Abstract
गिल ionocytes (आईसीएस) मछली में आयनिक नियमन के लिए कार्यात्मक इकाइयां हैं। वयस्कों में, वे गिल की filamental और तहदार epithelia पर पाए जाते हैं, जहां इस तरह के ना +, सीएल के रूप में वे परिवहन आयनों - आयन चैनल, पंप और एक्सचेंजर्स की एक किस्म के माध्यम से और सीए 2 +। teleost गिल बाहर से, जिह्वा-ग्रसनी (ग्यारहवीं) और वेगस (एक्स) तंत्रिकाओं (छठे) चेहरे द्वारा innervated है। नौवीं और दसवीं नसों भी गिल आईसी स्फूर्तिदान के बाह्य स्रोत हैं। इधर, स्फूर्तिदान, प्रसार और आईसीएस के वितरण का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल दो तकनीकों वर्णित हैं: एक समय अंतर धुंधला तकनीक और एक पूर्ण द्विपक्षीय गिल वितंत्रीभवन तकनीक। संक्षेप में, सुनहरी एक महत्वपूर्ण mitochondrion-विशिष्ट डाई को उजागर कर रहे हैं (उदाहरण के लिए, Mitotracker लाल) लेबल (जो लाल प्रतिदीप्ति) पूर्व मौजूदा आईसीएस। मछली या तो 3 के लिए ठीक करने के लिए अनुमति दी गई थी - 5 दिन या तुरंत एक पूर्ण द्विपक्षीय गिल वितंत्रीभवन कराना पड़ा। 3 के बाद - वसूली के 5 दिनों के, जीबीमारियों काटा और immunohistochemistry के लिए तय कर रहे हैं। ऊतक तो एक α-5 प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ दाग है (लक्ष्य कोशिकाओं से युक्त + / + K ATPase ना) सभी (दोनों नए और पहले से मौजूद) आईसीएस हरी लेबल है कि एक माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ संयोजन के रूप में। Confocal इमेजिंग का उपयोग करना, यह पूर्व मौजूदा आईसीएस और नए आईसीएस (एक व्यवहार्य mitochondrion-विशिष्ट डाई और α-5 दोनों के साथ लेबल) पीले रंग दिखाई देते हैं (α-5 ही साथ लेबल) हरी दिखाई देते हैं कि प्रदर्शन किया गया। मिलकर में इस्तेमाल किया दोनों तकनीकों मछली पर्यावरणीय चुनौतियों को उजागर कर रहे हैं जब गिल रेशा पर आईसीएस की स्फूर्तिदान, प्रसार और वितरण का अध्ययन करने के लिए लागू किया जा सकता है।
Introduction
आईसीएस मछली में आयनिक नियमन के लिए कार्यात्मक इकाई हैं और गिल तंतुओं की उपकला सतहों पर पाए जाते हैं और 4,6-8,10 lamellae। उपप्रकार की एक किस्म अनूठी विशेषताओं के अधिकारी है कि वर्णित किया गया है, आईसीएस के कई माइटोकॉन्ड्रिया के एक उच्च घनत्व (इस तरह वे भी mitochondrion युक्त कोशिकाओं के रूप में जाना जाता है) और / या एंजाइम के एक बहुतायत की विशेषता है ना + / + K ATPase (NKA)। आमतौर पर, इन आईसीएस घर आयन विनियमन (जैसे, ना + / एच + एक्सचेंजर, ना + / CL - सह ट्रांसपोर्टर, एच + पंप) में शामिल अन्य पंपों, आयन चैनलों और एक्सचेंजर्स की एक किस्म 2,10,11। एक प्रतिपूरक तंत्र के रूप में आईसीएस के पुनर्वितरण और प्रसार विशेष रूप से आयनिक तनाव (जैसे, आयन-गरीब पानी के लिए जोखिम) 4,8,9 दौरान आयन homeostasis को बनाए रखने के लिए केंद्रीय है।
यह अध्ययन एक समय अंतर धुंधला तकनीक का वर्णनकुए एक मछली गहरे नाले में नव proliferated ionocytes (आईसीएस) की पहचान करने के लिए। इस तकनीक गिल मेहराब की एक पूरी द्विपक्षीय वितंत्रीभवन के साथ युग्मित है। सुनहरी (Carassius auratus), इन अध्ययनों में प्रयुक्त प्रजातियों, वे संरचनात्मक रूप से उनके गहरे नाले 2 फिर से तैयार करने के लिए एक उल्लेखनीय क्षमता है क्योंकि गिल उपकला कोशिकाओं के प्रसार का अध्ययन करने के लिए अच्छी तरह से अनुकूल है। ठंडे पानी (<15 डिग्री सेल्सियस) या हाइपोक्सिया क्रमश: तीन को आदत हैं - गिल remodeling (30 डिग्री सेल्सियस सामान्य रूप से 15 पर बनाए रखा) मछली जब एक interlamellar सेल द्रव्यमान का विकास या त्याग (ILCM) को दर्शाता है। सुनहरी पर समय अंतर धुंधला तकनीक का उपयोग कर पिछले अध्ययनों 4,5 remodeling गिल के संदर्भ में गिल पर आईसीएस के पुनर्वितरण, तंत्रिका वितरण और प्रसार पर ध्यान केंद्रित किया है। Katoh और Kaneko एक killifish में परिवर्तन और गिल आईसीएस के प्रतिस्थापन का अध्ययन करने के लिए इस उपन्यास तकनीक विकसित (Fundulus heteroclitus) transfeताजा पानी (परिवार कल्याण) के लिए समुद्र के पानी (दप) से rred। इस अध्ययन में, फोकस 25 डिग्री सेल्सियस को आदत सुनहरी में आईसीएस के प्रसार और तंत्रिका वितरण पर है।
