (डीएमईएम) जिसमें उच्च ग्लूकोज और पाइरुवेट, भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस), एल-ग्लूटामाइन (भरमार), और पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन-ग्लूटामाइमिन मिश्रण (पीएसजी) शामिल हैं।  एफबीएस, ग्लूट और पीएसजी को -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टॉक किया जाना चाहिए, जबकि डीएमईएम को 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है। यह ठंड से पहले 50 मिलीलीटर शंकु ट्यूबों में एफबीएस को अलीकोट करने में सहायक है।
  2. एक लैमिनार फ्लो हुड में, एफबीएस के दो एलिकोट्स गल गए। डीएमईएम की एक 500 मिलीलीटर बोतल में एक एलिकोट जोड़ें, जिससे 10% एफबीएस/डीएमईएम मिश्रण बन जाए। इसके लिए 6 मिलीलीटर भरमार डालें और परिणामी समाधान को 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टॉक करें। इस समाधान को "एंटीबायोटिक दवाओं के बिना DMEM" लेबल किया जा सकता है। (डीएमईएम -एबी)
  3. डीएमईएम की एक दूसरी 500 मिलीलीटर की बोतल में, एफबीएस के अन्य 50 मिलीलीटर एलिकोट जोड़ें। इस घोल में 6 मिली लीटर पीएसजी और स्टॉक को 4 डिग्री सेल्सियस पर डालें। इस समाधान को "एंटीबायोटिक दवाओं के साथ DMEM" लेबल किया जा सकता है। (DMEM +Ab)
  4. जबकि लैमिनार हुड में, डीएमईएम +एबी के 10 मिलीलीटर को हटा दें और 25 मिलीलीटर ऊतक संस्कृति फ्लास्क में रखें।
  5. लैमिनार हुड में फ्लास्क छोड़कर, तरल नाइट्रोजन में भंडारण से H9c2 कोशिकाओं के एक जमे हुए aliquot को हटा दें और संस्कृति के गल जाने तक ट्यूब को 37 डिग्री सेल्सियस पानी स्नान में जल्दी से रखें।
  6. साफ करने के लिए 70% इथेनॉल के साथ ट्यूब स्प्रे करें, फिर हुड पर लौटें। केंद्रित डीएमएसओ में सेल समय को कम करने के लिए जल्दी से काम करना, डीएमईएम + एबी के 10 मिलीलीटर में कोशिकाओं का पूरा एलिकोट जोड़ें।  यह रातोंरात सेल व्यवहार्यता और पालन के लिए पर्याप्त रूप से DMSO पतला ।
  7. फ्लास्क को टिश्यू-कल्चर इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस, 5% C02,और 95% आर्द्रता रात भर रखें।
  8. अगले सुबह, पालन सुनिश्चित करने के लिए सेल परत की जांच करें। कोशिकाओं की संभावना इस समय तक 80-100% के बीच होगा ।
  9. ऊतक-संस्कृति हुड में, वैक्यूम का उपयोग करके फ्लास्क के भीतर निहित मीडिया को हटा दें, केवल फ्लास्क के भीतर कोशिकाओं को छोड़ दें।
  10. कोशिकाओं में लगभग 2 मिलीलीटर 0.25% ट्रिप्सिन-ईडीटीए जोड़ें और लगभग 3 सेकंड के लिए धीरे-धीरे रॉक करें।
  11. फ्लास्क को इस तरह पलटें कि ट्राइप्सिन समाधान अब मोनोलेयर के संपर्क में नहीं है, और वैक्यूम द्वारा ट्राइप्सिन को हटा दें।
  12. कोशिकाओं में ट्राइप्सिन का एक दूसरा 2 मिलीलीटर एलिकोट जोड़ें, और फ्लास्क को एक उल्टे माइक्रोस्कोप में ले जाएं। मोनोलेयर को तितर-बितर करने के लिए फ्लास्क को धीरे-धीरे कमाल करते हुए कोशिकाओं का निरीक्षण करें।
  13. एक बार मोनोलेयर तितर-बितर होने के बाद, तुरंत ऊतक संस्कृति हुड पर लौटें और सेल निलंबन में 4 मिलीलीटर डीएमईएम + एबी जोड़ें।
  14. सेल सस्पेंशन के 2 मिली हिस्से को हटा दें, और इसे 50 मिलीलीटर टिश्यू कल्चर फ्लास्क में जोड़ें जिसमें 23 मिलीलीटर डीएमईएम + एबी शामिल हैं। फ्लास्क को धीरे-धीरे रॉक करें, फिर इसे स्टेप 2.5 में सूचीबद्ध शर्तों में टिश्यू-कल्चर इनक्यूबेटर में रखें।
  15. कोशिकाओं को दैनिक जांचें जब तक कि वे लगभग 80% संगम तक न पहुंच जाएं (लगभग 2.0-4.0 x10 5 कोशिकाएं प्रति मिलीलीटर)। यह बहुत महत्वपूर्ण है कि कोशिकाएं बहुत ही संकुचित न हो जाएं, क्योंकि वे14 के समय की लंबी अवधि के लिए एफबीएस के भूखे होने पर कंकाल मांसपेशी मायोट्यूब में अंतर कर सकती हैं और यह भेदभाव बैक्टीरियल आक्रमण को बदल सकता है।  कोशिकाओं की सावधानी से निगरानी करें और कोशिकाओं की एक नई ट्यूब के साथ शुरू करें यदि कोई संस्कृति संकुचित हो जाती है।
  16. एक बार कोशिकाओं को ८०% संगम तक पहुंचने, वे या तो एक और ५० मिलीलीटर कुप्पी में पारित किया जा सकता है के रूप में सिर्फ वर्णित है, या आक्रमण परख के लिए तैयार किया ।

