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Immunology and Infection

Evaluación De La Invasión Bacteriana De Las Células Cardíacas En Cultivo Y Colonización Del Corazón En Ratones Infectados Usando Listeria monocytogenes

Published: May 27, 2015 doi: 10.3791/52497
Automatic Translation
1, 1
1Department of Microbiology and Immunology, College of Medicine, University of Illinois at Chicago

Summary

Listeria monocytogenes causa infecciones fetales en mujeres embarazadas y meningitis en poblaciones susceptibles. Las subpoblaciones de bacterias pueden colonizar el tejido cardíaco, causando miocarditis en pacientes y animales de laboratorio. Aquí presentamos un protocolo que describe cómo evaluar la invasión de células cardíacas de L. monocytogenes in vitro y la colonización cardíaca en animales infectados.

Abstract

Los monocytogenes de la listeriería son un patógeno intracelular facultativo Gram-positivo que es capaz de causar infecciones invasores serias en pacientes immunocompromised, los ancianos, y las mujeres embarazadas. Las manifestaciones mas comunes de la listeriosis en seres humanos incluyen meningitis, encefalitis, y aborto fetal. Una secuela significativa pero mucho menos documentada de la infección invasor de los monocytogenes del L. implica el corazón. La tasa de mortalidad por enfermedad cardíaca puede ser de hasta el 35% a pesar del tratamiento, sin embargo se sabe muy poco sobre la colonización de L. monocytogenes del tejido cardíaco y sus patologías resultantes. Además, recientemente se ha hecho evidente que las subpoblaciones de L. monocytogenes tienen una mayor capacidad para invadir y crecer dentro del tejido cardíaco. Este protocolo describe detalladamente los métodos ines vitro e in vivo que se pueden utilizar para determinar cardiotropism de los aislantes de los monocytogenes del L. Los métodos se presentan para la infección de los mioblastos cardiacos de la rata H9c2 en cultura del tejido así como para la determinación de la colonización bacteriana de los corazones de ratones infectados. Estos métodos son útiles no sólo para identificar tensiones con el potencial de colonizar el tejido cardiaco en animales infectados, pero pueden también facilitar la identificación de los productos bacterianos del gen que sirven para aumentar la invasión de la célula cardiaca y/o para conducir cambios en patología del corazón. Estos métodos también proporcionan la comparación directa del cardiotropismo entre múltiples cepas de L. monocytogenes.

Introduction

Listeria monocytogenes es un patógeno intracelular Gram-positivo capaz de causar enfermedades graves en poblaciones susceptibles, incluyendo ancianos, mujeres embarazadas, personas con VIH/SIDA y personas que reciben quimioterapia1. La infección en estas poblaciones es frecuentemente el resultado de la ingestión de productos alimenticios contaminados, y la mayoría de las infecciones están asociadas con brotes alimentarios a gran escala2,3. En humanos y otros mamíferos, L. monocytogenes es capaz de translocar a través de la frontera epitelial del intestino delgado, siendo posteriormente transportado al hígado4,5. Los modelos animales sugieren que las bacterias ingeridas se repliquen dentro de las vellosidades intestinales y transiten al hígado a través de la vena porta o se propaguen a través de los ganglios linfáticos mesentéricos hacia el torrente sanguíneo, lo que lleva a la diseminación hematógena al hígado y al bazo6,7. En el hígado y el bazo, la bacteria es capaz de mediar en fagocitos profesionales, así como en las células parenquimatosas residentes, y establece rápidamente infecciones dentro de estos órganos. A medida que aumenta la carga bacteriana, numerosas bacterias se dispersan de nuevo en la sangre, donde son capaces de colonizar aún más los tejidos susceptibles, incluyendo el sistema nervioso central y la placenta (donde esté presente). La colonización de estos sitios excluye las manifestaciones más comunes de listeriosis en humanos, incluyendo meningitis, encefalitis y aborto fetal2.

Recientemente se ha demostrado que determinadas subpoblaciones de L. monocytogenes tienen una mayor capacidad de invadir y replicarse dentro del tejido cardíaco8. Las manifestaciones de afectación cardíaca son variadas, y van desde la endocarditis y la pericarditis, hasta la miocarditis fulminante completa con anomalías de conducción9-13. El número total de casos cardiacos de los monocytogenes del L. por año es bajo pero puede debajo estimado pues esta faceta de la infección no se reconoce generalmente bien. La colonización del corazón por patógenos a menudo requiere predisposiciones del huésped, como daño valvular preexistente o válvulas cardíacas artificiales. Existen, sin embargo, aislados de L. monocytogenes que han sido identificados que son notables por su capacidad de colonizar los corazones de animales infectados en ausencia de cualquier daño cardíaco y/o anormalidades8.