गिल remodeling के संदर्भ में, यह दिखाया गया था कि समय अंतर धुंधला तकनीक का उपयोग करना, सुनहरी hypoxic जोखिम और बाद में normoxic वसूली के दौरान आईसीएस की एक निरंतर संख्या बनाए रखने के लिए, हालांकि, innervated कोशिकाओं का प्रतिशत normoxic वसूली की अवधि पाँच भर में कमी आई है। यह तंत्रिका नियंत्रण 12 के तहत अधिक से अधिक 70 साल पहले मछली में आयनिक तेज तंत्र हैं कि प्रस्तावित किया गया था। teleost गिल भी "गिल तंत्रिकाओं" 13,14 के रूप में भेजा चेहरे (सप्तम), जिह्वा-ग्रसनी (ग्यारहवीं) और वेगस (एक्स) तंत्रिकाओं द्वारा innervated है। Zebrafish पर Jonz और नर्स (2003) द्वारा स्टडीज (देनियो rerio) गिल स्फूर्तिदान स्फूर्तिदान की उत्पत्ति बाह्य (सेल शरीर के (तंत्रिका फाइबर की सेल शरीर गिल को बाह्य जाता है) के रूप में अच्छी तरह से आंतरिक पता चला है कितंत्रिका फाइबर) गिल के लिए स्वाभाविक है। एक ही लेखकों को भी गिल आईसीएस बाहर से 7 innervated रहे हैं कि प्रदर्शन किया।
इस अध्ययन में, पूर्ण द्विपक्षीय गिल वितंत्रीभवन के साथ युग्मित समय अंतर धुंधला तकनीक सुनहरी में बाह्य स्फूर्तिदान कमी आईसीएस के प्रसार की जांच के लिए इस्तेमाल किया गया था। नाजुक शल्य चिकित्सा प्रक्रियाओं को सरल, और ionocytes आसानी से मानक इम्युनो-histochemical तकनीक का उपयोग कर पहचान कर रहे हैं - पूर्ण द्विपक्षीय गिल वितंत्रीभवन कपाल नसों नौवीं और एक्स उनके अपेक्षाकृत बड़े आकार (200 ग्राम 30 से) क्योंकि इन दो दृष्टिकोणों सुनहरी में संभव है विच्छेद करने के लिए संदर्भित करता है। विकास अध्ययन हाइब्रिडोमा बैंक, विश्वविद्यालय, वर्तमान अध्ययन में, आईसीएस (जैसे, Mitotracker लाल) एक महत्वपूर्ण mitochondrion-विशिष्ट डाई या ना + / + K -ATPase (α-5 के α-सबयूनिट के खिलाफ एक प्राथमिक एंटीबॉडी का उपयोग कल्पना कर रहे थे आयोवा, आयोवा सिटी आइए)। इस प्रोटोकॉल एक सीधा metho प्रदान करता हैvisualizing और मछली गिल पर आईसीएस के पुनर्वितरण और प्रसार का विश्लेषण करने के डी।
Protocol
दोनों प्रोटोकॉल पशु की देखभाल (CCAC) की कनाडा परिषद के दिशा निर्देशों को पुष्टि और ओटावा पशु की देखभाल समिति के विश्वविद्यालय (प्रोटोकॉल बीएल-226) के अनुमोदन से बाहर किए गए।
1. समय विभेदक धुंधला तकनीक: mitochondrion युक्त डाई स्नान
- डाइमिथाइल sulfoxide (100% DMSO) की 94.0 μl में 50 माइक्रोग्राम प्रति भंग करके 1 मिमी Mitotracker लाल स्टॉक समाधान तैयार है। जब उपयोग में नहीं -20 डिग्री सेल्सियस पर अंधेरे में शेयर समाधान रखें। फ्रीज / पिघलना चक्र से बचें।
- 600 मिलीलीटर की एक अधिकतम मात्रा के साथ - (6 बक्से 3) अंधेरे बक्से तैयार करें। प्रणाली पानी की 400 मिलीलीटर पानी (सामान्य रूप में आयोजित की जाती हैं मछली) के साथ बॉक्स भरें और ओ 2 का एक स्रोत प्रदान करने के लिए प्रत्येक बॉक्स में एक हवाई पत्थर जगह है। सुनहरी प्राप्त (30 - 40 ग्राम) और 400 पानी की मिलीलीटर और एक हवाई पत्थर के साथ बक्से में उन्हें जगह है। 30 मिनट के बाद, 0.1 माइक्रोन और 0.01% DMSO के अंतिम सांद्रता उपज के लिए व्यवहार्य mitochondrion युक्त डाई जोड़ें। 4 घंटे के लिए मछली स्नानआर।
- इन पर नियंत्रण मछली (यानी, कोई वितंत्रीभवन) हैं, बक्से के लिए पानी के प्रवाह पर बारी डाई बाहर निकलवाने और प्रोटोकॉल में आवंटित समय की अवधि के लिए मछली ठीक करने के लिए अनुमति देते हैं। 5 दिन - मछली आमतौर पर 3 के लिए बरामद कर रहे हैं।
- वसूली की अवधि के बाद धारा 3 के लिए आगे बढ़ें: समय विभेदक धुंधला तकनीक: Immunohistochemistry। इन मछलियों denervated किया जाए तो धारा 2 के लिए आगे बढ़ें: पूर्ण द्विपक्षीय वितंत्रीभवन प्रक्रिया।
2. पूर्ण द्विपक्षीय वितंत्रीभवन प्रक्रिया
- (घुमावदार) छात्र Vannas वसंत कैंची, मानक पैटर्न संदंश-सीधे की एक जोड़ी की एक जोड़ी प्राप्त करने, मानक पैटर्न संदंश घुमावदार की एक जोड़ी, नंबर 5 संदंश के दो जोड़े, ऊतक retractors की एक जोड़ी, छोटे कपास गेंदों (1 - 2 व्यास में मिमी), और कपास swabs (क्यू सुझावों या समकक्ष)।
- संवेदनाहारी पानी स्नान तैयार। सबसे पहले, 100 मिलीलीटर की एक अंतिम मात्रा करने के लिए benzocaine के 10 ग्राम भंग99% इथेनॉल के एक शेयर के समाधान तैयार करने के लिए। , संवेदनाहारी पानी स्नान तैयार आवश्यक तापमान में वातित प्रणाली पानी की 30 एल में शेयर benzocaine समाधान के 15 मिलीलीटर भंग करने के लिए। एक हवाई पंप या पानी की टंकी में एक केंद्रीय एयर लाइन से जुड़ा एक हवा-पत्थर रखकर पानी Aerate।
- संवेदनाहारी पानी स्नान (चित्रा 1 ए) में मछली रखें।
