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Medicine

एक Published: June 30, 2015 doi: 10.3791/52672
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Medicine and New Jersey Medical School Cancer Center, Rutgers New Jersey Medical School

Introduction

बीमारी के रूप में जल्द ही छोटे ट्यूमर रक्त वाहिकाओं 2,3 विकास के रूप में, पता लगाने योग्य है 1 पहले स्तन कैंसर की कोशिकाओं को अस्थि मज्जा को metastasize। मेटास्टैटिक प्रक्रिया तेजी लेकिन अक्षम है। प्रकोष्ठों 4 दिन प्रति लाखों में, तेजी से नए रक्त वाहिकाओं में प्रवेश लेकिन कुछ दूर के अंगों से 5 यात्रा जीवित रहते हैं। फिर भी, कुछ micrometastases हड्डी में जीवित रहने और एकल कक्षों या नव निदान रोगियों 1 से अस्थि मज्जा रेस्पायरेट्रस में छोटे सेल clumps के रूप में पाया जा सकता है। इन कोशिकाओं को उन्हें 6 को नष्ट करने का बहुत उद्देश्य के लिए प्रशासित किया जाता है, जो सहायक कीमोथेरेपी, विरोध। यह प्रतिरोध अस्थि मज्जा माइक्रोएन्वायरमेंट 7,8 के साथ बातचीत के द्वारा शुरू किए गए संकेत अस्तित्व से, काफी, संपन्न होता है। Micrometastases स्थानीयकृत स्तन कैंसर के साथ महिलाओं के बारे में एक तिहाई में पाया जाता है और univariate विश्लेषण 9 से विश्लेषण किया जब अस्तित्व की एक स्वतंत्र सूचक का प्रतिनिधित्व किया जा सकता है। कुछ micrometastases विकास की पहल की हैं, लेकिन पुनरावृत्ति पैटर्न सेल प्रकार पर निर्भर करते हैं। ट्रिपल नकारात्मक स्तन कैंसर के रोगियों निष्क्रिय राज्य से अधिक गरीब नियंत्रण, सुझाव है 1 से 4 साल के बीच दुबारा होना चाहते हैं। ईआर / पीआर + कोशिकाओं सहित अन्य प्रकार की कोशिकाओं, पुनरावृत्ति 10 की एक सतत, निरंतर दर के साथ, अप करने के लिए 20 साल के लिए निष्क्रिय रह सकता है। ईआर + और ​​ईआर स्तन सेल लाइनों और ट्यूमर के बीच निद्रा जीन अभिव्यक्ति हस्ताक्षर में मतभेद अलग निद्रा क्षमता 11 को प्रतिबिंबित करते हैं, अस्थि मज्जा स्ट्रोमा के साथ बातचीत की संभावना निद्रा लिए एक महत्वपूर्ण योगदान का प्रतिनिधित्व करते हैं।

micrometastases दुर्लभ हैं और 10 से अधिक 6 गुना से hematopoietic कोशिकाओं द्वारा outnumbered रहे हैं क्योंकि इन विवो में निद्रा का अध्ययन असाधारण मुश्किल है। इसलिए, प्रासंगिक मॉडल तंत्र का सुझाव और vivo में परीक्षण योग्य परिकल्पना उत्पन्न कर सकते हैं कि इन विट्रो डेटा उपलब्ध कराने में है कि उत्पन्न किया जाना चाहिए। Mathe सहित निद्रा मॉडलों के एक नंबर,matical मॉडल 12,13, इन विट्रो मॉडल 7,8,14,15, vivo xenograft मॉडल 16, इन विट्रो का संयोजन और xenograft मॉडल 17,18 और सहज ट्यूमर और मेटास्टेसिस मॉडल 19, कैंसर सेल निद्रा 20 में कुछ अंतर्दृष्टि झुकेंगे । इन मॉडलों में से प्रत्येक अपनी सीमाएं हैं और खुद की आणविक संकेत और निद्रा अधिक जैविक रूप से प्रासंगिक मॉडल में परीक्षण किया जाना है कि सरकार बातचीत के बारे में परिकल्पना पैदा करने के लिए मुख्य रूप से उपयोगी होते हैं।

निद्रा के आणविक तंत्र, ईआर + कोशिकाओं में पुनरावृत्ति में परिणाम है कि चक्र गिरफ्तारी, redifferentiation और चिकित्सीय प्रतिरोध और तंत्र में यह परिणाम है कि microenvironment के साथ बातचीत को परिभाषित करने के समग्र लक्ष्य के साथ, हम में से प्रासंगिक तत्वों चयनित प्रदान करता है एक में इन विट्रो मॉडल विकसित स्ट्रोमल माइक्रोएन्वायरमेंट 7। इसके कम्पो में जबकि अपेक्षाकृत विरल यह मॉडलnents, निद्रा के महत्वपूर्ण कार्यों को प्रभावित करने वाले विशिष्ट आणविक तंत्र प्राप्त करने के लिए जांचकर्ताओं को अनुमति देने के लिए पर्याप्त रूप से मजबूत है। इन प्रयोगों सीधे vivo में परीक्षण किया जा सकता है कि परिकल्पना उत्पन्न करते हैं। मॉडल हम निद्रा में प्रासंगिक हो प्रदर्शन किया है कि कुछ महत्वपूर्ण तत्वों पर निर्भर करता है। वे उनकी बातचीत बुनियाद और मध्यम के घुलनशील घटक, एक फ़ाइब्रोनेक्टिन बुनियाद और बुनियादी fibroblast वृद्धि कारक की उपस्थिति के साथ मुख्य रूप से है जहां एक clonogenic घनत्व में एस्ट्रोजन निर्भर स्तन कैंसर की कोशिकाओं, कोशिकाओं की संस्कृति का उपयोग शामिल है (FGF -2) मध्यम में।