Adjunto se describen in vitro e in vivo los métodos para evaluar la colonización bacteriana del tejido cardiaco dentro de animales infectados usando análisis de la invasión en cultura del tejido así como infecciones animales vivas. Estos métodos han demostrado ser útiles no sólo para identificar cepas con el potencial de colonizar el tejido cardíaco en animales infectados, sino que también deben ser útiles para la identificación de productos de genes bacterianos que sirven para mejorar la invasión de células cardíacas y / o dar lugar a cambios en la patología del corazón. Estos métodos facilitan la comparación del cardiotropismo entre múltiples cepas. Para los métodos descritos aquí, L. monocytogenes 10403S se utiliza como un representante bien estudiado de una cepa no cardiotrópica y el aislado clínico 07PF0776 se utiliza como un ejemplo representativo de una cepa cardiotrópica. Estas dos cepas se eligieron para proporcionar una comparación para la invasión bacteriana de células cardíacas in vitro y la colonización de corazones de ratones infectados in vivo. El aislado 07PF0776 es un aislado clínico recuperado de un absceso interventricular que causó una arritmia fatal en un paciente VIH+8. Los aislados de L. monocytogenes pueden variar en su potencial de virulencia, y dada la propensión de Listeria a infectar a personas con inmunosupresión y mujeres embarazadas, las personas dentro de estas poblaciones deben tener cuidado al evaluar diferentes aislados clínicos.

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Protocol

1. Condiciones de almacenamiento y cultivo para cepas de L. monocytogenes

  1. Prepare medios sólidos autoclavando agar de infusión cerebro-corazón (BHI) y vertiendo los medios fundidos en placas de Petri. Deje que las placas se sequen durante la noche a temperatura ambiente, luego vuelva a pasar la noche a 37 °C.
  2. Usando un lazo estéril, obtenga una pequeña muestra de L. monocytogenes de cualquiera de las existencias previamente hechas del congelador (bacterias suspendidas en glicerol del 20% en medios líquidos de BHI, almacenadas en -80 °C) o de una placa de agar que contiene colonias previamente pulsadas para el aislamiento.
  3. Usando la técnica aséptica, rayar la muestra para el aislamiento de la sola colonia. Asegúrese de esterilizar el bucle entre las rayas cruzadas para evitar el exceso de arrastre y garantizar el aislamiento de las colonias individuales de la cepa que se está evaluando. Incubar la(s) placa(s) durante la noche a 37 °C.
  4. Usando un asa estéril, retire una colonia del aislado e inoculte 2 ml de caldo de BHI (sin agar) en un tubo de poliestireno de 14 ml.
  5. Para ensayos e infecciones, incubar el cultivo de caldo estáticamente (sin agitar) durante la noche en una incubadora de 37 °C. Para el almacenamiento de aislados cultivados, incubar el cultivo de caldo a 37 °C con agitación a 180-200 rpm durante la noche. Los cultivos se pueden almacenar añadiendo glicerol a una concentración final del 20% y almacenando tubos sellados a -80 °C indefinidamente.

2. Condiciones de Almacenamiento Y Cultivo De H9c2 Cardiaco Mioblasto-como Las Células

  1. Compre u obtenga un stock congelado de células H9c2, así como el Medio modificado de águila de Dubelco (DMEM) que contiene glucosa alta y piruvato, suero fetal bovino (FBS), L-glutamina (Glut) y mezclas de penicilina-estreptomicina y glutamina (PSG).  FBS, Glut y PSG deben almacenarse a -20 °C, mientras que DMEM se puede almacenar a 4 °C. Es útil alícuota FBS en tubos cónicos de 50 ml antes de la congelación.
  2. En una campana de flujo laminar, descongelar dos alícuotas de FBS. Añadir una alícuota a una botella de 500 ml de DMEM, haciendo una mezcla al 10% FBS/DMEM. A esto, añadir 6 ml de Glut y almacenar la solución resultante a 4 °C. Esta solución se puede etiquetar como "DMEM sin antibióticos". (DMEM –Ab)
  3. A una segunda botella de 500 ml de DMEM, añadir la otra alícuota de 50 ml de FBS. A esta solución, añadir 6 ml de PSG y caldo a 4 °C. Esta solución se puede etiquetar como "DMEM con antibióticos". (DMEM +Ab)
  4. Mientras esté en la campana laminar, retire 10 ml de DMEM +Ab y coloque en un matraz de cultivo de tejidos de 25 ml.
  5. Dejando el matraz en la campana laminar, retire una alícuota congelada de células H9c2 del almacenamiento en nitrógeno líquido y coloque rápidamente el tubo en un baño de agua de 37 °C hasta que el cultivo se haya descongelado.
  6. Rocíe el tubo con etanol al 70% para desinfectar, luego regrese a la campana. Trabajando rápidamente para minimizar el tiempo celular en DMSO concentrado, añadir la alícuota completa de las células a los 10 ml de DMEM +Ab.  Esto diluye el DMSO suficientemente para la viabilidad y la adherencia de la célula de noche.
  7. Colocar el matraz en una incubadora de cultivo de tejidos a 37 °C, 5% C02y 95% de humedad durante la noche.
  8. A la mañana siguiente, compruebe la capa celular para asegurar la adherencia. Las células probablemente estarán entre 80-100% confluentes en este momento.
  9. En la campana de cultivo de tejidos, retire los medios contenidos en el matraz utilizando el vacío, dejando sólo las células dentro del matraz.
  10. Añadir aproximadamente 2 ml de Tripsina-EDTA al 0,25% a las células y rockear suavemente durante aproximadamente 3 seg.
  11. Invierta el matraz de manera que la solución de tripsina ya no esté en contacto con la monocapa, y retire la tripsina al vacío.
  12. Agregue una segunda alícuota de 2 ml de tripsina a las células y mueva el matraz a un microscopio invertido. Observe las células mientras balancea suavemente el matraz para asegurarse de que la monocapa se disperse.
  13. Una vez dispersada la monocapa, volver inmediatamente a la campana de cultivo de tejidos y añadir 4 ml de DMEM +Ab a la suspensión celular.
  14. Retirar una porción de 2 ml de la suspensión celular y añadirla a un matraz de cultivo de tejidos de 50 ml que contenga 23 ml de DMEM +Ab. Mezcle suavemente el matraz y, a continuación, colóquelo en la incubadora de cultivos de tejidos en las condiciones enumeradas en el paso 2.5.
  15. Revise las células diariamente hasta que alcancen aproximadamente el 80% de confluencia (aproximadamente 2.0-4.0 x 105 células por ml). Es muy importante que las células no se vuelvan demasiado confluentes, ya que pueden diferenciarse en miotubos del músculo esquelético cuando se privan de FBS durante períodos prolongados de tiempo14 y esta diferenciación puede alterar la invasión bacteriana.  Vigile las células cuidadosamente y comience con un nuevo tubo de células si un cultivo se vuelve confluente.
  16. Una vez que las células alcanzan el 80% de confluencia, pueden pasarse a otro matraz de 50 ml como se acaba de describir, o prepararse para el ensayo de invasión.