- साँस लेने में नहीं रह गया है, एक बार किसी सर्जरी की मेज पर मछली जगह और चित्रा 1 बी में दिखाया गया है कि यह intubate। वातित संवेदनाहारी समाधान के साथ गहरे नाले में सिंचाई के लिए अपने मुख गुहा में एक ट्यूब डालने से यह मत करो। गहरे नाले की सिंचाई मछली वितंत्रीभवन प्रक्रिया के दौरान 2 हे और संवेदनाहारी की एक पर्याप्त राशि के साथ आपूर्ति की है कि सुनिश्चित करता है। सिर थोड़ा नीचे झुका हुआ है तो यह है कि मछली स्थिति। यह चौथा गिल मेहराब के पीछे क्षेत्र के बेहतर उपयोग के लिए अनुमति देता है।
- धीरे सीधे मानक पैटर्न संदंश के साथ operculum लिफ्टऔर operculum और सिर के अंदर के बीच ऊतक retractors जगह है। ध्यान से दूर सिर से operculum रखने के लिए और उजागर गहरे नाले रखने के लिए ऊतक retractors खुला।
- संवेदनाहारी समाधान इस प्रक्रिया के दौरान गहरे नाले की सिंचाई कर रहा है कि सुनिश्चित करें। प्रतिकर्षक सभी चार गिल मेहराब तक पहुँच प्रदान करता है जो सिर के बगल में संभालती आराम करें।
- सिर के चौथे गिल मेहराब संलग्न बंधन में तनाव पैदा करने के लिए उन्हें खोलने धीरे चौथे गिल मेहराब और सिर के पीछे के बीच घुमावदार मानक पैटर्न संदंश प्लेस और। Opercular गुहा को गिल मेहराब के पृष्ठीय अंत जोड़ने उपकला भेदी द्वारा - (3 मिमी 2) नंबर एक जोड़ी के साथ 5 संदंश एक छोटे से खोलने पैदा करते हैं। एक प्रमुख रक्त वाहिका को नुकसान पहुँचाए का खतरा है, क्योंकि वहाँ बहुत गहरे में नहीं जाने के लिए सावधान रहें।
- 5 संदंश धीरे धीरे और सावधानी से नंबर के साथ आयोजित एक छोटे से कपास की गेंद के साथ ग्यारहवीं (जिह्वा-ग्रसनी) और एक्स (वेगस) तंत्रिकाओं को बेनकाब करने के लिए चीरा का विस्तार करें। फ्रीफिर से रक्त वाहिकाओं को नुकसान नहीं ख्याल रख रही है, नंबर 5 संदंश का उपयोग करके किसी भी संयोजी ऊतक से नसों।
नोट: सुनहरी गिल नौवीं और दसवीं नसों चौथे गिल मेहराब के पीछे गहरी आराम और गिल मेहराब में खिला प्रमुख रक्त वाहिकाओं के लिए निकटता में हैं। - नसों उपयोग पहचान की गई है एक बार घुमावदार मानक आकार संदंश के साथ खुला चीरा जबकि पकड़े घुमावदार वसंत कैंची ध्यान से नसों में कटौती करने के लिए। नसों विच्छेद के बाद, धीरे घुमावदार संदंश वापस लेना। 48 घंटा - उपकला बहुत पतली है और चीरा आमतौर पर 24 के भीतर अपने आप ही बंद कर देता है, क्योंकि sutures के साथ चीरा को बंद करने की कोई जरूरत नहीं है। ऊतक प्रतिकर्षक निकालें।
- सिर के दूसरे पक्ष पर एक ही प्रक्रिया दोहराएँ।
- संज्ञाहरण से मछली ठीक करने के लिए नए सिरे से वातित पानी के लिए संवेदनाहारी से गहरे नाले की सिंचाई स्विच करें। एक बार opercular आंदोलनों कम से कम 24 घंटे के लिए स्वस्थ हो जाना करने के लिए प्रयोगात्मक टैंकों में मछली ले जाने के फिर से शुरू कर दिया है।
3. समय विभेदक धुंधला तकनीक: Immunohistochemistry
- (; पीबीएस के 96 मिलीलीटर में 4 जी पीएफए पीबीएस) पहले, 1x फॉस्फेट बफर खारा में 4% paraformaldehyde (पीएफए) तैयार करते हैं। पीएफए आरटी पर पीबीएस में आसानी से भंग नहीं करता। एक पानी के स्नान में हीट समाधान पीएफए भंग करने के लिए। एक धूआं हुड में इस प्रदर्शन करते हैं। पीएफए समाधान में एक बार उपयोग करने से पहले ठंडा करते हैं। 2 सप्ताह के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर।
- 8 जगमगाहट शीशियों (गिल कट्टर प्रति एक शीशी) की कुल के लिए एक जगमगाहट शीशी में 4% पीएफए के 4 मिलीलीटर - गिल ऊतक मछली euthanizing और निकालने से पहले, 3 जगह है। इसके अलावा, एक छोटे से 1x पीबीएस के साथ यह नाव तौलना और भरने ले। यह यह excised किया गया है के बाद ऊतक धोने के लिए इस्तेमाल किया जाएगा। बर्फ पर सभी समाधान रखें।
- व्यवहार्य mitochondrion युक्त डाई प्रदर्शन के बादप्रयोग benzocaine की अधिक मात्रा के साथ एक पानी के स्नान में रखकर सुनहरी euthanize, खत्म हो गया है।
- गिल गिल टोकरी में से प्रत्येक के अंत तोड़ने के लिए एक सिर के पक्ष और घुमावदार कैंची पर operculum लिफ्ट करने के लिए कुंद संदंश का प्रयोग करें। ध्यान से कुंद संदंश का उपयोग rakers से गहरे नाले लेने और opercular गुहा के बाहर उन्हें उठा। इसके तत्काल बाद अतिरिक्त benzocaine और खून निकालने के लिए पीबीएस 1x बर्फ ठंड में गहरे नाले धो लें।
- 4% पीएफए के साथ भरा अलग शीशियों में excised गहरे नाले (प्रत्येक गिल मेहराब के लिए एक शीशी) प्लेस और 4 डिग्री सेल्सियस पर हे / एन तय कर लो।