हम TGFβ 22 के माध्यम से मध्यस्थता FGF-2 21 से सेल चक्र गिरफ्तारी की प्रेरण, सहित इन विट्रो में व्यवस्था है कि सरकार तंत्र, विशेषता पर निर्भर है जो एक उपकला फेनोटाइप, को PI3 Kinase 7,8 और ERK 8 और morphogenic भेदभाव के माध्यम से संकेत अस्तित्व RhoA निष्क्रियता, Integrin45, 5β1 upregulation और अस्तित्व 7,15 के लिए स्ट्रोमल फ़ाइब्रोनेक्टिन के बंधाव (चित्रा 1)। MCF 7 कोशिकाओं पर FGF-2 की इन विट्रो सेल चक्र प्रभाव सांद्रता में 10 एनजी / एमएल 21,23 के नीचे कम से कम एक प्रवेश शुरू करते हैं। तर्क यह स्तनधारी सिस्टम 24-27 की संख्या में स्तन नलीपरक morphogenesis, चक्रीय विस्तार और मंदी गवर्निंग FGF -2 अभिव्यक्ति के अस्थायी नियंत्रण पर आधारित था। हम FGF-2 नलीपरक 3 डी संस्कृति 28 में morphogenesis, और आम तौर पर मानव ट्यूमर 29 की घातक परिवर्तन के साथ खो जाते हैं कि FGF -2 अभिव्यक्ति सहित, भेदभाव को प्रेरित करता है कि प्रदर्शन किया। FGR1 की अभिव्यक्ति सभी 4 FGF रिसेप्टर्स 30 व्यक्त करने के लिए जारी रखने के लिए 29 और MCF 7 कोशिकाओं का सर्वेक्षण स्तन कार्सिनोमा में बरकरार रह गए। निद्रा के संदर्भ में, FGF-2 से निर्यात किया जाता है और यह भारी hematopoietic स्टेम सेल 33 के संरक्षण में कार्य करता है जहां अस्थि मज्जा स्ट्रोमा 31,32 पर जमा किया। हम डीईएमFGF-2 यह morphogenic भेदभाव 7 लाती है जहां मज्जा, में भी प्रचुर मात्रा में फ़ाइब्रोनेक्टिन substrata, पर सुसंस्कृत ईआर + स्तन कैंसर की कोशिकाओं में एक निष्क्रिय राज्य लाती है onstrated। मॉडल में, स्तन कैंसर की कोशिकाओं की वृद्धि हिचकते हैं, RhoGap ग्राफ के माध्यम से रो एक निष्क्रिय एक उपकला phenotype के लिए redifferentiate और घातक प्रगति के साथ integrins α5β1 lost एक्सप्रेस रहे हैं। वे Integrin α5β1 के माध्यम से फ़ाइब्रोनेक्टिन बाँध और कहा कि साइटोटोक्सिक चिकित्सा 7,8,15 (चित्रा 1) के लिए उन्हें प्रतिरोधी प्रस्तुत करना संकेत अस्तित्व को सक्रिय करें। रो वर्ग GTPases का निषेध एक निष्क्रिय phenotype के 34 प्रेरित करने के लिए पहले से प्रदर्शन किया गया है।

यहाँ हम मॉडल की स्थापना और ईआर + स्तन कैंसर की कोशिकाओं की निद्रा गवर्निंग विशिष्ट आणविक और सेलुलर तंत्र का अध्ययन करने के लिए जांचकर्ताओं की अनुमति होगी कि विशिष्ट प्रक्रियाओं की रूपरेखा तैयार करेंगे। यहाँ प्रस्तुत प्रयोगों में मॉडल के उपयोग का वर्णन करने के लिए, हम एक AKT अवरोध करनेवाला और एक PI3K अवरोध करनेवाला और एक पैन-रो अवरोध करनेवाला और एक रो kinase (रॉक) अवरोध करनेवाला के साथ रो परिवार (चित्रा 1 बी) के सभी सदस्यों के साथ PI3K मार्ग (चित्रा 1 बी) को निशाना बनाया।