3. Preparación de células H9c2 para el ensayo de invasión

  1. En la campana de cultivo de tejidos, retire el medio de un matraz de 50 ml de células H9c2 que han alcanzado una confluencia del 80% mediante la aspiración al vacío.
  2. Añadir 4 ml de solución de tripsina-EDTA al 0,25% a la monocapa y retirar inmediatamente mediante aspiración al vacío.
  3. Añadir otra porción de 4 ml de Tripsina-EDTA al 0,25% al matraz y mover el matraz a un microscopio invertido para observar la dispersión de la monocapa.
  4. Una vez que las células se hayan dispersado, volver a la campana y añadir 4 ml de DMEM –Ab a las células. Pipetear la solución hacia arriba y hacia abajo asegura la eliminación completa de las células de la parte inferior del matraz.
  5. Después de la resuspensión de la monocapa, retire toda la suspensión y colóquela en un tubo cónico de 50 ml.
  6. Retire una porción de 20 ul de esta suspensión y cuente el número de células por mililitro con un hemocitómetro.
  7. Una vez determinada la concentración de células en la solución, ajustar la concentración a 2,25 x 104 células/ml añadiendo el volumen adecuado de solución celular a DMEM –Ab fresco. El volumen total de la solución ajustada debe ser de 25 ml.
  8. Mientras que en el capó, esterilizar cubiertas de vidrio sumergiéndolos en 90% Etanol y pasando brevemente cada cubrebocas a través de una llama. Agregue cada cubrebocas a un pozo individual de una placa tratada con cultivo de tejido de 24 pozos directamente después de que se esterilice.
  9. Después de que todos los pozos tengan un cubrebocas individual, use una pipeta de 25 ml para agregar 1 ml de la solución de celda diluida a cada uno de los pozos en la placa, y empuje cada cubrebocas hacia abajo con una aguja estéril.
  10. Revise cada pozo con un microscopio invertido para asegurarse de que haya cantidades similares de células en cada pozo. Coloque la placa de 24 pozos en la incubadora de cultivo de tejidos durante la noche a 37 °C en 5% deCO2 y 95% de humedad.
  11. A la mañana siguiente, vea cada pozo para asegurarse de que las cubiertas tienen cantidades comparables de mioblastos adherentes y que las cubiertas no están flotando en el pozo.

4. Preparación de cepas de L. monocytogenes para ensayos de invasión

NOTA: Todo el trabajo de laboratorio se lleva a cabo de acuerdo con las directrices de nivel 2 de bioseguridad de los CDC.

  1. Después de preparar la placa de 24 pozos para el ensayo, utilice un asa esterilizada para eliminar las colonias individuales de las cepas que se examinarán para la invasión bacteriana e inocular cada una en tubos individuales de 14 ml que contengan 2 ml de caldo de BHI.
  2. Coloque los tubos inoculados en una incubadora de 37 °C inclinada a 45° e incube estáticamente (sin agitar) durante la noche.
  3. A la mañana siguiente, retire el tubo de cultivo de la incubadora y el vórtice brevemente para garantizar la suspensión uniforme de las bacterias.
  4. Mida la densidad óptica del cultivo utilizando un espectrofotómetro a una longitud de onda de 600 nm. Asegúrese de poner a cero el espectrofotómetro usando caldo BHI estéril antes de leer la densidad óptica.
  5. Para L. monocytogenes, la densidad óptica está directamente relacionada con la concentración de bacterias por ml, de tal manera que una densidad de 1.000 = 1.0 x 109 UFC por ml.
  6. Calcule la cantidad de cultivo necesaria para infectar 2,25 x 104 células con 2,25 x 106 (MOI = 100).
  7. Retire la cantidad de cultivo necesaria y colóquela en un tubo centrífuga de 1,5 ml.
  8. Haga girar el cultivo a 19.000 x g durante 3 min y, a continuación, descarte el sobrenadante. Toque el extremo abierto del tubo contra una toalla de papel para eliminar el exceso de medios pegados al labio del tubo.
  9. Resuspend las bacterias en 1 ml de PBS estéril, y vórtice para asegurar suficiente mezcla. Esta mezcla debe contener aproximadamente 2,25 x 106 UFC por 20 ul (1,125 x 108 UFC/ml).