- निर्धारण के बाद, 1X पीबीएस में अतिरिक्त पीएफए धोने और 4 डिग्री सेल्सियस पर आरटी या हे / एन पर छह घंटे के लिए एक प्रकार के बरतन पर 1% ट्राइटन एक्स के 1.5 मिलीलीटर के साथ भरा एक 2 मिलीलीटर गोली ट्यूब में ऊतक जगह है। यह कदम ऊतक permeabilizes। पूरे गिल एक 2 मिलीलीटर ट्यूब में जगह करने के लिए बहुत बड़ी है तो तंतु नुकसान नहीं ट्यूब देखभाल फिट करने के लिए काफी छोटे वर्गों में ऊतक में कटौती।
- एमआई द्वारा प्राथमिक एंटीबॉडी dilutions तैयारXing 1x पीबीएस के 992 μl में प्रत्येक प्राथमिक एंटीबॉडी (8 μl की कुल) के शेयर समाधान के 4 μl। NKA (NKA युक्त कोशिकाओं लेबल) सुनिश्चित करें कि और Zn-12 (लेबल न्यूरॉन्स) प्राथमिक एंटीबॉडी ही मेजबान में उठाया गया है। शोधकर्ताओं वे एक अलग मेजबान प्रजातियों में उठाया प्राथमिक और माध्यमिक एंटीबॉडी का इस्तेमाल करना होगा, जिसके लिए एक ही समय में विशिष्ट आईसी उपप्रकार की पहचान करने के लिए तय अगर यह महत्वपूर्ण है।
- ट्राइटन एक्स समाधान निकालें और ऊतक एक एक जोड़ धोने के बिना: एक NKA मोनोक्लोनल एंटीबॉडी के 250 कमजोर पड़ने (1x पीबीएस में पतला) (α-5) NKA युक्त कोशिकाओं और एक zebrafish विशिष्ट neuronal एंटीबॉडी का पता लगाने के लिए (Zn-12) तंत्रिका तंतुओं (प्राथमिक एंटीबॉडी) का पता लगाने और 4 डिग्री सेल्सियस पर आरटी या हे / एन पर छह घंटे के लिए एक प्रकार के बरतन पर सेते हैं।
- 1x पीबीएस का उपयोग करते हुए 3 मिनट प्रत्येक के लिए प्राथमिक एंटीबॉडी तीन बार धोएं। ऐसा करने के लिए, एक पिपेट का उपयोग कर इसे बाहर suctioning द्वारा ट्यूब से प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान निकालें।
- एक पर माध्यमिक एंटीबॉडी तैयार करें1: 1x पीबीएस के 995 μl में शेयर माध्यमिक एंटीबॉडी के 5 μl मिश्रण से 200 कमजोर पड़ने। माध्यमिक एंटीबॉडी (एलेक्सा Fluor 488) लागू करें और एक प्रकार के बरतन पर 4 डिग्री सेल्सियस पर आरटी या हे / एन पर छह घंटे के लिए सेते हैं।
नोट: Mitotracker लाल एक ~ 594 एनएम तरंगदैर्ध्य पर उत्साहित है और लाल प्रतिदीप्ति जाएगा। एक ~ 488 एनएम तरंगदैर्ध्य पर उत्साहित और हरे रंग fluoresces है कि एक माध्यमिक एंटीबॉडी NKA लेबल और Zn-12 प्राथमिक एंटीबॉडी के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए। - (कदम 3.7 में वर्णित) 5 मिनट प्रत्येक के लिए ऊतक 3 बार धोने से अतिरिक्त माध्यमिक एंटीबॉडी निकालें।
4. इमेजिंग
- Washes के बाद, कोशिकाओं और तंत्रिका तंतुओं के confocal इमेजिंग माउंट पूरे के लिए एक अवतल स्लाइड पर ऊतक माउंट। ऊतक माउंट करने के लिए, पहली बार एक फ्लैट खुर्दबीन स्लाइड पर 1x पीबीएस की एक बूंद (200 μl) में जगह है। इस ऊतक सुखाना नहीं है कि यह सुनिश्चित करता है।
- घुमावदार सूक्ष्म कैंची से गिल hemibranchs अलग करें। 1x पीबीएस की एक बूंद और एक अवतल स्लाइड में बढ़ते मीडिया की एक बूंद प्लेस।
- ऊपर की ओर का सामना करना पड़ रेशा के अग्रणी बढ़त के साथ अवतल स्लाइड में विभाजित hemibranchs प्लेस और एक कवर पर्ची के साथ कवर किया। के आसपास घूम रहा है और ऊतक विस्थापित से कवर पर्ची को रोकने के क्रम में नेल पॉलिश के साथ कवर पर्ची के किनारों थपका। इमेजिंग से पहले 15 मिनट - ऊतक 10 के लिए अवतल स्लाइड के नीचे करने के लिए व्यवस्थित करने के लिए अनुमति दें।
- प्रत्येक गिल चाप के लिए, गिल कट्टर प्रति छह छवियों का निर्माण, इमेजिंग के लिए यादृच्छिक पर छह गिल तंतुओं का चयन करें। 3 माइक्रोन ऑप्टिकल स्लाइस - 1 लेने के द्वारा छवि के लिए ऊतक पारंपरिक confocal माइक्रोस्कोपी का उपयोग करें।
नोट: किसी भी पूर्व मौजूदा कोशिकाओं Mitotracker लाल के साथ लेबल किया जाएगा और NKA के लिए सकारात्मक ही पीला दिखाई देगा। केवल लाल दिखाई देते हैं कि प्रकोष्ठों NKA शामिल नहीं है कि पहले से मौजूद आईसीएस हैं। किसी भी हाल में proliferated सेल केवल NKA के लिए सकारात्मक हो जाएगा और केवल हरे रंग में दिखाई देगा। तंत्रिका तंतुओं भी हरी दिखाई देगा।
Ionocyte मात्रा के लिए 5. छवि विश्लेषण
- पूर्वी वायु कमान के लिएimaged किया गया है कि एच गिल रेशा, जेड ढेर के वर्गों के माध्यम से स्क्रॉल और वर्तमान और वे हाल में भेदभाव कर रहे हैं या नहीं, पहले से मौजूद है, और / या innervated तहदार और filamental आईसीएस की संख्या की गणना के द्वारा आईसीएस और संबद्ध स्फूर्तिदान यों ।