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Protocol

1. Clonogenic परख

  1. चरणों का उपयोग कर MCF 7 और T47D कोशिकाओं नीचे दिये एस्ट्रोजन निर्भर स्तन कैंसर कोशिका लाइनों की एक एकल कक्ष निलंबन की तैयारी
    1. MCF 7 या टी-47D कोशिकाओं के साथ कोई 50% से अधिक मिला हुआ है, जो एक 10 सेमी टिशू कल्चर पकवान से संस्कृति मध्यम (DMEM / 10% गर्मी निष्क्रिय भ्रूण बछड़ा सीरम / glutamine और कलम / स्ट्रेप) aspirate। पीबीएस के साथ कुल्ला। 1-4 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर 0.25% / 2.21 मिमी EDTA DMEM उच्च ग्लूकोज में भंग trypsin के साथ सेते हैं।
    2. एक एकल कोशिका वितरण सुनिश्चित करने के लिए एक चरण विपरीत खुर्दबीन के तहत 1 मिनट के अंतराल पर कोशिकाओं की जाँच करें। लगभग एक अचल, एकल कोशिका का दर्जा प्राप्त करने के लिए सेल सेल संपर्क को बाधित करने के लिए कई बार ऊपर और नीचे pipetting द्वारा एक 2 मिलीलीटर विंदुक के साथ कोशिकाओं Resuspend।
    3. आप ऊष्मायन के केवल 2 मिनट के बाद कोशिकाओं के clumps निरीक्षण करने के लिए 4 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर ट्रिप्सिन में कोशिकाओं को सेते जारी रखें। वे ई के अनुयायी रहते हैं अगर clonogenic अध्ययन के लिए इन कोशिकाओं का उपयोग न करेंtrypsinization के 4 मिनट के बाद अन्य ACH त्रुटि कॉलोनी संख्या उपज में पेश किया जाएगा।
      नोट: कोशिकाओं clumped कर रहे हैं, का गठन कालोनियों की संख्या incubated संख्या की तुलना में कम कोशिकाओं के उत्पाद को प्रतिबिंबित करेगा। कोशिकाओं को जरूरत से ज्यादा trypsinized कर रहे हैं, उनके clonogenic संभावित कम किया जा सकता है।
    4. के लिए आवश्यक पूरी मात्रा युक्त एक मास्टर ट्यूब में धारावाहिक dilutions द्वारा, (सेल प्रकार या बीतने संख्या पर निर्भर करता है, + 500 कोशिकाओं / एमएल) 24 अच्छी तरह प्लेटें, या कम, के लिए / एमएल संस्कृति के माध्यम से 1,500 कोशिकाओं की एक एकल कक्ष निलंबन की तैयारी प्रयोग में चर के सभी।
      नोट: लक्ष्य 800 कोशिकाओं / 2 सेमी (लगभग 500 1100 कोशिकाओं / 2 सेमी की रेंज) के अंतिम सेल घनत्व है। लक्ष्य के लिए अपेक्षाकृत आसान गिनती परमिट है, जो लगभग 100 + 50 कालोनियों को उपज है भीड़ से बचाता है और कालोनियों में वृद्धि हुई है या प्रयोगात्मक perturba की कमी कर रहे हैं जब महत्वपूर्ण सांख्यिकीय अंतर में परिणाम के लिए पर्याप्त कालोनियों परमिटमाहौल।
  2. चरणों का उपयोग कर Clonogenic घनत्व पर सेते कोशिकाओं नीचे उल्लिखित
    1. 1,500 कोशिकाओं / एमएल के एक मास्टर एकल कक्ष निलंबन ट्यूब से अच्छी तरह / 1,500 कोशिकाओं के एक clonogenic घनत्व कम 24 अच्छी तरह से फ़ाइब्रोनेक्टिन में लिपटे प्लेटों पर चार प्रतियों कुओं में कोशिकाओं को सेते हैं। 3 मिलीग्राम ड्राइंग और 2 कुओं में से प्रत्येक में 1 मिलीलीटर मध्यम वितरण से एक 5 मिलीलीटर विंदुक के साथ कोशिकाओं से युक्त मध्यम महीन चुर्ण बनाना।
      नोट: fibronectin लेपित प्लेटें पूर्व लेपित खरीदा जाना चाहिए कि एक वाणिज्यिक विक्रेता से। नियंत्रित गुणवत्ता के बाहर कोटिंग प्लेटें, एक असमान सतह में स्वचालित प्रक्रिया के परिणाम इस परख के लिए अनुपयुक्त।
    2. एक 5 मिलीलीटर विंदुक के साथ और नीचे pipetting द्वारा निलंबन मिक्स सेल निलंबन के 3 मिलीलीटर आकर्षित और 1 मिलीलीटर प्रत्येक के साथ 2 कुओं भरें। एक पिपेट से किसी एक समय में केवल 2 कुओं भरें। नीचे से ऊपर pipetting द्वारा फिर से, मास्टर ट्यूब में सेल निलंबन के लिए पिपेट में resuspend कोशिकाओं शेष मात्रा लौटें और एक और 2 wel के भरने के लिए एक और 3 मिलीलीटर आकर्षित1 मिलीलीटर प्रत्येक के साथ रास।
      नोट: कोशिकाओं लगातार तलछट होगा क्योंकि गुरु ट्यूब के सतत मिश्रण आवश्यक है। केवल 2 कुओं को भरने के लिए पर्याप्त मात्रा ड्राइंग कोशिकाओं के रूप में अच्छी तरह से पिपेट में तलछट क्योंकि प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए इसी तरह के सेल नंबर जोड़ने के लिए आवश्यक है।
    3. अनुमति देने के लिए कोशिकाओं को उनके clonogenic क्षमता (अप्रकाशित टिप्पणियों) मिलाना होगा कमरे के तापमान और सीओ 2 एकाग्रता में निलंबन में बैठने के लिए, क्योंकि कोशिकाओं की बड़ी मात्रा में वितरित करने के लिए तेजी से कार्य करें।
    4. कॉलोनी assays के लिए कुओं में उन्हें pipetting की कार्रवाई के दौरान कोशिकाओं के स्थानिक वितरण का अनुकूलन। धीरे-धीरे अच्छी तरह से के बीच में अंतिम सेल एकाग्रता युक्त निलंबन pipetting द्वारा ऐसा करते हैं। कोशिकाओं को नीचे करने के लिए बसने से पहले इस प्रस्ताव को आगे के लिए थाली न लायें। परिपत्र मिश्रण को प्रभावी ढंग से 6 दिनों में अच्छी तरह से बनाने के लिए उच्च सेल घनत्व और बेशुमार मिला हुआ कालोनियों की परिधि के लिए कोशिकाओं अपकेंद्रित्र होगा क्योंकि थाली ज़ुल्फ़ न करें।
      नोट: इस सब पर निलंबन में कोशिकाओं के साथ मात्रा को शुरू करने के बाद कोई मिश्रण से भी कम वांछनीय है क्योंकि जब तक आवश्यक मिश्रण नहीं है। यह कोशिकाओं मिश्रण करने के लिए आवश्यक है, यह एक सपाट सतह पर टिकी हुई है, जबकि सीधा दिशाओं में आगे और पीछे की थाली ले जाकर ऐसा करते हैं।
    5. 6 दिन के लिए मीडिया को बदलाव के बिना 37 डिग्री सेल्सियस 5% सीओ 2 में कोशिकाओं को सेते हैं। एक अच्छी तरह से 6 के बाद के दिनों में कोशिकाओं के छोटे संख्या में काफी पोषक तत्व या साइटोकाइन रचना और न ही मूल माध्यम की पीएच को प्रभावित नहीं करेंगे।
    6. इस प्रकार के रूप परख के समय कोर्स डिजाइन: 1 मिलीलीटर ताजा मध्यम या नए सिरे से युक्त मध्यम के साथ मध्यम मौजूदा बदलें दिन 1. पर फ़ाइब्रोनेक्टिन लेपित substrata पर कोशिकाओं को सेते FGF-2 के रूप में नीचे 6 दिन पर दिन 0. दाग कोशिकाओं पर 10 एनजी / एमएल 1.4 में)। ) 1.3 में नीचे के रूप में, दिन 3 पर किसी भी प्रयोगात्मक perturbations के आचरण।
  3. आण्विक संकेतन या आसंजन अणुओं की स्थापना की प्रयोगात्मक perturbations
    1. 3 दिन, 100 जोड़ने56, कुओं में 1 मिलीलीटर मध्यम करने के लिए perturbing एजेंट का अंतिम उद्देश्य एकाग्रता के 10x युक्त समाधान के एल। मत मिलाओ। एक अतिरिक्त 3 दिनों के लिए 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2 में कोशिकाओं को सेते जारी रखें।
      नोट: एजेंट perturbing निष्क्रिय राज्य के समर्थन में भूमिका निभा सकते हैं कि एक अवरोधकों की विविधता और आसंजन अणु, रिसेप्टर्स या अन्य सतह प्रोटीन, इंट्रासेल्युलर संकेत दे रास्ते, अणु, कारक, सहकारकों या संरचनात्मक प्रोटीन की अवरोधकों के अवरुद्ध एजेंट, शामिल कर सकते हैं।
    2. 6 दिन पर दाग कालोनियों के रूप में इस प्रकार है।
  4. दाग कालोनियों
    1. 2% इथेनॉल / 10 मिमी सोडियम borate में एक ताजा बना 0.1% क्रिस्टल वायलेट (पीएच 9.0) समाधान के साथ संस्कृति में 6 दिनों के बाद दाग कोशिकाओं। महाप्राण मीडिया और 20 मिनट के लिए अच्छी तरह से प्रत्येक के लिए एक मिलीलीटर क्रिस्टल बैंगनी समाधान जोड़ें।
    2. एक बर्फ की बाल्टी में एक तीव्र कोण पर नीचे का सामना अच्छी तरह से खुलने लगातार चल नल के साथ बह निकला के साथ उन्हें डुबो कर प्लेटें धो लेंसिंक में पानी। , एक बार पानी के नीचे एक क्षैतिज कोण करने के लिए थाली झुकाएँ अच्छी तरह से नीचे खोलने, और एक कोमल बह गति में निकालते समय तो न्यून कोण करने के लिए वापस झुकाव।
    3. कुओं के तल पर पानी नहीं रह नीला है जब तक विसर्जन में 2 या 3 बार दोहराएँ। जोरदार washes के गिनती और डेटा में त्रुटि के लिए काफी है, उनका कहना कारण प्रयोगात्मक हस्तक्षेप करने के लिए कम पक्षपाती हैं कि कोशिकाओं या कालोनियों निकाल सकते हैं।
    4. उल्टा उनके इसी लेबल वाले कवर में आसन्न बेंच शीर्ष पर तौलिए पर उन्हें रखने के द्वारा रात भर सूखी प्लेटें।
  5. कालोनियों गणना
    1. ऊष्मायन, धुंधला और सुखाने के प्रत्येक अच्छी तरह से करने के बाद 6 दिनों में बढ़ रही है और निष्क्रिय कालोनियों की संख्या की गणना। एक औंधा चरण विपरीत माइक्रोस्कोप में बेहतर 40X बढ़ाई कालोनियों गणना। कोशिकाओं बढ़ रही है, बड़े expa की तुलना में बहुत बड़े आकार की रूपात्मक उपस्थिति के साथ बढ़ रही है और 12 या उससे कम कोशिकाओं की कालोनियों के रूप में> 30 कोशिकाओं की कालोनियों गणनाबड़े कोशिका द्रव्य के साथ nded कोशिका द्रव्य चित्रा 1 7,15 में दिखाया अनुपात, नाभिक के लिए।
      नोट: वे सीधा निद्रा assays में बहुत अक्सर नहीं कर रहे हैं के रूप में 13-29 कोशिकाओं के समूहों सामान्य रूप से नहीं गिने जाते हैं। Perturbations या तो बढ़ रही है या निष्क्रिय कोशिकाओं के विकास को संभावित बदलाव अगर वे गिना जा सकता है। इन परिणामों तो जैविक महत्व के साथ जोड़ा जा करने की आवश्यकता होगी।