5. Realización del ensayo de invasión

  1. El día antes del ensayo de invasión, prepare placas de 24 pozos de células H9c2 como se describe en la Sección 3, y también inocule el caldo estéril de BHI con la(s) cepa(s) deseada(s) de Listeria como se describe en la Sección 4.
  2. Utilizando el protocolo de la Sección 4, prepare cultivos resuspended de PBS de las cepas que se evaluarán para la invasión. Nota: El título infeccioso se puede evaluar en este punto mediante el revestimiento de diluciones de cada muestra en medios sólidos y la enumeración de colonias después de la incubación durante la noche.
  3. Cargue al menos 20 ul de la solución de bacterias PBS en pozos individuales de la placa de 24 pozos. Tenga en cuenta que se necesitan al menos tres pozos individuales para cada cepa con el fin de obtener resultados por triplicado, por lo que se pueden evaluar hasta 8 cepas en tándem.
  4. Después de cargar los pozos con bacterias, mezcle suavemente la placa para fomentar la propagación homogénea de cada muestra dentro del pozo, y coloque la placa de 24 pozos de nuevo en la incubadora durante 45 minutos de incubación a 37 °C y 95% de humedad, con 5% de CO2.
  5. Durante esta incubación, prepare una alícuota de DMEM – Ab (Sección 2) simplemente retirando 25 ml de DMEM –Ab y colocándola en un tubo de halcón de 50 ml (o equivalente).
  6. Añadir gentamicina a la alícuota DMEM –Ab de 25 ml a una concentración de 15 ug/ml (7,5 ul de una solución común de 50 mg/ml). Coloque la solución DMEM –Ab +Gent en un baño de agua de 37 °C durante la incubación de 45 min.
  7. Alícuota 25 ml de PBS en un tubo de halcón de 50 ml y colocar en el baño de agua de 37 °C durante la incubación de 45 min.
  8. Una vez completada la incubación de 45 minutos, retire la placa de 24 pozos y colóquele en la campana. Retire los medios que contienen bacterias de cada pozo por aspiración al vacío, cambiando las puntas de pipeta de vidrio entre diferentes cepas.
  9. Agregue aproximadamente 1 ml de PBS a cada pozo para lavar las bacterias que se adhieren libremente de la superficie de las células, luego retire el PBS usando la aspiración al vacío.
  10. Después de la eliminación completa de PBS, añadir 1 ml de DMEM –Ab +Gent a cada pozo. La gentamicina sólo matará a las bacterias que permanecen fuera de las células, por lo tanto, las que son intracelulares seguirán siendo viables.
  11. Coloque la placa de 24 pozos de nuevo en la incubadora y deje que la incubación durante una hora adicional.
  12. Durante la incubación de una hora de duración, prepare 14 ml de tubos de polipropileno añadiendo 1 ml de ddHestéril 20 a cada tubo. Se requerirá un tubo para cada cubrebocas, por lo que para una placa de 24 pozos, prepare 24 tubos en total.
  13. Después de la incubación de una hora de duración, retire la placa de 24 pozos de la incubadora y colóquela en la campana, junto con los tubos preparados en el paso 5.12.
  14. Usando pinzas estériles, retire cada cubrebocas de su respectivo pozo y colóquelo inmediatamente en un tubo individual. Asegúrese de sumergir las pinzas en etanol y llamarlas entre cada cubrebocas para evitar la contaminación.
  15. Después de que todos los cubrebocas se hayan retirado y colocado en tubos individuales, deseche la placa de 24 pozos.
  16. Vuelva al banco y vórtice cada tubo durante 5-10 segundos.
  17. Retire una porción de cada tubo y coloque cada muestra en un pocillo individual de una placa de 96 pocillos, luego diluya en serie cada muestra usando diluciones 1:10 hasta una dilución 1:1,000.
  18. Usando placas LB precalentadas y secas, éguese la placa de cada una de las series de dilución en las placas de agar. Se puede utilizar un pipeteo multicanal para platear 5-10 puntos de μl de la serie de dilución de cada muestra.
  19. También retire las muestras de 20 μl de cada pozo sin diluir y detecte esta cantidad directamente en el agar LB en una placa separada de la serie de dilución. (Este mayor volumen se puede utilizar para enumerar cepas poco invasivas).
  20. Después de que todas las muestras hayan sido chapadas en manchas, deseche los tubos de 14 ml que contienen las tapas. Parafilmar la placa de 96 pozos y colocarla en una caja de congelador a -80 °C para replating, si es necesario.
  21. Deje que las manchas se sequen por completo. Este proceso se acelera en gran medida colocando las placas en la campana y retirando las tapas.
  22. Después de que las manchas se hayan secado, coloque las placas en una incubadora de 37 °C durante la noche.
  23. A la mañana siguiente, cuente el número de colonias en cada punto de la serie de dilución para las que se puede evaluar fácilmente el número de colonias (entre aproximadamente 5 y 50 colonias) (Figura 1), y utilice la serie para calcular el número de bacterias por cubrebocas para cada cepa evaluada.