3. आक्रमण परख के लिए H9c2 कोशिकाओं की तैयारी

  1. ऊतक संस्कृति हुड में, H9c2 कोशिकाओं के 50 मिलीलीटर फ्लास्क से मीडिया को हटा दें जो वैक्यूम आकांक्षा का उपयोग करके 80% संगम तक पहुंच गए हैं।
  2. मोनोलेयर में 0.25% ट्राइप्सिन-ईडीटीए समाधान के 4 मिलीलीटर जोड़ें और वैक्यूम आकांक्षा का उपयोग करके तुरंत हटा दें।
  3. फ्लास्क में 0.25% ट्राइप्सिन-ईडीटीए का एक और 4 मिलीलीटर हिस्सा जोड़ें और मोनोलेयर के फैलाव का निरीक्षण करने के लिए फ्लास्क को एक उल्टे माइक्रोस्कोप में ले जाएं।
  4. एक बार कोशिकाओं को तितर-बितर कर दिया है, हुड पर लौटने और कोशिकाओं के लिए DMEM -Ab के 4 मिलीलीटर जोड़ें । समाधान को ऊपर और नीचे पाइपिंग करना फ्लास्क के नीचे से कोशिकाओं को पूरी तरह से हटाना सुनिश्चित करता है।
  5. मोनोलेयर के पुनः पश्चाताप के बाद, निलंबन के सभी को हटा दें और इसे 50 मिलीलीटर शंकु नली में रखें।
  6. इस निलंबन के 20 उल भाग को हटा दें और एक हीमोसाइटोमीटर का उपयोग करके प्रति मिलीलीटर कोशिकाओं की संख्या गिनें।
  7. एक बार समाधान में कोशिकाओं की एकाग्रता निर्धारित हो जाने के बाद, ताजा डीएमईएम -एबी में सेल समाधान की उचित मात्रा जोड़कर एकाग्रता को2.25 x 10 4 कोशिकाओं/एमएल में समायोजित करें। समायोजित समाधान की कुल मात्रा 25 मिलीलीटर होनी चाहिए।
  8. हुड में रहते हुए, ग्लास कवरलिप को 90% इथेनॉल में डुबोकर और प्रत्येक कवरस्लिप को लौ के माध्यम से संक्षेप में पारित करके। एक व्यक्ति को अच्छी तरह से एक व्यक्ति को अच्छी तरह से जोड़ें अच्छी तरह से ऊतक संस्कृति का इलाज प्लेट सीधे के बाद यह निष्फल है ।
  9. सभी कुओं के बाद एक व्यक्तिगत कवर्लिप है, थाली में कुओं में से प्रत्येक के लिए पतला सेल समाधान के 1 मिलीलीटर जोड़ने के लिए एक 25 मिलीलीटर पिपेट का उपयोग करें, और एक बाँझ सुई के साथ नीचे प्रत्येक कवरलिप धक्का ।
  10. प्रत्येक अच्छी तरह से कोशिकाओं की समान मात्रा सुनिश्चित करने के लिए एक उल्टे माइक्रोस्कोप का उपयोग कर प्रत्येक अच्छी तरह से जांच करें । ऊतक संस्कृति इनक्यूबेटर में 24 अच्छी तरह से थाली 5% सीओ2 और 95% आर्द्रता में 37 डिग्री सेल्सियस पर रात भर रखो।
  11. अगली सुबह, प्रत्येक को अच्छी तरह से देखें ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि कवरस्लिप में अनुयायी मायोब्लास्ट की तुलनीय मात्रा है और कवरस्लिप अच्छी तरह से तैर नहीं रहे हैं।

4. आक्रमण परख के लिए एल मोनोसाइटोजीन के उपभेदों की तैयारी

नोट: सभी प्रयोगशाला कार्य सीडीसी जैवसेफ्टी स्तर 2 दिशानिर्देशों के अनुसार किया जाता है।

  1. परख के लिए 24-अच्छी प्लेट तैयार करने के बाद, जीवाणु आक्रमण के लिए जांच की जाने वाली उपभेदों की एकल उपनिवेशों को हटाने के लिए एक निष्फल लूप का उपयोग करें और प्रत्येक को 2 मिलीलीटर बीएचआई शोरबा वाले व्यक्तिगत 14 मिलीलीटर ट्यूबों में टीका लगाएं।
  2. टीका लगाए गए ट्यूबों को 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में रखें जो 45 डिग्री पर झुका हुआ है और रात भर स्थिर रूप से (बिना हिलाए) इनक्यूबेट करें।
  3. अगले सुबह, बैक्टीरिया के एक समान निलंबन सुनिश्चित करने के लिए संक्षेप में इनक्यूबेटर और भंवर से संस्कृति ट्यूब को हटा दें।
  4. 600 एनएम तरंगदैर्ध्य पर स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग करके संस्कृति के ऑप्टिकल घनत्व को मापें। ऑप्टिकल घनत्व पढ़ने से पहले बाँझ बीएचआई शोरबा का उपयोग कर स्पेक्ट्रोफोटोमीटर शून्य करने के लिए सुनिश्चित करें।
  5. एल मोनोसाइटोजीन केलिए, ऑप्टिकल घनत्व सीधे प्रति मिलीलीटर बैक्टीरिया की एकाग्रता से संबंधित है, जैसे कि 1.000 = 1.0 x 109 9 सीएलयू प्रति मिलीलीटर का घनत्व।
  6. 2.25 x 106 (एमओआई = 100) के साथ 2.25 x 104 कोशिकाओं को संक्रमित करने के लिए आवश्यक संस्कृति की मात्रा की गणना करें।
  7. संस्कृति की आवश्यकता की मात्रा को हटा दें और इसे 1.5 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब में रखें।
  8. 3 मिनट के लिए 19,000 x ग्राम पर संस्कृति स्पिन, तो सुपरनैंट त्यागें। ट्यूब के होंठ पर अटक अतिरिक्त मीडिया को हटाने के लिए एक कागज तौलिया के खिलाफ ट्यूब के खुले अंत नल ।
  9. पर्याप्त मिश्रण सुनिश्चित करने के लिए 1 मिलीलीटर बाँझ पीबीएस और भंवर में बैक्टीरिया को फिर से खर्च करें। इस मिश्रण में लगभग 2.25 x 106 सीएलयू प्रति 20 उल (1.125 x 108 सीएलयू/एमएल) होना चाहिए।