इम्यूनोफ्लोरेसेंस अध्ययन के लिए 2. Clonogenic ऊष्मायन

  1. संख्या / 24 में अच्छी तरह के प्रयोगों के अनुरूप सतह क्षेत्र सेल के अनुरूप करने के लिए, 6 अच्छी तरह प्लेटें में अच्छी तरह / लगभग 7,500-8,000 कोशिकाओं को सेल नंबर समायोजित करें।
  2. सेल इसके अलावा करने के लिए पहले इमेजिंग अध्ययन के लिए 6 अच्छी तरह से प्लेटों के प्रत्येक अच्छी तरह से आधार में एक दौर है, बाँझ, fibronectin लेपित कवर पर्ची रखें। ) 1.2 में उपरोक्त clonogenic प्रयोगों के लिए वर्णित के रूप में प्रत्येक कुएं में 3 मिलीग्राम की मात्रा में Pipet कोशिकाओं सांद्रता में एक बार में 2 कुओं, उल्लिखित।
  3. कोशिकाओं को सेतेऊपर के रूप में 1.2.4 और 1.2.5 में 6 दिन के लिए। 1.3 में कॉलोनी परख प्रक्रियाओं में वर्णित), 300 μl मात्रा में 10x सांद्रता में 3 दिन perturbing कारकों जोड़ें।
  4. एंटीबॉडी के साथ 6 दिन पर दाग कोशिकाओं उदाहरण के लिए, इस तरह के integrins α4, α5, α6, β1, β3, उदाहरण के लिए, फोकल आसंजन जटिल अणुओं FAK, paxillin और vinculin रूप आसंजन अणुओं सेल, ऐसे α ट्यूबिलिन के रूप में गतिशीलता में शामिल प्रोटीन, उदाहरण के लिए, इस तरह के phospho-AKT, phospho-ERK, phospho-p38, phospho-JNK, उदाहरण के लिए, या निद्रा में अपनी भूमिका के लिए जांच का लक्ष्य प्रत्यक्ष या अप्रत्यक्ष के लिए मानक तकनीक का उपयोग कर, यह है कि किसी भी अन्य प्रोटीन के रूप में संकेतन मार्ग सदस्यों immunofluorescence धुंधला।
    1. एसीटोन में संदंश दिन के साथ 6. फिक्स स्लाइड्स निकालें / मेथनॉल 1: 1 -20 पर 20 मिनट और शुष्क हवा के लिए सी °। एक वैकल्पिक लगानेवाला, यदि आवश्यक हो तो paraformaldehyde के रूप में इस तरह, इस्तेमाल किया जा सकता है। 2 मिनट F के लिए 0.1% ट्राइटन X-100, 0.1% सोडियम साइट्रेट के साथ Permeabilize कोशिकाओंइंट्रासेल्युलर एंटीजन की या पता लगाने। पीबीएस के साथ कोशिकाओं को धो लें।
    2. अप्रत्यक्ष immunofluorecence धुंधला, 5% BSA के साथ कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए या माध्यमिक एंटीबॉडी तैयार की गई थी, जिसमें प्रजातियों से 10% preimmune सीरम के साथ ब्लॉक स्लाइड के लिए।
    3. मार्ग के सदस्यों या पीबीएस में निर्माता से सिफारिश की विशिष्ट dilutions के लिए पतला निद्रा में अपनी भूमिका के लिए जांच का लक्ष्य है कि किसी भी अन्य प्रोटीन संकेत, आसंजन अणु, फोकल जटिल अणुओं सेल प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात सेते 0.1% ट्राइटन X -100।
    4. पीबीएस के साथ 3 बार धोएं। 2 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर fluorophor संयुग्मित एंटीबॉडी के साथ कवर फिसल जाता है सेते हैं। एक उदाहरण के रूप में, एलेक्सा Fluor 488 गधा विरोधी माउस आईजीजी एंटीबॉडी murine मोनोक्लोनल प्राथमिक एंटीबॉडी का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। माउंट DAPI के साथ एक antifade एजेंट का उपयोग कर गिलास स्लाइड पर नीचे सेल की ओर coverslips। नेल पॉलिश के साथ परिधि सील।
    5. प्रत्यक्ष इम्यूनोफ्लोरेसेंस के लिए, बीएसए बाहर ले जाने के लिएऊपर के रूप में 2.4.2 में) अवरुद्ध, 4 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात fluorophor संयुग्मित प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ सेते हैं। पीबीएस के साथ 3 बार धोएं। नेल पॉलिश के साथ एक antifade एजेंट और DAPI और मुहर के साथ स्लाइड सेते हैं।
    6. 4 में एल्यूमीनियम पन्नी और दुकान के साथ कवर स्लाइड ट्रे इमेजिंग और फोटोग्राफी के लिए ऊपर कभी भी कई सप्ताह बाद में करने के लिए सी °। 1,000x बढ़ाई पर एक कैमरा से लैस किसी भी प्रतिदीप्ति सूक्ष्म इमेजिंग प्रणाली का उपयोग कर देखें और फोटोग्राफ कोशिकाओं।
    7. तंतुमय एक्टिन धुंधला के लिए, 1% गोजातीय सीरम albumin (बीएसए) में ब्लॉक स्लाइड 30 मिनट के लिए और 20 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर BODIPY फ्लोरिडा-Phallacidin (हरा) या Rhodamine phalloidin (लाल) में सेते हैं। एक antifade एजेंट जोड़ने और ऊपर के रूप में सील।