6. Preparación de cepas de L. monocytogenes para infecciones de ratón

  1. La noche antes de la infección, use un asa esterilizada para eliminar colonias individuales de las cepas deseadas e inoculte cada una en tubos individuales de 14 ml que contengan 2 ml de caldo de BHI.
  2. Coloque los tubos inoculados en una incubadora de 37 °C inclinada a 45° e incube estáticamente (sin agitar) durante la noche.
  3. A la mañana siguiente, retire el tubo de cultivo de la incubadora y el vórtice brevemente para garantizar una suspensión uniforme de las bacterias.
  4. Mida la densidad óptica del cultivo utilizando un espectrofotómetro a una longitud de onda de 600 nm. Asegúrese de poner a cero el espectrofotómetro usando caldo BHI estéril antes de leer la densidad óptica. (Para L. monocytogenes, la densidad óptica está directamente relacionada con la concentración de bacterias por ml, tal que una densidad de 1.000 = 1.0 x 109 UFC por ml)
  5. Calcular la cantidad de cultivo necesario para infectar a cada animal. Las inyecciones típicamente contienen 200 μl de PBS con 10,000 UFC de una cepa individual, lo que se traduce en una concentración deseada de 5.00 x 104 UFC / ml.
  6. Retire una alícuota de 5 μl de cada dilución final y esparcirlo directamente sobre el agar LB.  Incubar durante la noche a 37 °C para confirmar la concentración utilizada para la inoculación.
  7. Inyecte cada suspensión de UFC dentro de 1 hora de la dilución (ver más abajo).

7. Inoculación de L. monocytogenes en ratones a través de la inyección de venas de cola y la evaluación de la carga bacteriana en el hígado, bazo, y el corazón

Nota: Todo el trabajo con animales se lleva a cabo de acuerdo con las directrices de nivel 2 de bioseguridad de los CDC.  Los ratones suelen ser ordenados con una semana de anticipación y enjaulados junto con 5 animales por jaula. A los ratones se les permite aclimatarse al nuevo entorno de laboratorio durante cuatro días antes de la inyección. Estos experimentos utilizaron ratones suizo-Webster hembras de 6-8 semanas de edad que fueron alojados 5 a una jaula en un ambiente de barrera y alimentados con una dieta no restringida.

  1. Prepare una jaula de ratones a la vez quitando la tapa y los recipientes de comida/agua, y colocando la jaula debajo de una lámpara de calor durante cinco minutos. Este proceso permite que las venas de la cola se dilaten, lo que hace que las inyecciones sean más fáciles de realizar.
  2. Retire un animal y colóquelo en un arnés (o tubo de halcón con el extremo cortado) para sujetar al animal durante la inyección.
  3. Limpie el sitio de inyección con una almohadilla de alcohol y deje que el alcohol se evapore. Esto no solo limpia el sitio, sino que también dilata aún más la vena de la cola.
  4. Usando una jeringa de 1 ml equipada con una aguja de calibre 27.5, inyecte suavemente el ratón con 200 μl del cultivo deseado en la vena de la cola.
  5. Use una gasa para detener cualquier sangrado que pueda ocurrir como resultado de la inyección y coloque al animal en una jaula fresca.
  6. Repita este proceso para los animales y cepas restantes. Asegúrese de etiquetar cada jaula de animales con la cepa que han recibido.
  7. Revise a los animales diariamente, retirando y sacrificando cualquier animal que parezca estar enfermo.  Si ningún animal presenta signos de enfermedad, permita que las infecciones continúen durante 72 horas antes de sacrificar a todos los animales.
  8. Para sacrificar, use la anestesia de CO2 de una fuente embotellada hasta que todas las respiraciones se hayan detenido, luego use la dislocación cervical para asegurarse de que el animal esté muerto.
  9. Después del sacrificio, mueva los animales a una capucha de cultivo de tejidos para la disección.
  10. Usando un bloque de disección, fije cada pata del animal con agujas de calibre grandes y rocíe al animal con etanol al 70% hasta que esté saturado.
  11. Corte la piel del abdomen y el tórax hacia atrás usando una incisión en forma de Y que se extiende desde la abertura vaginal hasta el proceso xifoides, progresando luego hasta la axila de cada brazo.
  12. Tire hacia atrás de la piel y retire las agujas de cada pierna para mantener la disección abierta.
  13. Corte suavemente a través del peritoneo, exponiendo los intestinos, el estómago, el hígado y el bazo.
  14. Al cortar primero la vena hepática y el ligamento coronal en la parte superior del hígado, comience a extirpar el hígado. Ligamentos adicionales a extirpar se encuentran debajo del hígado, conectándolo a la primera sección del intestino delgado, así como a la musculatura de la espalda.
  15. Colocar el hígado en 5 ml de ddH estéril2 0en un tubo de halcón de 50 ml.
  16. A continuación, retire el bazo aislándolo y cortando suavemente la vasculatura y los ligamentos. El bazo se extirpará más fácilmente que el hígado. Colocar el bazo en un tubo de halcón separado que contenga 5 ml de ddHestéril 20.
  17. Localice el diafragma y corte suavemente a lo largo de la caja torácica para visualizar el tórax. Cortar a través de la apófilo xifoides y el esternón hasta el nivel del cuello para abrir el tórax, exponiendo el corazón y los pulmones.
  18. Usando las medidas de supón, agarre el corazón suavemente por su ápice, y levábalo de tal manera que la aorta y los vasos pulmonares estén en tensión. Corte estos vasos para liberar el corazón.
  19. Coloque el corazón en un tubo de halcón de 50 ml que contenga 5 ml de ddHestéril 20.
  20. Deseche la carcasa del ratón y repita este proceso para cada animal, utilizando tubos de halcón limpios que contengan 5 ml de ddHestéril 20 por cada órgano extraído.
  21. Después de que todos los órganos han sido removidos, limpie la estación de trabajo y regrese al banco.
  22. Prepare un conjunto de 5 tubos que se utilizarán para limpiar y esterilizar el homogeneizador para cada conjunto de órganos de cinco ratones(es decir, un juego de 5 tubos para 5 hígados, 5 tubos para 5 bazos y 5 tubos para 5 corazones). Cuatro de cada uno de los tubos deben llenarse con 30 ml de ddH estéril20, y uno debe llenarse con 30 ml de EtOH al 90%.
  23. Usando un TissueMaster (u homogeneizador equivalente), sumerja el homogeneizador (mientras está en ejecución) en los tubos preparados en el paso 7.21 de la siguiente manera para limpiar la sonda:
  24. Tubo 1 (ddH2O)
    5 segundos en tubo 2 (ddH2O)
    5 segundos en tubo 3 (EtOH)
    5 segundos en tubo 4 (ddH2O)
    5 segundos en tubo 5 (ddH2O)
  25. Homogeneizar un hígado usando el homogeneizador durante al menos 2 minutos, o hasta que no queden porciones visibles de órgano. Utilice pinzas para eliminar cualquier residuo grande de la sonda.
  26. Repita el proceso de limpieza descrito en el paso 7.22
  27. Repita el proceso de homogeneización para los otros hígados, asegurándose de lavar la sonda entre cada hígado utilizando el proceso descrito en el paso 7.22.
  28. Después de que todos los hígados estén completamente homogeneizados, deseche los tubos de lavado (1-5) para el hígado.
  29. Repita el proceso de homogeneización/limpieza tanto para el bazo como para los corazones, asegurándose de usar un nuevo conjunto de tubos de lavado para cada serie de órganos. Si en algún momento los tubos de lavado se vuelven turbios, deséchelos y reemplácelos con tubos nuevos para terminar la serie.
  30. Después de que todos los órganos se hayan homogeneizado, haga un último ciclo de limpieza en el homogeneizador y séquelo bien para su almacenamiento.
  31. Coloque aproximadamente 200 μl de cada órgano en un pozo individual de una placa de 96 pozos.
  32. Realice diluciones en serie en las muestras de órgano diluyendo 1:10 en una serie hasta una dilución de 1:10,000 (hígado y bazo) o hasta una dilución de 1:1,000 (corazón).
  33. Placa puntual de la serie de dilución en agar LB precalentado. También retire 20 ul de cada órgano y placa sin diluir en placas de agar LB separadas para enumerar la UFC de órganos mal colonizados.
  34. Deseche los tubos de halcón que contienen los órganos homogeneizados y envuelva las placas de 96 pozos que contienen la serie de dilución con parafilm y colóquelo en una caja de congelador a -80 °C.
  35. Deje que las manchas se sequen. Este proceso se acelera colocando las placas en el capó y retirando las tapas.
  36. Después de que las manchas se hayan secado, coloque las placas en una incubadora de 37 °C durante la noche.
  37. Cuente el número de colonias en cada lugar a la mañana siguiente y use la serie de dilución para calcular el número total de bacterias por órgano.