5. आक्रमण परख प्रदर्शन

  1. आक्रमण परख से एक दिन पहले, धारा 3 में वर्णित H9c2 कोशिकाओं की 24-अच्छी प्लेटें तैयार करें, और धारा 4 में वर्णित लिस्टेरिया के वांछित तनाव (ओं) के साथ बाँझ भि शोरबा भी टीका करें।
  2. धारा 4 में प्रोटोकॉल का उपयोग करते हुए, आक्रमण के लिए मूल्यांकन किए जाने वाले उपभेदों की पीबीएस-पुनर्संरित संस्कृतियों को तैयार करें। नोट: संक्रामक टाइटर का मूल्यांकन इस बिंदु पर ठोस मीडिया पर प्रत्येक नमूने के कमजोर पड़ने और रात भर इनक्यूबेशन के बाद गणना कालोनियों की गणना करके किया जा सकता है।
  3. 24-अच्छी तरह से प्लेट के व्यक्तिगत कुओं में पीबीएस-बैक्टीरिया समाधान के कम से कम 20 उल लोड करें। ध्यान दें कि प्रत्येक तनाव के लिए कम से कम तीन व्यक्तिगत कुओं की आवश्यकता होती है ताकि त्रिपालेट में परिणाम प्राप्त किया जा सके, इसलिए 8 उपभेदों का मूल्यांकन मिलकर किया जा सकता है।
  4. बैक्टीरिया के साथ कुओं लोड करने के बाद, धीरे-धीरे प्लेट को रॉक करने के लिए अच्छी तरह से भीतर प्रत्येक नमूने के समरूप प्रसार को प्रोत्साहित करने के लिए, और 24-अच्छी तरह इनक्यूबेशन से प्लेट को 37 डिग्री सेल्सियस और 95% आर्द्रता पर 37 डिग्री सेल्सियस और 95% आर्द्रता पर 45 मिनट के लिए इनक्यूबेटर में वापसरखें।
  5. इस इनक्यूबेशन के दौरान, डीएमईएम -एबी (धारा 2) का एक एलिकोट तैयार करें, बस 25 मिलीलीटर डीएमईएम -एबी को हटाकर और इसे 50 मिलीज़ल फाल्कन ट्यूब (या समकक्ष) में रखकर।
  6. 25 मिलीलीटर DMEM-Ab aliquot में 15 यूजी/एमएल (50 मिलीग्राम/मिलीलीटर स्टॉक समाधान के 7.5 उल) की एकाग्रता के लिए gentamicin जोड़ें। 45 मिनट की अवधि के लिए डीएमईएम -एबी +जेंट समाधान को 37 डिग्री सेल्सियस वाटरबाथ में रखें इनक्यूबेशन।
  7. अलीकोट 25 मिलीलीटर पीबीएस को 50 मिली फाल्कन ट्यूब में और 45 मिनट इनक्यूबेशन के दौरान 37 डिग्री सेल्सियस वाटरबाथ में रखें।
  8. 45 मिनट इनक्यूबेशन पूरा होने के बाद 24 अच्छी प्लेट निकालकर हुड में रख दें। वैक्यूम आकांक्षा द्वारा प्रत्येक अच्छी तरह से बैक्टीरिया युक्त मीडिया को हटा दें, विभिन्न उपभेदों के बीच ग्लास पिपेट टिप्स बदलें।
  9. कोशिकाओं की सतह से शिथिल-अनुयायी बैक्टीरिया को धोने के लिए प्रत्येक अच्छी तरह से लगभग 1 मिलीलीटर पीबीएस जोड़ें, फिर वैक्यूम आकांक्षा का उपयोग करके पीबीएस को हटा दें।
  10. पीबीएस को पूरी तरह से हटाने के बाद, प्रत्येक कुएं में 1 मिलीलीटर डीएमईएम -एबी +जेंट जोड़ें। जेंटामिसिन केवल उन बैक्टीरिया को मार डालेगा जो कोशिकाओं के बाहर रहते हैं, इस प्रकार जो इंट्रासेलुलर हैं, वे व्यवहार्य रहेंगे।
  11. 24-अच्छी प्लेट को इनक्यूबेटर में वापस रखें और एक अतिरिक्त घंटे के लिए इनक्यूबेट करने की अनुमति दें।
  12. घंटे भर के इनक्यूबेशन के दौरान, प्रत्येक ट्यूब में 1 मिलीलीटर बाँझ डीडीएच20 जोड़कर 14 मिलीलीटर पॉलीप्रोपाइलीन ट्यूब तैयार करें। प्रत्येक कवरस्लिप के लिए एक ट्यूब की आवश्यकता होगी, इसलिए एक 24-अच्छी प्लेट के लिए, कुल 24 ट्यूब तैयार करें।
  13. घंटे भर की इनक्यूबेशन के बाद, इनक्यूबेटर से 24 अच्छी तरह से प्लेट को हटा दें और इसे हुड में रखें, साथ ही चरण 5.12 में तैयार ट्यूबों के साथ।
  14. बाँझ चिमटी का उपयोग करना, अपने संबंधित अच्छी तरह से प्रत्येक कवरस्लिप को हटा दें और इसे तुरंत एक व्यक्तिगत ट्यूब में रखें। इथेनॉल में चिमटी को डुबोना सुनिश्चित करें और संदूषण को रोकने के लिए उन्हें प्रत्येक कवरस्लिप के बीच लौ करें।
  15. सभी कवरस्लिप को हटा दिया गया है और अलग-अलग ट्यूबों में रखा गया है, 24-अच्छी प्लेट को त्यागें।
  16. बेंच पर लौटें और 5-10 सेकंड के लिए प्रत्येक ट्यूब भंवर।
  17. प्रत्येक ट्यूब से एक भाग निकालें और प्रत्येक नमूने को 96-अच्छी प्लेट के एक व्यक्ति कुएं में रखें, फिर 1:10 कमजोर पड़ने तक 1:10 कमजोर पड़ने का उपयोग करके प्रत्येक नमूने को क्रमिक रूप से पतला करें।
  18. पूर्वनियोजित और सूखी पौंड प्लेटों का उपयोग करना, आगर प्लेटों पर कमजोर पड़ने श्रृंखला के प्रत्येक स्पॉट प्लेट । प्रत्येक नमूने की कमजोर पड़ने वाली श्रृंखला से 5-10 माइक्रोन स्पॉट प्लेट करने के लिए एक मल्टीचैनल पिपेट का उपयोग किया जा सकता है।
  19. इसके अलावा प्रत्येक बिना पतला अच्छी तरह से और हाजिर थाली से 20 μl नमूनों को हटा दें इस राशि को सीधे कमजोर पड़ने श्रृंखला से एक अलग थाली पर पौंड आगर पर । (इस बड़ी मात्रा का उपयोग खराब आक्रामक उपभेदों की गणना करने के लिए किया जा सकता है)।
  20. सभी नमूनों को स्पॉट प्लेटेड किए जाने के बाद, कवर्लिप युक्त 14 मिलीलीटर ट्यूबों को त्यागें। पैराफिल्म 96-वेल प्लेट और यदि आवश्यक हो तो इसे रिपलेटिंग के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर फ्रीजर बॉक्स में रखें।
  21. धब्बे पूरी तरह से सूखने दें। प्लेटों को हुड में रखकर और ढक्कन को हटाकर इस प्रक्रिया को बहुत जल्दी किया जाता है।
  22. धब्बे सूखने के बाद प्लेटों को रात भर 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में रखें।
  23. अगली सुबह, कमजोर पड़ने वाली श्रृंखला के प्रत्येक स्थान में कालोनियों की संख्या की गणना करें जिसके लिए कॉलोनी संख्याओं को आसानी से मूल्यांकन किया जा सकता है (लगभग 5 और 50 कॉलोनियों के बीच)(चित्र 1),और मूल्यांकन किए गए प्रत्येक तनाव के लिए बैक्टीरियल प्रति कवरलिप की संख्या की गणना करने के लिए श्रृंखला का उपयोग करें।