- रेशा की (2 मिमी) रेशा या प्रति क्षेत्र के प्रति आईसीएस यों। आईसीएस मात्रा निर्धारित किया गया है जिसमें रेशा के क्षेत्र को शामिल फिलामेंट की lamellae की रूपरेखा तैयार करने के लिए छवियों को प्राप्त करने के लिए इस्तेमाल किया सॉफ्टवेयर के साथ जुड़े ड्राइंग उपकरण का उपयोग करके यह मत करो। अधिकांश confocal इमेजिंग सॉफ्टवेयर प्रोग्राम छवि पर एक उल्लिखित क्षेत्र के क्षेत्र की गणना करने का विकल्प है। आप इस क्षेत्र के अधिग्रहण के लिए ऐसा करने के लिए अनुमति देता है जो इमेजिंग सॉफ्टवेयर में विकल्प का प्रयोग करें।
- (2 मिमी प्रति, उदाहरण के लिए) प्रति इकाई क्षेत्र आईसीएस का एक उपाय प्राप्त करने के लिए सॉफ्टवेयर द्वारा गणना क्षेत्र द्वारा गिना आईसीएस फूट डालो।
Representative Results
चित्रा 1 की स्थापना की सर्जरी तालिका (चित्रा 1 ए) दिखाता है, शल्य चिकित्सा के दौरान मछली के स्थान (चित्रा 1 बी) और समय अंतर धुंधला तकनीक (चित्रा 1C) के लिए तीन सबसे महत्वपूर्ण कदम। चरण 1 में, मछली अंधेरे में 25 डिग्री सेल्सियस पर एक अच्छी तरह से वातित नहाने के पानी में 30 मिनट के लिए रखा जाता है। 30 मिनट की अवधि के दौरान, शोधकर्ता चरण 2 (चित्रा 1C) के दौरान पानी के लिए जोड़ा जाता है जो DMSO में mitochondrion युक्त डाई विभाज्य तैयार कर सकते हैं। चरण 2 में ऊष्मायन अवधि mitochondrion युक्त कोशिकाओं (यानी, आईसीएस) में पानी से mitochondrion युक्त डाई के तेज के लिए अनुमति देता है। मछली तो या तो पूर्ण द्विपक्षीय वितंत्रीभवन प्रक्रिया या मछली anaesthetized है जिसमें एक दिखावा प्रक्रिया और चालाकी से opercula गुजरना कर सकते हैं, लेकिन नसों बरकरार रहेगा। चरण 3 में स्थापित EI है कि एक मछली के लिए पानी बहने के साथ प्रदान की वसूली चैम्बर का प्रतिनिधित्व करता हैवहाँ पूर्ण द्विपक्षीय वितंत्रीभवन या एक "दिखावा" प्रक्रिया से गुजरा।
वसूली की अवधि के बाद, मछली euthanized किया गया था और गहरे नाले excised और immunohistochemistry के लिए तय किया गया। एक "दिखावा" प्रक्रिया आया था कि एक मछली की गिल रेशा पर आईसीएस के समग्र वितरण और तंत्रिका वितरण चित्रा 2 में दिखाया गया है। आईसीएस interlamellar क्षेत्रों के। 2A चित्रा से पता चलता है के आधार पर करने के साथ ही filamental epithelia पर मौजूद हैं mitochondrion युक्त डाई के साथ लेबल पूर्व मौजूदा आईसीएस (वितंत्रीभवन / दिखावा प्रक्रियाओं प्रदर्शन किया गया से पहले यानी, इन आईसीएस अस्तित्व में)। चित्रा 2B तंत्रिका तंतुओं पूर्व मौजूदा और नवगठित आईसीएस (NKA immunoreactivity द्वारा की पहचान) filamental की और innervating से पता चलता है तहदार epithelia। अंत में, दो छवियों के विलय (चित्रा -2) स्पष्ट रूप से पूर्व मौजूदा आईसीएस (पीला दिखाई देते हैं) और नए आईसीएस (हरे रंग दिखाई देते हैं) का पता चलता है।चित्रा 2 डी 2A चित्रा-सी में दर्शाया फिलामेंट के लिए आईसी मात्रा का ठहराव के एक प्रतिनिधि का ग्राफ गिरा है। इस विशिष्ट रेशा पर, पूर्व मौजूदा आईसीएस की तुलना में 2 मिमी प्रति नव proliferated आईसीएस की एक बड़ी संख्या होने के लिए वहाँ दिखाई देते हैं (एन = 1)। बाह्य गिल स्फूर्तिदान के स्रोत को दूर करने के लिए, नौवीं और दसवीं कपाल नसों (बाह्य स्फूर्तिदान) कटे हुए थे। चित्रा 3A गिल तंतुओं के बाद opercular गुहा के पृष्ठीय क्षेत्र से पता चलता है और तंत्रिकाओं को कवर epithelia नौवीं और दसवीं बेनकाब करने के लिए हटा दिया गया है दो प्रमुख तंत्रिका चड्डी से अवधि (जो रोमन अंकों के साथ संकेत दिया) कपाल नसों सभी चार मेहराब (चित्रा 3A) अंदर आना करने के लिए; गिल मेहराब पहले गिल मेहराब के चुनिंदा वितंत्रीभवन उदाहरण देकर स्पष्ट 4. चित्रा 3 बी-ई के जरिए एक गिने जा रहे हैं। पहले गिल मेहराब आराम करने के लिए स्फूर्तिदान ओ को प्रभावित किए बिना हटाया जा सकता है जो दोनों नौवीं और दसवीं कपाल नसों (3B चित्रा) द्वारा innervated हैगिल मेहराब (चित्रा -3 सी-ई) च। गिल तंतुओं को बाह्य स्फूर्तिदान के क्रमिक नुकसान (आंकड़े -4 ए-सी) में पूर्ण द्विपक्षीय वितंत्रीभवन का परिणाम है। नियंत्रण मछली रेशा (चित्रा -4 ए) की लंबाई तक फैला है, जो एक स्पष्ट तंत्रिका बंडल दिखा रहे हैं। पूर्ण द्विपक्षीय वितंत्रीभवन वसूली के 2 दिनों (चित्रा 4 बी) के बाद बाह्य स्फूर्तिदान के कुछ नुकसान में हुई। बाह्य स्फूर्तिदान के आगे लापता होने वितंत्रीभवन (चित्रा 4C) से वसूली के 5 दिनों के बाद नोट किया गया था। वसूली के 5 दिनों के संभवतः गिल रेशा भीतर सेल शरीर के साथ नसों से निकाला गया था के बाद आईसीएस करने के लिए किसी भी शेष स्फूर्तिदान (आंतरिक स्फूर्तिदान, चित्रा 4C)।