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Representative Results

Los aislantes seleccionados de los monocytogenes del L. exhiben la invasión aumentada de células cardiacas en cultivo celular y en modelos del ratón de la infección. La Figura 1 muestra un ejemplo de cómo pueden aparecer colonias bacterianas después del revestimiento puntual de suspensiones en medios de agar. Este método permite una evaluación precisa de las UFC dentro de una muestra sin utilizar un gran número de placas de medios de agar. La Figura 2 muestra un ejemplo de un ensayo basado en cultivo de tejidos que compara la capacidad de la cepa 10403S para invadir las células cardíacas con la de la cepa 07PF0776. Más del doble de 07PF0776 UFC bacteriana se pueden recuperar de células cardíacas H9c2 infectadas después del tratamiento con gentamicina en comparación con las células infectadas con 10403S. Las diferencias de 2 a 4 veces se observan rutinariamente para las cepas cardiotrópicas utilizando este ensayo. La Figura 3 muestra un ejemplo de la recuperación de bacterias de los hígados, bazos y corazones de ratones infectados a los 3 días después de la infección. La infección de ratones con la cepa cardiotrópica 07PF0776 o cepa 10403S da como resultado un número comparable de bacterias recuperadas de los hígados y bazos de ratones infectados, sin embargo, los ratones infectados con 07PF0776 tienen más probabilidades de producir números detectables de bacterias del corazón y exhibir mayores cargas bacterianas en este órgano.

Figure 1
Figura 1: Ejemplo de técnica de revestimiento puntual para determinar UFC bacterianas. Las células H9c2 crecidas en cubiertas de vidrio e infectadas con L. monocytogenes fueron lisadas y las suspensiones se diluyeron en serie utilizando diluciones de 1:10 hasta una dilución de 1:1.000 (panel izquierdo). Se utilizó un pipeteo multicanal para pipetear 10 ul de cada pozo directamente en una placa de agar LB, y la placa se incubó durante la noche a 37 ° C (panel derecho). El número de bacterias por cubrebocas se evalúa contando la UFC bacteriana asociada a la dilución adecuada.