6. माउस संक्रमण के लिए एल मोनोसाइटोजीन के उपभेदों की तैयारी

  1. संक्रमण से पहले रात, वांछित उपभेदों की एकल उपनिवेशों को हटाने के लिए एक निष्फल लूप का उपयोग करें और प्रत्येक को व्यक्तिगत 14 मिलीलीटर ट्यूबों में टीका लगाएं जिसमें 2 मिलीलीटर बीएचआई शोरबा होता है।
  2. टीका लगाए गए ट्यूबों को 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में रखें जो 45 डिग्री पर झुका हुआ है और रात भर स्थिर रूप से (बिना हिलाए) इनक्यूबेट करें।
  3. अगले सुबह, बैक्टीरिया के एक समान निलंबन सुनिश्चित करने के लिए संक्षेप में इनक्यूबेटर और भंवर से संस्कृति ट्यूब को हटा दें।
  4. 600 एनएम तरंगदैर्ध्य पर स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग करके संस्कृति के ऑप्टिकल घनत्व को मापें। ऑप्टिकल घनत्व पढ़ने से पहले बाँझ बीएचआई शोरबा का उपयोग कर स्पेक्ट्रोफोटोमीटर शून्य करने के लिए सुनिश्चित करें। (एल मोनोसाइटोजीन केलिए, ऑप्टिकल घनत्व सीधे प्रति मिलीलीटर बैक्टीरिया की एकाग्रता से संबंधित है, जैसे कि 1.000 = 1.0 x 109 एमएल प्रति एमएल का घनत्व)
  5. प्रत्येक जानवर को संक्रमित करने के लिए आवश्यक संस्कृति की मात्रा की गणना करें। इंजेक्शन में आम तौर पर एक व्यक्तिगत तनाव के 10,000 सीएलयू के साथ पीबीएस के 200 माइक्रोन होते हैं, जो 5.00 x 104 सीएलयू/एमएल की वांछित एकाग्रता में अनुवाद करता है।
  6. प्रत्येक अंतिम कमजोर पड़ने का एक 5 μl aliquot निकालें और यह सीधे पौंड आगर पर प्रसार प्लेट ।  टीका लगाने के लिए उपयोग की जाने वाली एकाग्रता की पुष्टि करने के लिए रात भर 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
  7. पतला करने के 1 घंटे के भीतर प्रत्येक सीएलयू निलंबन इंजेक्ट (नीचे देखें)।

7. पूंछ नस इंजेक्शन के माध्यम से चूहों में एल मोनोसाइटोजीन का इनोकुलेट करना और यकृत, तिल्ली और दिल के भीतर बैक्टीरियल बोझ का आकलन करना

नोट: सभी पशु कार्य सीडीसी बायोसेफ्टी स्तर 2 दिशानिर्देशों के अनुसार किया जाता है।  चूहों को आम तौर पर एक सप्ताह पहले आदेश दिया जाता है और पिंजरे के प्रति 5 जानवरों के साथ एक साथ बंदी की जाती है। चूहों को इंजेक्शन से पहले चार दिनों के लिए नई प्रयोगशाला पर्यावरण के लिए acclimate करने की अनुमति है । इन प्रयोगों का इस्तेमाल किया 6-8 सप्ताह पुरानी महिला स्विस-वेबस्टर चूहों कि एक बाधा वातावरण में एक पिंजरे के लिए 5 रखे गए थे और एक गैर प्रतिबंधित आहार खिलाया ।