चित्रा 1. प्रायोगिक में इस्तेमाल कदम की वितंत्रीभवन प्रक्रिया और अनुक्रम के लिए स्थापितसमय अंतर धुंधला तकनीक। संवेदनाहारी और वसूली टैंक दिखा वितंत्रीभवन प्रक्रिया के लिए सेट अप (ए) सर्जरी मेज। एक anaesthetized, intubated मछली की नियुक्ति (बी) उदाहरण। समय अंतर धुंधला तकनीक में इस्तेमाल किया (सी) महत्वपूर्ण कदम। चरण 1 में, मछली 30 मिनट के लिए एक तापमान नियंत्रित, स्थिर वातित नहाने के पानी में रखा गया है। mitochondrion युक्त डाई 0.1 सुक्ष्ममापी के अंतिम एकाग्रता के लिए चरण 2 में जोड़ा जाता है और मछली 4 घंटे की एक न्यूनतम के लिए समाधान में स्नान करने के लिए अनुमति दी है। जल प्रवाह चरण मछली गिल की एक पूरी द्विपक्षीय वितंत्रीभवन या एक दिखावा सर्जरी या तो undergoes बात जिस पर 3 में फिर आरंभ होता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
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चित्रा 2 दिन पूर्ण द्विपक्षीय वितंत्रीभवन के बाद (25 डिग्री सेल्सियस को आदत) एक सुनहरी में समय अंतर धुंधला तकनीक का प्रतिनिधित्व 2. लाइट micrographs। (ए) के पूर्व मौजूदा ionocytes (आईसीएस, तीर) का वितरण। एक एकल गिल रेशा पर mitochondrion युक्त डाई धुंधला द्वारा पता चला है (बी) आईसीएस के वितरण (नए और पहले से मौजूद है) और गिल तंत्रिकाओं (धराशायी तीर) क्रमशः, α-5 और Zn-12 एंटीबॉडी के साथ धुंधला से पता चला है। तीर आईसीएस से संकेत मिलता है (सी) (ए) और (बी) के ओवरलैप पूर्व मौजूदा आईसीएस अलग।; (; तीर द्वारा संकेत हरी दिखाई देते हैं) नव proliferated आईसीएस से (पीला दिखाई देते तीर द्वारा संकेत)। में डालें (सी) एक innervated पूर्व मौजूदा ionocyte के एक बढ़ाई है। (डी) पैनल (एसी) में दिखाया गया फिलामेंट के लिए आईसी मात्रा का ठहराव के प्रतिनिधि ग्राफ। पैनल में एन = 1. स्केल बार (सी) 50 माइक्रोन है और सभी पैनलों के लिए लागू होता है।/ftp_upload/52548/52548fig2highres.jpg "लक्ष्य =" _blank "> इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
गिल स्फूर्तिदान के विभिन्न चरणों का चित्रण 3. प्रतिनिधि छवियों चित्रा। नौवीं और दसवीं कपाल नसों सभी 4 गिल मेहराब innervating दिखा मुख गुहा (ए) पृष्ठीय दृश्य। गिल मेहराब 1-4 गिने जा रहे हैं। गिल तंतुओं और नसों बेहतर स्फूर्तिदान कल्पना करने के लिए हटा दिया गया है को कवर ऊतक। (बी) 1 सेंट और 2 एन डी गिल मेहराब संवेदी अंग प्रकट करने के लिए अलग हो रहे हैं और नौवीं और दसवीं कपाल नसों की शाखाओं 1 सेंट गिल innervating कट्टर। नौवीं और दसवीं कपाल नसों की शाखाओं विच्छेद द्वारा 1 सेंट गिल मेहराब के चुनिंदा वितंत्रीभवन दिखा छवियों के (सीई) अनुक्रम। एक योजनाबद्ध पुनः के लिएTeleost मछली की गिल स्फूर्तिदान की प्रस्तुति, Milsom एट अल में एक संदर्भ लें चित्र 26 छवियों में सफेद लाइनें खुर्दबीन रोशनी से पानी प्रतिबिंब हैं। वे किसी भी रूपात्मक संरचना को परिभाषित नहीं है। पैनल में स्केल बार (ई) 4 मिमी है और सभी पैनलों के लिए लागू होता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
25 डिग्री सेल्सियस Ionocytes (तीर प्रमुखों द्वारा इंगित) को आदत एक सुनहरी की एक सेंट गिल मेहराब की एक भी रेशा पर ionocytes के वितरण और तंत्रिका वितरण चित्रण चित्रा 4. लाइट micrographs संकेत दिया α-5 एंटीबॉडी और तंत्रिकाओं (साथ दाग रहे थे बीY तीर)। Zn-12 एंटीबॉडी के साथ दाग संभवतः व्यापक तहदार शाखाओं के साथ नौवीं और दसवीं तंत्रिकाओं (बाह्य स्फूर्तिदान) से होने वाले एक केंद्रीय तंत्रिका बंडल दिखा एक नियंत्रण मछली की (ए) गिल रेशा थे। संकेत दिया ionocytes से कुछ भी (डालने)। (बी) ए गिल रेशा 2 दिन पूर्ण द्विपक्षीय वितंत्रीभवन के बाद innervated रहे हैं। तहदार स्फूर्तिदान 5 दिनों बाह्य स्फूर्तिदान काफी हद तक अनुपस्थित था कि प्रदर्शन पूर्ण द्विपक्षीय वितंत्रीभवन के बाद। (सी) ए गिल रेशा काफी हद तक बरकरार दिखाई दिया, जबकि केंद्रीय तंत्रिका बंडल की कमी आई थी। गुणात्मक विश्लेषण पूर्ण द्विपक्षीय वितंत्रीभवन गिल रेशा भीतर सेल निकायों (आंतरिक स्फूर्तिदान) फिलामेंट के माध्यम से और lamellae में तंत्रिकाओं के एक नेटवर्क बनाने के साथ नसों को बनाए रखते हुए बाह्य गिल स्फूर्तिदान की गिरावट का कारण बनता है कि पता चलता है। कृपयाइस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