Figure 2
Figura 2: L. monocytogenes cepa 07PF0776 exhibe mayor invasión de células cardíacas en el cultivo de tejidos. Los análisis de la invasión fueron realizados en las células H9c2 usando un MOI = 100. El gráfico representa el número promedio de UFC bacterianas intracelulares recuperadas +/- SE de células infectadas con 10403S (negro) versus la cepa cardiotrópica 07PF0776 (azul). ** indica una significancia de p <0,01.

Figure 3
Figura 3: L. monocytogenes cepa 07PF0776 exhibe una mayor invasión del corazón en modelos de infección de ratón. Los animales fueron inoculados con 10.000 UFC a través de la vena de la cola. Las infecciones fueron permitidas progresar por 72 horas, en cuyo momento los animales fueron sacrificados y los hígados, los bazos, y los corazones fueron recogidos y procesados para determinar CFU bacteriano por el órgano. Los círculos sólidos representan la UFC obtenida de ratones individuales, con el valor promedio para todos los animales dentro de un grupo indicado por una línea +/- SE. Los valores porcentuales indican el número de animales que contienen UFC bacteriana detectable dentro del corazón. * indica una significancia de p <0,05.

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Discussion

L. monocytogenes es un patógeno humano extendido y bien caracterizado, capaz de causar una serie de manifestaciones diferentes de la enfermedad15. La bacteria se ha descrito previamente por su capacidad de translocar a través de barreras, como la barrera hematoencefálica y las barreras placentario-fetales, con el fin de alcanzar y colonizar el sistema nervioso central y el feto en desarrollo, respectivamente. La capacidad in vivo del organismo para colonizar estos tejidos a menudo se complementa con una capacidad in vitro para invadir las células representativas en cultivo que componen los órganos atacados. Por ejemplo, la invasión de células epiteliales en el plexo coroides se ha asociado con la capacidad del organismo para colonizar el SNC16; y se han utilizado explantes trofoblastos vellosos para representar la barrera materno-fetal17. En este protocolo, los métodos se han descrito que son útiles para evaluar la invasión bacteriana de las células del corazón en cultura así como para la comparación de la colonización bacteriana del corazón para los aislantes individuales en relación con la colonización del hígado y del bazo.

Este protocolo contiene una serie de pasos críticos, pero entre los más críticos se encuentran los que implican el uso de la UFC bacteriana correcta para la infección de células de cultivo de tejidos cultivadas en cubrebocas o la infección de animales. Si el número de UFC bacterianas no se controla correctamente entre diferentes pozos y animales, no se pueden hacer comparaciones directas entre muestras. Es importante verificar la serie de dilución utilizada para generar la inoculación por revestimiento directo de las diluciones finales en placas de medios con el fin de garantizar que el número de UFC bacterianas se ha estimado con precisión.

Las células H9c2 utilizadas en estos ensayos se derivan de la mitad inferior de un corazón de rata embrionaria de 13 días que incluía principalmente tejido ventricular18. Las células se propagan como mioblastos mononucleados y al alcanzar la confluencia en el cultivo de tejidos los frascos o platos comienzan a formar estructuras tubulares multinucleadas. Las células tienen un tiempo de generación de aproximadamente 30 hr18. La inanición sérica de las células H9c2 se ha asociado con la diferenciación de las células en células del músculo esquelético, mientras que el tratamiento de los mioblastos con 10 nM de ácido retinoicotrans se ha asociado con la diferenciación de mioblastos en miocitos cardíacos14. Este protocolo se centró en la invasión celular de mioblastos de L. monocytogenes, sin embargo, la línea celular H9c2 es una línea celular versátil que podría utilizarse para investigar los efectos de la diferenciación celular controlada sobre la invasión bacteriana.

La cepa L. monocytogenes 07PF0776 se aisló originalmente de un paciente infectado por el VIH que tuvo una detención asistólica no resusitable debido a una infección invasiva por L. monocytogenes delcorazón 8. El análisis posterior de esta tensión en modelos de la infección del ratón indicó que tenía una capacidad aumentada de apuntar e invadir el tejido cardiaco. Un análisis limitado de aislados aleatorios adicionales de L. monocytogenes sugiere que las subpoblaciones de aislados bacterianos son capaces de infectar los corazones de los ratones en ausencia de cualquier daño previo al tejido cardíaco o a las válvulas cardíacas8. Interesante, dos de las tensiones mejor caracterizadas de los monocytogenes del L., 10403S y EGD, fueron encontradas para ser colonizadores pobres de células y del tejido cardiacos. La secuenciación del genoma del aislado 07PF0776 no reveló la presencia de nuevas islas de patogenicidad ni proporcionó evidencia de grupos de genes únicos19; esto sugiere que 07PF0776 se dirige a las células cardíacas para la invasión a través de la modificación de su arsenal existente de productos de genes de virulencia. El análisis histoquímico preliminar indica que 07PF0776 forma abscesos dentro de los corazones de ratón infectados que parecen similares al absceso observado dentro del paciente humano infectado original (datos no mostrados). Si otros aislantes cardiotrópicos de los monocytogenes del L. inducen la formación cardiaca similar del absceso sigue siendo ser determinado.