  1. ढक्कन और भोजन/पानी के डिब्बे को हटाकर एक बार में चूहों का एक पिंजरा तैयार करें और पिंजरे को पांच मिनट के लिए हीट लैंप के नीचे रखें । यह प्रक्रिया पूंछ की नसों को फैलाने की अनुमति देती है, जिससे इंजेक्शन को प्रदर्शन करना आसान हो जाता है।
  2. इंजेक्शन के दौरान जानवर को नियंत्रित करने के लिए एक जानवर को निकालें और इसे एक दोहन (या अंत कट ऑफ के साथ फाल्कन ट्यूब) में रखें।
  3. एक शराब पैड का उपयोग कर इंजेक्शन साइट को साफ करें, और शराब को वाष्पित होने दें। यह न केवल साइट को शुद्ध करता है, बल्कि पूंछ की नस को भी फैलाता है।
  4. 27.5 गेज सुई से लैस 1 मिलीलीटर सिरिंज का उपयोग करके, धीरे-धीरे माउस को पूंछ नस में वांछित संस्कृति के 200 माइक्रोन के साथ इंजेक्ट करें।
  5. इंजेक्शन के परिणामस्वरूप होने वाले किसी भी रक्तस्राव को रोकने के लिए एक धुंध का उपयोग करें, और जानवर को एक ताजा पिंजरे में रखें।
  6. शेष जानवरों और उपभेदों के लिए इस प्रक्रिया को दोहराएं। जानवरों के प्रत्येक पिंजरे को उनके द्वारा प्राप्त तनाव के साथ लेबल करना सुनिश्चित करें।
  7. दैनिक जानवरों पर जांचें, किसी भी जानवर को हटाने और त्याग जो बीमार दिखाई देते हैं।  यदि कोई जानवर बीमारी के लक्षण प्रदर्शित नहीं करता है, तो सभी जानवरों का त्याग करने से पहले संक्रमण को 72 घंटे तक आगे बढ़ने की अनुमति दें।
  8. बलिदान करने के लिए, एक बोतलबंद स्रोत से सीओ2 संज्ञाहरण का उपयोग करें जब तक कि सभी श्वसन बंद नहीं हो जाते, फिर यह आश्वस्त करने के लिए कि जानवर मर चुका है, गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था का उपयोग करें।
  9. बलिदान के बाद, विच्छेदन के लिए जानवरों को एक ऊतक संस्कृति हुड में ले जाएं।
  10. विच्छेदन ब्लॉक का उपयोग करके, जानवर के प्रत्येक पैर को बड़े गेज सुइयों के साथ पिन करें और जानवर को 70% इथेनॉल के साथ स्प्रे करें जब तक कि यह संतृप्त न हो जाए।
  11. वाई के आकार के चीरा का उपयोग करके पेट और छाती की त्वचा को काटें जो योनि से xiphoid प्रक्रिया तक फैली हुई है, फिर प्रत्येक हाथ के एक्सिला तक प्रगति करती है।
  12. त्वचा को वापस खींचें और विच्छेदन को खुला रखने के लिए प्रत्येक पैर से सुइयों को हटा दें।
  13. पेरिटोनम के माध्यम से धीरे-धीरे काटें, आंतों, पेट, यकृत और तिल्ली को उजागर करें।
  14. सबसे पहले जिगर के शीर्ष पर हेपेटिक नस और कोरोनल स्नायु को काटने से, जिगर को दूर करना शुरू करें। हटाए जाने वाले अतिरिक्त लिगामेंट्स लिवर के नीचे पाए जाते हैं, इसे छोटी आंत के पहले भाग से जोड़ते हैं, साथ ही पीठ की मांसपेशियों को भी जोड़ते हैं।
  15. लिवर को 5 मिली डस्टाइल डीडीएच2 0में 50 एमएल फाल्कन ट्यूब में रखें।
  16. इसके बाद, तिल्ली को अलग करके हटा दें और धीरे-धीरे वैक्यूलेचर और स्नायुओं को काट लें। तिल्ली लिवर से ज्यादा आसानी से निकल जाएगी। तिल्ली को एक अलग फाल्कन ट्यूब में रखें जिसमें 5 मिलीलीटर बाँझ डीडीएच20 होता है।
  17. छाती की कल्पना करने के लिए डायाफ्राम का पता लगाएं और रिबकेज के साथ धीरे-धीरे काटें। छाती को खोलने के लिए, दिल और फेफड़ों को उजागर करने के लिए, गर्दन के स्तर पर xiphoid प्रक्रिया और उरोस्थि के माध्यम से काटें।
  18. संदंश का उपयोग करके, अपने शीर्ष से धीरे से दिल को पकड़ो, और इसे इस तरह उठाएं कि महाधमनी और फेफड़े के जहाज तनाव में हों। दिल को मुक्त करने के लिए इन जहाजों को काट लें।
  19. दिल को 50 मिलीलीटर फाल्कन ट्यूब में रखें जिसमें 5 मिलीलीटर बाँझ डीडीएच2 0होता है।
  20. माउस शव को त्यागें, और प्रत्येक अंग को हटाने के लिए 5 मिलीलीटर बाँझ डीडीएच20 युक्त साफ फाल्कन ट्यूब का उपयोग करके, हर जानवर के लिए इस प्रक्रिया को दोहराएं।
  21. सभी अंगों को निकालने के बाद वर्कस्टेशन को साफ कर बेंच पर लौट जाएं।
  22. पांच चूहों से अंगों के प्रत्येक सेट के लिए समरूपता को साफ करने और स्टरलाइज करने के लिए उपयोग की जाने वाली 5 ट्यूबों का एक सेट तैयार करें(यानी 5 यकृत के लिए एक 5 ट्यूब सेट, 5 तिल्ली के लिए 5 ट्यूब, और 5 दिलों के लिए 5 ट्यूब)। प्रत्येक ट्यूब में से चार को 30 मिलीलीटर बाँझ डीडीएच2 0से भरा जाना चाहिए, और एक को 30 मिलीलीटर 90% एटोह से भरा जाना चाहिए।
  23. टिशूमास्टर (या समकक्ष समरूप) का उपयोग करके, जांच को साफ करने के लिए चरण 7.21 में तैयार ट्यूबों में होमोजेनाइजर (दौड़ते समय) डुबोएं:
  24. ट्यूब 1 (डीडीएच2ओ)
    ट्यूब 2 में 5 सेकंड (ddH2O)
    ट्यूब 3 में 5 सेकंड (EtOH)
    ट्यूब 4 में 5 सेकंड (ddH2O)
    ट्यूब 5 में 5 सेकंड (ddH2O)
  25. कम से कम 2 मिनट के लिए समरूप का उपयोग करके एक जिगर को समरूप बनाना, या जब तक अंग के कोई दृश्यमान हिस्से नहीं रहते हैं। जांच से किसी भी बड़े मलबे को हटाने के लिए चिमटी का प्रयोग करें।
  26. चरण 7.22 में वर्णित सफाई प्रक्रिया को दोहराएं
  27. अन्य यकृत के लिए समरूपता प्रक्रिया दोहराएं, जिससे चरण 7.22 में वर्णित प्रक्रिया का उपयोग करके प्रत्येक यकृत के बीच जांच को धोना सुनिश्चित करें।
  28. सभी यकृत पूरी तरह से समरूप होने के बाद, जिगर के लिए वॉश ट्यूब (1-5) को त्याग दें।
  29. दोनों तिल्ली और दिल के लिए समरूप/स्वच्छ प्रक्रिया दोहराएं, अंगों की प्रत्येक श्रृंखला के लिए धोने ट्यूबों का एक नया सेट का उपयोग करने के लिए सुनिश्चित कर रही है । यदि किसी भी बिंदु पर वॉश ट्यूब टर्बिड हो जाते हैं, तो उन्हें त्यागें और श्रृंखला को खत्म करने के लिए नई ट्यूबों के साथ बदलें।
  30. सभी अंगों को समरूप होने के बाद, समरूप पर एक अंतिम सफाई चक्र करें और इसे भंडारण के लिए अच्छी तरह से सुखाएं।
  31. प्रत्येक अंग के लगभग 200 माइक्रोन को 96-अच्छी प्लेट के एक व्यक्ति में अच्छी तरह से रखें।
  32. 1:10,000 कमजोर पड़ने (जिगर और तिल्ली) या 1:1,000 कमजोर पड़ने (दिल) तक की श्रृंखला में 1:10 को कमजोर करके अंग नमूनों पर धारावाहिक कमजोर करना करें।
  33. स्पॉट प्लेट पूर्व गर्म पौंड आगर पर कमजोर पड़ने श्रृंखला । इसके अलावा खराब उपनिवेश अंगों से नीचे 100 00 नीचे की गणना करने के लिए अलग-अलग पौंड आगर प्लेटों पर प्रत्येक अन पतला अंग और प्लेट के 20 उल को हटा दें।
  34. समरूप अंगों वाले फाल्कन ट्यूबों को त्यागें, और पैराफिल्म के साथ कमजोर पड़ने वाली 96-अच्छी प्लेटों को लपेटें और इसे -80 डिग्री सेल्सियस पर फ्रीजर बॉक्स में रखें।
  35. धब्बे सूखने दें। प्लेटों को हुड में रखकर और ढक्कन को हटाकर इस प्रक्रिया को तेज किया जाता है।
  36. धब्बे सूखने के बाद प्लेटों को रात भर 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में रखें।
  37. अगले सुबह प्रत्येक स्थान पर कालोनियों की संख्या गिनें और प्रति अंग बैक्टीरिया की कुल संख्या की गणना करने के लिए कमजोर पड़ने वाली श्रृंखला का उपयोग करें।