Discussion
समय अंतर धुंधला तकनीक आयन तेज की गतिशील विनियमन को समझने के लिए और गिल epithelia में आईसीएस के अस्थायी पुनर्वितरण की जांच के लिए एक उपयोगी उपकरण हो सकता है। एक सीधी प्रक्रिया हालांकि, समय अंतर धुंधला तकनीक की सफलता के लिए महत्वपूर्ण हैं कि महत्वपूर्ण बिंदुओं का एक नंबर रहे हैं। सुनहरी प्रोटोकॉल में आवंटित समय के लिए mitochondrion युक्त डाई से अवगत कराया जाना चाहिए। कम जोखिम mitochondrion युक्त कोशिकाओं (यानी, ionocytes) द्वारा डाई के गरीब तेज में परिणाम होगा। नियतन के दौरान गिल ऊतक जल्दी से excised किया जाना चाहिए और फोटो विरंजन से बचने के लिए अंधेरे में रखा। ऊतक निर्धारण के दो सप्ताह के भीतर इमेजिंग के लिए कार्रवाई की जानी चाहिए। द्विपक्षीय तंत्रिका सेक्शनिंग प्रक्रिया के दौरान मछली अच्छी तरह से anaesthetized है कि यह सुनिश्चित; नसों और रक्त वाहिकाओं को स्पष्ट रूप से पहचाने जाते हैं; यह एक वसूली की टंकी के लिए ले जाया जाता है और इससे पहले कि मछली पूर्ण opercular समारोह शुरू।
"> परिवार कल्याण पर्यावरण। निष्क्रिय आयन घाटा और आसमाटिक पानी लाभ 14 के बीच संतुलन साधने की दोहरी चुनौती के साथ मछली प्रस्तुत करता निष्क्रिय आयन घाटे के संतुलन filamental और तहदार epithelia जहां वे कर सकते हैं करने के लिए अनुवादित हैं जो आईसीएस भर नमक के सक्रिय तेज के माध्यम से होता है बाहरी वातावरण 2,4,8,9,16 के साथ सीधे संपर्क कर सकते हैं। हालांकि, गिल पर आईसीएस के स्थान स्थिर नहीं है। पिछले तीन दशकों में अध्ययन का एक नंबर है कि कई परिवार कल्याण मछली प्रजातियों से पता चला है, का सामना करना पड़ा जब एक ईओण और / या तापमान चुनौती के साथ, लामेल्ला 1,2,4,5,17-21 के अधिक डिस्टल क्षेत्रों के लिए लामेल्ला का रेशा या आधार से ब्रान्चियल आईसीएस पुनर्वितरित। इस तरह के पुनर्वितरण lamellae की मोटाई में वृद्धि हो सकती है, जो गैस हस्तांतरण समझौता कर सकते हैं (ओ 2, सीओ 2) 22। शोधकर्ताओं ने इस पांडुलिपि में वर्णित समय अंतर धुंधला तकनीक का इस्तेमाल किया है गिल epithelia भर में स्थानांतरण और emergenc ट्रैक करने के लिएइन विभिन्न प्रयोगात्मक शर्तों (चित्रा 1C) 1,4,5 के तहत गिल epithelia पर नए आईसीएस के ई।गहरे नाले, और शायद गिल आईसीएस, नौवीं और दसवीं कपाल नसों 7,23-25 द्वारा innervated रहे हैं। इन तंत्रिकाओं क्रमश: करने के लिए और गिल से अपवाही और अभिवाही आदानों दोनों ले। वे 4 वें गिल मेहराब के पीछे मुख गुहा के पृष्ठीय पक्ष पर स्थित हैं। नसों और द्विपक्षीय वितंत्रीभवन प्रक्रिया का प्रदर्शन किया जा सकता है जिस आसानी से की पहुंच प्रजातियों विशिष्ट है। नसों के ऊतकों की एक पतली परत के नीचे 4 वें गिल मेहराब के पीछे एक ही विमान में झूठ बोलने के लिए के लिए ट्राउट, उदाहरण के लिए, सिर की ओर इशारा किया और चपटा शरीर रचना की अनुमति देता है। इस नसों दिखाई और वितंत्रीभवन कार्यविधि को पूरा करने के लिए शोधकर्ता के लिए आसानी से सुलभ बना देता है। इसके विपरीत, सुनहरी एक छोटा थूथन और एक राउंडर सिर है। सुनहरी की नौवीं और दसवीं कपाल नसों पृष्ठीय एसआई में गहरी झूठविभिन्न विमानों के कब्जे में 4 वें गिल मेहराब के बाद गुहा के डी। इस उन्मुखीकरण नसों के लिए उपयोग की आसानी सीमा और उपयुक्त नसों की पहचान करने और तोड़ने के लिए एक और अधिक सावधान दृष्टिकोण की आवश्यकता है। वितंत्रीभवन प्रक्रिया का उद्देश्य क्रमश: करने के लिए और गिल से संवेदी अभिवाही और अपवाही इनपुट दूर करने के लिए है। गिल मेहराब की वितंत्रीभवन भी radioisotopes का उपयोग कर आयन प्रवाह प्रयोगों (जैसे, 22 ना) के साथ मिलकर किया जा सकता है। इन तकनीकों में गिल epithelia भर आयन आंदोलन पर नर्वस इनपुट के योगदान का अध्ययन करने के लिए मिलकर में इस्तेमाल किया जा सकता है। वितंत्रीभवन प्रक्रिया के लिए एक और सीमा तंत्रिका विच्छेद इस प्रकार, जब संवेदी और मोटर न्यूरॉन्स के बीच अंतर यह तंत्रिका वितरण के दोनों प्रकार हटाया जा रहा है कि संभव है बंडल की अक्षमता है। किसी भी मोटर न्यूरॉन्स विच्छेद मछली के गिल और opercular आंदोलन को प्रभावित कर सकता है। गिल वितंत्रीभवन प्रयोगों प्रदर्शन जब इस प्रकार यह भी बाद वेंटिलेशन पर नजर रखने के लिए महत्वपूर्ण हैमछली गैस और आयन एक्सचेंज दोनों के लिए पर्याप्त गिल आंदोलन है कि यह सुनिश्चित करने के लिए प्रक्रिया से बरामद किया है।