आण्विक अध्ययन के लिए 3. Clonogenic ऊष्मायन

  1. पश्चिमी blots
    1. Fibronec पर 20,000 कोशिकाओं / 60 मिमी प्लेट और 50,000 कोशिकाओं / 100 मिमी प्लेट के clonogenic घनत्व में ईआर + स्तन कैंसर की कोशिकाओं MCF 7 या T47D सेतेटिन-लेपित 5% सीओ 2 में 37 डिग्री सेल्सियस पर प्लेटें।
    2. Lysates से प्रोटीन के लिए एमजी मात्रा की आवश्यकता होती है आणविक पढ़ाई के लिए 75,000 कोशिकाओं / 100 मिमी प्लेट का थोड़ा अधिक घनत्व में कोशिकाओं को सेते हैं। पश्चिमी blots का उपयोग कर आणविक पढ़ाई के लिए या उत्तरी दाग ​​के लिए शाही सेना के अलगाव के लिए पर्याप्त प्रोटीन एकत्र करने के लिए प्रयोगात्मक बिंदु प्रति दस प्लेटों का प्रयोग करें।
    3. सेल नंबर के आधार जेल लोड हो रहा है एकदम अलग आकार बढ़ रही है और निष्क्रिय कोशिकाओं में प्रोटीन अभिव्यक्ति की तुलना के लिए एक आवश्यक सहायक है। Trypsinizing से कोशिकाओं को इकट्ठा करके एक एकल बढ़त ब्लेड के साथ कोशिकाओं को बंद scraping के पश्चिमी blots के लिए lysates की तैयारी के लिए 0.2% Trypan ब्लू में एक hemocytometer में एक विभाज्य गिनती।
    4. अपकेंद्रित्र कोशिकाओं 2 मिनट के लिए 10,000 XG पर, आकांक्षा से मीडिया को दूर 200 μl lysis बफर जोड़ने के लिए, lysis बफर में कोशिकाओं sonicate और प्रोटीन एकाग्रता का निर्धारण।
    5. कोशिकाओं की संख्या से प्रोटीन उपज विभाजित करके सेल प्रति प्रोटीन की मात्रा की गणनाकि उस राशि उत्पन्न। बराबर सेल संख्या का प्रतिनिधित्व करने के लिए प्रोटीन की एक) बराबर मात्रा में और ख) प्रोटीन मात्रा दोनों का प्रतिनिधित्व करता है कि अलग polyacrylamide जैल से प्रत्येक कुएं में lysate लोड करें। कम से कम 25 माइक्रोग्राम प्रोटीन अच्छी तरह से प्रत्येक में लोड किया जाना चाहिए।
      नोट: इस आकार और प्रोटीन सामग्री (चित्रा 1) में काफी अलग हैं जो बढ़ रही है और निष्क्रिय कोशिकाओं, के बीच तुलना की अनुमति होगी।
  2. फ़्लो साइटॉमेट्री
    1. 3.1 के रूप में, trypsinization द्वारा 100 मिमी प्लेटों से कोशिकाओं को इकट्ठा और 2.4 में उल्लिखित के रूप में, इंट्रासेल्युलर या बाह्य एंटीजन के लिए या तो प्राथमिक या माध्यमिक immunofluorescence धुंधला का उपयोग कर (FACS) प्रोटोकॉल छँटाई मानक प्रतिदीप्ति सक्रिय सेल द्वारा विश्लेषण।
      नोट: एंटीबॉडी लेबलिंग द्वारा निर्धारित trypsinization द्वारा टिशू कल्चर प्लेटों से कोशिकाओं Detaching झिल्ली प्रोटीन की एकाग्रता को प्रभावित नहीं करता है।

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Representative Results

प्रयोगों परख पुनरावृत्ति करने के लिए आयोजित की गई। प्रयोग के समय के पाठ्यक्रम 2A चित्रा में दिखाया गया है। प्रकोष्ठों दिन -1 पर clonogenic घनत्व पर incubated हैं, FGF-2 ताजा माध्यम में 0 दिन पर जोड़ा जाता है और वे दाग रहे हैं और कालोनियों में गिने जाते हैं जब कोशिकाओं 6 दिन तक संवर्धित कर रहे हैं। प्रणाली में कोई perturbations 10x अंतिम सांद्रता में 100 μl की मात्रा में दिन में 3 पर प्रशासित रहे हैं वांछित। चित्रा 2B बढ़ रही है और निष्क्रिय कालोनियों की विशिष्ट उपस्थिति को दर्शाता है। बढ़ते कालोनियों> 30 कोशिकाओं होते हैं और निष्क्रिय कालोनियों बड़ी कोशिका द्रव्य / नाभिक अनुपात के साथ कोशिकाओं से बढ़ रहा है की तुलना में बड़ा है कई बार कर रहे हैं जो 12 या उससे कम सेल होते। चित्रा -2 चार प्रतियों में किए गए एक ठेठ प्रयोगात्मक परिणाम को दर्शाता है। , FGF-2 की उपस्थिति में क्लोन के विशाल बहुमत निष्क्रिय कर रहे हैं, जबकि FGF-2 के अलावा बिना कोशिकाओं के प्रमुख वितरण बढ़ रही क्लोन द्वारा प्रतिनिधित्व किया है।

> चित्रा 3 perturbing एजेंटों दिन 3. चित्रा पर जोड़ा गया था जिसमें एक प्रयोग का एक उदाहरण है "ontent एक पैन-रो अवरोध करनेवाला सी 3 ट्रांस्फ़्रेज़ और एक से GTPases का रो परिवार के निषेध द्वारा निष्क्रिय क्लोन की खुराक पर निर्भर निषेध का प्रतिनिधित्व करता है यह केवल कार्यप्रणाली को वर्णन करने के लिए प्रस्तुत किया गया था के बाद से परख निष्क्रिय क्लोन के रूप में अच्छी तरह से बढ़ रही क्लोन पर जोड़ा अवरोधकों के एड 50 का आकलन कर सकते अवरोध करनेवाला Y27632। रो काइनेज (रॉक)। इस प्रयोग में बढ़ रही है, क्लोन पर प्रभाव, निर्धारित नहीं किया गया था।

आंकड़े 4 और 5 परख निष्क्रिय क्लोन के अस्तित्व पर अवरोधकों के संयुक्त प्रभाव का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि प्रदर्शित करता है। हमारे पूर्व के अध्ययन PI3K मार्ग आंशिक रूप से निष्क्रिय क्लोन 7 के अस्तित्व को रोकता है PI3K और AKT दोनों के इस मॉडल और निषेध में निष्क्रिय कोशिकाओं में एक निरंतर सक्रियण प्रक्रिया से गुजरता है कि प्रदर्शन किया है। इधर, प्रारंभिक टिप्पणियों का प्रदर्शन Tछोटे GTPases का रो परिवार की टोपी अविशिष्ट निषेध भी आंशिक रूप से निष्क्रिय क्लोन के अस्तित्व को रोकता है। आंकड़े 4 और 5 में प्रस्तुत आंकड़ों सी 3 ट्रांस्फ़्रेज़ और एक रॉक अवरोध करनेवाला के साथ रो परिवार के निषेध के साथ, PI3K के निषेध और इसके नीचे की ओर प्रभावोत्पादक, AKT में से एक संयोजन लगभग पूरी तरह से कुछ परिस्थितियों में निष्क्रिय क्लोन के अस्तित्व को समाप्त कर सकते हैं कि प्रदर्शित करता है। हम पहले से निष्क्रिय क्लोन PI3K के निषेध जीवित नहीं बल्कि AKT का नहीं रह गया है दिखाई देते हैं बल्कि mesenchymal और व्यथित 7 निष्क्रिय फेनोटाइप दिखा रहे हैं, लेकिन लगता है कि कोशिकाओं के शामिल कर रहे हैं कि प्रदर्शन किया है। निष्क्रिय क्लोन में कोशिकाओं में जो रो परिवार को मोटे तौर पर सी 3 ट्रांस्फ़्रेज़ से हिचकते किया गया है और रॉक अवरोध करनेवाला भी, ठेठ निष्क्रिय उपस्थिति खो fibrolastoid दिखावे और लोगों में असंतोष बढ़ झिल्ली मान और भी (चित्रा 6) व्यथित दिखाई देते हैं। इन प्रयोगों के लिए एक बहुत ही br में पूछे जा सकता है कि एक मॉडल का प्रदर्शनoad ढंग से उपचार के लिए निद्रा और प्रतिरोध को नियंत्रित करने वाले तत्वों की समझ हासिल करने के लिए।