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Representative Results

एल मोनोसाइटोजीन के चयनित आइसोले कोशिका संस्कृति में और संक्रमण के माउस मॉडल में हृदय कोशिकाओं के उन्नत आक्रमण का प्रदर्शन करते हैं। चित्रा 1 इस बात का उदाहरण दिखाता है कि आगर मीडिया पर निलंबन के स्पॉट प्लेटिंग के बाद बैक्टीरियल कॉलोनियां कैसे दिखाई दे सकती हैं। यह विधि बड़ी संख्या में आगर मीडिया प्लेटों का उपयोग करने के बिना नमूने के भीतर सीएफयू के सटीक मूल्यांकन की अनुमति देती है। चित्रा 2 एक ऊतक संस्कृति का एक उदाहरण से पता चलता है परख आधारित तनाव 10403S की क्षमता की तुलना करने के लिए तनाव 07PF0776 के साथ दिल की कोशिकाओं पर आक्रमण । 10403S से संक्रमित कोशिकाओं की तुलना में gentamicin उपचार के बाद संक्रमित H9c2 हृदय कोशिकाओं से दो बार से अधिक के रूप में कई 07PF0776 बैक्टीरियल सीएफयू को बरामद किया जा सकता है। इस परख का उपयोग करके कार्डियोट्रोपिक उपभेदों के लिए नियमित रूप से 2 से 4 गुना के अंतर देखे जाते हैं। चित्रा 3 संक्रमण के बाद 3 दिनों में यकृत, तिल्ली और संक्रमित चूहों के दिलों से बैक्टीरिया की वसूली का एक उदाहरण दिखाता है। कार्डियोट्रोपिक तनाव 07PF0776 या तनाव 10403S के साथ चूहों के संक्रमण के परिणामस्वरूप यकृत और संक्रमित चूहों के प्लीहा से बरामद बैक्टीरिया की तुलनीय संख्या होती है, हालांकि 07PF0776 से संक्रमित चूहों में हृदय से बैक्टीरिया की पता लगाने योग्य संख्या पैदा होने और इस अंग में अधिक बैक्टीरियल बोझ प्रदर्शित करने की अधिक संभावना होती है।

Figure 1
चित्रा 1: बैक्टीरियल सीएफयू का निर्धारण करने के लिए स्पॉट प्लेटिंग तकनीक का उदाहरण। ग्लास कवरस्लिप पर उगाई जाने वाली और एल मोनोसाइटोजीन से संक्रमित H9c2 कोशिकाओं को lysed किया गया था और निलंबन को 1:10 कमजोर पड़ने (बाएं पैनल) तक 1:10 कमजोर करने का उपयोग करके क्रमिक रूप से पतला किया गया था। एक मल्टीचैनल पिपेट का उपयोग प्रत्येक अच्छी तरह से सीधे एलबी एगर प्लेट पर 10 उल को पिपेट करने के लिए किया गया था, और प्लेट को 37 डिग्री सेल्सियस (दाएं पैनल) पर रात भर इनक्यूबेट किया गया था। उचित कमजोर पड़ने से जुड़े बैक्टीरियल सीएलयू की गिनती करके प्रति कवरस्लिप बैक्टीरिया की संख्या का आकलन किया जाता है।

Figure 2
चित्रा 2: एल मोनोसाइटोजीन तनाव 07PF0776 ऊतक संस्कृति में हृदय कोशिकाओं के आक्रमण को बढ़ाया दर्शाताहै। आक्रमण परख H9c2 कोशिकाओं में एक MOI = 100 का उपयोग कर प्रदर्शन किया गया। ग्राफ में 10403S (ब्लैक) बनाम कार्डियोट्रोपिक 07PF0776 स्ट्रेन (ब्लू) से संक्रमित कोशिकाओं से बरामद इंट्रासेलुलर बैक्टीरियल सीएफयू की औसत संख्या को दर्शाया गया है । ** पी <0.01 के महत्व को इंगित करता है।

Figure 3
चित्र 3: एल मोनोसाइटोजीन तनाव 07PF0776 माउस संक्रमण मॉडल में दिल के आक्रमण को बढ़ाया दर्शाताहै । जानवर पूंछ नस के माध्यम से १०,००० CFU के साथ टीका लगाया गया । संक्रमण ७२ घंटे के लिए प्रगति करने की अनुमति दी गई थी, जिस पर बिंदु जानवरों की बलि दी गई और यकृत, तिल्ली, और दिल एकत्र और अंग प्रति जीवाणु CFU निर्धारित करने के लिए संसाधित किया गया । ठोस हलकों एक लाइन द्वारा इंगित समूह के भीतर सभी जानवरों के लिए औसत मूल्य के साथ, व्यक्तिगत चूहों से प्राप्त CFU का प्रतिनिधित्व करते हैं +/-एसई । प्रतिशत मान हृदय के भीतर पता लगाने योग्य बैक्टीरियल सीएलयू युक्त जानवरों की संख्या का संकेत देते हैं। * पी <0.05 का महत्व इंगित करता है।