अंधेरे चक्र और फेड वाणिज्यिक खाद्य छर्रों: इस पांडुलिपि उपयोग वयस्क पशुओं में वर्णित प्रोटोकॉल एक 12:12 प्रकाश पर रखा। इन तरीकों कई मायनों में संशोधित किया जा सकता है। सबसे पहले, mitochondrion युक्त डाई प्रदर्शन के बाद वसूली की अवधि के शोधकर्ता प्रोटोकॉल (जैसे, 1, 3, 5, या 14 दिन) की आवश्यकताओं को समायोजित किया जा सकता है। प्रयोगशाला में mitochondrion युक्त डाई प्रदर्शन के बाद वसूली की सबसे लंबी अवधि 14 दिनों 4,5 किया गया है। वसूली के 14 दिनों के बाद mitochondrion युक्त डाई की प्रतिदीप्ति की तीव्रता में एक महत्वपूर्ण कमी नहीं था। दूसरा, α-5 प्राथमिक एंटीबॉडी का उपयोग केवल NKA युक्त कोशिकाओं की पहचान करने और गिल आईसीएस के विभिन्न उपप्रकार के बीच भेद नहीं करता तक सीमित है। आईसीएस के बहुमत दोनों mitochondr हैं कि सौभाग्य से, सुनहरी में यह स्थापित किया गया थाआयन-रिच (Mitotracker साथ लेबल) और सभी मछली प्रजातियों 4,27 में मामला नहीं हो सकता है, जो कोशिकाओं (α-5 के साथ लेबल) NKA युक्त। भविष्य प्रयोगों चैनलों, पंप और एक्सचेंजर्स (जैसे, Nhe, एच + पंप) की एक किस्म के खिलाफ विशेष रूप से निर्देशित एंटीबॉडी का उपयोग करके विशिष्ट आईसी उपप्रकार के अस्थायी पुनर्वितरण निम्नलिखित पर ध्यान केंद्रित कर सकते हैं। पिछले अध्ययनों में पाया गया कि mitochondrion युक्त डाई प्रदर्शनी NKA immunoreactivity 4 के साथ दाग ionocytes के बहुमत। आईसीएस की INNERVATION zebrafish व्युत्पन्न न्यूरॉन विशिष्ट प्रतिजन (Zn-12) के खिलाफ एक प्राथमिक एंटीबॉडी का उपयोग करके पता लगाया जा सकता है। इस अध्ययन में,-5 α और Zn-12 प्राथमिक एंटीबॉडी दोनों के लिए एक ही माध्यमिक एंटीबॉडी (एलेक्सा Fluor 488) का उपयोग कर पाया गया। दोनों को प्राथमिक एंटीबॉडी एक माउस की मेजबानी में उठाया जा रहा है और NKA युक्त कोशिकाओं और न्यूरॉन्स वे एक ही रंग प्रतिदीप्ति भले ही आकृति विज्ञान के प्रतिष्ठित किया जा सकता है कि इस तथ्य से दूर है करने के लिए इस सीमा की वजह से है। अनुक्रमिक धुंधलाविभिन्न माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ (एलेक्सा Fluor 488 के साथ जैसे, पहले α-5 तब एलेक्सा Fluor 594 के साथ-12 Zn) भी एक ही रंग fluorescing दोनों मार्करों होने की समस्या को खत्म करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। अन्त में, पूर्ण द्विपक्षीय तंत्रिका सेक्शनिंग प्रोटोकॉल विशिष्ट गिल मेहराब के लिए तंत्रिकाओं को लक्षित करने के लिए संशोधित किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, चयनात्मक तंत्रिका सेक्शनिंग धीरे गिल टोकरी (चित्रा 2B-ई) के पृष्ठीय अंत में पहली गिल मेहराब के लिए अग्रणी नसों को बेनकाब करने के लिए पहली और दूसरी गिल मेहराब को अलग करने से पहले गिल चाप पर प्रदर्शन किया जा सकता है। समय अंतर तकनीक को भी वे विकास और गिल को त्वचा से आयन परिवहन संक्रमण के रूप में लार्वा zebrafish मछली में ionocytes के वितरण का अध्ययन करने के लिए लागू किया जा सकता है।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MitoTracker Red | Life Technologies | M-7512 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma Alrdich | D2650 | |
| α-5 primary antibody | Develompental Hybridoma Bank | a5 | |
| zn12 primary antibody | Develompental Hybridoma Bank | zn12 | |
| Alexa Fluor 488 (anti mouse) | Life Technologies | A-11001 | |
| Benzocaine | Sigma Alrdich | E1501 | 4-aminobenzoic acid ethyl ester, ethyl 4-aminobenzoate |
| Vannas spring scissors | Fine Science Tools | 15000-10 | |
| Standard pattern forceps | Fine Science Tools | 11000-12 | straight |
| Standard pattern forceps | Fine Science Tools | 11001-12 | curved |
| Dumont No. 5 forceps | Fine Science Tools | 11252-30 | |
| Tissue retractor | Fine Science Tools | 17009-07 | |
| Paraformaldehyde | Sigma Alrdich | P6148 | |
| Triton X | Sigma Alrdich | X100 | |
| Vectashield with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 |
References
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