चित्र 1
चित्रा 1:। तंत्र (ए) हमारे इन विट्रो निद्रा मॉडल गवर्निंग साथ और FGF2 10 एनजी / एमएल 7 (100x बढ़ाई) के बिना फ़ाइब्रोनेक्टिन में लिपटे प्लेटों पर clonogenic घनत्व में 6 दिन ऊष्मायन के बाद बढ़ रहा है और निष्क्रिय MCF 7 क्लोन। (बी) सारांश स्कीमा डेटा रूपरेखा कि FGFR और α5β1 समानांतर स्थिर राज्य सिगनल को सक्रिय करने और निद्रा 7 बनाए रखने के लिए आवश्यक है Integrin। FGF-2 संकेत initiatesurvival और कई दिनों के बाद स्थिर अवस्था तक पहुँच जाता है, जो Integrin α5β1 7, upregulate कि ERK 8 और PI3 काइनेज 7 को सक्रिय करता है, G1 गिरफ्तारी के 21 में जिसके परिणामस्वरूप cyclin निर्भर काइनेज अवरोधकों upregulates। दोहरी संकेतन througPI3K के माध्यम से और स्वतंत्र रूप से फ़ाइब्रोनेक्टिन द्वारा Integrin α5β1 के बंधाव के माध्यम से ज FGFR RhoA गैप ग्राफ 15 की FAK की सक्रियता और झिल्ली स्थानीयकरण और क्रियान्वयन के लिए आवश्यक हैं। इस RhoA और एफ actin (phalloidin से सना हुआ सूक्ष्मदर्शीफ़ोटोग्राफ़), उपकला फिर से भेदभाव और निद्रा 15 के cortical पुनर्व्यवस्था के लिए एक अनुमोदक स्थिर राज्य की निष्क्रियता का परिणाम है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2: इन विट्रो निद्रा परख के तत्वों निद्रा परख के अस्थायी घटकों के (ए) स्कीमा।। कक्ष एक कंपनी जगत में एक 24 अच्छी तरह से थाली की अच्छी तरह / 1,500 कोशिकाओं की एक अधिकतम घनत्व पर, clonogenic घनत्व पर फ़ाइब्रोनेक्टिन लेपित टिशू कल्चर प्लेटों पर incubated हैंमध्यम ताजा मध्यम या युक्त ताजा माध्यम के साथ 0 दिन पर बदल दिया जाता है 1 दिवस पर 37 डिग्री सेल्सियस पर ubator और 5% सीओ 2 FGF-2 10 एनजी / एमएल और कोशिकाओं को फिर से incubated हैं। दाग की उपस्थिति प्रकोष्ठों 10x वांछित सांद्रता में 100 μl की मात्रा में दिन में 3 पर जोड़ रहे हैं दिन 6. किसी भी inhibitors या गड़बड़ी एजेंटों पर, के रूप में वर्णित, क्रिस्टल बैंगनी समाधान के साथ दाग रहे हैं और कोशिकाओं दिन 6 (बी) जब तक फिर से incubated हैं बढ़ रही है और निष्क्रिय MCF 7 कालोनियों। बढ़ते कालोनियों> 30 कोशिकाओं होते हैं और निष्क्रिय कालोनियों में 12 या उससे कम सेल होते। प्रसुप्त कोशिकाओं बड़े कोशिका द्रव्य / नाभिक अनुपात के साथ कोशिकाओं से बढ़ रहा है की तुलना में पैनकेक आकार का, कई गुना बड़ा कर रहे हैं। (100x बढ़ाई)। (सी) के साथ ग्राफ़ और FGF-2 10 fibronectin लेपित 24 अच्छी तरह से प्लेटों पर / मिलीलीटर एनजी बिना incubated 1,500 MCF 7 मानव स्तन कैंसर की कोशिकाओं की clonogenic संभावित प्रदर्शन है। FGF-2 के बिना, कोशिकाओं के प्रमुख वितरण जबकि FGF- की उपस्थिति में बढ़ रही क्लोन द्वारा प्रतिनिधित्व किया है क्लोन के 2 विशाल बहुमत निष्क्रिय कर रहे हैं। प्रयोगों से चार प्रतियों में किया गया। (त्रुटि सलाखों एसडी + हैं)

चित्र तीन
चित्रा 3: अखिल रो परिवार द्वारा निष्क्रिय क्लोन की खुराक पर निर्भर निषेध सी 3 ट्रांस्फ़्रेज़ और रॉक अवरोध करनेवाला Y27632 inhibitors टी-47D कोशिकाओं FGF-2 के साथ अच्छी तरह से 24 अच्छी तरह से fibronectin लेपित प्लेटें प्रति 1,000 कोशिकाओं के clonogenic घनत्व पर incubated रहे थे। 6 दिन के लिए 10 एनजी / एमएल। मीडिया, सी 3 ट्रांस्फ़्रेज़ 3 या 5 माइक्रोग्राम / एमएल, और रॉक अवरोध करनेवाला Y27632 0.1, 1 या 10 माइक्रोग्राम / एमएल दिन 3 पर थे और निष्क्रिय क्लोन दिन 6. ग्राफ पर गिना रहे थे पर दाग निष्क्रिय क्लोन की एक खुराक पर निर्भर निषेध दर्शाता रॉक अवरोध करनेवाला की है कि इस परख में 1 के बीच और 10 माइक्रोन था, जबकि दिन 6. सी 3 के एड 50 लगभग 3 माइक्रोग्राम / मिली थी। प्रयोगों से चार प्रतियों में किया गया। (त्रुटि सलाखों एसडी + हैं)

हमेशा ">:" रख-together.within-पेज = के लिए "jove_content चित्रा 4
चित्रा 4:। एक AKT अवरोध करनेवाला के साथ या निष्क्रिय टी-47D क्लोन के अस्तित्व पर एक PI3 kinase अवरोध के साथ पैन-रो परिवार अवरोध करनेवाला सी 3 के संयुक्त प्रभाव टी-47D कोशिकाओं में अच्छी तरह से फ़ाइब्रोनेक्टिन 24 पर अच्छी तरह से प्रति 1,000 कोशिकाओं के clonogenic घनत्व पर incubated रहे थे 6 दिन के लिए FGF-2 10 एनजी / एमएल के साथ लिपटे प्लेटें। सी 3 और AKT अवरोध करनेवाला के संयुक्त प्रभाव इन पर योज्य के हो दिखाई देते हैं मीडिया, सी 3 ट्रांस्फ़्रेज़ 5 माइक्रोग्राम / एमएल, AKT 25 माइक्रोन अवरोध करनेवाला और LY294002 20 माइक्रोन दिन 6. पर गिना रहे थे व्यक्तिगत रूप से या 3 दिन और निष्क्रिय क्लोन पर संयोजन में जोड़ा गया सांद्रता लेकिन सी 3 और PI3K अवरोध करनेवाला के संयुक्त प्रभाव निष्क्रिय क्लोन अस्तित्व के निषेध पर इन प्रयोगों में synergistic होना दिखाई देते हैं। प्रयोगों से चार प्रतियों में किया गया। (त्रुटि सलाखों एसडी + हैं)