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Discussion

एल मोनोसाइटोजीन एक व्यापक और अच्छी तरह से विशेषता वाले मानव रोगजनक हैं, जो15विभिन्न रोग अभिव्यक्तियों के कारण कई बनाने में सक्षम हैं। जीवाणु को पहले केंद्रीय तंत्रिका तंत्र तक पहुंचने और भ्रूण को विकसित करने और भ्रूण को विकसित करने के लिए रक्त-मस्तिष्क-बाधा और अपरा-भ्रूण बाधाओं जैसे बाधाओं में स्थानांतरित करने की क्षमता के लिए वर्णित किया गया है । जीव की वीवो क्षमता में इन ऊतकों को उपनिवेश करने के लिए अक्सर संस्कृति में प्रतिनिधि कोशिकाओं पर आक्रमण करने की इन विट्रो क्षमता से पूरित किया जाता है जो अंगों को लक्षित करता है। उदाहरण के लिए, कोरॉयड प्लेक्सस में एपिथेलियल कोशिकाओं पर आक्रमण जीव की सीएनएस16को उपनिवेश बनाने की क्षमता से जुड़ा हुआ है; और विलस ट्रोफोब्लास्ट एक्सप्लांट्स का उपयोग मातृ-भ्रूण बैरियर17का प्रतिनिधित्व करने के लिए किया गया है । इस प्रोटोकॉल में, तरीकों का वर्णन किया गया है जो संस्कृति में हृदय कोशिकाओं के बैक्टीरियल आक्रमण का आकलन करने के साथ-साथ यकृत और तिल्ली के उपनिवेश के सापेक्ष व्यक्तिगत आइसोलेशन के लिए दिल के बैक्टीरियल उपनिवेशीकरण की तुलना के लिए उपयोगी हैं।

इस प्रोटोकॉल में कई महत्वपूर्ण कदम शामिल हैं, लेकिन सबसे महत्वपूर्ण में से वे हैं जो कवरस्लिप पर उगाए गए ऊतक संस्कृति कोशिकाओं के संक्रमण या जानवरों के संक्रमण के लिए सही बैक्टीरियल सीआईएफयू के उपयोग से जुड़े हैं। यदि बैक्टीरियल सीएलयू संख्या को विभिन्न कुओं और जानवरों के बीच सही ढंग से नियंत्रित नहीं किया जाता है तो नमूनों के बीच सीधी तुलना नहीं की जा सकती है। यह कमजोर पड़ने के लिए मीडिया प्लेटों पर अंतिम कमजोर पड़ने की सीधी चढ़ाना द्वारा inocula उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल किया श्रृंखला की जांच करने के लिए महत्वपूर्ण है ताकि गारंटी है कि बैक्टीरियल CFU संख्या सही अनुमान लगाया गया है ।

इन परखों में उपयोग की जाने वाली एच9सी2 कोशिकाएं 13 दिन के भ्रूणीय चूहे के हृदय के निचले आधे हिस्से से प्राप्त होती हैं जिनमें ज्यादातर वेंट्रिकुलर ऊतक18शामिल होते हैं । कोशिकाएं मोनोन्यूक्लिड मायोब्लास्ट के रूप में प्रचारित होती हैं और ऊतक संस्कृति फ्लास्क या व्यंजनों में घुल-जगह पहुंचने पर बहुनीय ट्यूबलर संरचनाएं बनाने लगती हैं। कोशिकाओं में लगभग 30 घंटे18का पीढ़ी का समय होता है । H9c2 कोशिकाओं के सीरम भुखमरी कंकाल मांसपेशी कोशिकाओं में कोशिकाओं के भेदभाव के साथ जुड़ा हुआ है, जबकि 10 एनएम सभीट्रांस रेटिनोइक एसिड के साथ मायोब्लास्ट के उपचार कार्डियक मायोसाइट्स14में मायोब्लास्ट भेदभाव के साथ जुड़ा हुआ है । यह प्रोटोकॉल एल मोनोसाइटोजीन मायोब्लास्ट सेल आक्रमण पर केंद्रित था, हालांकि H9c2 सेल लाइन एक बहुमुखी सेल लाइन है जिसका उपयोग बैक्टीरियल आक्रमण पर नियंत्रित सेल भेदभाव के प्रभावों की जांच करने के लिए किया जा सकता है।

एल मोनोसाइटोजीन तनाव 07PF0776 मूल रूप से एक एचआईवी संक्रमित रोगी से अलग था, जो दिल8के एक आक्रामक एल मोनोसाइटोजीन संक्रमण के कारण एक गैर-resusitatable asystolic गिरफ्तारी था । माउस संक्रमण मॉडल में इस तनाव के बाद विश्लेषण से संकेत मिलता है कि इसमें हृदय ऊतक को लक्षित करने और आक्रमण करने की क्षमता बढ़ी हुई थी। एल मोनोसाइटोजीन के अतिरिक्त यादृच्छिक आइसोले के सीमित विश्लेषण से पता चलता है कि बैक्टीरियल आइसोले की उप-आबादी हृदय ऊतक या हृदय वाल्व8को किसी पूर्व क्षति के अभाव में चूहों के दिलों को संक्रमित करने में सक्षम हैं। दिलचस्प बात यह है कि सबसे अच्छी विशेषता वाले एल मोनोसाइटोजीन उपभेदों में से दो, 10403S और ईजीडी, हृदय कोशिकाओं और ऊतकों के गरीब उपनिवेशीकरण पाए गए। 07PF0776 आइसोलेट के जीनोम अनुक्रमण ने किसी भी उपन्यास रोगजनकता द्वीपों की उपस्थिति का खुलासा नहीं किया या अद्वितीय जीन समूहों का प्रमाण प्रदान नहीं किया19. यह पता चलता है कि 07PF0776 उग्रता जीन उत्पादों के अपने मौजूदा शस्त्रागार के संशोधन के माध्यम से आक्रमण के लिए हृदय कोशिकाओं को लक्षित करता है । प्रारंभिक हिस्टोकेमिकल विश्लेषण इंगित करता है कि 07PF0776 संक्रमित माउस दिलों के भीतर फोड़े बनाता है जो मूल संक्रमित मानव रोगी (डेटा नहीं दिखाए गए) के भीतर देखे गए फोड़े के समान दिखाई देता है। क्या अन्य कार्डियोट्रोपिक एल मोनोसाइटोजीन इसी तरह के कार्डियक फोड़े गठन को प्रेरित करते हैं, यह निर्धारित किया जाना बाकी है।