Los análisis presentados aquí se pueden modificar fácilmente para facilitar la examinación de diversos aspectos de la infección. Los cubrebocas individuales se pueden fijar y teñir para microscopía basada en la luz o la fluorescencia, los tiempos de incubación del cultivo de tejidos se pueden aumentar para la medición y comparación de las tasas de crecimiento intracelular de bacterias, los tejidos y órganos pueden incrustarse en parafina y procesarse para el examen microscópico para examinar la formación de abscesos y la distribución bacteriana a nivel celular. Al evaluar los niveles de invasión bacteriana de las células de cultivo de tejidos o la colonización de los tejidos del huésped, hay limitaciones en términos de la cantidad mínima de bacterias que cada ensayo puede detectar. Los ensayos de invasión in vitro tienen un límite inferior de detección de aproximadamente 300 UFC por cubrebocas. El ajuste del volumen de agua utilizado para el vórtice de las cubiertas puede mejorar la detección de un bajo número de bacterias, con volúmenes de lisis celular tan bajos como 500 μl que demuestran ser útiles para detectar cepas poco invasivas. Los cubrebocas se pueden sumergir brevemente en agua estéril para eliminar el exceso de gentamicina antes de la lisis de las células huésped en volúmenes más pequeños. Los niveles de volumen de hasta 5 ml o más se pueden utilizar para enumerar correctamente las cepas altamente invasivas. En los animales, los homogenados de órganos se pueden generar en volúmenes de 5 ml o 10 ml de ddH20, siendo útiles volúmenes más bajos para detectar niveles más bajos de bacterias, y volúmenes más altos para enumerar mejor los órganos fuertemente colonizados. El rango mínimo de detección de órganos infectados es de aproximadamente 100 UFC. Si los órganos se colonizan constantemente a niveles altos, considere usar un mayor volumen de agua (10 ml) y realizar más diluciones dentro de la placa de 96 pocillos.

Los métodos descritos se pueden aplicar a órganos y tejidos fuera del corazón. Los análisis de la invasión y las infecciones del ratón tales como éstos se han utilizado para evaluar la colonización en una multitud de sitios, incluyendo la placenta, el cerebro, la vesícula biliar, el hígado, y el intestino. Las modificaciones de los protocolos descritos arriba se pueden también hacer para acomodar tensiones hiperinvasivas y/o hipervirulentas, y la substitución de las células cardíacas con otros tipos de la célula se puede hacer para evaluar fenotipos de la invasión en los sitios fuera del sistema cardiovascular. Dado que los diferentes tipos de células han alterado las susceptibilidades a la invasión de L. monocytogenes, puede ser necesario ajustar parámetros como moi y tiempos de incubación para recuperar con precisión los datos de los ensayos.

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Disclosures

Los autores no reportan intereses financieros en competencia.

Acknowledgments

Este trabajo fue apoyado por las subvenciones del Servicio de Salud Pública AI41816 y AI099339 (N.E.F.) y por F31AI094886-01 (P.D.M.) del NIAID. Los contenidos son responsabilidad exclusiva de los autores y no representan necesariamente los puntos de vista oficiales de las fuentes de financiación.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Difco BHI Broth Base 237200 2 kg of Brain Heart Infusion powder (without agar)
Difco Agar 214510 2 kg of Granulated Agar
Difco BHI Agar 241810 2 kg of Brain Heart Infusion Powder with 7.5% Agar
in vitrogen LB Broth Base 12975-084 2 kg of Luria Broth Base Powder (without agar)
Fisher Glass Coverslips 12-545-80 12 mm glass coverslips
Falcon 24-well Tissue Culture Plate 35-3047 24 well, Plasma-treated Tissue Culture Plate
Falcon 14mL Polystyrene tube 352051 14 ml Polystyrene tubes
Falcon 96-well U-bottom plate 35-3077 Non-tissue culture treated 96-well plate
Corning 0.05% Trypsin, 0.53 mM EDTA (1X) 25-052-CI Stock solution of Trypsin EDTA for tissue culture
Corning DMEM (High glucose, high pyruvate) 15-013-CU DMEM media without FBS, glutamine, or antibiotics
Corning Pen/Strep/Glut Solution 30-009-CI Stock mixture of penicillin, streptomycin, and L-glutamine for tissue culture
Corning Gentamicin 30-005-CR 50 mg/ml Stock solution of Gentamicin for tissue culture
Cellgro (Corning) L-Glutamine 25005197 Stock L-glutamine solution without antibiotics
Denville 75cm^2 Flask T1225 75 cm2 tissue culture treated flask
Denville 1.5mL microcentrifuge tubes 2013004 1.5 ml microcentrifuge tubes
ATCC H9c2 Cardiac Myoblasts CRL-1446 Rat cardiac myoblasts
Hyclone Fetal Bovine Serum SH30070.63 Fetal Bovine Serum

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References

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Infección Número 99 Patogénesis bacteriana patógeno intracelular tropismo tisular invasión bacteriana infección cardíaca listeriosis
Evaluación De La Invasión Bacteriana De Las Células Cardíacas En Cultivo Y Colonización Del Corazón En Ratones Infectados Usando <em>Listeria monocytogenes</em>
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McMullen, P. D., Freitag, N. E. Assessing Bacterial Invasion of Cardiac Cells in Culture and Heart Colonization in Infected Mice Using Listeria monocytogenes. J. Vis. Exp. (99), e52497, doi:10.3791/52497 (2015).

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