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चित्रा 5:। एक AKT अवरोध करनेवाला के साथ या निष्क्रिय टी-47D क्लोन के अस्तित्व पर एक PI3 kinase अवरोध के साथ रॉक अवरोध करनेवाला Y27632 के संयुक्त प्रभाव टी-47D कोशिकाओं 24 अच्छी तरह से फ़ाइब्रोनेक्टिन में लिपटे प्लेटों पर अच्छी तरह से प्रति 1,000 कोशिकाओं के clonogenic घनत्व पर incubated रहे थे 6 दिन के लिए FGF-2 10 एनजी / एमएल के साथ। मीडिया, रॉक अवरोध करनेवाला Y27632 3 माइक्रोग्राम / एमएल, AKT 25 माइक्रोन अवरोध करनेवाला और LY294002 20 माइक्रोन व्यक्तिगत रूप से या 3 दिन और निष्क्रिय क्लोन पर संयोजन में जोड़ा गया था दिन 6. Y27632 के संयुक्त प्रभाव और होना प्रकट नहीं करते AKT अवरोध करनेवाला पर गिना रहे थे इन सांद्रता लेकिन Y27632 और PI3K अवरोध करनेवाला के संयुक्त प्रभाव पर योज्य के निष्क्रिय क्लोन अस्तित्व के निषेध पर इन प्रयोगों में additive की तुलना में अधिक दिखाई देते हैं। प्रयोगों से चार प्रतियों में किया गया। (त्रुटि सलाखों एसडी + हैं)

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चित्रा 6:। वर्णित के रूप में सी 3 ट्रांस्फ़्रेज़ और रॉक अवरोध करनेवाला Y27632 के साथ उपचार के बाद निष्क्रिय टी-47D क्लोन के बचने की उपस्थिति कालोनी assays, FGF-2 के साथ अच्छी तरह / 1,000 कोशिकाओं में 24 अच्छी तरह से फ़ाइब्रोनेक्टिन लेपित टिशू कल्चर प्लेट में चार प्रतियों में स्थापित किए गए थे, अवरोधकों दिखाया सांद्रता में 3 दिन में जोड़ा गया था, कोशिकाओं अखिल रो परिवार inhibitors के साथ इलाज 6. कोशिकाओं दाग और दिन पर फोटो खींच रहे थे, उनके प्रसार उपस्थिति खो दिया है, छोटे वृक्ष के समान बन गया है और व्यथित दिखाई दिया। (100x बढ़ाई)।

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Discussion

हमारे मॉडल अस्थि मज्जा में निद्रा के कई प्रमुख तत्वों के शामिल है। यह यह फ़ाइब्रोनेक्टिन, मज्जा का एक महत्वपूर्ण संरचनात्मक तत्व, FGF -2, एक वृद्धि कारक बहुतायत से अस्थि मज्जा स्ट्रोमा द्वारा संश्लेषित के होते हैं, एस्ट्रोजन की विस्तारित अवधि के लिए 10 मज्जा में निष्क्रिय रहने की संभावना प्रकार के होते हैं, जो संवेदनशील कोशिकाएं, होते हैं और भारी उनकी बातचीत बुनियाद के साथ मुख्य रूप से कर रहे हैं, जहां clonogenic घनत्व में कोशिकाओं की अस्थि मज्जा 31,32 और ऊष्मायन के बाह्य मैट्रिक्स में जमा किया। अस्थि मज्जा माइक्रोएन्वायरमेंट कहीं अधिक जटिल है जबकि विशिष्ट यंत्रवत सवाल पूछने के लिए जरूरत के रूप में, इस सरल प्रणाली के रूप में ज्यादा जोड़ा जटिलता के साथ बनाया जा सकता है।

मॉडल, तरीकों की एक संख्या में कोशिकाओं से बढ़ सेल जीवविज्ञान तकनीक, आणविक तकनीक और vivo तकनीक में शामिल साथ निष्क्रिय तुलना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। सेलुलर phenotypes के फिर से क्लोनिंग, गतिशीलता assayed द्वारा किया जा सकता हैऔर आक्रमण nonadherent ट्यूमर विशिष्ट अवरुद्ध एंटीबॉडी या पेप्टाइड्स 7 का उपयोग microenvironment के साथ बातचीत के लिए कार्यात्मक अध्ययन छोटी गोली गठन 36 की शुरुआत या द्वारा, 35 अध्ययन करता है।

clonogenic परख के प्राथमिक उत्पादन कोशिकाओं की बढ़ती या निष्क्रिय clonogenic संभावित अनुवाद करने के लिए है, जो या तो बढ़ रही है या निष्क्रिय, कालोनियों के एक अंकीय गिनती है। इसके बाद के संस्करण निहित के रूप में, चर की एक बड़ी संख्या प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य परिणाम के रूप में संभव के रूप में इसरो नियंत्रित किया जाना चाहिए, जो सभी के लिए इस परिणाम को प्रभावित करने की क्षमता है। इन कोशिकाओं का स्रोत है, समग्र बीतने संख्या, cryopreservation तकनीक और cryopreserved थे कि सेल संस्कृतियों की गुणवत्ता, विगलन के बाद से मार्ग की संख्या में शामिल हैं, एकल कोशिका की तैयारियाँ प्राप्त किया गया है जिसमें से संस्कृतियों के संगम के स्रोत और गुणवत्ता भ्रूण बछड़ा सीरम, trypsinization के durations और उनके reproducibility, अवधिकमरे के तापमान पर छोड़ दिया कोशिकाओं के प्रत्येक अच्छी तरह से, निपुणता में बराबर सेल नंबर pipetting या समान रूप से एक अच्छी तरह से की पूरी सतह क्षेत्र भर में कोशिकाओं के वितरण की निपुणता, समय की संख्या एक थाली के बीच दर्जनों, प्रेक्षण के लिए इनक्यूबेटर से हटा दिया जाता है दूसरों। आम तौर पर स्वीकार टिशू कल्चर गुणवत्ता नियंत्रण का प्रतिनिधित्व करने के अलावा, इन चर प्रयोग करने के लिए प्रयोग से निष्क्रिय clonogenic संभावित प्रभावित करते हैं। इंट्रा-प्रयोगात्मक परिवर्तनशीलता हालांकि, प्रयोग से प्रतिशत परिवर्तन के परिणामस्वरूप अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य हैं कि प्रयोग करने के लिए, आम तौर पर कम से कम 8-10% है। आमतौर पर, डेटा के विचरण प्रणाली और इस परख के संचालन खर्च समय के साथ प्रयोगकर्ता की वृद्धि के अनुभव का एक सीधा संबंध के साथ कम करने के लिए शुरू होता है।

निष्क्रिय और बढ़ कोशिकाओं में जीन की अभिव्यक्ति आरटी पीसीआर, उत्तरी धब्बा, पश्चिमी धब्बा, immunoprecipitation / पश्चिमी और कार्यात्मक जटिल तेज़ी / पश्चिमी द्वारा मूल्यांकन किया जा सकता है, इम्यूनोफ्लोरेसेंस या immunohistochemistry, microfluidics द्वारा बहुसंकेतन, रमन स्पेक्ट्रोस्कोपी, प्रवाह cytometry और अन्य तकनीकों। इन तकनीकों में विशिष्ट रिसेप्टर्स, अन्य झिल्ली प्रोटीन, संकेत दे रास्ते, प्रतिलेखन कारक, हिस्टोन संशोधक, अंगों और mitochondrial प्रोटीन, चयापचय मार्ग और ऊर्जा के उपयोग पर अनगिनत तरीकों से microenvironment के साथ तनाव और बल और बातचीत की भूमिका निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है निद्रा की भूमिका।