यहां प्रस्तुत परख संक्रमण के विभिन्न पहलुओं की परीक्षा की सुविधा के लिए आसानी से संशोधित किया जा सकता है । व्यक्तिगत कवरस्लिप को या तो प्रकाश या फ्लोरेसेंस-आधारित माइक्रोस्कोपी के लिए तय और दाग दिया जा सकता है, ऊतक संस्कृति इनक्यूबेशन बार मापन और बैक्टीरिया की तुलना के लिए बढ़ाया जा सकता है इंट्रासेलुलर विकास दर, ऊतकों और अंगों को पैराफिन एम्बेडेड किया जा सकता है और सेलुलर स्तर पर फोड़ा संरचनाओं और जीवाणु वितरण की जांच करने के लिए सूक्ष्म परीक्षा के लिए संसाधित किया जा सकता है। ऊतक संस्कृति कोशिकाओं या मेजबान ऊतकों के उपनिवेशीकरण के जीवाणु आक्रमण के स्तर का आकलन करते समय, प्रत्येक परख का पता लगाने वाले बैक्टीरिया की न्यूनतम मात्रा के संदर्भ में सीमाएं हैं। इन विट्रो आक्रमण परख में लगभग 300 सीएलयू प्रति कवरस्लिप का पता लगाने की कम सीमा होती है। कवरस्लिप को भंवर में रखना उपयोग किए जाने वाले पानी की मात्रा को समायोजित करने से बैक्टीरिया की कम संख्या का पता लग सकता है, जिसमें कोशिका लाइसिस की मात्रा खराब आक्रामक उपभेदों का पता लगाने के लिए उपयोगी साबित होती है। कवरस्लिप को छोटे वॉल्यूम में मेजबान कोशिकाओं के लाइसिस से पहले अतिरिक्त जेंटामिसिन को हटाने के लिए बाँझ पानी में संक्षेप में डूबाया जा सकता है। 5 मिलीलीटर या उससे अधिक मात्रा के स्तर का उपयोग अत्यधिक आक्रामक उपभेदों को ठीक से गणना करने के लिए किया जा सकता है। जानवरों में, अंग समरूपों को 5 मिलीलीटर या 10 मिलीलीटर डीडीएच20 की मात्रा में उत्पन्न किया जा सकता है, जिसमें बैक्टीरिया के निचले स्तर का पता लगाने के लिए कम मात्रा उपयोगी होती है, और भारी उपनिवेश अंगों को बेहतर गणना करने के लिए उच्च मात्रा होती है। संक्रमित अंगों के लिए न्यूनतम पहचान सीमा लगभग 100 सीएलयू है। यदि अंगों को लगातार उच्च स्तर पर उपनिवेश किया जाता है, तो पानी की एक बड़ी मात्रा (10 मिलीलीटर) का उपयोग करने और 96-अच्छी प्लेट के भीतर अधिक कमजोर करने पर विचार करें।

वर्णित तरीकों को हृदय के बाहर अंगों और ऊतकों पर लागू किया जा सकता है। आक्रमण परख और माउस संक्रमण जैसे कि इनका उपयोग प्लेसेंटा, मस्तिष्क, पित्ताशय की थैली, जिगर और आंत सहित साइटों की एक भीड़ में उपनिवेशीकरण का आकलन करने के लिए किया गया है। ऊपर वर्णित प्रोटोकॉल के संशोधन भी हाइपरइनवेसिव और/या हाइपरवायरुलेंट उपभेदों को समायोजित करने के लिए किए जा सकते हैं, और हृदय प्रणाली के बाहर की साइटों पर आक्रमण फेनोटाइप का आकलन करने के लिए अन्य सेल प्रकारों के साथ हृदय कोशिकाओं का प्रतिस्थापन किया जा सकता है । चूंकि विभिन्न सेल प्रकारों ने एल मोनोसाइटोजीन आक्रमण में संवेदनशीलता को बदल दिया है, इसलिए परख से डेटा को सही ढंग से पुनर्प्राप्त करने के लिए एमओआई और इनक्यूबेशन बार जैसे मापदंडों को समायोजित करना आवश्यक हो सकता है।

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Disclosures

लेखकों की रिपोर्ट कोई प्रतिस्पर्धी वित्तीय हितों ।

Acknowledgments

इस काम को सार्वजनिक स्वास्थ्य सेवा अनुदान AI41816 और एआई099339 (एनईएफ) और एनआईएआईडी से F31AI094886-01 (पी.डी..M. द्वारा समर्थित किया गया था। सामग्री पूरी तरह से लेखकों की जिम्मेदारी है और जरूरी धन स्रोतों के आधिकारिक विचारों का प्रतिनिधित्व नहीं करते हैं ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Difco BHI Broth Base 237200 2 kg of Brain Heart Infusion powder (without agar)
Difco Agar 214510 2 kg of Granulated Agar
Difco BHI Agar 241810 2 kg of Brain Heart Infusion Powder with 7.5% Agar
in vitrogen LB Broth Base 12975-084 2 kg of Luria Broth Base Powder (without agar)
Fisher Glass Coverslips 12-545-80 12 mm glass coverslips
Falcon 24-well Tissue Culture Plate 35-3047 24 well, Plasma-treated Tissue Culture Plate
Falcon 14mL Polystyrene tube 352051 14 ml Polystyrene tubes
Falcon 96-well U-bottom plate 35-3077 Non-tissue culture treated 96-well plate
Corning 0.05% Trypsin, 0.53 mM EDTA (1X) 25-052-CI Stock solution of Trypsin EDTA for tissue culture
Corning DMEM (High glucose, high pyruvate) 15-013-CU DMEM media without FBS, glutamine, or antibiotics
Corning Pen/Strep/Glut Solution 30-009-CI Stock mixture of penicillin, streptomycin, and L-glutamine for tissue culture
Corning Gentamicin 30-005-CR 50 mg/ml Stock solution of Gentamicin for tissue culture
Cellgro (Corning) L-Glutamine 25005197 Stock L-glutamine solution without antibiotics
Denville 75cm^2 Flask T1225 75 cm2 tissue culture treated flask
Denville 1.5mL microcentrifuge tubes 2013004 1.5 ml microcentrifuge tubes
ATCC H9c2 Cardiac Myoblasts CRL-1446 Rat cardiac myoblasts
Hyclone Fetal Bovine Serum SH30070.63 Fetal Bovine Serum

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References

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संक्रमण अंक 99 बैक्टीरियल रोगजनक इंट्रासेलुलर रोगजनक ऊतक ट्रॉपिज्म बैक्टीरियल आक्रमण हृदय संक्रमण लिस्टेरियोसिस
<em>लिस्टेरिया मोनोसाइटोजीन</em> का उपयोग कर संक्रमित चूहों में संस्कृति और हृदय उपनिवेशीकरण में हृदय कोशिकाओं के जीवाणु आक्रमण का आकलन
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McMullen, P. D., Freitag, N. E.… More

McMullen, P. D., Freitag, N. E. Assessing Bacterial Invasion of Cardiac Cells in Culture and Heart Colonization in Infected Mice Using Listeria monocytogenes. J. Vis. Exp. (99), e52497, doi:10.3791/52497 (2015).

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