हमारे पूर्व के अध्ययनों से निष्क्रिय क्लोन 7 के अस्तित्व में के रूप में अच्छी तरह से कॉर्टिकल एक्टिन 15 की उपकला वितरण के साथ निष्क्रिय फेनोटाइप को बनाए रखने में PI3K रास्ते के लिए महत्वपूर्ण भूमिका का प्रदर्शन किया है। हम यह भी निष्क्रिय phenotype के सक्रिय होने के लिए RhoA विशेष रूप से, क्रम में हिचकते किया जाना चाहिए कि प्रदर्शन किया। यह अखिल inhibitors के साथ रो परिवार की निष्क्रियता निष्क्रिय क्लोन के अस्तित्व घटता है, जहां यहाँ प्रस्तुत आंकड़ों के विपरीत है। टीउसकी अंडरस्कोर तंत्र काटना रासायनिक अवरोधकों का उपयोग करने का खतरा है और रोकना या विशिष्ट रास्ते सक्रिय करने के लिए आनुवंशिक दृष्टिकोण का उपयोग करने के लिए की जरूरत है। इस दिशा में कार्यप्रणाली स्थायी अभिकर्मक या पारगमन द्वारा या क्षणिक अभिकर्मक 15, siRNA या नैनोकणों द्वारा, या तो कोशिकाओं के आनुवंशिक हेरफेर करने के लिए उधार देता है। यह मापा जा सकता है कि 6 दिनों में महत्वपूर्ण प्ररूपी प्रभाव का परिणाम देगा के साथ परख अवधि, क्षणिक जीन की अभिव्यक्ति या हस्तक्षेप में 6 दिनों के बाद से।

प्रवेश करने के तंत्र के अध्ययन के साथ-साथ निद्रा बाहर निकलने के लिए अपनी क्षमता को पहचानते हुए, हम वर्तमान में इन कोशिकाओं निद्रा से बचने के लिए के लिए तंत्र की जांच कर रहे हैं। निद्रा में प्रवेश बुरा समझा जाता है, निष्क्रिय अवस्था से बाहर निकलने के गवर्निंग तंत्र की एक समझ भी अधिक मायावी है। हम घायल स्ट्रोमा द्वारा भड़काऊ प्रतिक्रियाओं दोर के reawakening करने के लिए योगदान कर सकते हैं कि प्रारंभिक टिप्पणियों की सूचना दी हैmant MCF 7 इस मॉडल 37 का उपयोग कोशिकाओं। मॉडल के रूप में अच्छी तरह से टी -47 कोशिकाओं के लिए एक और ईआर + स्तन कैंसर कोशिका लाइन आवेदन किया जा सकता है। ईआर कोशिकाओं FGF-2 के जवाब में निष्क्रिय नहीं हो जाते हैं, यह भविष्य जांच में अलग भेदभाव एजेंटों के साथ अन्य कैंसर कोशिका प्रकार के कार्यप्रणाली अनुकूलित करने के लिए संभव हो सकता है।

निद्रा में शामिल कुंजी तंत्र की पहचान करने के लिए एक बेहद उपयोगी तकनीक होने के बावजूद, यह एक में इन विट्रो मॉडल बनी हुई है। हालांकि, निद्रा या इन विट्रो हेरफेर में आया है कि कोशिकाओं xenograft ट्यूमर क्षमता के गठन के लिए परीक्षण किया जा सकता है। प्रणाली के मुख्य संभावित लाभ, हालांकि, अत्यधिक जटिल इन विवो निद्रा मॉडल में परीक्षण किया जा सकता है, जो एक परिकल्पना के विकास की अनुमति होगी कि तंत्र की पहचान है।

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Disclosures

रक्षा अनुदान DAMD17-01-सी-0343 विभाग और DAMD17-03-1-0524, न्यू जर्सी राज्य आयोग कैंसर रिसर्च पर 02-1140-सीसीआर-E0 और कैंसर अनुसंधान के लिए रुथ Estrin गोल्डबर्ग मेमोरियल (आरडब्ल्यू) द्वारा समर्थित

Acknowledgments

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
MCF-7 cells ATCC HTB-22
T47D cells  ATCC HTB-123
BD BioCoat Fibronectin 24 Well Clear Flat Bottom TC-Treated Multiwell Plate Corning 354411
BD BioCoat Fibronectin 60 mm Culture Dishes Corning 354403
BD BioCoat Fibronectin 100 mm Culture Dishes Corning 354451
BD BioCoat 22x22mm #1 Glass Coverslip with a uniform application of human fibronectin Corning 354088
6 Well tissue culture plate CellTreat 229106
Dulbecco Modified Eagle Medium High Glucose 10X Powder Corning Life Sciences 50-013-PB
Heat Inactivated, Fetal Bovine Serum Serum Source International FB02-500HI
0.25% Trypsin/2.21 mM EDTA Corning 25-053-CI
Penicillin-Streptomycin Solution, 100X Corning 30-002-CI
L-Glutamine, 100x, Liquid Corning 25-005-CI
Recombinant Human FGF basic R&D Systems 234-FSE-025
Akt Inhibitor (1L6-Hydroxymethyl-chiro-inositol-2-(R)-2-O-methyl-3-O-octadecyl-sn-glycerocarbonate) CalBiochem 124005
LY294002  CalBiochem 19-142 Chenical PI3K inhibitor
C3 transferase  Cytoskeleton CTO3 Inhibits RhoA, RhoB, and RhoC, but not related GTPases such as Cdc42 or Rac1
Y-27632 dihydrochloride  Santa Cruz Biotechnology 129830-28-2
BODIPY FL-Phallacidin (green)  Molecular Probes B607 Fluorochrome for fibrillar actin staining
BODIPY FL-Rhodamine phalloidin (red)  Molecular Probes R415 Fluorochrome for fibrillar actin staining
Alexa Fluor 488 Donkey anti-Mouse IgG Antibody, ReadyProbes Reagent  Molecular Probes R37114
ProLong Gold Antifade Mountant with DAPI  Molecular Probes P-36931

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References

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चिकित्सा अंक 100 निद्रा अस्थि मज्जा स्ट्रोमा FGF -2 फ़ाइब्रोनेक्टिन स्तन कैंसर कॉलोनी परख
एक<em&gt; इन विट्रो</em&gt; अस्थि मज्जा में एस्ट्रोजन के प्रति संवेदनशील स्तन कैंसर की निद्रा आदर्श: आणविक तंत्र स्टडीज और परिकल्पना पीढ़ी के लिए एक उपकरण
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Tivari, S., Korah, R., Lindy, M.,… More

Tivari, S., Korah, R., Lindy, M., Wieder, R. An In Vitro Dormancy Model of Estrogen-sensitive Breast Cancer in the Bone Marrow: A Tool for Molecular Mechanism Studies and Hypothesis Generation. J. Vis. Exp. (100), e52672, doi:10.3791/52672 (2015).

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